Antifungal Effects of Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum on the Ascospharea apis Causative Agent of Honey bee Chalkbrood Disease

Document Type : Microbiology and Immunology

Authors

1 1Member of Scientific Board of Research Centre for Agriculture and Natural Resources of West Azerbaijan, Urmia, Iran

2 2Department of Microbiology, Faculty of Veterinary Medicine, Urmia University, Urmia, Iran

Abstract

BACKGROUND: Honey bee Chalkbrood disease is a fungal disease that is distributed in apiaries in the north provinces of Iran. Chalkbrood causative agent is Ascospaharea apis that can survive in colonies products for many years. Many chemical materials are used for control of Chalkbrood disease in honeybee colonies that can make some problems in honeybee consumer products, so  that survival of safe material and methods for honeybee colonies treatments is a important aim in honeybee research field.
OBJECTIVES: In this study antifungal effects of the Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum on the Ascospharea apis causative agent of honey bee Chalkbrood disease is examined.
METHODS:  Simultaneous inoculation, Agar spot, Confrontation assay, Overlay assay methods are used. LABs are cultured in MRS and A.apis is cultured in SDA media.
RESULTS: L.casei and L.acidophilus had moderate effects on the A.apis growth, but B.bifidum and LABs cell free supernatants(CFS) could not  inhibit growth of  this fungi.
CONCLUSIONS: Results of this survey show that LABs have antifungal activities on the honey bee Chalkbrood disease agent in culture medium and may be used as an alternative method for control of this disease in the honeybee colonies.

Keywords

Full Text

زنبوران عسل حشرات اجتماعی‌اند و ارتباط متقابل آن‌ها با بشر تاریخچه طولانی دارد. انسان فراورده‌های زنبورعسل از جمله عسل، گرده، موم، ژله رویال و زهر را علاوه بر مصارف غذائی، درصنایع داروسازی و آرایشی و صنایع دستی مورد استفاده قرار می‌دهد. زنبوران عسل فایده بسیار مهم دیگری برای بشر دارند که گرده افشانی گیاهان و درختان است.گرده افشانی گیاهان نقش بسیار مهمی در سلامتی و تغذیه انسان دارد. بطوریکه  از هر سه لقمه غذای انسان یک لقمه آن بطور مستقیم و غیر مستقیم وابسته به گرده افشانی توسط حشرات است. زنبوران عسل به عنوان مهمترین گرده افشانها نقش بسیار زیادی در رشد و توسعه کشاورزی مدرن کل جهان دارند، بطوریکه بر اساس تخمین‌ها، 52 نوع از 115 نوع غذای انسان وابسته به نقش زنبورعسل است و بدون وجود زنبورعسل، کاهش 10 الی 90 درصد در آن‌ها اتفاق می‌افتد(22). ارزش گرده افشانی زنبورعسل در کشاورزی آمریکا بیش از 14 میلیارد دلار در سال است(29) و ارزش اقتصادی گرده افشانی زنبورعسل در کل جهان در سال  2005  بیش از 153 میلیارد یورو بر آورد شده است(10). ارزش زنبورعسل در گرده افشانی گیاهان طبیعی براحتی تخمین زده نمی‌شود(28).

بیماری نوزاد گچی یک مایکوزیس مهاجم زنبوران عسل .Apis mellifera L است که بوسیله قارچ آسکوسفرا آپیسAscosphaera apis  ایجاد می‌گردد و منحصراً نوزادان زنبور را تحت تأثیر قرار می‌دهد. بیماری گرچه برای لاروها کشنده است ولی منجر به نابودی یک کلنی کامل نمی‌گردد. اما می‌تواند باعث کاهش چشمگیر تعداد زنبورها و تولید کلنی با کاهش تولید عسل به میزان 5 الی 37 درصد گردد (15). بیماری نوزاد گچی در حال حاضر در کلنی‌های زنبورعسل سراسر دنیا یافت می‌شود و نشانه‌های وجود دارد که در سالیان اخیر میزان شیوع آن افزایش یافته است(16). بیماری نوزاد گچی در زنبوران عسل در ابتدای سال 1900 تشخیص داده شد  و تا آخر نیمه دوم قرن بیستم بطور وسیعی در خارج از اروپا مشاهده نگردیده بود(2).

عامل بیماری نوزاد گچی قارچ آسکوسفرا آپیس Ascosphaera apis    است که یک قارچ هتروتالیک می‌باشد، بدین معنی که اسپورها تولید دو نوع میسلیوم متفاوت می‌کنند که به همدیگر وصل می‌شوند. اسپورها در داخل توده‌های کروی شکل در داخل کیست‌های اسپوری (اجسام میوه‌ای) قهوه‌ای تیره سبز رنگ که حدوداً  60 نانومتر قطر دارند، تشکیل می‌شوند. اسپورها بسیار مقاوم بوده و حداقل 15 سال عفونت زا باقی می‌مانند. لاروهای زنبور اسپورهای قارچ آسکوسفرا آپیس را همراه با غذا می‌بلعند. اسپورها جوانه زده و میسلیوم‌ها در داخل محوطه ی روده، بویژه در انتهای روده(کور)، شروع به رشد می‌کنند. سپس میسلیوم‌ها به داخل دیواره‌ی روده لارو نفوذ کرده و نهایتاً انتهای روده را سوراخ می‌کنند. غالباً ناحیه سر بدون آسیب باقی می‌ماند. هنگام بروز این اتفاقات، اجسام میوه‌ای قارچ در خارج از بدن لارو تلف شده تشکیل می‌شوند. معمولاً در طبیعت انتشار بیماری نوزاد گچی در داخل یک کلنی محدود است، که احتمالاًً به دلیل کم بودن تعداد لاروهائیست که با میسلیوم‌های هر دو سویه ی قارچ آلوده می‌گردند که در این صورت اسپورهای عفونت زا تشکیل نمی‌شوند (15 ،2). بهترین شرایط برای رشد این قارچ در داخل کلنی‌های زنبورعسل رطوبت بالا و عدم تهویه مناسب کندوهاست (14) که این شرایط در مناطق شمالی ایران و زنبورستانهائی که شرایط بهداشتی و پرورشی کلنی‌ها را رعایت نمی‌کنند فراهم بوده و میزان شیوع بیماری نوزاد گچی در زنبوزستانهای استان‌های شمالی کشور بسیار بالاتر از سایر مناطق است. بطوریکه در مناطق خشک و نیمه مرطوب ایران شکل بالینی بیماری نوزاد گچی  کمتر مشاهده می‌شود.

برای کنترل و درمان این بیماری از روش‌ها و مواد مختلفی استفاده شده است ولی با توجه به شیوع پائین بیماری، استفاده از داروهای ضدقارچی در کلنی‌های زنبورعسل چندان مقرون به صرفه نبوده و محققین در جستجوی روش‌های سالمتری می‌باشند. روش‌های مدیریتی یکی از روش‌های سالم و مقرون به صرفه در مبارزه و کنترل بیماری‌های زنبورعسل است که مورد توجه زنبورداران و محققین بهداشت زنبورعسل قرار گرفته است از جمله این روش‌ها می‌توان به تقویت کلنی‌های ضعیف از طریق دادن نوزاد از کلنی‌های قویتر، ادغام کلنی‌های ضعیف با کلنی‌های قوی، محافظت از کلنی‌ها در برابر شرایط نامساعد جوی، کاهش رطوبت داخل کلنی و تهویه مناسب آن‌ها، نابود کردن قاب‌های آلوده و حتی کلنی‌های شدیداً آلوده و از بین بردن قاب‌های کهنه نام برد (39، 33). علی رغم اثرات نامناسب مواد شیمیائی روی بهداشت کلنی‌های زنبورعسل و آلودگی فراورده‌های آن‌ها با این مواد و بروز خطراتی در مصرف کنندگان آن‌ها(9). مواد شیمیائی زیادی جهت کنترل بیماری نوزاد گچی زنبورعسل مورد استفاده قرار گرفته است که می‌توان به تعدادی از آن‌ها ا ز جمله اسید سوربیک، سدیم پروپیونات، متیل پاراهیدروکسی بنزوآت، تیابندازول، بنومیل، گریزوفولوین، نپاجین، سیکلوهگزامید، آمفوتریسین ب، نیستاتین، مایکوستاتین، مایکوسیدین و سیترال اشاره نمود که در شرایط محیط کشت یا داخل آزمایشگاه و داخل کلنی‌های زنبورعسل مورد استفاده قرار گرفته‌اند (14). مشکل اصلی این مواد این است که هیچکدام از آن‌ها بر اسپورهای قارچ مؤثر نمی‌باشند، از سوی دیگر این مواد امکان دارد روی بقا و طول عمر نوزادان و زنبوران تأثیر منفی داشته باشند (12) و همچنین منجر به بروز سویه مقاومی از قارچ مذکور در برابر داروهای مختلف گردند.در کنار بررسی‌هائی که روی مواد شیمیائی صورت گرفته است توجه زیادی هم به مواد طبیعی و کم خطر برای زنبورعسل و مصرف کنندگان فراورده‌های آن شده است و محققین موادی از جمله تیمول، اسیدهای آلی از جمله سالیسیلیک اسید، اسید استیک و بره موم زنبورعسل را مورد ارزیابی قرار داده‌اند (1،21،30).

استفاده از باکتری‌های اسیدلاکتیک یا پروبیوتیک‌ها در کنترل و درمان بیماری‌های انسان و دام یکی از روش‌های میانبر است که با توجه به سالم بودن برای مصرف کنندگان و حضور آن‌ها به عنوان فلور طبیعی دستگاه گوارش انسان و دام بسیار مورد توجه قرار گرفته اند. بررسی‌های مختلف نشان داده است که این باکتری‌ها دارای اثرات ضدباکتریائی، ضد قارچی (25) و ضد انگلی زیادی می‌باشند و در صورت رعایت اصول لازم، می‌توانند حتی به عنوان دارو هم مورد استفاده قرار گیرند. استفاده از این باکتری‌ها در صنعت زنبورداری سابقه زیادی ندارد و تنها چند بررسی ابتدائی نشان داده‌اند که باکتری‌های اسیدلاکتیک جداسازی شده از زنبوران عسل دارای اثرات چشمگیری روی عوامل بیماریزای باکتریائی آن از جمله باکتری پنی باسیلوس لاروا عامل بیماری لوک آمریکائی می‌باشند و در صورت اضافه کردن به غذای نوزادان زنبورعسل می‌توانند مانع از رشد باکتری مذکور و بروز علائم بیماری گردند (6،8،11،31).

 در مورد اثر ضد قارچی باکتری‌های اسیدلاکتیک روی قارچ آسکوسفرا آپیس بررسی‌های معدودی انجام گرفته است. Sabaté و همکاران  در سال 2009 و Li و همکاران در سال 2012 تعدادی از باکتری‌های همزیست در دستگاه گوارش زنبور عسل را مورد بررسی قرار داده‌اند که دارای اثرات ضد قارچی روی آسکوسفرا آپیس می‌باشند.  همچنین Mohamed O. M. Omar  و همکاران در سال 2014 اثرات آنتی گونیستی برخی از باکتری‌ها از جمله باسیلوس‌های جداسازی شده از روده زنبوران بالغ بر روی این قارچ را بررسی و مشخص نموده‌اند که  باکتری B. subtilis دارای بیشترین اثر ضدقارچی روی آن است.

با توجه به اثرات ضد قارچی باکتری‌های اسیدلاکتیک روی قارچ‌های مختلف و اهمیت پرداختن به روش‌های درمانی جدید و سالم در کلنی‌های زنبور عسل، تصمیم گرفته شد اثر ضد قارچی باکتری‌های لاکتوباسیلوس کازئی ، لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و بیفیدوباکتریوم بیفیدوم روی قارچ آسکوسفرا آپیس عامل بیماری نوزاد گچی زنبورعسل مورد ارزیابی قرار گیرد و شرایط امکان بررسی‌های بیشتری روی اثرات درمانی این باکتری‌ها، سایر باکتری‌های اسیدلاکتیک و پروبیوتیک‌ها روی عوامل بیماریزای نوزادان زنبورعسل در داخل کلنی‌های زنبورعسل فراهم نموده و در نهایت بتوان با تقویت فلور باکتریائی زنبورعسل بیماری‌های میکروبی آن را کنترل یا درمان نمود.

