نوع مقاله : بهداشت مواد غذایی
نویسندگان
1 گروه بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران
2 گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران
3 دانش آموخته دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
BACKGROUND: Staphylococcus aureus is one of the most important pathogenic microorganisms in meat products, especially those that are repeatedly handled by hand in the production process. Beta-lactam drugs, especially new generations of Cephalosporins, are used for treatment of most infections that are caused by Staphylococcus aureus. But the production of beta-lactamase enzyme by some strains has led to the failure for treating the infections that are associated with this organism.
OBJECTIVES: The present study was conducted to evaluate the prevalence and comparison of the antimicrobial effect of methanolic extracts of red pepper and red onion on Staphylococcus aureus with beta-lactamase gene that was isolated from minced meat in Semnan city.
METHODS: For this reason, sampling from 30 distribution and supply centers of packaged meat in Semnan city was performed in hygienic conditions and all of the samples were tested for presence of Staphylococcus aureus with beta-lactamase gene by biochemical methods and molecular confirmation by PCR assay. Also, the antibacterial effect of red pepper and red onion extracts on these isolates was evaluated by minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bacterial concentration (MBC), well distribution and bacterial growth curve tests.
RESULTS: The results showed that 16.6 percent of samples were contaminated with Staphylococcus aureus with beta-lactamase gene. Red pepper and red onion extracts had good antibacterial effects on these isolates and in all the tests, the red pepper extract was more effective than the red onion extract.
CONCLUSIONS: By proving stronger antimicrobial effect of red pepper, it is recommended to use pepper in sufficient amounts along with onion in foods that are made from minced meat like all kinds of Kebab.
کلیدواژه‌ها [English]
در طول دهه گذشته وقوع بیماریهای میکروبی ناشی از مواد غذایی نه تنها در کشورهای در حال توسعه دارای فقر بهداشتی، بلکه در کشورهای توسعه یافته با استاندارد بالای بهداشتی نیز رو به افزایش بوده است (17).
یکی از مهمترین میکروارگانیسمهای بیماریزا (پاتوژن) در فرآوردههای گوشتی به ویژه آن‌هایی که طی تولید مکررا با دست تماس دارند، استافیلوکوکوس اورئوس (عامل مسمومیت غذایی استافیلوکوکال) میباشد و در حال حاضر سلامت عمومی را در سراسر جهان به خطر انداخته است. در انسان، این باکتری در قسمت قدامی بینی بزرگسالان وجود دارد و در 20 تا 30 درصد از جمعیت انسانی به صورت دائم و پایدار و در 60 درصد افراد به صورت متناوب دیده میشود. لذا افرادی که در مراکز تهیه، عملآوری و توزیع غذا فعالیت دارند، در صورت عدم رعایت مسائل بهداشتی قادرند باکتری را به غذا انتقال دهند (5).
باکتری استافیلوکوکوس اورئوس دارای توکسینهای مختلفی مانند لوکوسیدین، همولیزین و انتروتوکسین است، که در بیماریهای غذازاد، انتروتوکسین از اهمیت زیادی برخوردار بوده و مصرف مواد غذایی آلوده به این توکسین موجب بروز مسمومیت غذایی میگردد (4). از دلایل شیوع بالای مسمومیت استافیلوکوکی میتوان به وجود باکتری در پوست و مخاط کارکنان، مقاومت و رشد باکتری در محیط‌های قندی نمکی و از همه مهمتر تولید انتروتوکسین مقاوم به حرارت اشاره کرد (18، 15).
برای درمان اغلب عفونتهای ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس از داروهای بتالاکتام به خصوص نسلهای جدید سفالوسپورینها استفاده میشود، اما افزایش سریع مقاومت به این داروها موجب ناموفق بودن درمان عفونتهای وابسته به این ارگانیسم شده است. اصلیترین مکانیسم مقاومت به داروهای بتالاکتام در استافیلوکوکوسها تولید آنزیمهای بتالاکتاماز و یا تغییر پروتئینهای دیواره (Penicillin Binding Proteins, PBPs) میباشد که تمایل کاهشیافته آن‌ها به دارو منجر به مقاومت وسیعی نسبت به پنی‌سیلینهای نیمه سنتزی، سفالوسپورینها و کارباپنمها میشود. بتالاکتامازها به طور انتخابی حلقه بتالاکتام را باز میکنند به نحوی که ساختار تغییریافته دارو نمیتواند اتصال موثری با PBSها برقرار نماید و در نتیجه سنتز سلولی ادامه مییابد (22) همبستگی بین مقاومت به پنیسیلین در ایزولههای بالینی استافیلوکوکوس اورئوس و تولید بتالاکتاماز، اولین بار در سال 1944 گزارش شد. طبق آمار، سویههای مقاوم باکتری از میزان 5 درصد در سال 1946، به 50 درصد در سال 1950 و به بیش از 90 درصد تا سال 2000، رسیده است (7).
