نوع مقاله : بهداشت و بیماری های آبزیان
نویسندگان
1 گروه تکثیر و پرورش آبزیان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران
2 گروه بهداشت و بیماریهای دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
3 گروه شیلات، دانشکده منابع طبیعی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران
چکیده
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
BACKGROUND: Yersiniosis is known as one of the most prevalent bacterial diseases in fish, which causes high mortality and economic losses in cultured fish farms every year.
OBJECTIVES: The present study was conducted to investigate the changes in hematological indices and gut histopathology in Caspian roach (Rutilus caspicus) exposed to Yersinia ruckeri.
METHODS: 60 Caspian roach broodstock with an average weight of 63.4 ± 2.1 g were divided into three groups (with two replicates for each group), including one treatment, one positive control, and one negative control groups. The treatment group was intraperitoneally injected with Yersinia ruckeri bacterium at a dosage of 3.8 × 107 cell/fish. The positive group just received normal saline (0.9 % NaCl) via intraperitoneal injection. No injection was performed in the negative control group.
RESULTS: Symptoms appeared on the fourth day after exposure and 20 % of the fish in the treatment group died 5 days after the challenge. Cumulative mortality reached 53 % on day 9 after the challenge. According to hematological analysis, the challenge with Yersinia ruckeri led to a significant increase in white blood cell counts (WBC) compared to the control groups. Moreover, 10 days following exposure, the treatment group experienced hypochromic macrocytic anemia. Gut histopathology was characterized with necrosis and detachment of intestinal epithelial cell and inflammatory cells infiltration in the treatment group.
CONCLUSIONS: Based on the obtained results herein, Yersinia rackeri can cause acute disease in Caspian roach; therefore, preventing and controlling this disease is essential for these fish in infected regions.
کلیدواژهها [English]
یرسینیوزیس یکی از بیماریهای شایع باکتریایی در مزارع پرورش ماهیان محسوب میشود که همه ساله خسارات فراوانی به این صنعت وارد میسازد، عامل این بیماری باکتری یرسینیا راکری (Yersinia ruckeri) است و اولین بار از مزارع قزل آلای رنگین کمان در آمریکا گزارش گردید (18). در حال حاضر این بیماری از نقاط مختلف دنیا در گونههای مختلف ماهیان گزارش شده و همه ساله خسارات فراوانی به صنعت پرورش آبزیان وارد میسازد (28). در برخی گزارشات میزان تلفات ناشی از این بیماری بیش از 70 درصد نیز ثبت گردیده است (8). معمولاً در شرایط استرسزا و شرایط نامناسب فیزیکوشیمیایی آب پرورش، شیوع بیماری افزایش مییابد (24). در عین حال حساسیت ماهیان مختلف نسبت به باکتری یرسینیا راکری متفاوت است، براساس گزارشات اگر چه بیماری در گونههای مختلف اتفاق میافتد، آزاد ماهیان از بیشترین حساسیت در میان ماهیان پرورشی برخوردارند (9).
یرسینیوزیس در ایران تنها از مزارع قزلآلای رنگینکمان گزارش شده است و تا کنون گزارش رسمی در رابطه با شیوع بیماری در مزارع ماهیان گرمابی کشور و بخصوص کپور ماهیان بهطور رسمی در دست نیست، اما گزارشات فراوانی در رابطه با شیوع این بیماری در مزارع ماهیان سردابی کشور وجود دارد، به گونهای که همه ساله خسارات فراوانی به این صنعت در کشور وارد میسازد (7،19،20). علایم کلینیکی متعددی برای این بیماری در ماهیان گزارش شده است که از آن جمله میتوان به سپتیسمی و خونریزی در فک و اطراف دهان (به همین دلیل نام دیگر بیماری، بیماری دهان قرمز است)، خونریزی در چشمها و اگزوفتالمی، پرخونی و خونریزی در محوطه شکمی و دستگاه گوارش بخصوص در قسمت انتهایی رودهها اشاره نمود که ممکن است تمامی علایم یاد شده در ماهیان یک مزرعه مشاهده نشود (11،18).
