بررسی مولکولی سویه‌های کیست هیداتیک گاوی در زابل، جنوب شرق ایران

نوع مقاله : انگل شناسی و بیماری های انگلی

نویسندگان

1 دانش آموخته دانشکده دامپزشکی، دانشگاه زابل، زابل، ایران

2 گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه زابل، زابل، ایران

3 عضو باشگاه پژوهشگران جوان و نخبگان، دانشگاه آزاد اسلامی واحد زابل، زابل، ایران

چکیده

زمینه مطالعه: کیست هیداتیک از مهم‌‌ترین بیماری‌های مشترک بین انسان و حیوان است که توسط مرحله نوزادی سستود اکینوکوکوس گرانولوزوس ایجاد می‌‌شود و یک مشکل عمده بهداشت عمومی در سراسر جهان است. معمولاً در مناطقی که بیماری آندمیک است، از‌لحاظ بیولوژی تنوع ژنتیکی نسبتاً زیادی در انگل وجود دارد. تاکنون ۱۰ ژنوتیپ مجزا از این انگل (G10-G1) گزارش شده است. مطالعات انجام‌شده در مناطق مختلف دنیا نشان می‌دهد تنوع ژنوتیپی و ماهیت کمپلکس اکینوکوکوس گرانولوزوس بر چرخه زندگی انگل، مسیر‌های انتقال، بیماری‌زایی، آنتی‌ژنیسیتی، ایمنی‌زایی، پاسخ به دارو‌ها، همه‌گیر‌شناسی و کنترل این بیماری تأثیرگذار است.
هدف: مطالعه حاضر  با هدف بررسی مولکولی سویه‌های کیست هیداتیک گاوی در منطقه زابل انجام شده است.
روش‎کار: این مطالعه در پاییز و زمستان سال ۱۴۰۱ بر روی ۵۰ نمونه کیست هیداتیک اخذ‌شده از کشتارگاه زابل انجام شد. بعد از استخراج DNA از پروتو اسکولکس و لایه زایا، آزمایش PCR ژنITS2  صورت گرفت. سپس محصول PCR توسط آنزیم HpaII مورد هضم آنزیمی قرار گرفت و نمونه‌ها تعیین توالی شدند.
نتایج: اندازه قطعه ITS2 تکثیر‌شده ۷۵۰ جفت باز بود. الگوی قطعات به‌دست‌آمده از محصول PCR-RFLP وجود E. granulosus sensu stricto (G1- G3 complex) را نشان داد و تعیین توالی هم نتایج هضم آنزیمی نمونه‌ها را تأیید کرد.
نتیجه­گیری نهایی: با مطالعه و تعیین ژنوتیپ‌های انگل در منطقه بر‌اساس میزبان، الگوی انتقال گوسفندی مطرح است که می‌توان الگوی پیشگیری مناسب را با‌توجه‌به چرخه زندگی انگل ارائه داد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Molecular Investigation of Bovine Hydatid Cyst Strains from A Slaughterhouse in Zabol, Southeast of Iran

نویسندگان [English]

  • Nahid Ozbakzaee 1
  • Maryam Ganjali 2
  • Fereshteh Mirshekar 3
1 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine, University of Zabol, Zabol, Iran
2 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Zabol, Zabol, Iran
3 Member of Young and Elite Researchers Club, Zabol Branch, Islamic Azad University, Zabol, Zabol, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Hydatid cyst, caused by the larval stage of the cestode Echinococcus granulosus (E. granulosus) is one of the most significant zoonotic diseases and a major global public health concern. In endemic regions, this parasite exhibits substantial genetic diversity in its biological characteristics. To date, 10 distinct genotypes of E. granulosus (G1–G10) have been identified. Studies worldwide demonstrate that the genotypic variation and complex nature of E. granulosus influence the parasite’s life cycle, transmission pathways, pathogenicity, antigenicity, immunogenicity, drug response, epidemiology, and disease control strategies.
OBJECTIVES: This study aimed to perform a molecular characterization of bovine hydatid cyst strains collected from a slaughterhouse in Zabol, south of Iran.
METHODS: This study was conducted in the autumn and winter of 2022 on 50 samples with a definitive diagnosis of hydatid cyst collected from a slaughterhouse in Zabol city. DNA was extracted from protoscolices and germinal layers, followed by PCR amplification of the ITS2 gene. The PCR products were then digested with the restriction enzyme HpaII and the samples were sequenced.
RESULTS: The PCR product ITS2 was 750 bp in size and was digested with HpaII restriction enzymes. According to the Restriction fragment length polymorphism analysis, the isolates belonged to a single species named E. granulosus sensu stricto (G1–G3 complex) and sequencing also confirmed the results.
CONCLUSIONS: Based on the determination of parasite genotypes in the region, a sheep transmission pattern is proposed, which can provide the appropriate prevention pattern according to the life cycle of the parasite.

کلیدواژه‌ها [English]

  • HpaII
  • Hydatid cyst
  • Protoscolex
  • PCR-RFLP
  • Strain

اصل مقاله

مقدمه

کیست هیداتیک یکی از مهم‌ترین بیماری‌های مشترک بین انسان و حیوان در بسیاری از مناطق دنیا، ازجمله ایران است که توسط مرحله نوزادی سستود  اکینوکوکوس گرانولوزوس (Echinococcus Granolusus) ایجاد می‌گردد. کرم بالغ در روده سگ و سگ‌سانان (میزبان نهایی) استقرار دارد و انسان و دام‌ها که نقش میزبان واسط انگل را دارند با خوردن تخم دفع‌شده با مدفوع سگ به مرحله لاروی انگل یا کیست هیداتیک مبتلا می‌شوند. میزبان نهایی زمانی به انگل آلوده می‌شود که امعا و احشای علفخواران آلوده به کیست هیداتیک را بخورد. این علفخوار می‌تواند گوسفند، بز، گاو، شتر، خوک یا سایر علفخواران وحشی باشد. انسان به‌صورت تصادفی همانند دام‌ها با خوردن آب یا مواد غذایی و سبزیجات که به تخم‌‌های این انگل آلوده باشد یا از‌طریق تماس با حیوانات آلوده و یا خاک‌خواری به این انگل مبتلا می‌‌شود. این بیماری در انسان به‌دلیل ابتلای اعضای حساس و حیاتی بدن، مانند کبد، ریه و انجام عمل‌های جراحی و در دام ازنظر غیرقابل‌مصرف بودن احشای آلوده، موجب خسارات بهداشتی و اقتصادی زیادی می‌شود (1، 2).

