طراحی و تولید رده»‌ سلولی بیان کننده ِ ژن‌های‌UTR’ 5 و ‌3NS از عامل اسهال ویروسی گاوها ‌(BVDV)‌ به منظور ارزیابی کارآیی روش‌های درمانی علیه این ویروس

نویسندگان

1 گروه میکروبیولوژی و ایمونولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، تهران– ایران

2 گروه میکروبیولوژی و ایمونولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، تهران- ایران

3 گروه زیست فناوری دام و آبزیان، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری ایران، تهران– ایران

4 گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهرکرد، شهرکرد– ایران

چکیده

زمینه مطالعه:‌ ‌عامل مولد اسهال ویروسی گاو ‌(BVDV)‌ عامل مضرات اقتصادی، بهداشتی قابل توجهی در مزارع پرورش گاو است. به دلیل ناکارآمدی نسبی برنامه‌های ریشه کنی این ویروس، در سال‌های اخیر برای مبارزه با  آن تدابیر متعدد ضد ویروسی نظیر ژن درمانی به فراوانی به کار گرفته شده است. یکی از روش‌های ارزیابی کیفیت این تدابیر، استفاده از این ابزارهای ضد ویروسی در رده‌های سلولی اختصاصی بیان کننده آن ژن از طریق القای بیان ژن توسط پلاسمید حامل یا عفونت با وکتورهای ویروسی است. هدف:‌ ‌این مطالعه با هدف تهیه یک رده ی سلولی بسیار بیان کننده بخشی از ژنوم ‌BVDV‌ برای ارزیابی کارآمدی روش‌های درمانی و پیشگیرانه علیه این ویروس انجام شد. روش کار:‌ ‌بدین منظور پس از کشت سویه  استاندارد ‌NADL‌ از ‌BVDV‌ و استخراج ‌vRNA‌، افزوده سازی ژن‌های کد کننده 'UTR5‌ و ‌3NS‌ از ژنوم این ویروس و سپس کلونینگ این قـطعـات ژنـی در پلاسمیـد لنتـی ویروسی ‌ pWPI- linker B‌ در فرادست ژن ‌GFP‌ انجام شد. پس از تأیید کلونینگ، لنتی وکتور‌های حاوی 3BVDV- NS‌ و ‌'UTR5 BVDV-‌ در سلول‌های ‌T293‌ با استفاده از سیستم ‌packaging‌ نسل سوم تولید شدند. در مرحله بعد سلول‌های ‌MDBK‌ بیان کننده دائمی ‌'UTR5‌ و ‌3NS‌ با استفاده از عفونت با لنتی ویروس‌های بیان کننده 3BVDV- NS‌ و ‌'UTR5 BVDV-‌ تولید گردیدند. نتایج:‌ ‌کارآمدی عفونت با لنتی وکتورهای حامل ترانس ژن با آزمون‌های مشاهده مستقیم با میکروسکوپ فلورسنت، وسترن بلاتینگ و ‌RT-PCR‌ بررسی و با گروه کنترل مقایسه گردید و حضور و بیان ژن‌های مورد نظر تأیید شد. نتیجه‌گیری‌نهایی:‌ نتایج نشان دهنده تولید موفقیت آمیز رده ی سلولی ‌MDBK‌ بسیار بیان کننده این دو ژن از ‌BVDV‌ بود و لنتی وکتورها به دلیل بیان طولانی مدت و پایدار ژن تا چندین نسل سلولی و امکان عفونی نمودن بسیاری از رده‌های سلولی نسبت به سایر وکتورهای ویروسی ارجحیت دارند.
 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Design and production of a cell line expressing 5|'UTR and NS3 genes of bovine viral diarrhea virus (BVDV) in order to evaluate the efficacy of treatments against this virus

نویسندگان [English]

  • Azam Mokhtari 1
  • Omid Madadgar 2
  • Mohammad Massumi 3
  • Mohammad Reza Mahzounieh 4
  • Arash Ghalyanchi langeroudi 4
1 Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran-Iran
2 Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran-Iran
3 Department of Stem Cells, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran-Iran
4 Department of pathobiology, Faculty of veterinary medicine, University of Shahrekord, Shahrekord- Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Bovine viral diarrhea virus (BVDV) causes significant economic and health effects in cattle farms. Because of the relative inefficiency of BVDV eradication programs, in recent years, numerous strategies such as anti-viral gene therapy has been used extensively to fight it. One of the ways to evaluate the quality of these anti-viral strategies is the study of their efficacy in the specific cell lines expressing those viral genes through the induction of gene expression by transfection of plasmids or infection of viral vectors. OBJECTIVES: This study was performed for preparation of a cell line expressing some portions of BVDV genome to evaluate the efficacy of preventive and therapeutic strategies against this virus. METHODS: After the culture of BVDV NADL, vRNA was extracted and proliferation of 5'UTR and NS3-coding genes and cloning of these gene segments was performed in the upstream of GFP gene in pWPI-linker B lentivirus plasmid. After confirmation of cloning, lentiviral vector containing BVDV-NS3 and BVDV-5'UTR were generated in 293T cells using third-generation packaging system. Then MDBK cells persistently express 5'UTR and NS3 were generated by the infection with lentiviral vectors containing BVDV-NS3 and BVDV-5'UTR. RESULTS: The efficacy of infection with lentiviral vectors carrying transgenes, examined by fluorescence microscopy, Western blotting and RT-PCR tests, were compared with control groups and the presence and expression of the above mentioned genes were confirmed. CONCLUSIONS: The results indicate that the successful production of a MDBK cell line expressing both genes of BVDV and lentiviral vectors are preferred to the others for their persistent and long-term gene expression in several cell generations and the ability to infect many different cell lines.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • BVDV
  • infection
  • lentiviral vector
  • MDBK
  • transfection

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار