تأثیر افزودن بذر، عصاره و گیاه خارمریم بر فراسنجههای خونی و پاسخ ایمنی جوجه های گوشتی تغذیه شده با جیره آلوده به آفلاتوکسین

بیش از 300 نوع مایکوتوکسین مختلف تا به حال شناسایی شد‌ه‌اند که سمومی نظیر تریکوتسین‌ها، زیرالنون، اکراتوکسین‌ها، فومونیزون و آفلاتوکسین‌ها مورد توجه ویژ‌ه‌ای هستند. بر اساس گزارشات IARC (آژانس بین المللی تحقیقات بر روی سرطان)، آفلاتوکسین‌ها موادی با پتانسیل سرطان‌زایی بالا می‌باشند. آفلاتوکسیکوزیس یا بیماری ناشی از مصرف آفلاتوکسین عمدتاًً به شکل مزمن در طیور بروز می‌نماید و از مهمترین علائم آن می‌توان به کاهش وزن بدن، نامناسب شدن ضریب ‌تبدیل خوراک، کاهش تولید تخم‌مرغ، افزایش حساسیت به بیماری‌های عفونی و در نهایت کاهش بهره‌وری واحد تولیدی اشاره کرد  (6،7،13،18). به منظور حذف این قبیل اثرات نامطلوب در جوجه‌های گوشتی، روش‌های مختلفی به کارگرفته می‌شود. یکی از راهکارهای مؤثر و کاربردی استفاده‌ از گیاهان دارویی از جمله گیاه خارمریم در تغذیه جوجه‌های گوشتی است (2،9).

گیاه خارمریم (Milk thistle) با نام علمی (Silybum marianum) از تیره کاسنیان است. ترکیبات اصلی گیاه را مخلوطی از فلاونولیگنان‌ها، با نام کلی سیلی‌مارین (C25H22O10) تشکیل می‌دهد. سیلی‌مارین به عنوان آنتی‌اکسیدان و محافظ کبد شناخته شده است (16). بین ترکیب‌های سازنده سیلی‌مارین، مقدار سیلی‌دیانین در ساقه گیاه بیشتر است؛ در صورتی که مقدار سایر ترکیبات در بذر بیشتر هستند (11). سیلی‌مارین باعث کاهش اثرات منفی آفلاتوکسین‌B1 بر مصرف خوراک، وزن بدن، وزن اندام‌های داخلی و مورفولوژی کبد در جوجه‌های گوشتی می‌گردد (9). افزودن ppm 600 ترکیب فسفولیپید سیلی‌مارین به جیره آلوده به ppm 8/0 آفلاتوکسینB1 سبب پوشاندن اثرات منفی آفلاتوکسینB1 بر وزن بدن و مصرف خوراکرجوجه‌های گوشتی گردید (18). جیره‌های آلوده به ppm 250 و 500 آفلاتوکسینB1، سبب بروز علائم غیر طبیعی مانند بزرگ، زرد و شکننده شدن کبد جوجه‌های گوشتی گردید، مطالعات نشان داد استفاده از سطوح 5/0 و 1% پودر بذر خارمریم در جیره‌های آلوده سبب شرایط طبیعی در کبد شد (9). کاهش معنی‌دار غلظت آنزیم آسپارت آمینوترانسفراز در جوجه‌های گوشتی تغذیه شده با جیره آلوده در ترکیب با پودر بذر خارمریم گزارش شده است (2).

هدف از این تحقیق مقایسه پودر بذر، پودر و عصاره گیاه کامل خارمریم در مهار اثرات منفی آفلاتوکسین بر فراسنجه‌های خونی و پاسخ ایمنی جوجه‌های گوشتی می‌باشد. استفاده از پودر گیاه خارمریم در مقایسه با پودر بذر که دارای مصارف انسانی است از نظر جنبه‌های اقتصادی می‌تواند قابل توصیه باشد.