معمولاً در مناطقی که بیماری اندمیک است، ازنظر بیولوژی، تنوع ژنتیکی نسبتاً زیادی در اکینوکوکوس گرانولوزوس وجود دارد (2). مطالعات متعدد ثابت کرده‌اند در این مناطق، اکینوکوکوس به‌صورت کمپلکسی از سویه‌‌های مختلف وجود دارد که این تنوع ممکن است بر روی اپیدمیولوژی و بیماری‌زایی کیست هیداتیک اثر بگذارد (3). اکینوکوکوس گرانولوزوس دارای ۱۰ سویه (G1-G10) است(4، 5) که ۷ سویه آن می‌‌تواند انسان را درگیر کند (6). کمپلکس E.granulosus sensu stricto (G1-G3) علاوه‌بر انسان در گوسفند، گاو، بز، بوفالو، شتر و خوک، ژنوتیپ G4 در اسب و الاغ، ژنوتیپ G5 در گوسفند، بز، گاو، بوفالو، خوک و انسان و کمپلکس E. canadensis (G6–G10) گزارش شده است. این کمپلکس به 2 ژنوتیپ مجزای E. canadensis (G8 , G10) در گوزن و انسان و E. intermedius, (G6 ,G7) در خوک، گاو، گوسفند، بز و انسان تقسیم شده است (7، 8). رایج‌ترین سویه زئونوز انسانی در اکثر کشورها، شامل جنوب و شرق اروپا، شمال و شرق آفریقا، قسمت‌هایی از آسیا، استرالیا و جنوب آمریکا (آرژانتین) G1 (سویه گوسفندی) است. طبق مطالعات انجام‌شده در ایران نیز شایع­ترین سویه گزارش‌شده، سویه‌ G1 است. تاکنون گزارش‌هایی مبنی بر وجود سویه‌های G3 و G6 در گوسفندان ایران داده شده است (9).

Haniloo و همکاران در سال ۲۰۱۲ عنوان کردند کیست هیداتیک در گوسفند (٥ تا ٧٢ درصد)، شتر (٤/١١ تا ٧٠ درصد)، گاو (٥/٣ تا ٣٨ درصد) و بز (٧/١ تا ٢٠ درصد) شایع می­باشد. همچنین عفونت‌‌های انسانی به­طور مداوم از مناطق مختلف کشور گزارش می­شود (10).

این بیماری تأثیر مهمی در سلامت انسان و حیوان دارد؛ همچنین از‌نظر ضررهای اقتصادی نیز بسیار با‌اهمیت است. شواهد نشان می‌دهند در سالیان اخیر نه‌تنها از شیوع بیماری در دنیا کاسته نشده، بلکه در بسیاری از کشورها شیوع و شدت بیماری در انسان و حیوانات در حال گسترش است. در ایران آلودگی انسان به این بیماری از نقاط مختلف کشور گزارش شده است (11).

شناسایی مولکولی گونه‌‌ها و ژنوتیپ‌های عامل کیست هیداتیک انسان برای اهداف تشخیصی تأییدی، برای درک مسیر‌های انتقال انگل و در‌نهایت برای اجرای برنامه‌های کنترل هدفمند مهم است (12).

تکنیک‌های استفاده‌شده برای تعیین سویه، شامل تعیین ترادف ژن‌های میتوکندری COX1 و NAD1 و آنالیز مناطق ریبوزومال DNA شامل ITS1 و ITS2 به‌وسیله RFLP و RAPD و  SSCPاست. در حال حاضر برای شناخت سویه‌های اکینوکوکوس گرانولوزوس علاوه‌بر خصوصیات ریخت‌شناسی‌، بیوشیمیایی و زیستی از روش‌های مولکولی، به‌خصوص روش‌هایی بر مبنای  PCR-RFLPاستفاده می‌شود. با‌توجه‌به اهمیتی که ژن‌های میتوکندری COX1 و NAD1 در تعیین ژنوتیپ سویه‌های مولد بیماری کیست هیداتید دارند، برای شناخت اولیه ژنوتیپ‌های انگل از ژن‌های مذکور برای شناسایی بهره گرفته شده است (2، 13). ناحیه ITS از DNA ریبوزومی نیز به‌عنوان یک نشانگر ژنتیکی که ابزاری ساده و قدرتمند برای شناسایی دقیق و تمایز سویه‌های اکینوکوکوس گرانولوزوس فراهم می‌کند، مطرح شده است (14).

با‌توجه‌به اینکه تاکنون مطالعه‌ای در‌رابطه‌با شناسایی ژنوتیپ‌های اکینوکوکوس در گاوها در منطقه زابل انجام نشده است، به همین منظور بررسی و شناسایی ژنوتیپ انگل با استفاده از روش PCR-RFLP مدنظر قرار گرفت.

مواد و روش کار

نمونه‌گیری: در مطالعه حاضر با مراجعه به کشتارگاه و بررسی دقیق لاشه‌ها تعداد ۵۰ نمونه مثبت (کبد و ریه) از‌نظر کیست هیداتیک در پاییز و زمستان سال ۱۴۰۱ جمع­آوری گردید. نمونه‌ها با رعایت تمام موارد بهداشتی جمع‌آوری و در کنار یخ با حفظ شرایط به آزمایشگاه انگل‌شناسی دانشکده دامپزشکی دانشگاه زابل منتقل شدند. در شرایط آسپتیک با استفاده از سرنگ استریل مایع درون کیست‌‌ها کشیده و در لوله‌‌های آزمایشگاهی خالی شد. لوله‌‌های حاوی مایع کیست هیداتیک جمع‌آوری‌شده از هر عضو (کبد و ریه) با دور ۸۰۰ به‌مدت ۲ دقیقه سانتریفیوژ شدند. سپس مایع رویی دور ریخته شد و باقی‌مانده تا زمان استخراج DNA در ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری گردید.

در هر عضو امکان وجود کیست‌‌های بارور، استریل و یا کلسیفیه وجود دارد. به کیستی که حاوی مایع بدون پروتواسکولکس باشد، کیست استریل می‌گویند. با‌توجه‌به اینکه نمونه‌های جمع‌آوری‌شده از گاوها اکثراً استریل بودند لایه زایای (Germinal Layer) نمونه‌ها هم جهت استخراج  DNAجداسازی گردید.

استخراج  DNAو آزمایش PCR: محتویات کیست‌ها با سرنگ استریل آسپیره و از‌نظر وجود پروتواسکولکس بررسی شدند و در نمونه‌هایی که فاقد پروتواسکولکس بودند، از لایه زایای آن‌ها جهت استخراج DNA استفاده شد. عمل سایش و خرد کردن نمونه‌ها در هاون چینی انجام شد. هضم اولیه نمونه با افزودن بافر لیز‌کننده و پروتئیناز K  انجام شد. استخراج DNA با استفاده از کیتMBST  و طبق دستورالعمل کیت صورت گرفت. غلظت DNA استخراج‌شده توسط اسپکتروفتومتر تعیین و نمونه‌ها تا زمان استفاده در ۲۰‌- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند .تکنیک PCR بر روی ژن ITS2 نمونه‌ها، با استناد به روش Gareh و همکاران در سال ۲۰۲۱ (۱۴) و با استفاده از پرایمرهای forward 5'GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCG3' و پرایمر reverse 5'GGGATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGC3' انجام شد. برای انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز، حجم نهایی واکنش ۲۵ میکرولیتر در نظر گرفته شد که شامل  MgCl2 ۵/۱ میلی‌مولار، DNA  الگو ۵/۲ میکرولیتر، ۵/۰ میکرومول از هر پرایمر و ۲۰۰ میکرومولار dNTP Mix می‌باشد. آغازگر‌های استفاده‌شده در مطالعه حاضر از شرکت پیشگام تهیه شدند. تکثیر قطعه مورد‌نظر بر‌اساس الگوی دمایی و با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (Eppendorf, Germany) به‌ترتیب زیر انجام شد:

مرحله اول شامل ۵ دقیقه واسرشت اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتی‌گراد بود. مرحله دوم شامل ۳۰ سیکل و هر سیکل شامل سه گام بود: گام اول دناتوراسیون به‌مدت ۳۰ ثانیه در دمای ۹۴ درجه سانتی‌گراد، گام دوم شامل اتصال آغازگر‌ها به‌مدت ۴۵ ثانیه در دمای ۵۶ درجه سانتی‌گراد، گام سوم شامل گسترش قطعات به‌مدت ۴۵ ثانیه در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد و مرحله بسط و گسترش نهایی که به‌مدت ۵ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد انجام شد.

محصول‌PCR ، بر روی ژل آگارز در بافر EDTA-boric-Tris الکتروفورز شد و پس از رنگ‌آمیزی ژل با اتیدیوم بروماید، تصاویر باند‌های DNA توسط دستگاه Documentation UV ثبت شد. در فرایند PCR یک نمونه به‌عنوان کنترل منفی (بدونDNA ) و یک نمونه به‌عنوان کنترل مثبت (با استفاده از DNA  سویه استاندارد) مورد استفاده قرار گرفت.

PCR-RFLP: بعد از تکثیر قطعه ژنی، هضم آنزیمی محصول PCR توسط آنزیم (C/CGG) HpaII (MspI) انجام شد. در این آزمایش ۱۰ میکرولیتر از محصول PCR به‌دست‌آمده، ۱۸ میکرولیتر از آب فاقد نوکلئاز، ۲ میکرولیتر بافر R و 2 میکرولیتر از آنزیم HpaII (MspI)  به میکروتیوب انتقال داده شد. حجم کلی واکنش ۳۲ میکرولیتر بود که به‌مدت ۶ تا 10 ساعت در ۳۷ درجه سانتی‌گراد هضم محصول انجام شد. پس از هضم آنزیمی، محصول PCR بر روی آگارز ۲ درصد الکتروفورز گردید.

تعیین توالی نوکلئوتیدی و تجزیه‌وتحلیل درخت فیلوژنتیک: پس از انجام آزمایشات، ۴ نمونه از محصولاتPCR  جدایه‌های مختلف اکینوکوکوس گرانولوزوس برای تعیین توالی نوکلئوتیدی به‌صورت دو‌طرفه به شرکت پیشگام ارسال گردید. بعد از مشاهده نتایج، توالی موردنظر ازطریق نرم‌افزار distance new به دست آمد. توالی‌های نوکلئوتیدی به‌دست‌آمده با نرم‌افزار Blast  هم‌ردیف‌سازی شد و با سایر توالی‌های موجود در بانک ژن مورد مقایسه قرار گرفت.

در مطالعه حاضر، برای رسم درخت فیلوژنتیکی توالی نوکلئوتیدی مورد‌بررسی و سایر توالی‌های موجود در بانک ژن از روش neighbor-joining  استفاده شد و تجزیه‌و‌تحلیل تکاملی در نرم‌افزار MEGA X انجام شد (15، 16).

نتایج

نتایج استخراجDNA: استخراج DNA از تمام نمونه‌های کیست هیداتیک ریه و کبد  با استفاده از کیت MBST (MBST, Tehran, Iran) طبق دستورالعمل شرکت سازنده با موفقیت انجام گرفت.

نتایج واکنشPCR: قطعه تکثیر‌شده ناحیهITS2  به روش PCR با پرایمرهای اختصاصی روش Gareh و همکاران در سال ۲۰۲۱ (14) واجد باند ۷۵۰  جفت باز بودند. بعد از انجامPCR ، محصول واکنش همراه با کنترل مثبت و منفی در چاهک‌های ژل ۱ درصد قرار گرفتند و سپس الکتروفورز شدند. نتایج مربوط به نمونه‌‌ها در تصویر 1 قابل‌مشاهده است. 

نتایج حاصل از هضم آنزیمی: محصول‌های PCR توسط آنزیم HpaII طی واکنش PCR-RFLP مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند. محل برش این آنزیم C/GCC است، بنابراین بر‌اساس تعداد بازهای CGCC در قطعه تکثیر‌شده در واکنش PCR الگوی هضم آن بر روی محصول روی ژل مشاهده شد (تصویر ۲). الگوهای قطعات به‌دست‌آمده از محصول PCR ناحیهITS2-rDNA  بعد از برش توسط آنزیم HpaII نشان داد تمام نمونه‌ها منطبق با E. granulosus sensu stricto (G1- G3 complex) می‌باشند، به‌طوری‌که با آنزیم برش‌دهندهHpaII  قطعاتی با اندازه‌های حدود ۳۹۰ و ۳۶۰ جفت باز ایجاد شد (تصویر ٢). بنابراین براساس الگوی PCR-RFLP به‌دست‌آمده و با‌توجه‌به تقسیم‌بندی پیشنهادی اکینوکوکوس گرانولوزوس توسطNakao  و همکاران در سال ۲۰۰۷ و Moks  و همکاران در سال ۲۰۰۸ (5، 17) نمونه‌های مورد‌مطالعه به‌عنوانE. granulosus sensu stricto (G1- G3 complex) شناسایی شدند.

نتایج تعیین توالی نوکلئوتیدی و تجزیه ‌و‌تحلیل داده‌ها: نتایج به‌دست‌آمده با اطلاعات موجود در بانک جهانی ژن که از جدایه‌‌های اکینوکوکوس گرانولوزوس شامل ژنوتیپG1  ثبت شده است، با استفاده از ابزار بلاست مقایسه گردید. آنالیز توالی‌های به‌دست‌آمده، نشان داد همه آن‌ها واجد یک الگو می‌باشند. بررسی هم‌ردیفی توالی‌های به‌دست‌آمده در مطالعه حاضر با توالی‌های ژن ITS2  ثبت‌شده در بانک ژنی و بررسی ماتریس فاصله برای مطالعه حاضر نشان داد توالی به‌دست‌آمده تا ۹۶ درصد به توالی‌‌های G1 به‌دست‌آمده از سایت شباهت داشت که این نتایج تأییدی بر دقت و صحت توالی‌یابی می‌باشد. 

نتایج تحلیل درخت فیلوژنتیک: در مطالعه حاضر برای رسم درخت فیلوژنتیکی توالی نوکلئوتیدی مورد‌بررسی از روش neighbor-joining method با بوت استراپ ۱۰۰۰ استفاده شد (تصویر ۳). همان‌طور که در تصویر ۳ مشاهده می­گردد درخت فیلوژنتیک رسم‌شده بر‌اساس توالی ژنITS2  از نمونه‌های مختلف اکینوکوکوس گرانولوزوس روابط تکاملی میان این توالی‌ها را به‌خوبی نشان می‌دهد. توالی‌ها در خوشه‌ای شامل ژنوتیپG1  است که شایع‌ترین ژنوتیپ در بین گونه‌های انسانی و دامی در مناطق مختلف جغرافیایی است. بررسی فیلوژنتیکی ژن اکینوکوکوس گرانولوزوس نشان داد نمونه مورد‌نظر در مطالعه حاضر نزدیک‌ترین خویشاوندی را با ژنوتیپ G1 عراق داشت. توالی مطالعه حاضر در  Gen Bankبا کد PV544216 ثبت شده است.

بحث

با‌توجه‌به تنوع درون‌گونه­ای اکینوکوکوس گرانولوزوس اکتفا کردن به اطلاعات به‌دست‌آمده از شاخص‌های ریخت­شناسی جهت تمایز سویه و گونه، قابل‌اعتماد نیست؛ بنابراین تلفیقی از روش‌های ریخت­شناسی و مولکولی با هم می‌تواند اطلاعات جامع‌تری را دررابطه‌با شناسایی تنوع در سویه­های اکینوکوکوس گرانولوزوس فراهم کند. برای مطالعه ژنوتیپ‌های اکینوکوکوس گرانولوزوس از روش­‌های مولکولی به‌ویژه روش­‌های مبتنی بر PCR-RFLP استفاده می­گردد که از کیفیت و کمیت مناسبی برای تهیه محصولات PCR برخوردار است (18). با‌توجه‌به اهمیت ژن‌های میتوکندری COX1 و NAD1 در تعیین ژنوتیپ سویه‌های مولد بیماری کیست هیداتیک، برای شناخت اولیه ژنوتیپ‌‌های انگل از ژن‌های مذکور بهره گرفته شده است (2، 13) در مطالعه Gareh و همکاران در سال ۲۰۲۱ ناحیه ITS از DNA ریبوزومی به‌عنوان یک نشانگر ژنتیکی که روشی ساده برای شناسایی دقیق و تمایز سویه‌های اکینوکوکوس گرانولوزوس فراهم می‌کند، مطرح شده است (14). بررسی مطالعات انجام‌شده نشان می­دهد ژنوتیپ G1 شایع­ترین علت ایجاد‌کننده کیست هیداتیک انسانی در دنیا محسوب می­شود (19).