 

مواد و روش‌کار

قارچ آسکوسفرا آپیس: ابتدا نمونه‌های از لاروهای گچی شده زنبورعسل که از زنبورستانهای شمال کشور جمع آوری گردیده و در بخش تحقیقات بیماری‌های زنبورعسل و کرم ابریشم موسسه رازی مورد بررسی و تأیید قرار گرفته بودند تهیه شد. برای کشت و جداسازی قارچ آسکوسفرا آپیس  لاروهای گچی شده را در شرایط استریل بصورت پودر در آورده و مقداری از آنرا در سطح پلیت‌های حاوی محیط کشت سابرودگستروز آگار پخش نموده و به مدت حداقل 5 شبانه روز در دمای  C˚25 و شرایط بی هوازی قرار داده تا کلنی‌های سفید رنگ قارچ ظاهر شوند سپس پلیت‌ها را در شرایط هوازی قرار داده تا اسپورهای قارچ تشکیل شوند. بعد از ظاهر شدن اسپورها سطح پلیت‌ها را با مقداری آب معمولی یا سرم فیزیولوژی استریل پوشانده و با استفاده از پیپت پاستور کج یا آنس حلقوی، سطح کلنی‌های قارچ را خراش داده تا اسپورها در آب یا سرم فیزیولوژی وارد شوند. بعد از جدا شدن اسپورهای قارچ از میسیلیوم‌های آن، مایع حاصله را با استفاده از سرنگ استریل جمع آوری نموده و در لوله‌های آزمایش استریل ریخته و تا زمان بررسی‌های بعدی در یخچال نگهداری شدند(1).

باکتری‌های اسیدلاکتیک(LAB): در این بررسی از باکتری‌های لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس(PTCC NO 1643) و لاکتوباسیلوس کازئی(PTCC NO 1608) و بیفیدوباکتریوم بیفیدوم (PTCC NO 1644)استفاده گردید. این باکتری‌ها را بصورت لیوفیلیزه از سازمان پژوهشهای صنعتی ایران تهیه نموده و طبق دستورالعمل، برای فعال نمودن آن‌ها از محیط کشت MRS  استفاده گردید و پلیت‌ها و لوله‌های حاوی باکتری‌های لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و بیفیدوباکتریوم بیفیدوم را در شرایط بی هوازی و دمای  C˚ 37 و باکتری لاکتوباسیلوس کازئی در شرایط هوازی و دمای C˚37 به مدت 24 الی 48 ساعت  قرار داده شدند(8). سپس از محتویات لوله‌ها کشت مجدد تهیه نموده و در شرایط لازم قرار داده تا از میزان رشد طبیعی باکتری‌ها اطمینان حاصل گردد. 

بررسی اثرات ضد قارچی باکتری‌های اسیدلاکتیک  روی قارچ آسکوسفرا آپیس: برای اینکار از روش‌های زیر استفاده گردید:

1.    روش Overlay assay

در این روش ابتدا باکتری‌های اسیدلاکتیک را بصورت دو خط موازی به فاصله  cm 1 از هم در سطح محیط کشت MRS آگار کشت داده و در دمای C˚37 و شرایط بی هوازی به مدت 24 ساعت قرار داده تا رشد کامل نمایند. سپس مقدار  ml 1 از محلول  اسپورهای قارچ آسکوسفرا آپیس که به روش فوق جمع آوری گردیده است را در ml 10 محیط کشت سابرودگستروز آگار نرم(دمای C˚45) ریخته و بصورت یکنواخت درآورده و در سطح پلیت‌های واجد باکتری‌های اسیدلاکتیک ریخته و مدتی صبر گردید تا محیط منعقد گردد سپس به مدت 5 شبانه روز در شرایط بی هوازی و دمای C˚25 قرار داده و هر 24 ساعت میزان رشد کلنی‌های قارچ آسکوسفرا آپیس اندازه گیری شد. میزان رشد قارچ نسبت به سطح کل پلیت سنجیده شد. معیار سنجش به شکل زیر بوده است(25).

-= عدم مشاهده مهار رشد

+= عدم رشد قارچ در 0.1 الی 3 درصد سطح پلیت

++= عدم رشد قارچ در 3 الی 8 درصد سطح پلیت

+++= عدم رشد قارچ در بیش از 8 درصد سطح پلیت

2.    روشConfrontation Assay: در این روش ابتدا باکتری‌های اسید لاکتیک به شکل دو نوار موازی به فاصله cm 1 در سطح محیط کشت MRS  آگار کشت داده و در شرایط مناسب به مدت 24 ساعت قرار داده شدند، بعد از رشد باکتری‌های اسید لاکتیک، با استفاده از اسکالپل یا آنس نوک تیز به اندازه mm25 از کلنی قارچ آسکوسفرا آپیس را برداشته و در وسط دو خط باکتری‌های اسید لاکتیک قرار داده و به مدت 5 شبانه روز در شرایط بی هوازی و دمای C˚25 قرار داده شد بعد از این مدت پلیت‌ها بررسی شد و میزان رشد قارچ مذکور در مقایسه با گروه‌های کنترل سنجیده شد(3).

3.    روش  Agar Spot: در این روش ابتدا باکتری‌های اسیدلاکتیک را بصورت نقطه‌ای در سطح محیط کشت MRS  آگار کشت داده و در شرایط مناسب به مدت 24 ساعت قرار داده تا رشد نمایند سپس  ml 1  از مایه اسپور قارچ را در ml 10محیط کشت سابرودگستروز آگار نرم ریخته و به هم زده تا بطور یکنواخت حل گردد و سپس به آرامی روی لکه‌های باکتری‌های اسیدلاکتیک ریخته و مدت نیم ساعت صبر نموده تا منعقد گردد. سپس پلیت‌ها را در دمای C˚25و شرایط بی هوازی قرار داده و 72 ساعت بعد از کشت قطر‌هاله ممانعت از رشد قارچ در اطراف لکه‌های باکتری‌های اسیدلاکتیک اندازه گیری شد.

4.    روش کشت توأم Simultaneous Inoculation: در این روش ابتدا باکتری‌های اسیدلاکتیک را به میزان  106 CFU/mL در محیط کشت  MRS  آگار نرم مخلوط نموده و بعد از مخلوط شدن یکنواخت و منعقد شدن محیط کشت، قارچ آسکوسفرا آپیس را در مرکز پلیت‌های مذکور کشت داده و در دمای C˚30به مدت 48 ساعت قرار داده و بعد از این مدت قطر کلنی‌های قارچ سطح محیط کشت را در گروه‌های کنترل و تیمار اندازه گیری نموده و با هم مقایسه گردید(33).