مواد و روش کار

ایـن آزمـایش با استفاده از 192 قطعـه جوجـه خروس گوشـتی یک روزه سـویه راس 308 در قالب طرح کاملاً تـصادفی بـا شش تیمـار، چهار تکرار و هشت قطعه جوجه در هر تکرار در سالن تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه بیرجند در سال 1395 اجرا شد. تیمارهای آزمایشی عبارت بودند از: 1) تیمار شاهد سالم، 2) شاهد آلوده به آفلاتوکسین، 3) شاهد آلوده + 5/0% پودر بذر خارمریم (پروتئین خام 39/17 و انرژی خام 5312 کیلوکالری در کیلوگرم)، 4) شاهد آلوده + 1% پودر گیاه خارمریم (پروتئین خام 46/6 و انرژی خام 39/2774 کیلوکالری در کیلوگرم)، 5) شاهد آلوده +  ppm 600  عصاره گیاه خارمریم، 6) شاهد آلوده + ppm 1000 عصاره گیاه خارمریم. جیره پایه بر اساس آنالیز ترکیب شیمیایی مواد خوراکی انجمن ملی تحقیقات و با استفاده از نـرم‌افـزار UFFDA برای دوره آغازین، رشد و پایانی تنظیم شد (جدول 1). در مدت انجام آزمایش، جوجه‌ها به آب و خوراک دسترسی آزاد داشتند. در پایان دوره‌ی آزمایش (35 روزگی)، از هر واحد آزمایشی یک قطعه جوجه بصورت تصادفی انتخاب و از ورید وداج در هنگام ذبح خونگیری شد. نمونه‌های خون درون لوله‌های دارای ماده‌ی ضد انعقاد اتیلن‌دی‌آمین‌تترا‌استیک‌اسید ریخته شده، سپس با دور 3000 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ گردیدند. نمونه‌های پلاسما جدا شده و تا زمان انجام آزمایشات در دمای C° 20- نگهداری شدند. غلظت کلسترول (CHOL)، تری‌گلیسرید (TG)، لیپوپروتئین‌های با چگالی بالا (HDL)، آلکالین‌فسفاتاز (ALP)، لاکتات‌دی-هیدروژناز (LDH)، آسپارتات‌آمینو‌ترانسفراز (AST) و آلانین‌آمینو‌ترانسفراز (ALT) توسط کیت‌های شرکت پارس آزمون، بر پایه‌ی روش-های استاندارد آزمایشگاهی و توسط دستگاه اتوآنالایزر جسان ایتالیا مدل 200 (Chem. Gesan 200–Made in Italy) اندازه‌گیری شد. همچنین غلظت لیپوپروتئین‌های با چگالی پایین (LDL) با استفاده از رابطه زیر و نسبت HDL/کلسترول و LDL/HDL نیز محاسبه شد.

LDL = TC - [HDL + TG/5]                 

به منظور بررسی ایمنوگلوبین‌‌های خون جوجه‌های مورد آزمایش از تست عیار پادتن بر ضد گلبول قرمز گوسفندی (SRBC) استفاده شد. برای انجام این مرحله از تست SRBC، از گوسفند خونگیری شد و خون گوسفند به لوله آزمایش حاوی ماده ضد انعقاد اضافه گردید. لوله آزمایش به مدت 10 دقیقه و با دور 3000 سانتریفیوژ شد و پلاسما جدا و چندین بار با سرم فیزیولوژی نمونه خون را شسته تا گلبول‌های قرمز جدا شدند و SRBC تهیه گردید. سپس SRBC 5 ٪ در 16 روزگی و SRBC 10 ٪ در 30 روزگی به میزان یک سی‌سی به 2 قطعه جوجه از هر تکرار از طریق ورید بال تزریق شد. در فاصله 5 روز پس از هر تزریق از جوجه‌ها خونگیری به عمل آمد. خون گرفته شده از هر قطعه به لوله آزمایش اضافه گردید. پلاسما خون هر نمونه بعد از سانتریفویوژ به مدت 10 دقیقه در دور 3000 جدا شد و نمونه‌های پلاسما تا زمان انجام مراحل آزمایشگاهی تست SRBC در دمای C° 20- نگهداری شدند.

مراحل آزمایشگاهی بدین صورت بود که ابتدا میکروتیوب‌های پلاسما از فریزر خارج شد و به مدت نیم تا یک ساعت در دمای C° 55 قرار گرفت تا پلاسماها از حالت یخ‌زده خارج شدند. سپس بوسیله سمپلر میزان µl 50  بافر در داخل چاهک‌های پلیت آزمایشگاهی ریخته شد. بعد از پر کردن همه چاهک‌ها عمل رقیق‌سازی با µl 50 پلاسما صورت گرفت. در ادامه داخل همه چاهک‌ها µl 50، SRBC یک درصد ریخته شد تا حجم همه چاهک‌ها به ml 100 رسید. بعد از قرار دادن پلیت‌ها به مدت دو ساعت در دمای C° 37 و تشکیل لخته خونی عمل قرائت انجام داده شد. دکمه‌ها یا لخته‌های ایجاد شده حاکی از رسوب SRBC است، که نشان دهنده ترکیب پادتن با SRBC می‌باشد. دکمه‌ها برای هر تکرار شمارش و یادداشت شد. در طی این مراحل مقدار SRBC اندازگیری شد.