دو مکانیسم مقاومت اولیه در برابر بتالاکتامها در گونه‌های استافیلوکوکوس قابل توجه است: بیان آنزیمهای بتالاکتاماز کدگذاری شده توسط ژن blaZ و تولید پروتئینهای اتصال دهنده پنیسیلین 2a که توسط ژن MecA کدگذاری شده است. شیوع مقاومت پنیسیلین در بیماریهای جانوری ناشی از استافیلوکوکوس اغلب به دلیل ژن blaZ است. ژن blaZ بخشی از اپران سه قسمتی bla است. اپران bla شامل blaZ، blaI و blaR1 است (10).
تستهای مختلفی برای ارزیابی محصولات بتالاکتاماز در استافیلوکوکوسها میتواند انجام شود. یک روش کیفی برای جداسازی بتالاکتاماز، استفاده از دیسکهای Nitrocefin است. در این روش از سوسپانسیونهای باکتریایی در سرم فیزیولوژی بر روی این دیسکها استفاده میشود و تغییر رنگ دیسک مورد بررسی قرار میگیرد. یک روش دیگر، استفاده از تست میکروبیولوژیک clover leaf است. در این تست، بر روی محیط آگار مولر هینتون، یک سویه آکسفورد استافیلوکوکوس اورئوس، به عنوان شاخص، و از دیسکهای حاوی یک میکروگرم بنزیل پنیسیلین استفاده میشود (23).
با توجه به اینکه این تستهای فنوتیپی حساسیت کمتر از 72 درصد دارند، ردیابی blaZ با استفاده از روش PCR، به عنوان gold standard توصیه میشود (10).
نتایج مطالعات انجام شده بر روی آلودگی باکتریایی غذاهای مصرفی در برخی از دانشگاهها نشان داد که کبابکوبیده و ماهی از نظر شمارش کلی باکتریها آلودهترین نوع غذاها بودهاند و 6/55 درصد نمونهها دارای آلودگی استافیلوکوکوس اورئوس بودهاند و همچنین آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس فقط در نمونههای مربوط به کبابکوبیده وجود داشته است (26).
از زمان کشف داروهای شیمیایی و ترکیبات ضد میکروبی، گرچه کنترل عفونتهای غذایی امکانپذیر گردیده، ولی با این همه، برخی باکتریها به ترکیبات فوق مقاوم هستند و علاوه بر این نگرانی‌هایی در خصوص ایمنی و پتانسیل اثر افزودنیهای مصنوعی و عوارض جانبی نگهدارندههای شیمیایی بر سلامت مصرفکنندگان مطرح شده که معطوف شدن توجهات به بحث جایگزینی آن‌ها با ترکیبات ضد میکروبی طبیعی را در پی داشته است. در این میان، توجه تولیدکنندگان و مصرفکنندگان به استفاده از ترکیبات گیاهی معطوف شده که خواص ضد میکروبی ترکیبات فوق، مورد مطالعه قرار گرفته و اثرشان علیه طیف وسیعی از باکتریها، مخمرها و قارچها به اثبات رسیده است (19).
پیاز و فلفل از مهمترین و پرکاربردترین افزودنیهای گیاهی در مواد غذایی تهیه شده از گوشت چرخ کرده مانند کباب کوبیده میباشند. پیاز نوعی گیاه غدهای گوشتی زیر زمینی از خانواده لاله با نام علمی Allium cepa است. پیاز دارای بخش هوایی و بخش ریشه خوراکی است. بو و مزه پیاز مربوط به ترکیب محیط و ژنتیک آن است. بوی پیاز مربوط به مواد گوگردی فراری است که در هنگام تقطیر در حرارت معمولی اتاق تجزیه میگردند. فلاوونوئیدهای پیاز ترکیبات شیمیایی هستند که در برابر میکروارگانیسمها فعال میشوند و در محیط آزمایشگاه، در برابر رشد میکروارگانیسمها اثر آنتی باکتریال از خود نشان میدهند (31).
فلفل قرمز از جمله گیاهانی است که در طب سنتی در درمان عفونتهای چرکی استفاده میشوند. فلفل گیاهی است علفی و دارای ساقه بی کرک که از تیره Piperaceae است. برخی از ترکیبات ضد میکروبی استخراج شده از آن عبارتند از: کاپسانتین، ترپینر، بتاپینن، آلفاپینن، لینالئول و ترپینئول (33).
بنابراین تحقیق حاضر با هدف بررسی و مقایسه اثر ضد میکروبی عصارههای متانولی فلفلقرمز و پیازقرمز بر استافیلوکوکوس اورئوس واجد ژن بتالاکتاماز جدا شده از گوشت چرخکرده، انجام شد.