از‌آنجایی‌که اطلاعات کمی در‌مورد خصوصیات ژنتیکی E. granulosus  در زابل وجود دارد، شناسایی ژنوتیپ انگل در گاوهای منطقه مدنظر قرار گرفت. روش مولکولی مورد‌استفاده در مطالعه حاضر، روش PCR- RFLP  روی قطعه ITS2 با استفاده از یک آنزیم اندونوکلئاز محدود‌کننده (‌(HpaII‌ بود. این آنزیم قادر به تفریق اغلب سویه‌های اکینوکوکوس گرانولوزوس از یکدیگر می‌‌باشد. نتیجه مطالعه نشان‌دهنده وجود E. granulosus sensu stricto (G1- G3 complex) در گاو‌های این منطقه می‌باشد.

درخت فیلوژنتیک رسم‌شده بر‌اساس توالی ژنITS2  از نمونه‌های مختلف اکینوکوکوس گرانولوزوس (تصویر ۳)، روابط تکاملی میان این توالی‌ها را به‌خوبی نشان می‌دهد. توالی‌ها در خوشه‌ای شامل ژنوتیپ G1 قرار می‌گیرد که شایع‌ترین ژنوتیپ در بین گونه‌های انسانی و دامی در مناطق مختلف جغرافیایی است (19). این نکته می‌تواند در مطالعات اپیدمیولوژیک و تکمیلی حائز اهمیت باشد.

در مطالعه Matini و همکاران در سال ۲۰۱۸ در همدان برای شناسایی ژنتیکی ایزوله‌های اکینوکوکوس گرانولوزوس، در‌مجموع  ۷۴ نمونه دامی شامل ۶۹ گوسفند، ۳ گاو و ۲ بز و ۹ کیست هیداتید انسانی با روش PCR- RFLP بر روی ژن ITS1 و با آنزیم‌های RsaI, HpaII, AluI, TaqΙ  مورد بررسی قرار گرفت و در‌نهایت پس از تعیین توالی نمونه‌ها E. granulosus sensu stricto (G1- G3 complex) گزارش شد (20) که با نتیجه مطالعه حاضر مطابقت دارد. همچنین در مطالعه Dousti و همکاران در سال ۲۰۱۳ در ایلام، برای شناسایی ژنوتیپ‌‌های کیست هیداتید بر روی ۳۴ نمونه حیوانی و انسانی با روش PCR- RFLP بر روی ژن ITS1 و با آنزیم‎‌های RsaI, HpaII, AluI, TaqΙ نتیجه مشابه با مطالعه حاضر به دست آمده است (21).

در مطالعه Jamali و همکاران در سال ۲۰۰۴ در تبریز با جمع­آوری ۲۰ نمونه کیست هیداتیک گاوی و انجام PCR- RFLP  با 2 آنزیمRsaI  و HpaII سویه‌های موجود در آن­ها راG1  تشخیص دادند (18).

در مطالعه Gholami و همکاران در سال ۲۰۰۹ که در شهر ساری بر روی پروتواسکولکس‌های کیست هیداتیک بارور گاو با روش PCR-RFLP  بر روی ژن ITS1 و هضم آنزیمی با آنزیم‌های تجزیه‌کننده اندونوکلئازیAllspl, EcoR 1,Hhal,atq1  انجام شده بود، تنها ژنوتیپG1  گزارش گردید (11).

در مطالعه Haniloo و همکاران در سال ۲۰۱۲ جهت شناسایی ژنوتیپ‌‌های کیست هیداتیک در ۷۷ نمونه اخذ‌شده از گاو و گوسفند و ۹ نمونه انسانی در استان زنجان، از روش PCR-RFLP استفاده شد. الگوهای قطعات به‌دست‌آمده از محصول PCR ناحیه ITS1 بعد از برش با آنزیم‌هایAlu1، Rsa1، Msp1 وTaq1  نشان داد تمام نمونه‌ها منطبق با ژنوتیپG1  یا همان ژنوتیپ شایع گوسفندی می‌باشند (10).

Yakhchali  و همکاران در سال 2013 در استان آذربایجان‌غربی در کیست‌های جدا‌شده از گاو با استفاده از روش PCR-RFLP بر روی NAD1 سویه G1 را گزارش نموده­اند (22).

در مطالعه­ اولیه‌ای توسط  Zhangو همکاران در سال ۱۹۹۸ در مناطق مختلف ایران، از ۴ ایزوله کیست هیداتیک گاوی با تعیین توالی COX1 وNAD1  2 سویهG1  (گوسفندی) و G6 (شتری) شناسایی شد (23). Harandi و همکاران در سال ۲۰۰۲ نیز در مطالعاتی که در مناطق مختلف ایران بر روی ۳۲ نمونه جمع­آوری‌شده گاوی با روشPCR-RFLP  انجام دادند وجود 2 سویه گوسفندی و شتری را تأیید کردند (24).

Shahnazi و همکاران در سال ۲۰۱۱ در اصفهان با انجام تکنیکPCR-RFLP  ژن ITS1 نمونه‌های کیست هیداتید گاوی و انجام تعیین توالی 2 ژن  COX1 و NAD1 ، 2 ژنوتیپ G1 و G6 را تشخیص دادند (25).

در مطالعه Sharbatkhori و همکاران نیز در سال ۲۰۱۰ در نواحی مختلف ایران بر روی ۱۱۲ نمونه کیست هیداتیک از دام‌های مختلف با انجام روش PCR-RFLP  ژن ITS1 ژنوتیپ‌های G1 و  G6 گزارش شد (19).