برای اندازه‌گیری ایمنوگلوبولین‌های  M، مراحل قبلی انجام شد با این تفاوت که به جای بافر، µl 50 مرکاپتواتانول یک درصد ریخته شد. مشابه مرحله قبل بعد از دو ساعت قرار دادن رک‌ها در دمای C° 37 دکمه‌ها شمارش شدند.

ایمنوگلوبولین‌های G با توجه به فرمول‌های زیر محاسبه شدند (1).

SRBC = ImM + ImG

ImG = SRBC -  ImM

تولید آفلاتوکسین‌ به روش Shotwell انجام گرفت (17). قارچ آسپرژیلوس‌پارازیتیکوس (سویه NRRL 2999) در محیط کشت عصاره سیب‌زمینی دکستروز آگار (PDA) تکثیر شد و به محیط کشت جدید (برنج) منتقل گردید. کشت‌های قارچی آماده شده به مدت هفت روز در دمای C° 28 انکوباسیون شدند. برای انتقال قارچ به برنج در هر فلاسک ارلن‌مایر (cc 250) g 25 برنج و حدود cc 14 آب مقطر ریخته شد. درب فلاسک‌ها توسط پنبه بسته شدند و روی آن فویل آلومنیومی قرار گرفت و به مدت یک ساعت نگهداری شدند. فلاسک‌ها در دمای C° 121 و به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شدند. پس از سرد شدن برنج‌های اتوکلاو شده، قسمتی از محیط کشت قارچ آسپرژیلوس‌‌پارازیتیکوس درون پتری‌دیش به فلاسک‌ حاوی برنج اضافه شد. درب فلاسک بسته و محتویاتش را تکان داده تا همه دانه‌های برنج به خوبی از یکدیگر جدا شوند و تمامی دانه‌های برنج با قارچ آسپرژیلوس‌‌پارازیتیکوس آلوده گردند. در پایان فلاسک‌ها به مدت هفت روز انکوباسیون شدند. در این مدت به منظور جلوگیری از چسبندگی دانه‌های برنج فلاسک‌ها را با رعایت احتیاط روزانه به شدت تکان داده تا تمامی دانه‌های برنج از هم جدا شوند. فلاسک‌های حاوی برنج آلوده به قارچ آسپرژیلوس-پارازیتیکوس پس از هفت روز در دمای C° 121 به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شدند. برنج‌ها در ظرفی تخلیه و در محیطی استریل و بدور از نور خورشید قرار داده شدند تا خشک شده و سپس آسیاب شدند. میزان آفلاتوکسین‌B1 تولید شده از طریق ارسال نمونه به آزمایشگاه تستا مشهد به روش کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) اندازه‌گیری شد. سپس برنج‌های آسیاب شده به مقدار لازم برای تأمین سطح مورد نیاز آفلاتوکسینB1 تیمارها (ppb 500) به جیره پایه اضافه شد (13).

به منظور عصاره‌گیری، گیاه خارمریم از مزرعه آموزشی محمدیه بیرجند از قسمت‌های بالای ریشه در اوایل تیر ماه جمع‌آوری شد و سپس در تاریکی و دمای اتاق خشک و آسیاب گردید. عصاره‌گیری بصورت هیدروالکلی از طریق روش خیساندن با نسبت الکل و آب 70 به 30 انجام شد. با توجه به گزارشات، استخراج ماده مؤثره سیلی‌مارین در عصاره‌گیری با الکل متانول نسبت به دیگر حلال‌ها بیشتر بوده به همین دلیل از متانول به عنوان حلال جهت عصاره‌گیری استفاده گردید (8). نمونه گیاه با نسبت g 1 به cc 5  با حلال خیسانده و به مدت 48 ساعت در داخل همزن قرار داده شد. پس از گذشت مدت زمان مشخص محلول مورد نظر را با کاغذ صافی شماره یک صاف کرده، سپس محلول صاف شده توسط دستگاه تقطیر در خلاء (روتاری) در دمای C° 60 و سرعت چرخش 70 دور در دقیقه غلیظ شد. نمونه غلیظ شده در پلیت‌های شیشه‌ای ریخته و به مدت دو روز در آون با دمای C° 40 قرار داده شد. بعد از حذف حلال، نمونه‌ها از سطح پلیت تراشیده شد و در یخچال در دمای C° 4 تا زمان استفاده در جیره نگهداری گردید. برای آماده سازی پودر بذر خار مریم، بذر خارمریم آسیاب شده و میزان انرژی خام و پروتئین خام به ترتیب با بمب‌کالریمتر و کلدال اندازه‌گیری شد (پروتئین خام 39/17 و انرژی خام 5312 کیلوکالری در کیلوگرم)، و سپس در سطح مورد آزمایش بکار گرفته شد. گیاه خارمریم به مقدار کافی جمع‌آوری شد و در تاریکی و دمای اتاق خشک و آسیاب گردید و میزان انرژی خام و پروتئین خام اندازه‌گیری شد (پروتئین خام 46/6 و انرژی خام 39/2774 کیلوکالری در کیلوگرم)، سپس پودر گیاه خارمریم در سطح مورد آزمایش در جیره آزمایشی بکار گرفته شد.