5.    تهیه محلول روئی عاری از سلول(CFCS) باکتری‌های اسید لاکتیک:  برای تهیه محلول روئی عاری از سلول (Cell Free Culture Supernatant)  باکتری‌های اسید لاکتیک، آن‌ها را در محیط براث کشت داده و بعد از 24 ساعت که باکتری‌ها بطور کامل رشد نمودند محتویات لوله‌ها را در 5000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ نموده و مایع روئی را از فیلترهای استریل µm 22/ عبور داده تا سلول‌های باکتری و قطعات باقی مانده آن‌ها جداسازی گردد. مایع صاف شده تا زمان استفاده در یخچال نگهداری شد(13).

6.    اندازه گیری pH  مایع روئی عاری از سلول(CFS )لاکتوباسیلوسه ا: با استفاده از دستگاه pH مترpH  مایع روئی عاری از سلول لاکتوباسیلوس‌ها را در دمای C˚20اندازه گیری شد که در جدول شماره  ذکر شده اند

7.    بررسی اثرات ضد قارچی مایع روئی عاری از سلول لاکتوباسیلوس‌ها روی قارچ آسکوسفرا آپیس: برای اینکار ابتدا  ml 1 از محلول مایه اسپور قارچ را در داخل ml 20 از محیط کشت سابرودگستروز آگار نرم (C˚45) ریخته و بطور یکنواخت حل نموده و در پلیت‌های شیشه‌ای ریخته و مدتی صبر نموده تا بطور کامل منعقد و سفت گردد. سپس با استفاده از پانچر چاهک‌هایی را در سطح آگار ایجاد نموده و  µl 100از مایع روئی فاقد سلول باکتری‌های اسید لاکتیک را در چاهک‌ها آگار ریخته و مدتی صبر نموده تا جذب محیط شوند. سپس پلیت‌ها را در دمای C˚25و شرایط بی هوازی به مدت 5 شبانه روز قرار داده تا قارچ آسکوسفرا آپیس رشد نماید. بعد از این مدت قطر‌هاله ممانعت از رشد اطراف چاهک‌ها با استفاده از خط کش اندازه گیری گردید.

 

نتایج

pH مایع روئی عاری از سلول(CFS )لاکتوباسیلوس‌ها: pH مایع روئی عاری از سلول (CFS)لاکتوباسیلوس‌ها در جدول 1 ذکر شده اند. همچنانکه در جدول مشاهده می‌شود pH  مایعات روئی عاری از سلول و همچنین محلول حاوی باکتری‌های کاملاًً رشد کرده در محدوده اسیدی می‌باشند ولی pH  محیط کشت سابرودگستروز آگار 6 بوده و قارچ آسکوسفرا آپیس در این محدوده قابل رشد است.

pH محیط‌هایی کشت مورد استفاده: برای بررسی اثرات احتمالی تغییرات pH حاصل از رشد باکتری‌های اسیدلاکتیک روی قارچ مذکور تصمیم گرفته شد که pH محیط‌هایی کشت قارچ و لاکتوباسیلوس‌ها در دمای C˚20 اندازه گیری شود. هدف از این کار این بود که مشخص شود که قارچ آسکوسفرا آپیس در چه محدوده‌ای از pH  رشد می‌نماید و زمانی که باکتری‌های اسیدلاکتیک رشد نموده و pH محیط به حدود 4 می‌رسد آیا قارچ مذکور قادر به رشد خواهد بود.

روش Overlay assay: نتایج حاصل از این روش در جدول شماره 3 ذکر شده است. همچنانکه مشاهده می‌شود دو باکتری لاکتوباسیوس کازئی و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در اطراف دو خط موازی کشت مانع از رشد قارچ آسکوسفرا گردیده‌اند ولی با توجه به معیار تأثیر باکتری‌ها روی قارچ‌ها به این روش این میزان تأثیر چشمگیر نبوده و در حد عدم تأثیر در نظر گرفته می‌شود و باکتری بیفیدوباکتریوم بیفیدوم مانع از رشد قارچ آسکوسفرا آپیس نگردید.

روش Confrontation Assay: بعد از اینکه پلیت‌ها به شیوه‌ای که ذکر شد آماده گردید و به مدت 5 شبانه روز در شرایط بی هوازی و دمای C˚ 25 قرار داده شد، میزان رشد قارچ مذکور در مقایسه با گروه‌های کنترل ارزیابی گردید. بدینصورت که اگر قارچ رشد نموده و تشکیل آسک‌ها را بدهد نتیجه منفی، اگر قارچ رشد نموده ولی آسک‌ها تشکیل نشوند + و اگر در سطح پلیت هیچگونه پرگنه‌ای از قارچ مشاهده نشود ++ در نظر گرفته می‌شود. همچنانکه در جدول 4 مشاهده می‌شود باکتری‌های لاکتوباسیلوس کازئی و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مانع از رشد میسلیوم‌های قارچ آسکوسفرا آپیس نشده‌اند ولی حتی بعد از چندین روز هم از تشکیل آسک‌ها ممانعت به عمل آورده و سطح پلیت فقط پوشیده از میسلیوم‌های سفید رنگ قارچ بود. باکتری بیفیدوباکتریوم بیفیدوم تأثیری روی رشد قارچ آسکوسفرا آپیس نداشته است.

روش Agar Spot: 5 روز بعد از اینکه  پلیت‌ها در شرایط بی هوازی و دمای C˚ 25 قرار داده شد هر 24 ساعت یکبار آن‌ها را مورد مشاهده قرار داده و قطر‌هاله ممانعت از رشد اطراف لکه‌های باکتری‌های اسیدلاکتیک اندازه گیری می‌شد و اینکار به مدت 144 ساعت ادامه پیدا کرد. نتایج در جدول 10 ذکر شده اند. با توجه به اینکه قطر لکه حاصل از کشت و رشد باکتری‌های اسیدلاکتیک در سطح پلیت‌ها حدود mm 5 می‌باشد لذا در حین اندازه گیری قطر‌هاله ممانعت از رشد در اطراف لکه‌ها اندازه آن‌ها هم جزو‌هاله ممانعت از رشد در نظر گرفته می‌شود.  همانگونه که در جدول 5 مشاهده می‌شود قطر‌هاله ممانعت از رشد اطراف لکه‌های باکتری‌های لاکتوباسیلوس کازئی و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ابتدا بیشتر از mm 5 می‌باشد که بتدریج این میزان کمتر شده و در روزهای آخر بررسی در لاکتوباسیلوس کازئی به mm 5 رسیده و در لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس به طور کامل از بین می‌رود و قارچ سطح لکه‌های باکتری را هم می‌پوشاند. باکتری بیفیدوباکتریوم بیفیدوم تأثیر زیادی در مهار رشد قارچ آسکوسفرا آپیس نداشته و از روز دوم بررسی سطح پلیت و لکه‌های باکتری توسط قارچ پوشیده شد. این نتایج نشان می‌دهد که باکتری‌های اسیدلاکتیک استفاده شده دارای اثر مهاری روی رشد قارچ آسکوسفرا آپیس می‌باشند ولی این اثر به تدریج از بین رفته و قارچ در نهایت رشد کامل خواهد داشت. اما باکتری لاکتوباسیلوس کازئی طی مدت بررسی در محل لکه رشد مانع از رشد قارچ گردید. 

مایع روئی عاری از باکتری(CFS): مایع روئی هیچکدام از باکتری‌های اسیدلاکتیک تأثیری در مهار رشد قارچ آسکوسفرا آپیس نداشتند.

 

 

جدول شماره 1 : pHمحلول روئی عاری از سلول باکتریهای اسیدلاکتیک در دمای Cº20

نوع CFS

pH

لاکتوباسیلوس کازئی

10/4

لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس

15/4

بیفیدوباکتریوم بیفیدوم

94/4

 

جدول شماره 2 :  pH محیط های کشت  MRS , SDA قبل از کشت باکتری و قارچ در دمای Cº20

نوع محیط

pH

SDA

70/6

MRS

20/6

 

جدول شماره 3: فعالیت ضد قارچی باکتریهای اسیدلاکتیک علیه قارچ آسکوسفرا آپیس در روش Overlay assay

باکتری اسیدلاکتیک

میزان تأثیر

لاکتوباسیلوس کازئی

++

لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس

++

بیفیدوباکتریوم بیفیدوم

_

 

جدول شماره 4: فعالیت ضد قارچی باکتریهای اسیدلاکتیک علیه قارچ آسکوسفرا آپیس در روش Confrontation Assay

باکتری اسیدلاکتیک

میزان تأثیر

لاکتوباسیلوس کازئی

+

لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس

+

بیفیدوباکتریوم بیفیدوم

-

 

 

جدول شماره 5: اثر ضد قارچی باکتریهای اسیدلاکتیک علیه قارچ آسکوسفرا آپیس در روش Agar Spot

باکتری اسیدلاکتیک

قطر هاله ممانعت از رشد(mm)

زمان مشاهده ( Hr)

24

48

72

96

120

144

لاکتوباسیلوس کازئی

10

8

6

6

5

5

لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس

7

6

5

3

0

0

بیفیدوباکتریوم بیفیدوم

5

0

0

0

0

0

 

 

 

 

 

بحث

با توجه به نقش بسیار مهم زنبورعسل در اکوسیستم‌های گیاهی و جانوری، گرده افشانی و تکثیر و تولید بسیاری از گیاهان و درختان، افزایش کمیت و کیفیت محصولات کشاورزی و استفاده وسیع از محصولات آن به عنوان غذا، دارو و مواد آرایشی و صنعتی و تأثیر بسیار بالائی که در افزایش بهره وری اقتصاد کشاورزی کشورها دارد، پرداختن به تهدیداتی از جمله عوامل بیماریزا و آفات و شکارچیان که زندگی زنبورعسل و نهایتاً صنعت زنبورداری کشور را با مخاطره مواجه می‌سازند، از اولویت ویژه‌ای برخوردار بوده و محققین باید از روش‌های مختلف در جهت مبارزه و کنترل این عوامل بهره جسته و میزان تلفات کلنی‌های زنبورعسل را کاهش دهند و از سوی دیگر مواد و روش‌های مورد استفاده در کلنی‌های زنبور عسل علاوه بر سالم بودن برای زنبورها، فاقد کمترین اثر سوء در مصرف کنندگان محصولات زنبورعسل باشند. در حال حاضر مؤثرترین روش مبارزه با عوامل بیماریزای زنبورعسل مواد شیمیائی و داروهای مختلف است که علی رغم تأثیر نسبی روی آن‌ها موجب بروز مشکلاتی ازجمله بروز سویه‌های مقاوم عوامل بیماریزا در مقابل داروها و ورود مواد شیمیائی به داخل فراورده‌های کلنی‌ها و بروز عوارض ناخواسته در مصرف کنندگان آن‌ها می‌گردند. یکی از روش‌های جدید و مؤثر در مبارزه با عوامل بیماریزای انسان و دام استفاده از فراورده‌های طبیعی است که طی بررسی‌های مختلف سالم بودن تعدادی از آن‌ها به اثبات رسیده و در حال مصرف در انسان و دام می‌باشند.

پروبیوتیک‌ها و باکتری‌های اسیدلاکتیک طی بررسی‌های مختلف نقش بسیار مهمی در کنترل و مبارزه با بیماری‌های دامی و انسانی داشته و در مواردی به عنوان دارو و مکمل داروئی در اختیار مصرف کنندگان قرار می‌گیرند و بتدریج جایگاه ویژه‌ای در فارماکوپه‌های پزشکی و دامپزشکی باز کرده و هر روز دامنه مصرف آن‌ها گسترده تر می‌شود. در سالیان اخیر توجه زیادی به امکان استفاده از باکتری‌های اسیدلاکتیک و پروبیوتیک‌ها در کلنی‌های زنبورعسل به عنوان روشی برای کنترل و مبارزه با بسیاری از عوامل بیماریزا و همچنین مکمل رشد زنبورعسل شده است و در بسیاری از تحقیقات اقدام به جداسازی باکتری‌های اسیدلاکتیک از زنبورعسل و بررسی نقش آن‌ها در مهار رشد عوامل بیماریزا نموده‌اند و نتایج قابل توجهی را بدست آورده اند.

در این بررسی که برای اولین بار در ایران اثرات ضد قارچی باکتری‌های اسیدلاکتیک علیه عوامل بیماری‌های قارچی زنبورعسل مورد مطالعه قرار گرفته است باکتری‌های لاکتوباسیلوس کازئی، لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و بیفدوباکتریوم بیفیدوم باعث مهار رشد قارچ آسکوسفرا آپیس عامل بیماریزای نوزاد گچی زنبورعسل در محیط کشت شده اند. گرچه این میزان مهار رشد نسبت به اثر داروهای ضد قارچی ناچیز است ولی نشان می‌دهد که باکتری‌های اسید لاکتیک قادر به رشد قارچ مذکور بوده و با بررسی‌های بیشتر روی سایر باکتری‌های اسیدلاکتیک و پروبیوتیک‌ها شاید بتوان به باکتری‌هائی دست یافت که دارای اثرات بیشتری بوده و در صورت دارا بودن شرایط پروبیوتیکی بتوان به عنوان مکملهای داروئی یا غذائی در کلنی‌های زنبورعسل مورد استفاده قرار داد. 

بیشتر محققین مکانیسم اثر باکتری‌های اسیدلاکتیک روی سایر میکروارگانیسم‌ها اثرات ضد باکتریائی متابولیت‌های حاصل از آن‌ها می‌دانند. متابولیت‌ها شامل مواد ضد میکروبی با وزن کم از جمله اسیدهای آلی اسید استیک و اسید لاکتیک، هیدروژن پروکسید،  دی استیل، استالدئید، استوئین، دی اکسید کربن، رئوترین، رئوتریسیکلین و مواد ضد میکروبی با وزن زیاد از جمله باکتریوسین‌ها می‌باشند که هر کدام از این مواد با اثرات مختلف موجب نابودی یا کاهش رشد عوامل بیماریزا می‌گردند. در رابطه با باکتری‌های اسپور دار از جمله باکتری پنی باسیلوس لاروا ذکر شده است که باکتری‌های اسیدلاکتیک مانع از جوانه زدن اسپورها در محیط کشت و جلوگیری از رشد باکتری می‌گردند.  Laitila و همکاران در سال 2002 نشان داده‌اند که سویه‌های Lactobacillus plantarum دارای اثرات ضد قارچی بر علیه سویه‌های مختلف قارچ Fusarium می‌باشند. همچنین Nora Laref و Bettache Guessas در سال 2013 با بررسی اثرات ضد قارچی 54 سویه باکتری اسیدلاکتیک از جمله لاکتوباسیلوس پلانتاریوم روی قارچ‌های مختلف مشخص کرده‌اند که این باکتری‌ها روی قارچ‌های                                                                                          Aspergillusspp., Fusarium roseum, Trichoderma spp., Penicillium spp. and Stemphylium spp دارای اثرات مهاری می‌باشند. Collins و Hardt در سال 1980 نشان دادند که باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مانع از رشد قارچ کاندیدا آلبیکنس می‌شود.  Matei و Cornea در سال 2014 با بررسی اثر ضد قارچی 27 سویه از باکتری‌های اسیدلاکتیک روی قارچ آلترناریا سولانی و پنی سیلیوم دیجیتاتوم عامل بیماریزای گیاهان با استفاده از روش Overlay متوجه شدند که 11 سویه از باکتری‌های آزمایش شده دارای اثرات ضدقارچی روی این عوامل می‌باشند. Verdenelli و همکاران در سال 2009 با بررسی اثرات ضد میکروبی لاکتوباسیلوس‌های L.rhamnosus و L. paracasei جداسازی شده از مدفوع انسان روی مخمر C. albicans ATCC 10291 متوجه شدند که این باکتری‌ها به میزان بسیار زیادی موجب مهار رشد این مخمر می‌شوند. Coloretti Fabio و همکاران در سال  2007 با جداسازی 65 سویه از قارچ‌های مختلف از سالامی گوشت و بررسی اثرات ضد قارچی آن‌ها متوجه شدند که 10 سویه دارای اثرات ضد قارچی برعلیه قارچ‌هائی از جمله آسپرژیلوس و پنی سیلیوم بوده و  مؤثرترین ترکیبات ضد قارچی این باکتری‌ها که در مرحله اول رشد آزاد می‌شوند فنیل لاکتات و هیدروکسی فنیل لاکتات می‌باشند. از سوی دیگر تمام سویه‌ها در مرحله نهائی رشد ترکیبات فعال پپتیدی آزاد نموده اند.

Ergin. K و همکاران در سال 2010 با جداسازی 30 جدایه لاکتوباسیلوس از مدفوع کودکان 5 الی 15 ساله و همچنین جداسازی 50 جدایه کاندیدا از خون، اثر ضد قارچی لاکتوباسیلوس‌ها را روی قارچ کاندیدا مورد بررسی قرار دادند و مشاهده کردند که این باکتری‌ها دارای اثر ضد قارچی زیادی روی مخمرهای C. albicans, C. parapsilosis, C. famata  and C. guilliermondii  می‌باشند. Muñoz, R و همکاران در سال 2010 اثر ضد قارچی باکتری‌هایLactobacillus fermentum ،  Lactobacillus rhamnosus و Saccharomyces cerevisiae علیه قارچ Aspergillus nomius VSC 23 مولد مایکوتوکسین را مورد بررسی قرار دادند و مشاهده کردند که این باکتری‌ها به میزان بسیار زیادی مانع از رشد قارچ مذکور می‌شوند.

Magnusson. J و همکاران در سال2003 بررسی جامعی را روی اثر ضد قارچی 1200 جدایه مختلف از باکتری‌های اسیدلاکتیک روی قارچ آسپرژیلوس فومیگاتوس و تعدادی دیگر از قارچ‌ها انجام داده و متوجه شده‌اند که 10 درصد از جدایه‌ها دارای  فعالیت مهاری و 4 درصد از آن‌ها اثر بسیار قوی روی قارچ مذکور دارند. بیشترین فعالیت ضد قارچی مربوط به باکتری Lactobacillus coryniformis بوده است. S. M. Schwenninger و همکاران در سال 2005 با جداسازی 1424 جدایه از باکتری‌های اسیدلاکتیک از مواد غذائی مختلفی از جمله شیر خام، ماست، پنیر و دوغ  اثر ضد قارچی آن‌ها را مورد بررسی قرار داده‌اند و در نهایت متوجه شده‌اند که 82 جدایه دارای بیشترین اثرات ضد قارچی برعلیه قارچ‌هائی از جمله کاندیدا و پنی سیلیوم می‌باشند. از بین باکتری‌های اسیدلاکتیک جداسازی شده 25 درصد آن‌ها مربوط به  گروه لاکتوباسیلوس کازئی از جمله L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus  بوده اند. بر اساس بررسی‌هایsabate  و همکاران در سال 2009 و  Li و همکاران در سال 2012 تعدادی از باکتری‌های همزیست در دستگاه گوارش زنبور عسل دارای اثرات ضد قارچی روی آسکوسفرا آپیس بوده اند. همچنین بررسی‌های Mohamed O. M. Omar  و همکاران در سال 2014 نشان داده است که برخی از باکتری‌ها از جمله باسیلوس‌های جداسازی شده از روده زنبوران بالغ دارای  اثرات آنتی گونیستی بر روی قارچ آسکوسفرا آپیس بوده  و  باکتری B. subtilis دارای بیشترین اثر ضدقارچی است.

در این بررسی مشخص گردید که باکتری‌های اسیدلاکتیک دارای اثر نسبی روی کنترل رشد قارچ آسکوسفرا آپیس عامل بیماری نوزاد گچی زنبورعسل در محیط کشت می‌باشند و بیانگر این مسئله است که این باکتری‌ها دارای اثرات بالقوه‌ای می‌باشند که می‌تواند آن‌ها را به عنوان کاندیدهای پروبیوتیک‌ها در درمان و کنترل بیماری‌های قارچی زنبور عسل مطرح نماید. ولی آنچه که باید در استفاده از باکتری‌های اسیدلاکتیک یا پروبیوتیک‌ها در کلنی‌های زنبورعسل مورد توجه قرار گیرد مقاومت این باکتری‌ها در برابر ژله رویال، عسل و گرده گل مورد مصرف زنبوران عسل، عدم تأثیر منفی این باکتری‌ها بر روی سلامتی نوزادان و زنبوران بالغ، عدم واکنش منفی بین این باکتری‌ها و فلور طبیعی دستگاه گوارش زنبوران عسل و مقاوم بودن آن‌ها در برابر واکنش‌های ایمنی نوزادان یا زنبوران بالغ می‌باشد، بطوریکه بسیاری از عوامل میکروبی قادر به رشد در داخل مواد غذائی مورد مصرف زنبورعسل نبوده و براحتی از بین می‌روند(اطلاعات منتشر نشده). همچنین سیستم ایمنی زنبورعسل بسیاری از عوامل میکروبی را از بین برده و مجال رشد در داخل بدن آنرا پیدا نمی‌کنند. لذا در بررسی‌های مشابه باید این موضوعات در نظر گرفته شده و بعد از حصول نتایج در محیط کشت یا آزمایشگاه، بررسی‌های زیستی در داخل کلنی‌ها یا نمونه‌های داخل آزمایشگاهی صورت گرفته و در نهایت عواملی به عنوان کنترل زیستی بیماری‌های زنبورعسل انتخاب شوند که هم در مقابل عوامل ضد میکروبی مواد غذائی یا سیستم ایمنی زنبورعسل مقاومت لازم را داشته و هم اثرات منفی زیادی روی سلامتی زنبور نداشته باشند.

 

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از همکاران بخش میکروبیولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه ارومیه و همکاران بخش تحقیقات بیماری‌های زنبورعسل و کرم ابریشم موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی کرج بواسطه همکاری در تهیه برخی مواد این بررسی تشکر و قدردانی می‌شود.

 

تعارض در منافع

بین نویسندگان  هیچ گونه تعارض در منافع  گزارش نشده است.

References

Aronstein, K., Hayes, G. (2004). Antimicrobial activity of allicin against honeybee pathogens. J Apicult Res, 43, 57-59. https://doi.org/10.1080/00218839.2004.11101111
Bailey, L., Ball, B.V. (1991). Honey Bee Pathology. Academic Press, London, UK. p. 53-63; p154-158.
Brunner, K., Zeilinger, S., Ciliento, R., Woo, S. L., Lorito, M., Kubicek, C. P., Mach, R. L. (2005). Improvement  of  the  fungal biocontrol systemic disease resistance both antagonism and induction of plant agent Trichoderma atroviride to enhance. Appl Environ Microbiol, 71, 3959-3965. https://doi.org/10.1128/aem.71.7.3959-3965.2005 PMID: 16000810
Collins, E. B., Hardt, P. (1980). Inhibition of Candida albicans by Lactobacillus acidophilus. J Dairy Sci, 63, 830-832. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(80)83013-X PMID: 6771309
Ergin,  K., Şener, T., Belgin, E. (2010). Antifungal effects of Lactobacillus Spp. bacteria on candida yeast. Kafkas Univ Vet Fak Derg, 16, 6, 1061-1064.
Evans, J. D., Armstrong, T. N. (2006). Antagonistic interactions between honey bee bacterial symbionts and implications for disease. BMC Ecol, 6, 4-12. https://doi.org/10.1186/1472-6785-6-4 PMID: 16551367
Coloretti, F. (2007). Antifungal activityof lactobacilli isolated fromsalami. Fems Microbiol Lett, 271, 245-250. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2007.00723.x
Forsgren, E., Olofsson, Tc., Va´Squez, A., Fries, I. (2010). Novel lactic acid bacteria inhibiting paenibacillus larvae in honey bee larvae. Apidologie, 41, 99-108. https://doi.org/10.1051/apido/2009065
Frazier,  M., Mullin, C., Frazier, J., Ashcraft, S. (2008). What have pesticides got to do with it? American Bee Journal, 148, 521-523.
Gallai, N., Salles, J. M., Settele, J., Vaissiere, B. E. (2009). Economic valuation of the vulnerability of world agriculture confronted with pollinator decline. Ecol Econ, 68, 810-821. https://doi.org/10.1016/j.ecolecon.2008.06.014
Gilliam, M. (1997). Identification and roles of non-pathogenic microflora associated with honey bees. FEMS Microbiol Lett, 155, 1-10. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1997.tb12678.x
Gliński, Z., Chmielewski, M. (1996). Imidazole derivatives in control of the honey bee brood mycoses. Pszczelnicze Zeszyty Naukowe, 40, 2, 165-173.
Imani Fooladi, A. A., Chavoshi Forooshai, M., Saffarian, P., Mehrab, R. (2014). Antimicrobial effects of four lactobacilli strains isolated from yoghurt against Escherichia Coli O157:H7. J Food Saf, 34, 150-160. https://doi.org/10.1111/jfs.12108
Heath, LAF. (1982a). Development of chalk brood in a honey bee colony: a review. Bee World, 63, 119-130. https://doi.org/10.1080/0005772X.1982.11097876
Heath, LAF. (1982b). Chalk brood pathogens: a review. Bee World, 63, 130-135.
Heath, LAF. (1985). Occurrence and distribution of chalk brood disease of honeybees. Bee World, 66, 9-15.
Heath, LAF. Gaze, BM. (1987). Carbon dioxide activation of spores of the Chalkbrood Fungus Ascosphaera apis. J Apic Res, 26, 243-246.
Herbert Jr, EW. Chitwood, DJ., Shimanuki, H. (1985). New compounds with potential for the control of chalkbrood. American Bee Journal, 125, 430-431.
Herbert Jr, EW. Chitwood, W., Shimanuki, H. (1986). The effect of a candidate compound on Chalkbrood disease in New Jersey. American Bee Journal, 126, 258-259.
Hornitzky, M. (2001). Literature Review of Chalkbrood. A report for the RIRDC. Publication No. 01/150. Kingston, ACT, AU.
Hornitzky, M. A. Z., Willis, P. A. (1983). Gamma radiation inactivation of bacillus larvae to control American foul brood. J Apic Res, 22, 196-199. https://doi.org/10.1080/00218839.1983.11100587
Klein, A. M., Vaissiere, B.E., Cane, J. H., Steffan-Dewenter, I., Cunningham, S.A., Kremen, C., Tscharntke, T. (2007). Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proc Roy Soci Lond B, 274, 303-313. https://doi.org/10.1098/rspb.2006.3721
Laitila, A. (2002). Antifungal activities of two Lactobacillus plantarum strains against Fusarium moulds in vitro and in malting of barley. J Appl Microbiol, 93, 566-576. https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2002.01731.x
Li, J., Zheng, Z., Hong, S., Qi, X., Liang, Q. (2012). Isolation and identification of an antagonistic bacterial strain against Ascosphaera apis from honey bee larvae infected with chalkbrood disease. Scientia Agricultural Sinica, 5, 5-20.
Magnusson, J., Ström, K., Roos, S., Sjögren, J., Schnürer, J. (2003). Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria. FEMS Microbiol Lett, 219, 129-135. https://doi.org/10.1016/s0378-1097(02)01207-7
Matei, A., Cornea, C. P. (2014). Antifungal activity of some lactic acid bacteria isolated from materials of vegetal origin. Sci Bull Series f Biotechnologies, 18, 42-47.
Mohamed, O. M. Omar. (2014). Antagonistic effect of gut bacteria in the hybrid carniolan honey bee, Apis Mellifera carnica, against Ascosphaera Apis, the causal organism of Chalkbrood disease. J Apic Sci, 58, 1-10. https://doi.org/10.2478/jas-2014-0002
Moritz, R. F. A., De Miranda, J., Fries, I., Le Conte, Y., Neumann, P., Paxton, R. J. (2010). Research strategies to improve honeybee health in Europe. Apidologie, 41, 227-242. https://doi.org/10.1051/apido/2010010
Morse, R. A., Calderone, N. W. (2000).The value of honey bee pollination in the United States. Bee Culture, 128, 1-15.
Mourad, A. K., Zaghloul, O. A., Kady, E. L., Nemat, F. M., Morsy, M. E. (2005). A novel approach for the management of the chalkbrood disease infesting honeybee Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae) colonies in Egypt. Commun Agric Appl Biol Sci, 70(4), 601-611.
Mrazek, J., Strosova, L., Fliegerova, K., Kott, T., Kopecny, J.(2008). Diversity of insect intestinal microflora. Folia Microbiol, 53, 229-233.  https://doi.org/10.1007/s12223-008-0032-z
Muñoz R, M. E., Arena, J.Silva., González, S. N. (2010). Inhibition of mycotoxin-producing Aspergillus nomius Vsc 23 by lactic acid bacteria and Saccharomyces Cerevisiae. Braz J Microbiol, 41, 1019-1026.
Nelson, DL., Gochnauer, TA. (1982). Field and laboratory studies on chalkbrood disease of honey bees. American Bee Journal, 122, 29-34.
Nora, L., Bettache, G. (2013). Antifungal Activity Of Newly Isolates of lactic acid bacteria. Innov Rom Food Biotechnol, 13, 80-88. (3218) Galati University Press ISSN (P) 1843-6099 ISSN (L) 1843-6099.
Schwenninger. (2005). Detection of antifungal properties in Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei Sm20, Sm29, And Sm63 and molecular typing of the strains. J Food Prot, 68(1), 111-119.
Spivak, M., Downey, DL. (1998). Field assays for hygienic behaviour in honey bees (Hymenoptera:Apidae). J Econ Entomol, 91(1), 64-70.
Van, E. D., Meixner, M. D. (2010). A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol, 103, 80-95. https://doi.org/10.1016/j.jip.2009.06.011
Verdenelli, Mc. Ghelfi, F., Silvi, S., Orpianesi, C., Cecchini, C., Cresci, A. (2009). Probiotic properties of Lactobacillus Rhamnosus and lactobacillus paracasei  isolated from human faeces. Eur J Nutr, 48, 355-363. https://doi.org/10.1007/s00394-009-0021-2
Winston, M. (1995). We need alternatives. Pesticide resistance. Bee Culture, 123(7), 389-390.
Wood, M. (1998). Microbes help bees battle chalkbrood. J Econ Entomol, 46(8), 16- 17.
 
Journal of Veterinary Research
Volume 74, Issue 2
June 2019
Pages 273-282

Files

Share

How to cite

Statistics