تهیه عصاره الکلی: پس از تهیه میوه فلفلقرمز و پیازقرمز از فروشگاههای محلی و شناسایی دقیق آن ناخالصیهای احتمالی موجود جدا گردید، قسمتهای خوراکی گیاه خرد و در سایه خشک گردید و پس از آسیاب کردن بصورت پودر درآمد و سپس با نسبت 1 به 5 با متانول 70 درصد در آب مقطر (v/v) به صورت سوسپانسیون درآورده شدند و در محیط آزمایشگاه نگه داشته شدند و پس از 24 ساعت مخلوط حلال و گیاه از هم جدا شدند و به وسیله کاغذهای صافی بزرگ (واتمن شماره 41) و کوچک (واتمن شماره 1)، فیلتراسیون دقیق انجام شد تا عصاره خالص حاصل شود. عصاره خالص در دستگاه تبخیر کننده دوار تحت خلا (روتاری) ( ساخت آلمان، شرکت IKA) قرار گرفت و در دمای 45 درجه سانتیگراد حلال آن به مدت 1 ساعت به آرامی تبخیر و عصاره غلیظ شده به دست آمد (20).
نمونهبرداری و جداسازی استافیلوکوکوس: نمونهبرداری از 30 مرکز توزیع و عرضه گوشت بستهبندی شده در شهر سمنان تحت شرایط بهداشتی و به صورت کاملاً تصادفی انجام شد و نمونهها در بسته‌های 500 گرمی در کنار یخ به آزمایشگاه بهداشت مواد غذایی منتقل شدند. برای جداسازی استافیلوکوکوس اورئوس ابتدا 25 گرم از نمونه به 225 سیسی پپتون واتر بعنوان غنی کننده اولیه افزوده شد و پس از مخلوط کردن کامل، 24 ساعت در 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شد. 1/0 سی سی از هر نمونه در محیط کشت اختصاصی استافیلوکوکوس اورئوس (آگار برد پارکر) کشت داده شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری گردید (30). تایید بیوشیمیایی کلنیهای سیاه با هاله شفاف اطرافی به وسیله آزمونهای تولید کواگولاز و نوکلئاز مقاوم به حرارت و کاتالاز صورت گرفت (2). پس از تایید بیوشیمیایی کلنیهای استافیلوکوکوس اورئوس با روش PCR از نظر جنس و گونه و حضور ژن بتالاکتاماز مورد بررسی و تایید قرار گرفتند. جدایههای تایید شده به مدت 18 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد در محیط آبگوشت قلب و مغز (BHI) کشت داده شد. سپس کشت مجدد از کشت اول داده شد و به مدت 18 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری شد. از کشت دوم برای تهیه استوک به نسبت 1 به 5 با گلیسرین استریل مخلوط و در حجمهای 100 میکرولیتری در لولههای اپندورف استریل در 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد (16).
استخراج اسیدهای نوکلئیک:جهت استخراج DNA از جدایههای ذخیره شده S. aureusابتدا نمونهها از یخچال خارج شده و بمدت 24 ساعت در محیط لوریا برتانی آگار (LB) در دمای 37 درجه سانتیگراد کشت شدند. سپس از پرگنههای رشد یافته برداشت کرده و به میکروتیوبهای حاوی 25 میکرولیتر NaOH نیم نرمال افزوده شد تا شیرابه‌ای یکنواخت بدست آید. پس از گذشت 30 دقیقه، 25 میکرولیتر تریس یک مولار به سوسپانسیون فوق اضافه گردید تا عمل هضم باکتریها توسط سود متوقف شده و محلولی با pH نهایی 5/7 تهیه شود. بلافاصله با افزودن 450 میکرولیتر آب مقطر استریل به مجموعه حجم محلول به 500 میکرولیتر رسیده و رقت نهایی از عصاره DNA جهت انجام آزمون PCR تهیه گردید.
انجام آزمون PCR جهت تایید مولکولی S. aureus و ردیابی ژنblaZ : پس از انجام مراحل استخراج DNA از سوشهای استافیلوکوکوس آرئوس مورد مطالعه، واکنش زنجیرهای پلی مراز مطابق پروتکل ارائه شده توسط Trung و همکاران در سال 2015 با استفاده از یک جفت پرایمر اختصاصی توالی 16SrRNA گونه S.aureus، و جهت ردیابی ژن بتالاکتاماز blaZ از پرایمرها و پروتکل ارائه شده توسط Haveri و همکاران در سال 2005 درون دستگاه ترموسایکلر XP (BIOER tech. China) در 35 سیکل و تحت شرایط دمایی زیر انجام شد: دناتوراسیون اولیه 3 دقیقه در 94 درجه سانتیگراد ، دناتوراسیون 1 دقیقه در 94 درجه سانتیگراد، اتصال 40 ثانیه در 3/57 درجه سانتیگراد، طویلسازی 40 ثانیه در 72 درجه سانتیگراد و طویلسازی نهایی 4 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد انجام پذیرفت (27، 13). توالی پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه در جدول1 آمده است. مخلوط واکنش در حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل: 3 میکرولیتر DNA استخراج شده، 5/12 میکرولیتر مستر میکس، 1 میکرولیتر از پرایمرها (جدول 1)، 5/7 میکرولیتر آب مقطر استریل در یک میکروتیوب 2/0 میلیلیتری تهیه شد.