مدل آماری استفاده شده جهت آنالیز داده‏های بصورت رابطه 1 بود.

Yij = µ + Ti + εij               (1)     

در این رابطه، Yij مقدار مشاهده شده، µ میانگین جامعه، Ti اثر هر تیمار و εij اثر خطای آزمایش است.

آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شد و داده‌های حاصل از آن با استفاده از نرم‌افزار آماری SAS (نسخه 1/9) و با رویه‌ GLM مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. برای مقایسه میانگین‌ تیمارها نیز از آزمون توکی در سطح احتمال معنی‌داری 05/0 استفاده شد.

نتایج

  جدول 2 اثر تیمارهای مختلف آزمایشی بر غلظت پلاسمایی فراسنجه‌های خونی تری‌گلیسرید، کلسترول، لیپوپروتئین‌های با چگالی بالا، لیپوپروتئین‌های با چگالی پایین، آلکالین فسفاتاز، لاکتات‌دی‌هیدروژناز، آسپارتات‌آمینو ترانسفراز و آلانین‌آمینو‌ترانسفراز جوجه‌های گوشتی در پایان دوره آزمایشی (35 روزگی) نشان می‌دهد. نتایج آنالیز آماری نشان داد که تیمارهای آزمایشی اثر معنی‌داری بر CHOL، HDL، LDL، ALP، LDH و AST خون جوجه‌های گوشتی نداشتند. جیره‌های آلوده حاوی سطوح ppm 600 و 1000 عصاره گیاه خارمریم نسبت به جیره شاهد سالم از نظر غلظت پلاسمایی تری‌گلیسرید خون افزایش معنی‌دار نشان دادند (05/0≥P). تیمار شاهد آلوده موجب افزایش معنی‌دار غلظت پلاسمایی ALT در مقایسه با تیمار شاهد سالم گردید(05/0≥P). افزودن 5/0%  پودر بذر خارمریم، 1% پودر گیاه خارمریم و ppm 1000 عصاره گیاه خارمریم به جیره آلوده سبب کاهش معنی‌دار غلظت پلاسماییALT  در مقایسه با شاهد آلوده گردید (05/0≥P).

عیار ایمنوگلوبولین‌های M و G و همچنین عیار پادتن علیه چالش SRBC در 35 روزگی جوجه‌های گوشتی در جدول 3 آورده شده است. اثر تیمارهای آزمایشی تنها در عیار پادتن علیه چالش SRBC در 35 روزگی جوجه‌های گوشتی به لحاظ آماری معنی‌دار بود. جیره آلوده حاوی یک درصد پودر خارمریم موجب افزایش معنی‌دار عیار پادتن علیه چالش SRBC در مقایسه با شاهد سالم و شاهد آلوده گردید (05/0≥P).

بحث

 یافته‌ها نشان داد تیمار شاهد آلوده موجب افزایش معنی‌دار غلظت پلاسمایی ALT در مقایسه با تیمار شاهد سالم گردید. در تأیید یافته‌های تحقیق حاضر تغذیه ppb 500 آفلاتوکسینB1 در جوجه‌های گوشتی سبب افزایش معنی‌دار غلظت سرمی آنزیم‌های ALT و AST گردید (2). افزایش فعالیت آنزیم‌های کبدی در نتیجه آسیب کبدی و نشت آنزیم به خون است (3). افزودن 5/0% پودر بذر خارمریم، 1% پودر گیاه خارمریم و ppm 1000 عصاره گیاه خارمریم به جیره آلوده بصورت معنی‌دار غلظت پلاسماییALT  را کاهش داد. کاهش معنی‌دار غلظت پلاسمایی ALT در جیره‌های آلوده‌ی حاوی پودر بذر، عصاره و پودر گیاه خارمریم در مقایسه با جیره‌ی شاهد آلوده می‌تواند به‌دلیل تخفیف اثرات منفی آفلاتوکسین بر تخریب سلول‌های کبدی باشد. سیلی‌مارین به دلیل اینکه یک آنتی‌اکسیدان بسیار قوی است با مهار پراکسیداسیون لیپیدها مخصوصاً در سلول‌های کبدی، اختلالات متابولیسمی این سلول‌ها را مهار می‌کند (19). گروهی دیگر از محققان پیشنهاد می‌کنند که تقویت سیستم‌ایمنی تضعیف شده توسط سیلی‌مارین عامل محافظت کبدی توسط آن می‌باشد، در حقیقت سیلی‌مارین بدون توجه به عوامل ایجاد کننده اختلالات در سلول‌های کبدی، سلول را در برابر هر آسیب نابود کننده حاد یا مزمن محافظت می‌کنند (12). جیره‌های آزمایشی حاوی عصاره و پودر گیاه خارمریم در مقایسه با تیمار حاوی پودر بذر گیاه خارمریم اختلاف آماری معنی‌داری در فراسنجه‌های خونی مورد بررسی نشان ندادند.

