Document Type : Microbiology and Immunology
Authors
1 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Semnan University, Semnan, Iran
2 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Tehran University, Tehran, Iran
3 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine, Semnan University, Semnan, Iran
Abstract
Keywords
اعضاء جنس کمپیلوباکتر، یکی از مهمترین عوامل بیماریزای باکتریایی و از اصلیترین عوامل منتقل شده از طریق مواد غذایی آلوده در سراسر جهان محسوب میگردند (1،9،12،19). در میان گونه‌های مختلف این باکتری، کمپیلوباکتر ژژونی و کولای، مهمترین گونه‌های مسبب بیماری در انسان هستند. بیش از نیمی از گاستروانتریتهای انسانی توسط این باکتری‌ها ایجاد می‌شود که این میزان، از مجموع گاستروانتریتهای ایجاد شده توسط شیگلا، سالمونلا و اشریشیاکلی بیشتر است (6). اختلالات گوارشی و اسهال ناشی از این بیماری، حتی در کشورهای توسعه یافته، شمار زیادی از افراد، به خصوص کودکان را روانه بیمارستان میکند (1،9).
گونه‌های مختلف این باکتری ممکن است علاوه بر اسهال آبکی و خونی، موجب بیماری‌های ثانویه‌ای نظیر مننژیت، سپتی سمی، سندروم اورمی همولیتیک و Guillain-Barre گردند (12،14،17). این باکتری گرم منفی، در دمای C° 42 و شرایط میکروآئروفیلیک به خوبی رشد میکند به همین خاطر قادر نیست به مدت طولانی در خارج از بدن میزبان زنده بماند. اما با توجه به تعدد میزبان‌ها (پرندگانو، نشخوارکنندگان، سگ، گربه و انسان) و شیوع زیاد آن، به فراوانی در طبیعت یافت می‌شود (9،11،12،17).
پرندگان اهلی و وحشی، یکی از اصلیترین میزبان‌های این باکتری هستند و مصرف گوشت آلوده و یا تماس با مدفوع آن‌ها، یکی از مهمترین منابع آلودگی جمعیت‌های انسانی محسوب میگردد. پرندگان خانگی و پرندگانی که در باغ‌های پرندگان و باغ وحش‌ها از آن‌ها نگهداری می‌شود و همچنین حیوانات خانگی به دلیل تماس نزدیکی که با انسان دارند، در اپیدمیولوژی این بیماری، از اهمیت زیادی برخوردارند (1،9،11). عفونت در پرندگان اغلب بدون علامت است که این مساله سبب دشواری در تشخیص و مبارزه با باکتری مولد آن میگردد. پرندگان حامل بدون علامت میتوانند به مدت زیادی باکتری را از طریق مدفوع خود دفع کرده و موجب انتشار آلودگی شوند (20).
حضور کمپیلوباکتر در مدفوع پرندگانی که همراه با انسانها زندگی میکنند نظیر اردک‌ها و حیوانات خانگی، ممکن است موجب آلودگی آب‌های سطحی، آب موجود در دریاچه ها و تفرجگاه ها و مناطق بازی کودکان شده و بهداشت عمومی جامعه را تهدید کند (1،4،11). حضور گونه‌های مختلف این باکتری در مدفوع پرندگانی نظیر اردک علاوه بر انتشار آلودگی در محیط، از طریق ایجاد آلودگی در گوشت و تخم مرغ، ممکن است موجب انتقال باکتری از طریق مصرف مواد غذایی تهیه شده از گوشت و تخم اردک گردد. در سالهای اخیر با توجه به افزایش میزان بروز بیماری‌های قلبی-عروقی و توصیه به مصرف گوشت سفید، منابع پروتئینی جدید نظیر گوشت و تخم اردک نیز بسیار مورد توجه قرار گرفته است. از آنجا که پروتئین، آهن، سلنیوم و نیاسین به میزان کافی در گوشت اردک وجود دارد و میزان کالری آن نیز کمتر از گوشت گاو میباشد، گوشت اردک میتواند جایگزین مناسبی برای منابع پروتئینی و سایر مواد مغذی محسوب گردد (1).
اگرچه عفونت ناشی از کمپیلوباکتر به صورت خود محدود شونده است. اما از یک طرف ممکن است منجر به عوارض ثانویه‌ای نظیر Guillain-Barre گردد و از سوی دیگر با توجه به توانایی حمل ژن‌های مختلف مرتبط با حدت باکتریایی نظیر توکسین‌های گوارشی (cdt و ...) و عوامل مرتبط با مقاومت‌های آنتیبیوتیکی (1،9،12،13)، آلودگی محیط به این باکتری از اهمیت زیادی برخوردار است. به همین خاطر، درک بهتر توزیع گونه‌های مختلف کمپیلوباکتر در میزبان‌های مختلف و راه‌های انتقال آن در تدوین بهتر سیاستهای مربوط به کنترل و پیشگیری از بیماری‌های عفونی بسیار مؤثر است.
در مناطق شمالی ایران، اردک پرندهای است که به صورت سنتی همانند حیوانات خانگی در حیاط منازل نگهداری می‌شود و آلودگی آب‌های سطحی، معابر و محل بازی کودکان به مدفوع این پرنده اجتناب ناپذیر است. اگرچه عفونت ناشی از مصرف مواد غذایی آلوده به کمپیلوباکتر به طور گستردهای مورد مطالعه قرار گرفته است، اما انتقال این باکتری از طریق محیط آلوده به مدفوع دام‌های اهلی، پرندگان وحشی و حیوانات خانگی کمتر مورد بررسی قرار گرفته است. در ایران تاکنون مطالعه‌ای در ارتباط با میزان حضور کمپیلوباکتر در مدفوع اردک‌های آزاد مناطق شمالی صورت نگرفته است. در نقاط مختلف دنیا میزان آلودگی به گونه‌های کمپیلوباکتر در میزبان‌های مختلف، بسیار متغیر گزارش شده است. میزان آلودگی به کمپیلو باکتر ژژونی در محل پرورش و فرآوری گوشت اردک، در انگلستان در حدود 96.7 درصد گزارش گردیده و میزان آلودگی گوشت اردک بهکمپیلوباکتر ژژونی وکمپیلوباکتر کولای به ترتیب 12.5درصد و 87.5 درصد، بیان شده است (1) در حالی که بر اساس مطالعه Raeisi و همکاران که در سال 2017 انجام شد، در ایران میزان فراوانی کمپیلوباکتر ژژونی در گوشت اردک بیشتر از کمپیلو باکتر کولای میباشد (12).
با توجه به این که درک بهتر سهم نسبی عوامل مختلف محیطی در ایجاد عفونت ناشی از کمپیلوباکتر در طراحی اقدامات کنترلی مناسب و تامین بهداشت عمومی حائز اهمیت زیادی است (3،11)، هدف از این مطالعه بررسی میزان حضور کمپیلوباکتر ژژونی وکمپیلوباکتر کولای در مدفوع اردک‌های آزاد برخی مناطق شمالی ایران در نظر گرفته شد.
مواد و روش کار
نمونه برداری: به منظور بررسی میزان حضور کمپیلوباکتر در مدفوع اردک‌های آزاد مناطق شمالی ایران، تعداد هفتاد و پنج نمونه مدفوع تازه اردک‌های به ظاهر سالم، طی اردیبهشت ماه سال 1395، از اردک‌های آزاد تعدادی از روستاهای اطراف شهرهای ساری، قائمشهر، بابل و آمل اخذ گردید. به منظور جلوگیری از مطالعه نمونههای مشابه، از هر کانون یک یا دو نمونه تهیه شد. هرنمونه به طور جداگانه در کنار یخ و در کوتاهترین زمان ممکن به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران منتقل گردید.
استخراج DNA: با توجه به دشواری کشت و روش‌های بیوشیمیایی در شناسایی کمپیلوباکتر، استخراج DNA با استفاده از کیت AccuPrep Stool Genomic DNA Extractionا(Bioneer, Korea) صورت گرفت.
واکنش زنجیرهای پلیمراز: به منظور تشخیص جنس کمپیلوباکتر و گونه‌های ژژونی و کولای، از واکنش زنجیرهای پلیمراز سه گانه بر پایه ژن‌های 16srRNA، mapA، و ceuE استفاده گردید (7،10،15،17). توالی پرایمرها (ساخت شرکت سینا کلون) و شرایط دمایی مورد استفاده در جدول شماره یک درج گردیده است. واکنش زنجیرهای پلیمراز در حجم نهایی µL 25 شامل ng 5 DNA، 0.1µmol از هریک از پرایمرها دو واحد Taq DNA polymerase،اmmol 200 dNTP، 2.5µL بافر 10X و mmol 2.5 کلرید منیزیوم (سینا کلون-ایران) صورت گرفت. تکثیر قطعۀ DNA توسط دستگاه ترموسایکلر (Techne TC- 512, England) انجام شد.
از نمونه تهیه شده در مجموعه میکروبی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران به عنوان کنترل مثبت (نمونه واجد هر سه ژن) و آب مقطر استریل به عنوان کنترل منفی استفاده گردید. محصولات به دست آمده در ژل آگارز دو درصد با ولتاژ 80mV به مدت یک ساعت الکتروفورز گردید و پس از رنگامیزی با اتیدیوم بروماید، تحت تابش اشعه ماوراء بنفش مورد مشاهده قرار گرفت.
نتایج
از میان هفتاد و پنج نمونه مورد بررسی در این مطالعه، 13 مورد (17.33درصد) واجد کمپیلوباکتر تشخیص داده شدند. از این تعداد یازده نمونه (84.6درصد) حاوی ژن mapA و دو نمونه (15.4 درصد) واجد ژن ceuE بودند که به ترتیب به عنوان کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کولای معرفی گردیدند. میزان حضور کمپیلوباکتر ژژونی به طور معنی‌داری بیشتر از کمپیلوباکترکولای گزارش گردید(0.5-0>P) (تصویر1).
جدول شماره یک: مشخصات پرایمرهای استفاده شده در این مطالعه
|
منبع |
ژن هدف |
دما و زمان لازم برای واسرشت |
اندازه (bp) |
توالی (3-5) |
پرایمر |
|
17 |
16SrRNA |
S90-C° 59 |
408 |
AGTCTTGGCAGTAATGCACCTAACG ATATGCCATTGTAGCACGTGTGTCG |
CampF CampR
|
|
17 |
mapA |
S30-C° 50 |
589 |
CTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTG GCTTTATTTGCCATTTGTTTTATTA
|
MDmap A1 MDmap A2 |
|
17 |
ceuE |
S30-C° 50 |
462 |
AATTGAAAATTGCTCCAACTATG TGATTTTATTATTTGTAGCAGCG |
COL3 MDCOL2 |
بحث
در کشور ما آمار دقیقی از میزان ابتلا به عفونت‌های ناشی از کمپیلوباکتر در دست نیست. اما از آنجایی که تحقیقات اخیر نشان میدهد میزان ابتلا به عفونت‌های ناشی از این باکتری در بسیاری از کشورهای توسعه یافته بسیار زیاد است. به نظر می‌رسد طیف گستردهای از عفونت‌های گوارشی ایجاد شده به خصوص در کودکان، در کشور ما نیز بر اثر این باکتری ایجاد می‌شود (9،12).
مطالعات مختلف صورت گرفته در ارتباط با ارزیابی میزان شیوع گونه‌های مختلف کمپیلوباکتر عمدتاًً بر منابع غذایی آلوده متمرکز شده است. امروزه در سراسر جهان، مصرف گوشت و فرآورده‌های طیور به عنوان اصلیترین منبع عفونت ناشی از کمپیلوباکتر شناخته شده (1،3،9،11،12) و مطالعه برروی انتقال باکتری از طریق محیط آلوده به مدفوع پرندگان وحشی نادر است (11). در کشور ما تاکنون مطالعه‌ای جهت ارزیابی میزان حضور گونه‌های مهم کمپیلوباکتر در مدفوع اردک صورت نگرفته است و کلیه گزارشات مربوط به فراوانی گونه‌های مختلف کمپیلو باکتر در پرندگان مربوط به آلودگی لاشه و یا گوشت پرندگانی نظیر مرغ، بوقلمون، بلدرچین و اردک میباشد. در این مطالعه که برای اولین بار به منظور بررسی میزان حضور کمپیلوباکتر در مدفوع اردک‌های آزاد برخی مناطق شمال ایران صورت گرفت، از هفتاد و پنج نمونه مورد بررسی 13 مورد (17.3درصد) واجد کمپیلوباکتر شناخته شدند و همانگونه که انتظار میرفت میزان کمپیلوباکتر ژژونی (84.6درصد) به طور معنی‌داری بیشتر از کمپیلوباکتر کولای (15.4درصد) بود.
در مطالعات مختلف صورت گرفته در بیشتر نقاط دنیا میزان آلودگی به کمپیلوباکتر بسیار متغیر است. در مطالعه‌ای که توسط Economu و همکاران در سال 2015 در یونان صورت گرفت، 29درصد از نمونههای گوشت پرندگان واجد کمپیلوباکتر تشخیص داده شدند. درحالی که Wei و همکاران در سال 2016 در کره جنوبی میزان آلودگی به این باکتری را 80.1 درصد گزارش کردند. در مطالعه صورت گرفته توسط Raeisiو همکاران در سال 2017 در ایران، میزان آلودگی به کمپیلوباکتر در گوشت مرغ 62درصد، بوقلمون 22.5درصد و اردک 33.3درصد گزارش گردید. در همین مطالعه میزان آلودگی به کمپیلوباکتر ژژونی وکمپیلوباکتر کولای به ترتیب در گوشت مرغ 61.3درصد و 22.5درصد، بوقلمون 44.4 و 44.4 درصد و در اردک 70 و 20درصد مشاهده شد(12).
در ارتباط با میزان حضور گونه‌های مختلف کمپیلوباکتر در اردک در مقایسه با پرندگان دیگر مطالعات زیادی صورت نگرفته و گستره حضور این باکتری در مدفوع، گوشت و احشاء، محل پرورش و کشتار اردک‌ها، بسیار متغیر ( صفر تا 96.7درصد) گزارش شده است. شیوع بیش از 80درصد عمدتاً در کشورهایی نظیر انگلستان، تایوان و تانزانیا گزارش شده است. در انگلستان بیشترین میزان آلودگی (96.7درصد) در محل پرورش و فرآوری گوشت اردک گزارش گردید که 74.6درصد آن مربوط به کمپیلوباکتر ژژونی و 25.4درصد مربوط به کمپیلوباکتر کولای بود. درحالی که میزان آلودگی در گوشت اردک 45.4درصد مشاهده شد که 12.5درصد مربوط به کمپیلوباکتر ژژونی و 87.5درصد مربوط به کولای بود (1).
جالب است که تا سال 2011 در کشور غنا هیچگونه آلودگی به این باکتری در اردک‌ها مشاهده نشده است (احتمالاًً مطالعه‌ای در این ارتباط صورت نگرفته است)، درحالی که در سایر کشورهای آفریقایی مانند مصر (19درصد)، نیجریه (63.5درصد) و تانزانیا (80درصد) آلودگی به کمپیلوباکتر در اردک گزارش شده است. در آسیا (ایران، مالزی، و تایوان) میزان آلودگی از 35.5درصد تا 92درصد متغیر است. در ایالات متحده میزان آلودگی به کمپیلوباکتر در گوشت اردک 12.5درصد ثبت گردیده است (1).
Raeisi و همکاران در سال 2017 بیان کردند اختلاف در میزان شیوع آلودگی به کمپیلوباکتر در مطالعات مختلف ممکن است به علت تفاوت در منطقه جغرافیایی مورد مطالعه، فصل، تعداد نمونه، روش‌های نمونه گیری و شرایط بهداشتی متفاوت محل پرورش و کشتار باشد (8،12،19). براساس نتایج Boonmar و همکاران در سال 2007 علت دیگر این تفاوت ممکن است مربوط به حساسیت روش‌های مختلف آزمایشگاهی در شناسایی این باکتری باشد (2). حساسیت روش‌های مولکولی نظیر واکنش زنجیرهای پلیمراز (31درصد) در شناسایی گونه‌های مختلف کمپیلوباکتر، بسیار بیشتر از روش‌های استاندارد مبتنی بر آزمونهای بیوشیمیایی (20درصد) است (2). همچنین براساس نتایج مطالعه Tsaiو Hsing در سال 2004 آلودگی به کمپیلوباکتر در جوجه اردک‌های زیر دو هفته به طور معنی‌داری کمتر از اردک‌های بالغ میباشد (16).
مطالعات Adzitey و همکاران در سال 2012 نشان میدهد در اردک میزان آلودگی به کمپیلوباکتر ژژونی نسبت به سایر گونه‌های کمپیلوباکتر بیشتر است که این الگو مشابه الگوی آلودگی در انسان، پرندگان و سایر حیوانات است. و با نتایچ حاصل از مطالعه حاضر مطابقت دارد.
نتایج این مطالعه نشان میدهد میزان حضور کمپیلوباکتر در مدفوع اردک‌های آزادی که در تماس نزدیک با انسان، در روستاهای برخی از مناطق شمال ایران نگهداری می‌شوند، نسبتاً زیاد است و این امر موجب انتشار آلودگی در آب‌های سطحی و محل بازی کودکان شده و با توجه به گرمادوست بودن این باکتری و بقاء آن در فصول گرم، احتمال ابتلا به عفونت‌های ناشی از کمپیلوباکتر در ساکنین این مناطق به خصوص کودکان بسیار زیاد است.
از آنجایی که اردک‌های آزاد مناطق شمال ایران در تماس نزدیک با جمعیت‌های انسانی مناطق روستایی، طیور بومی و سایر حیوانات نظیر گوسفند، گاو، اسب، سگ و گربه زندگی میکنند، مطالعه مولکولی تنوع ژنتیکی و تعیین قرابت آن‌ها با سویه‌های جدا شده از موارد انسانی بسیار با اهمیت است. به همین خاطر توصیه می‌شود با توجه به گرمادوست بودن باکتری و احتمال افزایش میزان شیوع آن در فصول گرم سال و نیز به دلیل تغییرات فیزیولوژیک ناشی از تغییرات جیره غذایی در دستگاه گوارش پرنده و تأثیر آن در ترکیب جمعیت میکروارگانیسم‌های دستگاه گوارش، حضور این باکتری و تنوع ژنتیکی آن در فصول مختلف سال مورد بررسی قرار گرفته و با سویه‌های جدا شده از موارد انسانی مقایسه گردد. همچنین با توجه به تماس نزدیک اردک‌های این منطقه با سایر حیوانات اهلی به نظر می‌رسد علاوه بر کمپیلو باکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کولای که گونه‌های غالب در ماکیان و انسان می‌باشند، حضور گونه‌های غالب در سایر میزبان‌ها، در مدفوع این اردک‌ها دور از انتظار نباشد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان این مقاله بر خود لازم می‌دانند از زحمات کارکنان آزمایشگاه میکروبشناسی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران صمیمانه قدردانی نمایند.
تعارض در منافع
بین نویسندگان هیچ گونه تعارض در منافع گزارش نشده است.
)