در سال ۲۰۰۹ تکنیک ‌(SSCP) single-strand conformation polymorphism بر روی ۳۰ ایزوله گرفته‌شده از گاو در مناطق مختلف ایران، 2 ژن COX1 و NAD1 از ژنوم میتوکندری تعیین سویه شد. نتایج این مطالعه نشان داد ۱۰۰ درصد نمونه‌های گاوی متعلق به ژنوتیپ G3- G1بودند (26).

 Hajialilo و همکاران در سال ۲۰۱۲ با مطالعه کیست‌های جدا‌شده از دام‌های مختلف در استان کرمان با روش PCR ژن‌های COX1  و‌ NAD1 سویه‌‌های G1 را در گوسفند، گاو، شتر، بز و G3 را از گاو، گوسفند و شتر جدا کردند و در‌مورد نمونه انسانی سویه G6 را گزارش کردند (27).

Fallahizadeh و همکاران در سال ۲۰۱۹ در کیست‌های جدا‌شده از گاومیش، گاو، بز و گوسفند از کشتارگاه شهرستان شوش با روش PCR-RFLP بر روی قطعه ژنی ITS1، بعد از برش با آنزیم‌‌های Alu1، Rsa1، HpaII وTaq1 ‌، کمپلکس E. granulosus sensu stricto (G1- G3) را در این نمونه‌‌ها گزارش کردند (28).

در مطالعه Hedayati و همکاران در سال ۲۰۱۹ در بررسی مولکولی ژنوتیپ کیست هیداتیک انسانی در مازندران با استفاده از ژن‌‌های NAD1، سویه‌های G1،  G2و G3 شناسایی شد (29).

Shahbazi و همکاران در سال ۲۰۲۰ در تعیین ژنوتیپ کیست‌های هیداتیک انسانی تازه و پارافینه‌شده با استفاده از ژن‌های COX1 و NAD1 در استان همدان، سویه‌‌های G1 و G3 را گزارش کردند (30).

در مطالعه Arabloo و همکاران در سال ۲۰۲۵ در شهرستان قزوین، با بررسی ژن‌های COX1 و NAD1 در ۸۰ نمونه کیست هیداتیک جدا‌شده از انسان و گاو، گوسفند و بز، سویه‌های G1 (۵/۹۷ درصد) و G3 (۵/۲ درصد) را گزارش کردند (31).

همان­طور که از نتایج مطالعات صورت‌گرفته پیداست، ژنوتیپ G1 به‌عنوان ژنوتیپ غالب و اصلی در آلوده کردن گاوها نقش دارد و به دنبال آن ژنوتیپ G6 و G3 گزارش شده است. در مطالعات پیشین انجام‌گرفته در سایر نقاط دنیا نیز از ژنوتیپ G1 به‌عنوان ژنوتیپ غالب یاد شده و آلودگی با سایر ژنوتیپ‌ها به میزان کمتری صورت گرفته است.

Utuk و همکاران در سال ۲۰۰۸ در ترکیه از ۷ کیست هیداتیک گاوی با انجام روشPCR-RFLP  روی قطعه ژنی ITS1  ژنوتیپG1  را گزارش کردند (32). Andresiuk و همکاران در سال ۲۰۰۹ در مطالعه­ای بر روی ۳۲ نمونه گاوی از اسپانیا و ۲۲ نمونه گاوی از آرژانتین با روش PCR ، ژنوتیپ G1 را جدا کردند (33).

Dinkel و همکاران در سال ۲۰۰۴ در آفریقا ۶ مورد کیست‌‌های گاوی را توسط تکنیک semi-nested PCR  مورد آزمایش قرار دادند که ۴ کیست ژنوتیپ G6/G7 و 2 مورد ژنوتیپ G5 را داشتند (34). Busi و همکاران در سال ۲۰۰۷ در ایتالیا با مطالعه بر روی ۱۵ کیست هیداتیک گاوی ژنوتیپ‌هایG1  و G3 را گزارش کردند (35). در مطالعه  Vuralو همکاران در سال ۲۰۰۸ در ترکیه بر روی کیست‌های جدا‌شده از ۱۲ گاو با روشsemi –nested PCR ‌، ژنوتیپ G1 را از ۹ گاو و ژنوتیپ G3 را از ٣ گاو جدا کردند (36).  Radو همکاران در سال ۲۰۱۰ در تونس ۵ کیست گاوی را با تعیین توالی ژن COX1 مورد بررسی قرار دادند و ژنوتیپ G3 را شناسایی کردند (37).

با‌توجه‌به اینکه گونه غالب در گاوهای منطقه زابل E. granulosus sensu stricto (G1- G3 complex) است، محتمل‌ترین چرخه زندگی انگل، چرخه زندگی سگ ـ گوسفند است. در مناطقی که گوسفندان با سایر دام‌های اهلی نگهداری می‌شوند، انسان هم به‌علت تماس با میزبان نهایی گوشتخوار در معرض آلودگی با ژنوتیپ گوسفندی قرار می‌گیرد (20). با‌توجه‌به اهمیت بهداشتی و اقتصادی این بیماری، لازم است اقدامات مؤثری در کنترل بیماری صورت گیرد.

نتیجه‌گیری نهایی: مطالعه حاضر در‌واقع یک اقدام اولیه برای تشخیص ژنوتیپ‌هایE.granulosus  در زابل بود. باتوجه‌به یافته‌های مطالعه حاضر E.granulosus sensu stricto (G1- G3 complex) به‌عنوان ژنوتیپ غالب و اصلی در آلوده کردن گاوهای منطقه نقش دارد. از‌آنجایی‌که طراحی یک استراتژی مناسب برای کنترل آلودگی مستلزم درک خوب چرخه انتقال در هر منطقه است، اطلاعات کسب‌شده در هنگام اجرای برنامه‌های کنترل این بیماری مشترک انسان و حیوان می‌تواند مفید واقع شود؛ بنابراین مطالعات ژنتیکی بیشتری برای تعیین دقیق ژنوتیپ‌های E.granulosus  در منطقه و در سطح استان نیاز است.