بررسی عیار ایمنوگلوبولین‌های M و G و همچنین عیار پادتن علیه چالش SRBC در 35 روزگی جوجه‌های گوشتی نشان داد اختلاف تیمار شاهد سالم و آلوده به لحاظ آماری معنی‌دار نبود اما جیره آلوده به آفلاتوکسین سبب کاهش عددی تیتر آنتی‌بادی علیه چالش SRBC و ایمنوگلوبولین G جوجه‌های گوشتی گردید. بررسی گزارشات محققان در رابطه با اثرات سمی آفلاتوکسین بر ایمنی هومورال نشان داد که براساس غلظت و مدت زمان مصرف آفلاتوکسین ایمنی هومورال می‌تواند کاهش و یا افزایش یابد (20). گزارشات نشان می‌دهد تغذیه جوجه‌های گوشتی از 1 تا 35 روزگی با جیره آلوده به ppm 5 آفلاتوکسین، سبب افزایش تیتر آنتی‌بادی برعلیه بیماری گامبرو شد (15). افزایش سطح آفلاتوکسین جیره مرغان گوشتی هوبارد از صفر تا ppm 5/0 تغییرات معنی‌داری را در تیتر آنتی‌بادی بر علیه بیماری نیوکاسل نشان نداد (10). تغذیه مرغان تخمگذار لگهورن از 128 تا 280 روزگی با جیره آلوده به ppm 2/0 آفلاتوکسین تیتر آنتی‌بادی بر علیه بیماری گامبرو، برونشیت و نیوکاسل را کاهش داد (4). کاهش ایمنوگلوبولین‌ها در آلودگی با سطوح بالا آفلاتوکسین اتفاق می‌افتد (5). غلظت‌های بالای آلودگی جیره به آفلاتوکسین‌ها، سیستم‌ایمنی هومورال را سرکوب کرده و تولید ایمونوگلوبولین‌های را کاهش می‌دهد. با کاهش سطح ایمنی هومورال‌، پرندگان نسبت به بیماری‌ها حساسیت نشان می‌دهند.

جیره آلوده حاوی 1% پودر خارمریم موجب افزایش معنی‌دار عیار پادتن علیه چالش SRBC در مقایسه با شاهد سالم و شاهد آلوده گردید. جیره آلوده حاوی 1% پودر گیاه خارمریم در مقایسه با دیگر جیره‌های آزمایشی به لحاظ عددی دارای بیشترین عیار ایمنوگلوبولین‌های M و G بود. در تأیید یافته‌های تحقیق حاضر Mojahedtalab و همکاران سال 2013 گزارش دادند که مصرف سیلی‌مارین موجب افزایش عیار پادتن علیه چالش SRBC و ایمنوگلوبولین G شده، ولی بر ایمنوگلوبولین M تأثیری نداشت.

نتیجه‌گیری: نتایج بدست آمده از این پژوهش نشان می‌دهد که پودر گیاه خارمریم در بهبود عیار پادتن علیه چالش SRBC و آنزیم‌های کبدی در جیره آلوده اثر مثبت داشت. بنابراین با درنظر گرفتن جنبه‌های اقتصادی می‌توان بیان داشت که استفاده از پودر گیاه خارمریم در مقایسه با پودر بذر خارمریم به منظور کاهش یا حذف عوارض منفی آفلاتوکسین در تغذیه جوجه‌های گوشتی قابل توصیه است.

تشکر و قدردانی

از مسئول آزمایشگاه تغذیه دام دانشکده کشاورزی بیرجند خانم مهندس سمیه یوسفی که نهایت همکاری را با ما در هر چه بهتر انجام شدن این تحقیق داشتند، بی‌نهایت سپاسگزاریم.

تعارض در منافع

بین نویسندگان  هیچ گونه تعارض در منافع  گزارش نشده است.