ماهی کلمه خزری (Rutilus caspicus) از جمله ماهیان با ارزش دریای خزر و حوزه آبریز آن محسوب میشود. این ماهی در بین مصرفکنندگان شمال کشور از استقبال بالایی برخوردار است، در عین حال به عنوان یکی از مهمترین منابع غذایی ماهیان خاویاری و بخصوص فیلماهی نیز محسوب میشود. متأسفانه در سالهای اخیر شاهد کاهش چشمگیر جمعیت این ماهی در دریای خزر بودهایم و در راستای بازسازی ذخایر این ماهیان با ارزش، سازمان شیلات ایران همه ساله اقدام به تکثیر مصنوعی و رها سازی بچه ماهیان در سایز انگشت قد به دریا مینماید اما آمار صید این گونه از دریا بیانگر این موضوع است که این اقدامات اگرچه بسیار مفید بوده است اما نتوانسته جمعیت آسیب دیده این گونه را در دریا بازسازی کند (21). برای عملیات بازسازی نیاز به تأمین ماهی مولد است و این مولدین میتواند بهصورت مولدین صید شده از دریا و یا به صورت پرورش بچه ماهیان و رسیدن به مرحله مولدی، تأمین گردد که در هر دو صورت نیاز به نگهداری آنها در استخرهای پرورشی میباشد. با توجه به گسترش یرسینیوزیس در مزارع سردابی کشور احتمال آلودگی مزارع پایین دست نیز وجود دارد. لذا در صورت آلودگی به یرسینیا راکری در منطقه آلودگی این ماهیان در مزارع پایین دست نیز دور از ذهن نیست و با توجه به عدم وجود گزارشی در رابطه با حساسیت ماهیان مولد کلمه خزری نسبت به یرسینیا راکری، در مطالعه حاضر بافت روده و شاخصهای خونی ماهیان مذکور در مواجهه با این بیماری مورد بررسی قرار گرفته است.
تهیه و آماده سازی ماهیان: به منظور انجام آزمایش تعداد 60 عدد ماهی کلمه خزری با میانگین وزنی 1/2 ± 4/63 (گرم) که به منظور مولد سازی پرورش داده شده بودند، با پلاستیک حمل بچه ماهیان به محل انجام آزمایش منتقل گردید. ماهیان مذکور در دو تانکر 400 لیتری تقسیم شده و به مدت یک هفته به منظور سازگاری با شرایط مورد پرورش قرار گرفتند. در طی این دوره ماهیان روزانه به میزان 3 درصد وزن بدن و دوبار در روز با غذای تجاری (انرژی – ایران) تغذیه شدند. در طی این دوره دمای آب 2 ± 24 درجه سانتیگراد، سختی آب برابر با 2 ± 196 (میلی گرم/لیتر) ثبت گردید.
نحوه آماده سازی باکتریایی: باکتری یرسینیا راکری (Yersinia ruckeri) مورد استفاده در این مطالعه از سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران با کد PTCC 1888 بصورت فریز شده تهیه گردید. در این راستا گونه دقیق باکتری قبلاً با کمک تست PCR مورد تأیید قرار گرفته بود (13). این باکتری ابتدا به مدت 48 ساعت در محیط کشت تریپتیک سوی براث (Tryptic Soya Broth) غنیسازی گردیده و سپس به صورت کشت سطحی در محیط نوترینت آگار (Nutrient agar) تلقیح گردید. 48 ساعت پس از گرمخانه گذاری، باکتریها از سطح محیط کشت برداشت شده و در سرم فیزیولوژی (NaCl 9/0 درصد) به صورت سوسپانسیون باکتریایی آماده گردید. کدورت سوسپانسیون مذکور با کمک دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 620 نانومتر و OD بر اساس نیم استاندارد مک فارلند تنظیم گردید. بار باکترهای زنده این سوسپانسیون روش کشت سطحی و بر مبنای تشکیل کلونی (CFU) به روش استاندارد محاسبه گردید به این منظور پس از تهیه رقتهای سریالی و کشت آنها در محیط نوترینت آگار، بار باکتریهای زنده سوسپانسیون 108 × 8 /3 سلول زنده به ازای هر سیسی محاسبه گردید.