برای قرائت نتایجPCR ، محصولات PCR روی ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز گردید. شاهد مثبت و منفی در تمام واکنشهای PCR مورد استفاده قرار گرفت. به عنوان شاهد مثبت گونه استافیلوکوکوس آرئوس از سویه استاندارد 29213 و به عنوان شاهد منفی از گونه اشریشیاکلی استفاده شد. بدلیل عدم وجود سویه استاندارد واجد ژن blaZ جهت استفاده در مطالعه حاضر، محصولات تکثیر شده در آزمون مورد نظر جهت تعیین توالی به شرکت سیناکلون ارسال شده و نتایج اخذ شده پس از انجام Nucleotide BLAST مشخص نمود که توالی مربوط به محصولات تکثیر شده دقیقاً متعلق به ژن blaZ میباشند. بعلاوه صحت نتایج PCR با استفاده از سوش فاقد مقاومت فنوتیپی در تست آنتیبیوگرام علیه آنتیبیوتیکهای بتالاکتام از لحاظ وجود باندهای غیراختصاصی کنترل گردید. در گوده اول ژل نیز مارکر bp-plus100 استفاده شد (تصویر 1). برای رنگآمیزی ژل از رنگ Ethidium Bromide استفاده شده و زیر دستگاه UV نتایج بررسی شد
اثر ضد میکروبی عصارهها بر جدایههای استافیلوکوکوس اورئوس-تهیه میزان تلقیح باکتری: جهت تهیه میزان تلقیح باکتری از کشت استوک گلیسیرینه به داخل محیط آبگوشت BHI برده و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 18 ساعت گرمخانه گذاری شد. سپس از کشت اول کشت مجددی داده شد و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 18 ساعت گرمخانه گذاری شد. از کشت دوم مقادیر مختلفی به داخل لوله کووتی که حاوی 4 میلیلیتر آبگوشت BHI استریل بود، منتقل شد تا جذب نوری 1/0 در طول موج 600 نانومتر به دست آید. سپس با انتقال 1 میلیلیتر از سوسپانسیون باکتریایی داخل کووت، به لوله حاوی 9 میلیلیتر آب پپتونه 1/0 درصد رقتهای متوالی تا 10 به نمای منفی شش، از طریق انتقال 100 میکرولیتر از هر رقت به پلیتهای حاوی BHI آگار از رقتهای تهیه شده، کشت داده شد. پلیتها به مدت 24 ساعت در دمای 35 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شد و پس از این مدت، تعداد باکتری شمارش شد و از این طریق میانگین تعداد باکتری درکووت حاوی سوسپانسیون باکتری با جذب نوری معادل 1/0 با دو بار تکرار محاسبه شد. با مشخص شدن این عدد، هرگاه که سوسپانسیون باکتریایی با جذب نوری 1/0 تهیه شود، تعداد باکتری در آن معادل عدد محاسبه شده بوده و میتوان از این سوسپانسیون غلظتهای دلخواه را تهیه نمود. البته در هر مورد تعداد دقیق باکتری تلقیح شده از طریق کشت هم زمان باکتری و شمارش تعداد کلونی محاسبه شد (11).
روش انتشار از چاهک در آگار (agar well diffusion): در این روش از محیط آگار مولر هینتون استفاده گردید (28). بدین ترتیب که سواب های پنبه ای استریل، درون سوسپانسیون باکتریایی با غلظت 106 CFU در هر میلی لیتر غوطه ور شدند و درون لوله در قسمت بالای سطح مایع، به دیواره لوله فشرده شدند. سپس سواب به سرعت در تمام سطح پلیت حرکت داده شد تا تلقیح به خوبی انجام شود. در هر پلیت شش چاهک با فواصل یکسان به قطر 6 میلی متر، یکی در مرکز و پنج تا در اطراف ساخته شد، به گونهای که 2 میلی متر از لبه پلیت فاصله داشت. 5 تا از چاهکها به صورت آسپتیک با 50 میکرولیتر از غلظتهای مختلف هر عصاره (100، 200، 300، 400 و 500 میلیگرم در میلیلیتر در BHI براث حاوی 5 درصد DMSO) پر شدند. یکی از چاهکها نیز به عنوان کنترل با 50 میکرولیتر محیط استریل BHI براث حاوی 5 درصد DMSO پر شد. پلیتها به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار گرفتند تا عصاره در آگار پخش شود و سپس به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند. در نهایت محدوده ممانعت بر حسب میلیمتر اندازهگیری شد. آزمایش با سه بار تکرار انجام شد و نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار گزارش گردید (1).