ملاحظات اخلاقی

کلیه مراحل انجام مطالعه حاضر در کمیته تحقیقات اخلاق دانشگاه زابل با کد: IR.UOZ.REC.1403.025 تأیید شد.

سپاسگزاری

از دانشکده دامپزشکی دانشگاه زابل  جهت حمایت و پشتیبانی در انجام مطالعه حاضر تشکر می‌شود.

تعارض منافع

هیچ گونه تعارض منافعی در ارتباط با این مطالعه وجود ندارد.

مراجع

  1. Eslami A. Veterinary helminthology: Cestoda. 2nd Tehran: Tehran University Publisher; 2006.p.120-121.
  2. Shamsi M, Dalimi A, Khosravi A, Ghafarifar F. Determination of genotype isolates of human and sheep hydatid cyst in Ilam. J Ilam Univ Med Sci. 2015;23(2):111-9.
  3. Yousefi H, Hashemzadeh CM, Aliyari Z, Zebardast N, Farokhi E. Molecular characterization of the strains cause sheep-hydatid cyst, in Chaharmahal and Bakhtiary Province using restriction fragment length polymorphism.  J Shahrekord.  2007;9(2):28-33.
  4. Bowles J, Blair D, McManus DP. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Mol Biochem Parasitol. 1992;54(2):165-73. doi: 10.1016/0166-6851(92)90109-w
  5. Nakao M, McManus DP, Schantz PM, Craig PS, Ito A. A molecular phylogeny of the genus Echinococcus inferred from complete mitochondrial genomes. Parasitol. 2007;134:713-22. doi: 10.1017/S0031182006001934 PMID: 17156584
  6. Bardonnet K, Piarroux R, Dia L, Schneegans F, Beurdeley A, Godot V, et al. Combined eco-epidemiological and molecular biology approaches to assess Echinococcus granulosus transmission to humans in Mauritania: occurrence of the ‘camel’strain and human cystic echinococcosis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2002;96(4):383-6. doi: 10.1016/s0035-9203(02)90369-x PMID: 12497974
  7. Thompson RC. The taxonomy, phylogeny and transmission of Echinococcus. Exp Parasitol. 2008;119(4):439-46. doi: 10.1016/j.exppara.2008.04.016 PMID: 18539274
  8. Saarma U, Jõgisalu I, Moks E, Varcasia A, Lavikainen A, Oksanen A, et al. A novel phylogeny for the genus Echinococcus, based on nuclear data, challenges relationships based on mitochondrial evidence. Parasitol. 2009;136(3):317-28. doi: 10.1017/S0031182008005453 PMID: 19154654
  9. Mirshekar F, Hashemitabar G, Razmi G. A morphological and molecular study of hydatid cyst in slaughtered sheep in Mashhad area. Vet Res & Biol Pr. 2021;34(2):68-76. doi: 10.22092/vj.2020.341360.1678
  10. Haniloo A, Farhadi M, Farzali A, Nourian A. Genotype characterization of hydatid cysts isolated from Zanjan using PCR-RFLP technique. Zanjan Univ Med Sci J. 2012;84:57-65.
  11. Gholami S, Irshadullah M, Khan A. Genetic variation of Echinococcus granulosus isolates from Indian buffalo and Iranian sheep, cattle and camel. J Maz Univ Med Sci. 2009;19(71):60-9.
  12. Issa AR, Arif SH, Mohammed AA, Santolamazza F, Santoro A, Mero WM, Casulli A. Insights into human cystic echinococcosis in the Kurdistan Region, Iraq: characteristics and molecular identification of cysts. Pathog. 2022;11(4):408. doi: 10.3390/pathogens110404083 PMID: PMC9025470
  13. Gholami SH, Sosarai M, Fakhar M, Sharif M, Daryani A. Genotype identification of Echinococcus granulosus from paraffin-embedded tissues of hydatid cysts isolated from human by PCR-RFLP. J Maz Univ Med Sci. 2011;21(85):10-9.
  14. Gareh A, Saleh AA, Moustafa SM, Tahoun A, Baty RS, Khalifa RM, et al. Epidemiological, morphometric, and molecular investigation of cystic echinococcosis in camel and cattle from upper Egypt: current status and zoonotic implications. Front Vet Sci. 2021;8:750640. doi: 10.3389/fvets.2021.750640
  15. Tamura K, Nei M, Kumar S. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101:11030-11035. doi: 10.1073/pnas.0404206101
  16. Kumar S, Stecher G, Li M, Knyaz C, Tamura K. Mega X: molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Molecular biology and evolution. 2018;35:1547-1549. doi: 10.1093/molbev/msy096 PMID: 29722887
  17. Moks E, Jogisalu I, Valdmann H, Saarma U. First report of Echinococcus granulosus G8 in Eurasia and a reappraisal of the phylogenetic relationships of ‘genotypes’ G5-G10. Parasitol. 2008;135:645-54. doi: 10.1017/S0031182008004198 PMID: 18261256
  18. Jamali R,Ghazanchaei A, Asgharzadeh M. Identification and characterization of Echinococcus granulosus by PCR-RFLP technique in Tabriz district. J parasitic Dis.2004: 28(2): 69-72.
  19. Sharbatkhori M, Mirhendi H, Harandi MF, Rezaeian M, Mohebali M, Eshraghian M, et al. Echinococcus granulosus genotypes in livestock of Iran indicating high frequency of G1 genotype in camels. Exp Parasitol. 2010;124(4):373-9. doi: 10.1016/j.exppara.2009.11.020 PMID: 20004194