مواجهه باکتریایی ماهیان: در راستای انجام آزمایش یک گروه شاهد منفی، یک گروه شاهد مثبت و یک گروه تیمار (با 2 تکرار برای هر گروه) در نظر گرفته شد. به این منظور مولدین کلمه خزری در 6 آکواریوم شیشهای با ابعاد 30 × 50 × 40 سانتیمتر تقسیم شدند (15 ماهی در هر آکواریوم). یک هفته پس از سازگاری ماهیان مواجهه باکتریایی انجام شد. در این مطالعه ماهیان گروه تیمار با 1/0 سیسی از سوسپانسیون باکتریایی (معادل 107 × 8 /3 باکتری زنده) به روش تزریق داخل صفاقی مورد مواجهه قرار گرفتند(14). ماهیان گروه شاهد مثبت نیز با 1/0 سیسی سرم فیزیولوژی استریل به روش داخل صفاقی تزریق شدند. هیچ تزریقی در ماهیان گروه شاهد منفی صورت نگرفت. پس از تزریق ماهیان به مدت 2 هفته همه روزه پایش شده و تلفات روزانه در صورت وقوع ثبت گردید.
بررسی آسیب شناسی بافت روده: نمونه برداری بافتی در گروه تیمار از ماهیان در حال مرگ و یا تازه تلف شده صورت گرفت. همزمان از ماهیان گروه شاهد نیز نمونه برداری انجام شد. به این منظور پس از باز شدن شکم ماهی نمونهبرداری از قسمتهای میانی و انتهایی روده هر کدام از نمونهها انجام گرفت. نمونههای بافتی بلافاصله به فرمالین 10 درصد منتقل شد و پس از 24 ساعت فیکساتیو نمونهها تعویض گردید. نمونههای بافتی در دستگاه پروسسور بافتی آمادهسازی شد، و پس از آبگیری در الکل اتانول پارافینه شده، مقاطع 5 میکرونی از بافتها تهیه گردید. رنگآمیزی مقاطع بافتی به روش هماتوکسیلین و ائوزین صورت پذیرفت (15) و نمونه ها با چسب انتالن لامل گذاری شده و به کمک میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 100 تا 400 برابر مورد بررسی قرار گرفتند.
بررسی شاخصهای خونی: جهت بررسی شاخصهای خونی در روز 12 پس از مواجهه از ماهیان سالم و بدون علایم بیماری خونگیری انجام شده و از هر گروه مورد آزمایش 7 نمونه خون تهیه گردید. ابتدا ماهیان توسط 100 (میلی گرم در لیتر) یوجینول (Sigma_ Aldrich co, Germany) بیهوش شدند و سپس خونگیری از ساقه دمی ماهیان توسط سرنگ آغشته شده به هپارین با سرسوزن گیج 25 صورت گرفت. شمارش تعداد گلبولهای قرمز (RBC) و گلبولهای سفید (WBC) توسط لام نئوبار بر اساس روش استاندارد روتین شمارش سلولی انجام شد (5). هماتوکریت به روش استاندارد میکروهماتوکریت انجام شده و به صورت درصد بیان گردید. مقادیر هموگلوبین در این آزمایش توسط روش سیانومت هموگلوبین و با کیت تجاری پارس آزمون اندازهگیری شد (1). اندیسهای خونی حجم متوسط گلبولی (MCV)، وزن هموگلوبین داخل گلبولی (MCH) و غلظت هموگلوبین داخل گلبولی (MCHC) بر اساس روش Dacie و Lewis (2001) محاسبه گردید (5). پس از تهیه گسترش خونی نمونهها و رنگ آمیزی با گیمسا تعیین درصد انواع گلبولهای سفید نیز بر اساس ساختار و شکل سلولی صورت پذیرفت (17).
بررسیهای آماری: بررسی آماری نتایج تحقیق حاضر توسط نرمافزارهای SPSS18 وExcell 2010 انجام شد. نمودار روند تلفات مولدین کلمه خزری نیز توسط نرم افزارهای SPSS18 رسم گردید. نتایج بهصورت میانگین ± انحراف استاندارد بیان گردید. برای مقایسه نتایج بین گروههای مختلف از one way ANOVA و آزمون آماری دانکن (Duncan) استفاده شد.
وضعیت تلفات حاصل از مواجهه تجربی ماهیان مولد کلمه خزری با باکتری یرسینیا راکری در نمودار 1 قابل مشاهده است. بر اساس این نتایج تا 4 روز اول پس از مواجهه علایم بیماری و تلفات مشاهده نشد. در روز پنجم پس از مواجهه 20 درصد ماهیان مواجهه شده با 107 × 8 /3 باکتری تلف شدند، روند تلفات تا روز 9 پس از مواجهه به 53 درصد رسید و پس از آن تا روز چهاردهم پس از مواجهه تلفاتی مشاهده نگردید (نمودار 1). عمده علایم ماهیان بیمار شامل پرخونی و خونریزی در قاعده بالهها و همچنین پرخونی و خونریزی دستگاه گوارش و بخصوص در قسمت انتهایی رودهها ثبت گردید. در این مطالعه هیچ تلفاتی در ماهیان گروههای شاهد مشاهده نگردید.