تعیین حداقل غلظت بازدارنده رشد (MIC) به روش میکرودایلوشن: در مطالعه حاضر، جهت تعیین حداقل غلظت بازدارنده رشد به روش میکرودایلوشن از پلیت 96 خانه با چاهک ته گرد و با حجم 300 میکرولیتر استفاده گردید. غلظتهای متوالی از عصارهها در آبگوشت BHI حاوی 5 درصد DMSO تهیه شد. سپس 200 میکرولیتر از هر کدام از غلظتها به هر کدام از پلیتهای 96 خانه انتقال داده شد و تا 30 میکرولیتر از سوسپانسیون هر باکتری نیز اضافه شد (با غلظت نهایی 105 x 5 CFU در هر میلیلیتر باکتری در هر چاهک)، که با تهیه رقتهای متوالی از سوسپانسیون باکتری و کشت در پلیت و شمارش تعداد کلونی تایید گردید. محتویات هر چاهک به مدت 2 دقیقه توسط Plate Reader مجهز به شیکر مخلوط شد. سپس جذب نوری با استفاده از Plate Reader در زمان صفر و با طول موج 600 نانومتر خوانده شد. پلیتها به مدت 24 ساعت در دمای 35 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند و بعد از اتمام گرمخانه گذاری کدورت یا عدم کدورت در چاهکها به صورت چشمی مشاهده گردید و با جذب نوری خوانده شده بعد از گرمخانه گذاری توسط Plate Reader تایید شد. روش کار به این صورت بود که افزایش جذب نوری به میزان بزرگتر یا مساوی 1/0 نسبت به زمان صفر به معنای رشد باکتری و ایجاد کدورت و اولین غلظت از عصارهها که فاقد کدورت بودند به منزله حداقل غلظت بازدارنده رشد (MIC) در نظر گرفته شدند (24 ، 16).
MBC: تعیین حداقل غلظت کشندگی باکتری (باکتری کشی): برای تعیین MBC، 20 میکرولیتر از رقتهای متوالی عصاره و سوسپانسیون باکتری که در تست MIC فاقد کدورت بودند، در محیط تازه نوترینت آگار به صورت خطی کشت داده شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شد. کمترین غلظتی که فاقد رشد در محیط نوترینت آگار بود، به عنوان MBC گزارش شد (1).
بررسی اثر عصارههای پیاز و فلفل بر نمودار رشد باکتری: در این مرحله بر اساس نتایج حاصل از تعیین حداقل غلظت بازدارنده رشد عصارهها (جدول 4) اثر غلظتهای تحت بازدارنده عصارههای پیاز و فلفل به تنهایی و به صورت توام با هم روی رشد یکی از ایزولههای تایید شده در طی 24 ساعت مورد ارزیابی قرار گرفت. غلظتهای مورد استفاده عبارت بودند از عصاره متانولی فلفل صفر و 5/7 میلی گرم بر میلیلیتر و عصاره متانولی پیاز 0 و 5/12 میلیگرم بر میلیلیتر. مجموع حالات مورد استفاده در جدول 2 آمده است. 10 میلیلیتر از محلولهای تهیه شده (در غلظتهای مختلف) در لولهها توزیع شد و سپس 100 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری (با غلظت نهایی 105 x 5 CFU در میلیلیتر) به هر 4 لوله اضافه گردید. لولهها در دمای 35 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند و در ساعتهای صفر، 1، 2، 4، 6، 8، 10، 12، 24 رقتهای مورد مطالعه از هر 4 لوله در زمآن‌های فوق تهیه شد و در پلیت آگار BHI به صورت سه تایی کشت داده شد و بعد از گرمخانه گذاری به مدت 24 ساعت در دمای 35 درجه سانتیگراد شمارش تعداد کلونی انجام شد و تعداد باکتریها در ساعات مورد نظر بر حسب لگاریتم CFU در هر میلیلیتر (log CFU/ml) محاسبه شد.
نمودارهای مربوط به منحنی رشد باکتری با نرم افزار Graphpad prism 4 ترسیم شد و کلیه تحلیلهای آماری بین لگاریتم تعداد باکتریها در ساعات مختلف و همچنین شیب خط منحنیهای رشد با استفاده از نرمافزار SPSS 16 صورت گرفت. جهت مقایسه دادهها از تست One-way ANOVA همراه تست تکمیلی توکی و همچنین آنالیز ارزیابیهای مکرر (Repeated measure) برای بررسی روند رشد استفاده شد و اختلاف میانگین دادهها در سطح 5 درصد از لحاظ آماری، معنیدار تلقی گردید.
میزان آلودگی نمونهها:میزان آلودگی به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و تایید ملکولی باکتری و ژن بتالاکتاماز جدایهها در نمونههای گوشت چرخکرده به ترتیب در جدول 2 و تصویر 1 نمایش داده شده است. همانگونه که مشاهده میشود از 22 نمونه از گوشتهای چرخکرده (3/73 درصد) استافیلوکوکوس اورئوس جدا گردید که تمام جدایهها با تست PCR نیز تایید شدند (تصویر 1). ردیابی ژن blaZ نیز نشان داد که 5 نمونه از جدایههای استافیلوکوکوس اورئوس (7/22 درصد از نمونههای آلوده و 6/16 درصد از کل نمونهها) حاوی ژن بتالاکتاماز بودند (تصویر 1).
اثر ضد میکروبی عصارهها: بر اساس نتایج این پژوهش، فعالیت ضد باکتریایی عصارههای پیاز و فلفلقرمز بر روی 5 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس حاوی ژن بتالاکتاماز در جدول 4 آمده است. همان گونه که مشاهده میگردد در تمامی آزمایشها و بر ضد تمام جدایههای استافیلوکوکوس اورئوس عصاره فلفلقرمز اثر مهاری قویتری دارد که این برتری در ارتباط با آزمایش انتشار چاهک از نظر آماری نیز معنادار میباشد (05/0>P).
جدول 1. مشخصات پرایمرهای استفاده شده جهت ردیابی ژن 16s rRNA و blaZ.
|
ژن هدف |
اندازهی محصول |
توالی پرایمر |
نام پرایمر |
|
16S rRNA |
515 bp |
5'- AAGGGCGAAATAGAAGTGCCGG-3' |
S. aureus.F |
|
515bp |
5´- ATGGTCGGTTCCTTAGAAAACAAACTTG-3' |
S. aureus.R |
|
|
blaZ |
579bp |
5'- AAGAGATTTGCCTATCCTTC-3' |
blaZ. F
|
|
579bp |
5'- GCTTGACCACTTTTATCAGC-3' |
blaZ. R |
جدول 2. مجموع حالات مورد استفاده در بررسی اثر غلظتهای مختلف عصارههای فلفل قرمز و پیاز قرمز روی نمودار رشد باکتری.
|
|
حالت اول |
حالت دوم |
حالت سوم |
حالت چهارم |
|
غلظت عصاره پیاز (میلی گرم در میلی لیتر) |
صفر |
5/12 |
صفر |
5/12 |
|
غلظت عصاره فلفل ( میلی گرم در میلی لیتر) |
صفر |
صفر |
5/7 |
5/7 |
جدول 3. تعداد نمونههای آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس.
|
تعداد نمونهها |
30 |
|
تعداد نمونههای آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس |
22 (3/73 درصد) |
|
تعداد نمونههای آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس واجد ژن بتالاکتاماز |
5 (6/16 درصد) |
جدول 4. فعالیت ضد میکروبی عصارههای فلفل قرمز و پیاز قرمز بر روی جدایههای استافیلوکوکوس اورئوس حاوی ژن بتالاکتاماز.
|
|
عصاره پیازقرمز |
عصاره فلفلقرمز |
||||
|
جدایه ها |
MBC (mg/ml) |
MIC (mg/ml) |
IZ (mm) |
MBCc(mg/ml) |
MICb (mg/ml) |
IZa (mm) |
|
1 |
35 |
25 |
6/0± 8B |
20 |
15 |
6/0± 15A* |
|
2 |
40 |
25 |
5/0± 7B |
25 |
15 |
9/0± 16A |
|
3 |
40 |
25 |
4/0± 5B |
20 |
15 |
0/1± 15A |
|
4 |
35 |
25 |
6/0± 7B |
20 |
10 |
8/0± 17A |
|
5 |
40 |
25 |
3/0± 6B |
25 |
15 |
5/0± 15A |
a (Inhibition Zone) : میانگین ±انحراف معیار قطر هاله مهاری به میلیمتر، b MIC: حداقل غلظت مهاری (میلیگرم بر میلیلیتر)، c MBC : حداقل غلظت کشندگی (میلیگرم بر میلیلیتر)، * حروف غیر مشابه در ستونهای مربوط به IZ نشان دهنده تفاوت معنادار آماری (05/0 >P) بین دو عصاره میباشند.
تصویر 1. نتایج حاصل از الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز. M: مارکر به اندازه 100 باز، :B1 شاهد منفی (جدایه اشریشیاکلی) مربوط به آزمون تایید استافیلوکوکوس آرئوس، Sa+: شاهد مثبت استافیلوکوکوس آرئوس (29213)، 1-5: نمونههای مثبت تشخیص داده شده به عنوان S. aureus، B2: شاهد منفی جهت ردیابی blaZ، Bla+: نمونه شاهد مثبت blaZ (تعیین توالی شده مطابق جدول 2)، 6-10 : نمونههای مثبت از لحاظ حضور ژن blaZ.
نمودار1. منحنی رشد و شیب خطی رشد (روند افزایشی) باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در حضور کنترل، عصاره فلفل به تنهایی، عصاره پیاز به تنهایی و ترکیب عصارههای پیاز و فلفل (O: پیاز، P: فلفل).
بررسی اثر عصارههای پیاز و فلفل بر نمودار رشد باکتری: نمودار 1 منحنیهای رشد و همچنین شیب خطی (روند افزایشی) جدایه استافیلوکوکوس اورئوس حاوی ژن بتالاکتاماز را در حضور عصارههای هیدروالکلی پیازقرمز و فلفلقرمز نشان میدهند. تحلیل آماری روی منحنی رشد باکتری در نمودار 1 نشان داد که از ساعت 2 گرمخانه گذاری در تمامی ساعات میزان باکتری در گروه کنترل و گروه حاوی عصاره پیازقرمز بیشتر از گروههای عصاره فلفلقرمز و گروه ترکیبی بود (001/0>P) و بین دو گروه کنترل و عصاره پیاز و همچنین بین دو گروه عصاره فلفل و گروه ترکیبی اختلاف معنادار دیده نشد (05/0<P). مقایسه و تحلیل آماری لگاریتم تعداد باکتریها در هر گروه و بررسی افزایش معنادار در تعداد باکتریها (001/0>P) نشان داد که دوره فاز تاخیر در گروههای کنترل، عصاره پیاز، عصاره فلفل و ترکیب پیاز و فلفل به ترتیب 1، 2، 4 و 4 ساعت بود. مقایسه شیب خطی منحنیهای رشد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در حضور عصارههای پیاز و فلفل نیز نشان داد که بین روند افزایشی تعداد باکتری در دو گروه کنترل (با شیب 02/0±17/0) و پیاز به تنهایی (با شیب 02/0±17/0) و همچنین بین دو گروه فلفل به تنهایی (با شیب 02/0±12/0) و ترکیب پیاز و فلفل (با شیب 01/0±12/0) اختلاف معنادار وجود ندارد (05/0<P) ولی روند افزایشی تعداد باکتری در گروههای فلفل به تنهایی و ترکیب پیاز و فلفل به صورت معنادار کندتر از گروه کنترل و گروه پیاز به تنهایی است (05/0>P)
اخیرا به دلیل بروز مقاومتهای دارویی و طولانی بودن زمان درمان عفونت باکتریهای مقاوم به آنتیبیوتیک، اولویت تحقیقات برای ساخت داروهای جدید و موثر افت پیدا کرده و اهمیت یافتن راهی جدید برای درمان دوچندان شده است. در این راستا با اثبات اثر ترکیبات گیاهی علیه طیف وسیعی از باکتریها، مخمرها و قارچها توجه تولیدکنندگان و مصرفکنندگان به استفاده از این ترکیبات معطوف شده است (8). یکی از مهمترین مزایای ترکیبات گیاهی نسبت به داروهای سنتزی این است که بر خلاف این ترکیبات شیمیایی علاوه بر تاثیر مستقیم بر پیکر باکتریها محیط اطرافی را بر ضد آن‌ها و در جهت مهار رشدشان تغییر داده و به این ترتیب از ایجاد سویههای میکروبی مقاوم به دارو نیز جلوگیری میشود (3).
استافیلوکوکوس اورئوس یکی از مهمترین میکروارگانیسمهای پاتوژن در مواد غذایی میباشد که میتواند عامل انتقال عفونتهای استافیلوکوکی و همچنین مسمومیت غذایی به انسان گردد (5). نتایج این مطالعه نشان داد که 3/73 درصد از نمونههای بستهبندی شده گوشت چرخکرده آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس بودند. بالا بودن آلودگی در نمونههای خام می تواند به دلایل مختلفی از جمله آلودگی اولیه و ثانویه (ناشی از آمادهسازی با دست و عدم رعایت صحیح اصول بهداشتی در حین آمادهسازی باشد (21). در مطالعهای که توسط Mustafa و همکاران در سال 2009 در یک پادگان نظامی در هند انجام گرفت، آلودگی 7/77 درصد از مواد گوشتی خام به استافیلوکوکوس اورئوس تایید شد که این میزان بسیار به مطالعه حاضر شباهت داشت (21). TavaKoli و همکاران در سال 2012 نیز در مطالعهای که بر روی غذاهای سرو شده در رستورآن‌های مراکز نظامی انجام دادند آلودگی 6/55 درصدی غذاهای گوشتی به استافیلوکوکوس اورئوس را گزارش نمودند (25). با اینکه این میزان آلودگی کمتر از نتایج این تحقیق بود ولی با توجه به اینکه نمونههای مورد آزمایش آن‌ها غذاهای آماده مصرف بودند این میزان آلودگی بسیار قابل توجه میباشد.
در این تحقیق نمونههای آلوده به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس واجد ژن بتالاکتاماز نیز ردیابی شدند و نتایج نشان داد که 6/16 درصد از نمونهها آلوده به این سویهها بودند. فنوتیپهای استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به آنتیبیوتیک از نظر مسمومیت غذایی اهمیت زیادی ندارند زیرا این بیماری گوارشی از طریق مصرف آنتیبیوتیک مدیریت نمیشود اما فرضیهای وجود دارد که تماس، دستکاری و مصرف گوشتهای آلوده از دلایل انتقال و کلونیزه شدن باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در روی پوست و مخاطات بینی و دهان میباشد و بدین ترتیب حضور این سویههای واجد مقاومت آنتیبیوتیکی در نمونههای خام و آماده مصرف حتی با میزان بسیار کمتر از نتیجه این تحقیق میتواند سلامت عمومی جامعه را به طور جدی تهدید کند (6). مطالعات در مورد استافیلوکوکوس اورئوسهای جدا شده از گوشت بیشتر بر پایه استافیلوکوکوس اورئوسهای مقاوم به متیسیلین (MRSA) بوده است و در ارتباط با باکتریهای حامل ژن اختصاصی بتالاکتاماز تحقیقات زیادی صورت نگرفته است. در این ارتباط Hanson و همکاران در سال 2011 شیوع استافیلوکوکوس اورئوسهای مقاوم به متیسیلین در نمونههای گوشت عرضه شده در فروشگاهها را مورد بررسی قرار دادند و میزان آلودگی 2/1 درصد را گزارش نمودند (12). همچنین در مطالعهای که توسط Igbinosa و همکاران در سال 2015 در نیجریه صورت گرفت 20 درصد از نمونههای گوشت گاو آلوده به MRSA بودند (14).
نتایج این تحقیق نشان دهنده اثر خوب عصارههای فلفل و پیاز بر ضد باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس واجد ژن بتالاکتاماز میباشد. این اثر ضد باکتریایی در مورد عصاره پیازقرمز میتواند مربوط به حضور ترکیبات فلاونوئیدی و پلی فنلی موجود در این عصاره باشد که اثر مهاری آن‌ها بر رشد باکتریها ثابت شده است (9). نتایج این مطالعه حاکی از تاثیر قویتر عصاره فلفلقرمز نسبت به پیازقرمز در تمام تستهای ضد میکروبی و نمودار رشد میکروبی بود. در مطالعات پیشین ثابت شده است که عصارههای بعضی از گیاهان از جمله فلفل علاوه بر اثر روی غشای باکتریها (که در مورد بسیاری از نگهدارندهها به عنوان تنها مکانیسم ضد میکروبی پیشنهاد میشود) بر روی سنتز آنزیمهای مختلف باکتریها نیز نقش مهاری دارند (32). این مطلب میتواند یکی از دلایل برتری عصاره فلفلقرمز نسبت به پیازقرمز در این مطالعه باشد.
در مجموع نتایج این مطالعه نشان داد که عصارههای فلفلقرمز و پیازقرمز دارای اثر ضد باکتریایی بر استافیلوکوکوس اورئوسهای واجد ژن بتالاکتاماز جدا شده از گوشتهای چرخکرده میباشند. با توجه به اینکه استفاده از منابع گیاهی در ایجاد سویههای باکتریایی مقاوم به آنتیبیوتیک تاثیر بسیار کمتری نسبت به نگهدارندههای شیمیایی دارد، پیشنهاد میشود در مطالعات آینده از مواد موثر این عصارهها به صورت خالص در فراوری محصولات گوشتی استفاده گردد و همچنین با اثبات اثر ضد میکروبی قویتر فلفلقرمز توصیه میشود در غذاهایی مانند انواع کباب که در آن‌ها از گوشت چرخکرده استفاده میشود حتماً در کنار پیاز از فلفل نیز به میزان مناسب استفاده شود.
نویسندگان مقاله مراتب تشکر و قدردانی خود را از خانم مهندس بهناز رئیسیان و خانم لیلا رضایی به خاطر کمکهای ارزندهشان در مراحل کارهای آزمایشگاهی و ویراستاری مطالب اعلام میدارند.
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
', './data/jvr/coversheet/cover_fa.jpg'))