  20. Matini M, Roostami M, Fallah M, Maghsood AH, Saidijam M, Fasihi Harandi M. Genetic Identification of Echinococcus granulosus Isolates in Hamadan, Western Iran. Iran J Parasitol. 2018;13(3):423-429. PMID: 30483334
  21. Dousti M, Abdi J, Bakhtiyari S, Mohebali M, Mirhendi S, Rokni M. Genotyping of Hydatid Cyst Isolated from Human and Domestic Animals in Ilam Province, Western Iran Using PCR-RFLP. Iran J Parasitol.2013;18(1):47-52. PMID: 23682259
  22. Yakhchali M, Mardani K. A study on Echinococcus granulosus strains using nucleotide sequence of co-1 gene by PCR-RFLP technique in West Azarbaijan province, Iran. Med Sci. 2013;23(7):792-798.
  23. Zhang L, Eslami A, Hosseini SH, McManus DP. Indication of the precence of two distinct strains of Echinococcus granulosus in Iran by mitochondrial DNA markers. Am J Trop Med Hyg. 1998;59(1):171-4. doi: 10.4269/ajtmh.1998.59.171 PMID: 9684648
  24. Harandi MF, Hobbs RP, Adams PJ, Mobedi I, Morgan-Ryan UM, Thompson RC. Molecular and morphological characterization of Echinococcus granulosus of human and animal origin in Iran. Parasitol. 2002;125(4):367-73. doi: 10.1017/s0031182002002172 PMID: 12403325
  25. Shahnazi M, Hejazi H, Salehi M, Andalib AR. Molecular characterization of human and animal Echinococcus granulosus isolates in Isfahan, Iran. Act Trop. 2011;117:47-50. doi: 10.1016/j.actatropica.2010.09.002 PMID: 20858453
  26. Sharbatkhori M, Fasihi Harandi M, Mirhendi H, Hajialilo E, Kia EB. Sequence analysis of cox1 and nad1 genes in Echinococcus granulosus G3 genotype in camels (Camelus dromedarius) from central Iran. Parasitol Res. 2011;108:521-7. doi: 10.1007/s00436-010-2092-7 PMID: 20922418
  27. Hajialilo E, Harandi MF, Sharbatkhori M, Mirhendi H, Rostami S. Genetic characterization of Echinococcus granulosus in camels, cattle and sheep from the south-east of Iran indicates the presence of the G3 genotype. J Helminthol. 2012;86(3):263-70. doi: 10.1017/S0022149X11000320 PMID: 21749740
  28. Fallahizadeh S, Arjmand R, Jelowdar A, Rafiei A, Kazemi F. Determination of genotypes in livestock slaughtered in Shush County, Southwest Iran using PCR-RFLP. Helminthol. 2019;56(3):196-201. doi: 10.2478/helm-2019-0023 PMID: 31662691
  29. Hedayati Z, Daryani A, Sarvi S, Gholami S, Sharif M, Pirestani M, et al. Molecular genotyping of the human cystic echinococcosis in Mazandaran Province, North of Iran. Iran J Parasitol. 2019;14(1):151-158.
  30. Shahbazi AE, Saidijam M, Maghsood AH, Matini M, Haghi MM, Fallah M. Genotyping of fresh and Parafinized human hydatid cysts using nad1 and cox1 genes in Hamadan Province, west of Iran. Iran J Parasitol. 2020;15(2):259-265. PMID: 32595717
  31. Arabloo S, Johkool MG, Mohammadi MA, Mohammadzadeh A, Mohammadi D, Harandi MF, et al. Genetic profile of Echinococcus granulosus isolated from the livestock and human in northwest Iran. J Parasit Dis. 2025;49(1):142-8. doi: 10.1007/s12639-024-01738-3 PMID: 39975620
  32. Utuk AE, Simsekb S, Koroglub E, McManus DP. Molecular genetic characterization of different isolates of Echinococcus granulosus in east and southeast regions of Turky. Acta Trop. 2008;107:192-4. doi: 10.1016/j.actatropica.2008.05.026 PMID: 18579101
  33. Andresiuk M, Ponce gordo F, Elissondo C. Echinococcus granulosus: biological comparison of cattle isolates from endemic regions of Argentina and Spain. Rev Asoc Argent Microbiol. 2009;41:218-225.
  34. Dinkel A, Njoroge EM, Zimmermann A, Wälz M, Zeyhle E, Elmahdi IE, et al. A PCR system for detection of species and genotypes of the Echinococcus granulosus-complex, with reference to the epidemiological situation in eastern Africa. Int J Parasitol. 2004;34(5):645-53. doi: 10.1016/j.ijpara.2003.12.013 PMID: 15064129
  35. Busi M, Šnábel V, Varcasia A, Garippa G, Perrone V, De Liberato C, D’Amelio S. Genetic variation within and between G1 and G3 genotypes of Echinococcus granulosus in Italy revealed by multilocus DNA sequencing. Vet Parasitol. 2007;150(1-2):75-83. doi: 10.1016/j.vetpar.2007.09.003 PMID: 17951008
  36. Vural G, Baca A.U, Gauci C.G, Bagci O, Gicik Y, Lightowlers  Variability in the Echinococcus granulosus cytochrome C oxidase1 mitochondrial gene sequence from livestock in Turkey and a re-appraisal of the G1–3 genotype cluster. Vet Parasitol. 2008;154,347–350. doi: 10.1016/j.vetpar.2008.03.020 PMID: 18485601
  37. M’Rad S, Filisetti D, Oudni-M’rad M, Mekki M, Belguith M, Nouri A, et al. Molecular evidence of ovine (G1) and camel (G6) strains of
مجله تحقیقات دامپزشکی (Journal of Veterinary Research)
دوره 81، شماره 1
فروردین 1405
صفحه 1-11

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار