نوع مقاله : بهداشت و بیماری های آبزیان
نویسندگان
1 گروه تکثیر و پرورش آبزیان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گلستان، ایران
2 موسسه تحقیقات علوم شیلاتی ایران، مرکز تحقیقات ذخایر آبزیان آبهای داخلی گرگان، گلستان، ایران
3 گروه بهداشت و بیماریهای، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
4 دانشآموخته دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گلستان، ایران
چکیده
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
BACKGROUND: Ammonia accumulation in warm-water fish pond can lead to mortality or reduction in growth and body immune indices.
OBJECTIVES: The present study aimed to investigate the effects of chronic sub-lethal unionized ammonia (NH3) on growth indices and gill and kidney histopathology l, after a 30 – day trial in common carp (Cyprinus carpio).
METHODS: Herein, 180 fish with an average weight of 4.5±0.5 g were divided into six tanks. Two groups, including one control group and one treatment group (with three replicates for each one), were considered. The treatment fish were exposed to 0.1 mg/l on un-ionized ammonia (NH3) for 30 consecutive days. Following one -month, ammonia exposure growth indices and histological analysis of gill and kidney were investigated.
RESULTS: The results showed that exposure to 0.1 mg/l of NH3 led to a significant reduction in growth indices. Additionally, edema and epithelial lifting with hyperplasia in the second lamella were detected in the gill of the treatment group. The kidney was characterized by focal renal tubules degeneration and necrosis, congestion, and increase in the melano-macrophage centers.
CONCLUSIONS: Although chronic exposure to 0.1 mg/l of unionized ammonia was not found to cause mortality in common carp, it could have some side effects, such as a decline in growth indices and histopathological effects in kidney and gill tissues. Thus, for higher production, sublethal levels of ammonia should also be taken into account in common carp ponds.
کلیدواژهها [English]
کپور معمولی (Cyprinus carpio) یکی از گونههای ماهیان آب شیرین میباشد که به دلیل سهولت در پرورش، مقاومت بالاتر در برابر تغییرات محیطی نسبت به سایر گونهها و همچنین سرعت رشد بالا و استفاده از خوراک ارزان قیمت در جهان بهصورت وسیع پرورش داده میشود (7). این ماهی در ایران نیز یکی از گونههای با ارزش اقتصادی به حساب میآید که در بین مصرف کنندگان مقبولیت بالایی دارد و در سیستم پرورش ماهیان گرمابی کشور مورد پرورش قرار میگیرد، در سیستم پرورش این ماهیان در کشور به دلایل مختلف از جمله عدم اعمال مدیریت صحیح در مزارع پرورشی، در دسترس نبودن منابع آب کافی و همچنین در استخرهای زمستانگذرانی تعویض آب مناسب صورت نمیگیرد، لذا برخی فاکتورهای کیفی آب دست خوش تغییرات شدند که اگرچه ممکن است کشنده نباشند اما بهصورت مزمن میتواند منجر به بروز استرس و آسیب به ماهیها و کاهش فاکتورهای رشد و تولید شود، یکی از این فاکتورها مواد نیتروژنداری هستند که ممکن است تحت شرایط خاصی در صورت تجمع بهصورت حاد یا مزمن مشکلاتی را ایجاد کنند (19).
آمونیاک اصلیترین محصول متابولیسم ترکیبهای نیتروژندار مانند پروتئین در ماهیها و همچنین محصول فرعی تجزیه باکتریایی مواد آلی نیتروژندار در آب میباشد، آمونیاک سمیترین ماده دفعی نیتروژندار بوده و به صورت غیر یونیزه در شرایط خاص شدیداً در ماهیان کشنده است. این ماده در آب به دو صورت آمونیاک یونیزه NH4 و آمونیاک غیر یونیزه NH3 یافت میشود که نسبت این دو بستگی به شرایط محیط دارد. آمونیاک غیریونیزه بسیار سمیتر از آمونیاک یونیزه است و با بالا رفتن درجه حرارت و pH نسبت NH4 به افزایش یافته و با بالا رفتن شوری این نسبت کاهش مییابد. علاوه بر این، در شرایط استرسزا از جمله هیپوکسی در محیط سمیت NH3 بیشتر میشود (3). در سیستمهای بسته و استخرهایی با تراکم بالا، مسمومیت با آمونیاک به علت کافی نبودن جمعیت باکتریهای تجزیه کننده آمونیاک و در نتیجه کاهش تبدیلهای زیستی، افزایش مییابد. سمیت آمونیاک به عواملی از قبیل گونه و سن ماهی، میزان آمونیاک غیر یونیزه، مدت زمان در معرض قرار گرفتن ماهی با آمونیاک، تراکم ذخیرهسازی ماهی در استخر و دیگر فاکتورهای کیفی آب بستگی دارد (6،9،15). مواجهه با غلظتهای سمی غیرکشنده آمونیاک منجر به تغییرات تحت کلینیکی در پارامترهای بیوشیمیایی و کاهش عملکرد و کاهش ایمنی ماهیان میگردد (22). در مقادیر سمیتر این ماده قادر به بروز علایمی همچون آسیب به اپیتلیوم پوست، روده، سیستم اعصاب مرکزی، کبد و آبشش ماهی میگردد (16،22). همچنین افزایش آمونیاک رفتار شنای ماهیان را نیز به دلایل مختلف تغییر میدهد (10). وقتی ماهیها در معرض غلظتهای غیر کشنده آمونیاک قرار میگیرند، ممکن است علایمی همچون کاهش پارامترهای رشد و افزایش حساسیت به بیماریها را از خود نشان دهند؛ مطالعات متعددی بر روی اثرات آمونیاک با غلظتهای تحت حاد در ماههای مختلف صورت گرفته است. در این رابطه میتوان به مطالعه Paust و همکاران در سال 2011 روی هالیبوت (Hippoglossus hippoglossus)، مطالعات El‐Husseiny و همکاران در سال 2008 و El-Shafai و همکاران در سال 2004 بر روی تیلاپیای نیل (Oreochromis niloticus)، مطالعه Shingles و همکاران در سال 2001 بر روی قزلآلای رنگینکمان (Oncorhynchus mykiss) و همچنین مطالعه Zhang و همکاران در سال 2019 بر روی ماهی سیم دریایی (Megalobrama amblycephala) اشاره کرد (1،2،14،18،25).
با توجه به شرایط حاضر در ایران، وقوع کمآبی امکان تعویض آب استخرها را با محدودیت روبهرو ساخته است. به دلیل کم بودن تعویض آب و بالا بودن تراکم ماهیها در استخرهای پرورشی نسبت به محیطهای طبیعی، بالا بودن میزان سطح آمونیاک در آب استخرهای پرورشی امری رایج میباشد. برای جلوگیری از بروز خسارتهای اقتصادی اعمال مدیریت دقیق و همه جانبه حائز اهمیت میباشد. جهت انجام این امر آگاهی از علائم کلینیکی در مرحله ابتدایی امری انکار ناپذیر است تا در صورت ایجاد تغییر در پارامترهای فیزیکوشیمیایی آب از جمله افزایش سطح ترکیبهای سمی مانند آمونیاک اقدامهای کلیدی اعمال گردد. در این راستا مطالعه حاضر به بررسی تأثیر مزمن آمونیاک بر روی ماهی کپور معمولی و علائم ایجاد شده در مواجهه با آمونیاک مولکولی میپردازد.
تهیه بچه ماهیان و شرایط پرورشی: جهت ارزیابی اثرات مزمن آمونیاک غیر کشنده در مطالعه حاضر تعداد 180 عدد ماهی کپور معمولی با میانگین وزن 5/0± 5/4 گرم به مدت 2 هفته جهت سازگاری با شرایط محیط مطالعه در یک مخزن 500 لیتری نگهداری شدند و در طی این مدت خوراکدهی با غذای تجاری بیومار (BioMar-France) 1 ساعت بعد از تعویض روزانه 50 درصد آب به مقدار 3 درصد وزن زیست توده در دو وعده انجام گرفت. سپس برای بررسی اثرات مزمن آمونیاک، ماهیان با 1/0 میلیگرم/لیتر مورد مواجهه قرار گرفتند. در این راستا ماهیها با الگوی تصادفی به گروه شاهد و گروه تیمار، هر کدام با سه تکرار تقسیم بندی شدند و تعداد 90 عدد ماهی به هر گروه اختصاص یافت.
تیمارها و تهیه محلول آمونیاک: ماهیهای گروه تیمار به مدت 30 روز با دوز مزمن 1/0 میلیگرم بر لیتر آمونیاک مولکولی مورد مواجهه قرار گرفتند. به منظور آمادهسازی آمونیاک مولکولی از کلرید آمونیوم (NH4Cl) شرکت مرک (Merck Co. Germany) پس از محاسبه آمونیوم و فرم مولکولی آن (آمونیاک) استفاده گردید. گروه شاهد نیز در مدتی مشابه اما بدون مواجهه با آمونیاک مولکولی مورد پرورش قرار گرفتند. در این گروه متوسط سطح آمونیاک 005/0 میلیگرم بر لیتر اندازهگیری شد. در طول مطالعه متوسط درجه حرارت آب، اکسیژن محلول و سختی کل بهترتیب به مقدار 2± 26 درجه سانتیگراد، 1± 2/6 میلیگرم در لیتر و 3± 4/186 میلیگرم در لیتر ثبت گردید. برای کنترل سطح آمونیاک بعد از افزودن آن به آب، دما و pH اندازهگیری شد. در این راستا از محلول 1/0 نرمال KOH برای تثبیت pH آب در حدود 2/8 استفاده شد و با کمک بخاریهای اتوماتیک دمای آب در حدود 1± 26 درجه سانتیگراد ثابت نگه داشته شد. محلول آمونیاک مورد نیاز برای هر تیمار بهصورت روزانه تهیه و تعویض آب حداقل 2 ساعت بعد از آماده سازی محلول آمونیاک انجام شد. با در نظر گرفتن مقدار pH و دما، میزان آمونیاک یونیزه شده و آمونیاک مولکولی با استفاده از جدول استاندارد ارائه شده توسط Emerson و همکاران در سال 1975 محاسبه گردید (3).
شاخصهای رشد: آنالیز شاخصهای رشد بر اساس زیست سنجی در پایان دوره با بیومتری 20 عدد ماهی از هر تانک طبق الگوی تصادفی محاسبه شد. برای این کار ابتدا ماهیهایی که بهطور تصادفی نمونهبرداری شده بودند، با کمک 100 میلیگرم/لیتر یوجینول (Sigma Co. USA) بیهوش گردیدند و سپس بهصورت انفرادی با استفاده از ترازوی دیجیتال با دقت 1/0 گرم توزین شدند. در این بررسی طول ماهیان توسط خطکش با دقت 1 میلیمتر ثبت گردید. شاخصهای رشد از قبیل افزایش وزن بدن (WG)، نرخ رشد ویژه (SGR)، نرخ رشد روزانه (GR)، درصد افزایش وزن (%BWI)، عامل وضعیت (CF) و درصد بازماندگی (SR) براساس معادلههای ریاضی که توسط Turchini و همکاران در سال 2003 ارائه شده است، محاسبه شدند (20).
جهت ثبت علائم کلینیکی در طی دوره، ماهیها به صورت روزانه مورد بررسی و مشاهده قرار گرفتند تا در صورت بروز تلفات، علائم کلینیکی و رفتارهای غیر طبیعی در آنها ثبت گردد. در پایان دوره، جهت انجام مطالعههای هیستوپاتولوژی، ماهیها توسط محلول 100 میلیگرم/لیتر از یوجینول بیهوش شده و پس از کالبدگشایی محوطه شکمی و سرپوش آبششی، علائم غیرطبیعی در آبششها و اندامهای داخلی ثبت گردید، سپس از کلیه و آبشش ماهیها نمونهبرداری صورت گرفت. نمونههای بافت آبشش و کلیه به ظرفهای حاوی فرمالین 10 درصد منتقل شدند و پس از گذشت 12 ساعت فرمالین مذکور تعویض گردید. سپس طبق روش استاندارد مراحل آبگیری و پارافینه کردن نمونههای بافتی انجام شد و مقاطع 5 میکرومتری از بافتها تهیه و روی لام چسبانده شد و در انتها با استفاده از رنگ هماتوکسیلین - ائوزین رنگآمیزی مقاطع بافتی صورت گرفت (17). مقاطع بافتی آماده شده با کمک میکروسکوپ نوری (Nikon ECLIPSE E100) با بزرگنمایی 100 تا 400 برابر مطالعه شدند.
آنالیزهای آماری: جهت انجام آنالیزهای آماری دادهها از نرم افزار SPSS18 و Excel (Microsoft office) استفاده شد. تحلیل دادهها با کمک آنالیز واریانس یکطرفه و برای بررسی معنیدار بودن میانگینها از آزمون دانکن استفاده شد. نتایج نهایی بهصورت میانگین ± انحراف استاندارد گزارش شدند.
بازماندگی و مشاهدات هیستوپاتولوژی: در مطالعه حاضر مواجهه با دوز مزمن 1/0 میلیگرم در لیتر آمونیاک تلفاتی در ماهیهای گروه تیمار شده با آمونیاک به همراه نداشت و در گروه شاهد نیز هیچ تلفاتی مشاهده نشد. به عبارت دیگر نرخ بازماندگی 100 درصد ثبت شد.
در بررسیهای میکروسکوپی مقاطع بافتی با استفاده از میکروسکوپ نوری، غلظت مزمن آمونیاک منجر به ایجاد اِدم و جدا شدن اپیتلیوم پوششی لاملاهای ثانویه گردید. به علاوه هایپرپلازی در لاملاها از علائم تیپیک در این گروه بود (تصویر1). همچنین مقاطع تهیه شده از بافت آبشش ماهیهای گروه شاهد هیچگونه آسیبی را نشان نداد (تصویر 1).
علیرغم مشاهده نشدن آسیب به بافت کلیه در ماهیهای گروه شاهد (تصویر 2)، مشاهده میکروسکوپی مقاطع تهیه شده از کلیه ماهیهای تیمار شده با 1/0 میلیگرم در لیتر آمونیاک بیانگر نکروز گسترده در توبولهای کلیوی، پر خونی و انسداد در بافت بینابینی کلیه و نیز رسوب هموسیدرین و تجمع ملانوماکروفاژها ناشی از تأثیر دوز تحت حاد آمونیاک بود (تصویر 2).
سنجش شاخصهای رشد: بر اساس نتایج حاصل از بررسی شاخصهای رشد در ماهیهای کپور معمولی در مطالعه حاضر، پس از گذشت 30 روز و در پایان دوره آزمایش طول و وزن نهایی، اختلاف وزن، درصد رشد و ضریب رشد ویژه در گروه شاهد در مقایسه با گروه تیمار شده با دوز تحت حاد آمونیاک اختلاف معنیداری مشاهده شد (05/0>P). به عبارت دیگر شاخصهای رشد ذکر شده در ماهیهای گروه شاهد در مقایسه با ماهیان گروه تیمار بهطور معنیداری بالاتر ثبت گردید (جدول 1). همچنین اگر چه نتایج حاصل شده از محاسبه شاخص ضریب چاقی در ماهیهای گروه شاهد بیشتر از ماهیهای گروه تیمار شده با آمونیاک محاسبه شد، اما این اختلاف معنیدار نبود (05/0<P).
آمونیاک در اثر کاتابولیسم پروتئین تولید میشود که خاصیت سمی داشته و میتواند در دوزهای بالا منجر به بروز تلفات سنگین شود. افزایش سطح این ترکیب در مزارع پرورش ماهی که امکان تعویض آب در آنها وجود ندارد یا به مقدار کم در آنها تعویض آب انجام میگیرد بهطور شایع دیده میشود. تجمع آمونیاک خصوصاً بعد از سمپاشی استخرها به دلیل کاهش جمعیت فیتوپلانکتونها بهعنوان مصرف کننده ترکیبهای نیتروژندار و همچنین استفاده از آنتیبیوتیکها به دلیل از بین بردن باکتریهای تجزیه کننده ترکیبهای ازته مانند نیتروزوموناس و نیتروباکترها (باکتریهای دخیل در نیتریفیکاسیون) روی میدهد (5،24). چنانچه مدیریت صحیح در استخرهای پرورشی صورت بگیرد مواجهه با غلظت کشنده آمونیاک کاهش مییابد، با این حال حذف 100 درصد آمونیاک و همچنین ثابت نگه داشتن آن در حد کمتر از آستانه آسیبرسان بدون شک امری بسیار مشکل است. ماهیها ممکن است به دو روش نسبت به تحمل مقادیر بسیار ناچیز آمونیاک آداپته شوند، یکی از این راهها ساخت گلوتامات با افزایش سنتز گلوتامین و جذب NH3 است (21). راه دیگر خنثی کردن خاصیت سمی آمونیاک با تبدیل آن به اوره است که در گونههای دریایی مانند کوسهها دیده میشود (23). با وجود چنین مکانیسمهای کارآمدی، ماهیها به ندرت توانایی تحمل غلظتهای بالای آمونیاک را دارند و اگر این غلظتها موجب تلفات نشود، میتواند منجر به بروز استرس، کاهش رشد و سطح پارامترهای ایمنی و همینطور باعث ایجاد آسیب به بافتهای مختلف بدن ماهیها شود. در مطالعه حاضر مواجهه طولانی مدت با 1/0 میلیگرم/لیتر اگرچه منجر به تلفات در ماهیان کپور معمولی نگردید اما باعث آسیبهای بافتی واضح در آبشش و کلیه و نیز کاهش رشد گردید. بهطور کلی غلظت غیرکشنده و امن آمونیاک مولکولی برای گونههای مختلف ماهیان بین 2/0–05/0 میلیگرم/لیتر عنوان شده است (8،20). اما ظاهراً اگرچه این غلظت باعث تلفات نمیشود ولی ممکن است منجر به ضعف سیستم ایمنی و نیز کاهش بازدهی تولید شود؛ به عبارت دیگر تأثیر غلظتهای تحت حاد آمونیاک بسته به شرایط مختلف میتواند بسیار متفاوت باشد. به عنوان مثال نتایج مطالعه Lemarie و همکاران در سال 2004 بر روی باس دریایی (Dicentrarchus labrax) نشان داد غلظتهای مزمن 24/0 و 26/0 میلیگرم در لیتر، فاکتورهای رشد را تحت تأثیر قرار نمیدهد (12). همچنین در مطالعه دیگری که توسط Le Ruyet و همکاران در سال 1998 بر روی ماهیان توربوت (Scophthalmus maximus) و سیم دریایی (pagrus Pagrus) انجام شد نتایج مشابهی برای غلظت مزمن 18/0 و 11/0 میلیگرم در لیتر آمونیاک به همراه داشت (11). اما Foss و همکاران در سال 2004 گزارش کردند که غلظت 17/0 میلیگرم در لیتر آمونیاک و غلظتهای بالاتر منجر به کاهش معنیدار رشد در ماهی کاد (Gadus morhua) طی 96 روز پرورش میشود (4). غلظت 032/0 و 068/0 میلیگرم در لیتر آمونیاک به مدت 42 روز تأثیری بر فاکتورهای رشد در ماهی Strongylocentrotus droebachiensis نداشت ولی رشد گنادها بهصورت معنیدار کاهش یافت و افزایش مرگ و میر را به همراه داشت (19). در مطالعه Zhang و همکاران در سال 2019 مواجهه با آمونیاک مزمن به مدت 9 هفته در ماهیان سیم جوان (Megalobrama amblycephala) منجر به کاهش پارامترهای تولید، افزایش آنزیمهای دخیل در استرس اکسیداتیو و نیز آسیبهای بافتی به آبشش و رودهها ثبت گردید (25). همچنین در مطالعه Wang و همکاران در سال 2017 مواجهه با آمونیاک مزمن منجر به آسیبهای بافتشناسی کبد و آبشش در کپور نقرهای (Hypophthalmichthys molitrix)، کپور سرگنده (Aristichthys nobilis) و ماهی قرمز (Carassius auratus gibelio) گردید (22). نتایج مطالعه حاضر نیز نشاندهنده حساس بودن ماهی کپور معمولی به پرورش در محیطی با غلظت 1/0 میلیگرم در لیتر آمونیاک در دورههای مواجهه بیش از 1 ماه میباشد به گونهای که میتواند آسیبهای واضح در بافتهای کلیه و کبد ایجاد کند. با توجه به اینکه دو عضو آبشش و کلیه اصلیترین وظیفه را در تنظیم اسمزی ماهی به عهده دارند، وجود آمونیاک در مقادیر تحت حاد ممکن است تداخل در تنظیم فشار اسمزی خون را به همراه داشته باشد، که نیازمند به تحقیق و مطالعه بیشتر است.
شرایط اقیمی در کشور به گونهای میباشد که در اکثر نقاط با مشکل کمآبی روبرو است به همین دلیل در مزارع پرورش گرمابی در کشور پس از آبگیری استخرها تا پایان دوره پرورش به ندرت تعویض آب صورت میگیرد و گاهی اوقات این مزارع در طی سال تنها یک بار آبگیری میشوند، لذا افزایش آمونیاک کل و مولکولی در این مزارع حداقل در حدی بالاتر از غلظت مجاز دور از ذهن نمیباشد. به عبارت دیگر اگرچه شرایط مسمومیت حاد با آمونیاک در این استخرها مشاهده نمیشود اما مواجهه به سطوح 1/0 میلیگرم/لیتر و حتی بالاتر در این شرایط رخ میدهد که این غلظتها معمولاً بر روی بازدهی و حتی سلامت ماهیان تأثیر منفی دارد. در یک مطالعه جداگانه که توسط Mazandarani و همکاران در سال 2015 صورت گرفت مواجهه طولانی مدت با غلظت 2/0 میلیگرم/لیتر در ماهی کلمه خزری باعث کاهش معنیدار در شاخصهای رشد گردید، همچنین ماهیان مواجهه شده با غلظت آمونیاک مذکور پس از 1 ماه دچار کمخونی ماکروسیتیک هایپوکرومیک شدند (13). در مطالعه حاضر نیز این مواجهه باعث عوارض بافتی واضح در کلیه و آبشش و تأثیرات منفی بر شاخص رشد بوده است. به همین دلیل در شرایط کم آبی کشور، میتوان گفت یکی از عواملی که بر روی بازدهی تولید تأثیرگذار است افزایش آمونیاک مولکولی استخرها در غلظتهای غیر کشنده اما آسیبرسان میباشد. لذا پیشنهاد میشود برای رسیدن به بازدهی بالاتر در مزارع گرمابی کپور معمولی و همچنین جلوگیری از وارد شدن خسارتهای اقتصادی و ممانعت از هدر رفت هزینهها، مقدار آمونیاک آب مزارع پرورشی در پایینترین سطح ممکن و بسیار کمتر از 1/0 میلیگرم در لیتر کنترل شود. هرچند برای رسیدن به حداقل غلظت آسیبرسان به بافتها بررسیهای بیشتری نیاز است.
نویسندگان مطالعه حاضر وظیفه خود میدانند مراتب قدردانی خود را نسبت کارکنان مرکز تحقیقات شیلات گرگان که در اجرای این مطالعه ما را یاری نمودند، اعلام نمایند.
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
References