در بررسی بافت شناسی رودهها، آسیبهای وارده به بافت روده انتهایی در مقایسه با روده میانی در ماهیان گروه تیمار بسیار گستردهتر و شدیدتر بوده است، عمدهترین شاخص آسیبی در این بافت شامل نکروز و جداشدگی سلولهای استوانهای اپیتلوم پوششی رودهها و نفوذ سلولهای آماسی در بافت زیر مخاط روده بود (تصویر 1). علایم یاد شده در قسمتهای میانی رودهها به صورت خفیف تا ملایم ثبت گردید (تصویر 1، ب و پ). اما در قسمت انتهایی روده گستردگی نکروز اپیتلوم پوششی پرزهای روده به حدی شدید بود که می توان گفت پرزهای روده در این قسمت تمامی اپیتلیوم پوششی خود را از دست دادهاند (تصویر 1، ث و ج). هیچ آسیب بافتی در ماهیان گروه شاهد مشاهده نشد (تصویر1، الف و ت).
نتایج حاصل از بررسیهای خونشناسی گروههای شاهد و ماهیان گروه تیمار 12 روز پس از مواجهه با یرسینیا راکری در جدول 1 آورده شده است. بر اساس این نتایج مواجهه با یرسینیا باعث کاهش معنیدار تعداد گبلولهای قرمز (RBC) و مقادیر هموگلوبین در ماهیان گروه تیمار گردید. در عین حال تعداد گلبولهای سفید (WBC) در ماهیان گروه تیمار افزایش معنیدار داشت. در بررسی شاخصهای خونی نیز مقادیر MCV در ماهیان گروه تیمار بالاتر و MCHC پایینتر محاسبه گردید (جدول 1).
همانگونه که در جدول 1 نشان داده شد، مواجهه با 107×8/3 باکتری منجر به تلف شدن 53 درصد از ماهیان مولد کلمه خزری گردید، که این موضوع نشان دهنده حساسیت متوسط این ماهی نسبت به باکتری یرسینیا راکری است. این حساسیت در ماهیان مختلف متفاوت گزارش شده است. به عنوان مثال در یک بررسی تزریق داخل صفاقی 106 × 8/2 باکتری منجر به تلفات حدود 70 درصدی در بچه ماهیان تاسماهی ایرانی (Acipenser persicus) گردید (14). همچنین با تزریق 105 × 5 باکتری در ماهی کپور معمولی (Cyprinus carpio) 86 درصد ماهیان تلف شدند (2)، در مطالعه Haig و همکاران در سال 2011 با تزریق داخل صفاقی 107 × 4/2 باکتری به آزاد ماهی آتلانتیک (Salmo salar L) و قزلآلای رنگین کمان تلفات 60 تا 75 درصد ثبت گردید (10).
بررسیهای خونشناسی قادر است یک تابلو پاراکلینیکی قابل استناد از سلامت ماهیان ارائه کند. در مطالعه حاضر همانگونه که در جدول 1 آورده شده است در ماهیانی که با باکتری مواجه شدند تعداد گلبولهای قرمز کاهش یافته است که با توجه به افزایش اندیسهای خونی MCV و کاهش MCHC میتوان گفت این مواجهه منجر به کم خونی نوع ماکروسیتیک هیپوکرومیک در ماهیان مولد کلمه خزری شده است (4). در حقیقت با عدم تغییر MCH در بین تمامی گروههای مورد مطالعه در کنار تغییرات اندیسهای یاد شده بیانگر این موضوع است که اگرچه هموگلوبین سلولی کاهش نیافته اما با توجه با کاهش MCHC درصد هموگلوبین خون کاهش معنیدار داشته است. در بررسی مشابهی در تاسماهی ایرانی مواجهه با یرسینیا راکری منجر به کمخونی شدید ماهیان گردید (14). افزایش تعداد گلبولهای سفید (WBC) را نیز میتوان به درگیری سیستم ایمنی با باکتری پاتوژن ربط داد. در بررسیهای متعدد افزایش تعداد گلبولهای سفید در درگیری با پاتوژنهای باکتریایی در ماهیان به اثبات رسیده است (22).
وجود آسیبهای بافتی رودهها نیز در بررسی حاضر بیانگر حساسیت ماهیان مولد کلمه خزری به یرسینیوزیس میباشد، علایم یاد شده شبیه برخی گزارشات در ماهی قزلآلای رنگین کمان (25،26،27)، تاسماهی ایرانی (14) میباشد. در این بررسی همانگونه که در تصویر 1 قابل مشاهده است عوارض بافتی در قسمت انتهایی روده در مقایسه با قسمتهای میانی از شدت بالاتری برخودار بوده است که این موضوع شاید به دلیل تجمع و کلونیزه شدن باکتری در قسمت انتهایی رودهها باشد. شاید بتوان نفوذ و حضور بالای سلولهای آماسی در قسمتهای انتهایی روده ماهیان تیمار را با این موضوع مرتبط دانست. در بررسیهای متعدد خونریزی در فکها و دهان و همچنین خونریزی در قسمت انتهایی روده و بیرون زدگی مخرج ماهی از علایم تیپیک این بیماری در آزد ماهیان میباشد (11،18). در مطالعه حاضرعلایم یاد شده در آزاد ماهیان در ماهیان کلمه خزری به این کیفیت مشاهده نگردید، به عنوان مثال در هیچ موردی خونریزی و بیرون زدگی مخرج و یا خونریزی در دهان و فکین ثبت نشد.
همانگونه که در مقدمه اشاره گردید متأسفانه جمعیت ماهیان کلمه خزری در طی سالهای اخیر به شدت روند کاهشی داشته است به گونهای که در برخی مقاطع حتی تهیه مولدین از دریا نیز مشکل بوده است (21)، به همین دلیل در کنار تکثیر مصنوعی و پرورش بچهماهیانی که همه ساله به منظور رهاسازی و ترمیم جمعیت این ماهیان توسط سازمان شیلات ایران صورت میگیرد، ناگزیر به مولد سازی و نگهداری مولدین نیز خواهیم بود. که در این راستا آگاهی از خطرات احتمالی که این روند را تهدید میکند ضروری و کاربردی است. ماهی کلمه خزری یک ماهی گرمابی است و با توجه به شرایط اقیمی کشور محل قرار گرفتن استخرهای این ماهی در پایین دست رودخانهها است به عبارت دیگر آلودگی در قسمتهای بالا دست (که معمولاً مزارع سردابی در آن واقع است) قادر به آلودگی این مزارع نیز میباشد. با توجه به شیوع همه ساله یرسینیا در مزارع سردابی کشور(7،19،20)، مواجهه کلمه خزری با باکتری یرسینیا راکری در پایین دست این مزارع نیز دور از ذهن نیست. از طرفی هنگام شیوع یرسینیوزیس در یک منطقه، آلودگی برای مدت طولانی باقی خواهد ماند. بر اساس برخی گزارشات این باکتری قادر است به مدت 4 ماه در استخرهای پرورش زنده بماند (23). در عین حال در صورت بروز بیماری، باکتری در دستگاه گوارش ماهی کلونیزه شده و تا چند ماه پس از بهبودی این ماهیان باکتری را از طریق مدفوع در محیط دفع میکنند (3،16). این باکتری حتی از ماهیان سالم و بدون سابقه بیماری نیز در مناطق با سابقه آلودگی جداسازی شده است (6). برخی محققین بر این باورند که این باکتری قادر است در اندام داخلی ماهیان حساس کلونیزه شده و تا مدتها باقی بماند و در شرایط ناساعد محیطی و یا بروز استرس و ضعف سیستم عمومی بدن بیماری به طور ناگهانی بروز پیدا کند (12).
لذا بر اساس مطالعه حاضر، با توجه به حساسیت ماهیان مولد کلمه خزری و همچنین آلودگی منطقه به یرسینیا راکری در پرورش و نگهداری مولدین کلمه خزری ملاحظات بهداشتی و قرنطینهای برای این باکتری باید در نظر گرفته شود.
در پایان از مدیریت و پرسنل صمیمی و زحمتکش "مرکز تکثیر و پرورش ماهیان استخوانی سیجوال _ گلستان" که در انجام مطالعه حاضر ما را همراهی نمودند صمیمانه سپاسگزاری میشود.
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
References