Synergistic Effect of Nisin and Cinnamon Essential oil                          (Cinnamomum verum) on the Growth of Lactococcus garvieae in Fish Fillets of Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss)

Roomiani, Laleh; Roomiani, Laleh; Ghaeni, Mansoreh

doi:10.22059/jvr.2018.239101.2678

Synergistic Effect of Nisin and Cinnamon Essential oil (Cinnamomum verum) on the Growth of Lactococcus garvieae in Fish Fillets of Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss)

Document Type : Aquatic Animal Health Management

Authors

Department of Fisheries, Ahvaz Branch, Islamic Azad University, Ahvaz, Iran

10.22059/jvr.2018.239101.2678

Abstract

BACKGROUND: Lactococcusis disease due to Lactococcus garvieae, one of the most important zoonotic bacterial diseases.
Objectives: The purpose of this study was to evaluate the effect of Cinnamon essential oil and Nisin on the growth of Lactococcus garvieae.
Methods: The effect of cinnamon essential oil with concentrations of 0, 0.25 and 0.75%, and Nisin 0, 0.4 and 0.8 μg/mL on growth of this bacteria at 4 and 8 °C during 0, 3, 6, 9, 12, 15 days of storage was investigated.
Results: The results of this study showed that on samples kept at 4 °C, bacterial growth was delayed until the fifteenth day using cinnamon essential oil or Nisin, and in the case of cinnamon, the growth rate of bacteria in the ninth and fifteenth days was below 2 log cfu/g. While the combination of 0.8 μg/ml Nicin and 0.75% essential oil of cinnamon postponed growth on the third day. At 8 °C, Nisin, the cinnamon essential oil alone and in combination (similar to 4 ºC) until the sixth day prevented bacterial growth. Compared to the control treatment, the concentration of Nisin and cinnamon essential oil had a significant difference in inhibitory bacterial growth (P<0.05). The results also showed that the combination of Nisin and cinnamon essential oil, had a significantly higher effect than their single state.
Conclusions: Results indicate that Nisin and cinnamon essential oil effectively inhibit the growth of Lactococcus garvieae in the rainbow trout fillet.

Keywords

20.1001.1.20082525.1398.74.2.6.2

Full Text

مقدمه

یکی از مهمترین معضلات بهداشتی در خصوص مصرف دام‌ها و آبزیان، وجود بیماری‌های است که بین انسان و حیوان مشترک هستند. از جمله این عوامل بیماریزای بسیار خطرناک مشترک بین انسان و آبزیان، لاکتوکوکوس گارویه است. این باکتری گرم مثبت، بدون‌هاگ، غیرمتحرک، بی هوازی اختیاری و دارای زنجیره‌های کوتاه، باعث بروز تلفات زیادی در ماهیان قزل آلا شده و پس از انتقال به انسان قادر به بروز عوارضی مانند مننژیت در افراد سالم با سیستم ایمنی ضعیف می‌شود (1). یکی از راه حل‌هایی که سال‌ها برای جلوگیری از انتقال این عوامل بیماری زا به انسان در پیش گرفته شده است، استفاده از انواع مختلفی از آنتی بیوتیک‌ها در درمان آبزیان است. برای کاهش یا جلوگیری از وابستگی صنعت آبزی پروری به داروها و از آنجایی که هنوز ایمنی استفاده از آنتی بیوتیک‌ها مورد سوال است، محصولات طبیعی برای کنترل باکتری‌ها به عنوان راه حل دیگر مورد توجه واقع شده اند. افزایش آگاهی عموم درباره اثرات منفی استفاده بیش از حد از مواد شیمیائی مصنوعی منجر به تحقیق درباره محلول‌های سبز مانند اسانس‌های گیاهی و بدون مواد شیمیایی گردیده است (2). هزینه بالا و در دسترس نبودن واکسن‌های تجاری منطقه‌ای و رعایت اصول امنیت زیستی به منظور جلوگیری از ورود اولیه باکتری به مزارع، سبب گردید که استفاده از اسانس‌های گیاهی مورد توجه واقع شوند. اسانس‌های گیاهی روغن‌های فراری هستند که اثرات ضد میکروبی آن‌ها شناخته شده است و از بخش‌های مختلف گیاه به دست می‌آیند. این اسانس‌ها مایع، خالص و بندرت رنگی هستند و از طریق ناپایدار ساختن لایه فسفولیپیدی غشاء سلولی، سیستم آنزیمی و مواد ژنتیکی باکتری نقش ضد باکتریایی خود را ایفا می‌کنند(3). ترکیب اسانس‌های گیاهی با نایسین تأثیرات سینرژیکی بر روی کاهش ATP برون سلولی میکروارگانیسم‌ها دارد. نکته قابل توجه این است که اگر مواد نگهدارنده طبیعی به جای مواد شیمیایی در مواد غذایی استفاده شوند لازم است که ارزیابی فعالیت ضد میکروبی آن‌ها در آزمایشگاه و سپس در مدل‌های غذایی صورت گیرد. بنابراین امروزه به پیشرفت تکنیک‌های جدید برای حذف یا کاهش عوامل بیماریزای مواد غذایی از طریق ترکیب شیوه‌های نوین با روش‌های جدید نیاز است (6).

با توجه به اینکه سلامت غذا یک موضوع مهم چه از دیدگاه مصرف کننده مواد غذایی و چه از دیدگاه صاحبان صنایع غذایی بوده است و موارد متعددی از عفونت‌های حاصل از مواد غذایی آلوده دیده شده است، لذا توجه به سلامت مواد غذایی و ارائه راهکارهایی جهت حفظ و نگهداری مواد غذایی در حال گسترش است. همچنین به دلیل اثرات منفی استفاده از نگهدارنده‌های شیمیایی و روش‌ها و سیستم‌های کنترلی وقت‌گیر و گران، استفاده از نگهدارنده‌های طبیعی توصیه می‌گردد (8). از جمله مطالعات انجام شده در زمینه استفاده از عصاره‌های گیاهی می‌توان به مطالعه Roomiani و Rokni در سال 2015، بر روی اثر بازدارندگی اسانس زیره سیز و نایسین بر میزان رشد استرپتوکوکوس اینیایی در فیله ماهی قزل‌آلا (9)، Pajohi و همکاران در سال 2011، تأثیر سینرژیسم نایسین همراه با اسانس دارچین علیه باسیلوس سرئوس و باسیلوس سابتیلوس (10) و نیز Ekhtiarzadeh و همکاران در سال 2012، رفتار رشد ویبریو پاراهمولایتیکوس و لیستریا مونوسیتوژنز در فیله ماهیان شور شده تحت تأثیر نایسین و اسانس آویشن شیرازی را مورد بررسی قرار دادند (11)، که همگی تأثیرات مثبت اسانس‌های گیاهی بر روی حفظ مواد غذایی را تأیید می‌کنند. اغلب تحقیقات در خصوص اثرات ممانعت‌کنندگی اسانس دارچین و نیسین در محیط آزمایشگاهی انجام شده است، اما مطالعات معدودی در خصوص تأثیریات بازدارندگی این اسانس و ماده طبیعی نیسین در ماده غذایی نظیر فیله ماهی انجام شده است. هدف اصلی این تحقیق، مطالعه و تعیین دوزهای مؤثر گیاه دارچین و نیسین به صورت انفرادی و ترکیبی در کنترل باکتری زئونوز لاکتوکوکوس گارویه که عامل بیماریزایی مهمی برای دامنه وسیعی از عفونت‌های انسانی و حیوانی است (12) در فیله ماهی قزل آلای رنگین‌کمان می‌باشد. در این تحقیق کوشش شده است که اثر غلظت‌های مختلف اسانس دارچین، نیسین، درجه حرارت نگهداری و طول مدت نگهداری روی رفتار رشد باکتری لاکتوکوکوس گارویه بررسی گردد.

مواد و روش‌ کار

آنالیز اسانس دارچین: گیاه دارچین، در سال 1395 از استان البرز جمع آوری شد. اسانس به روش تقطیر با بخار تهیه شد. جهت انجام این کار، 100 گرم از پودر گیاه خشک در یک بالن ته گرد L 1 ریخته شده و دو سوم بالن با آب پر شد. بالن به دستگاه کلونجر متصل و عمل تقطیر به مدت 4 ساعت انجام شد. برای شناسایی ترکیبات اسانس از گاز کروماتوگرافی متصل شده به طیف سنج جرمی استفاده شد. دستگاه از نوع Termoquest Finnigan با ستون مویینه به طولm 30 و قطر داخل µm 250 و ضخامت لایه داخلµ 25/0 با برنامه دمایی ºC 50 تا 265 و همراه با افزایش تدریجیmin 5/2 و نگهداری ستون در 265 به مدت min30 استفاده شد.

آماده‌سازی محلول نایسین: از پودر نایسین 5/2 درصد (Sigma 5764) استفاده شد. به منظور استفاده، این ماده در اسید کلریدریکN 02/0 حل شد. سپس mL 500 پودر نایسین را در mL 50 اسید آماده شده در زیر هود بیولوژیکی حل شد، بطوریکه در ظرف استریل دیگری این محلول از فیلترµm 2/0 عبور داده م‌ شد و با استفاده از رابطه N 1V1 = N 2V 2 مقدار مورد نظر از آن را برداشته و به ظروف دربدار افزوده و پس از پخش شدن آن در آب، برش‌های ماهی‌های مورد نظر به آن اضافه می‌گردید (13).

آماده‌سازی نمونه‌های ماهی: در این مطالعه از قزل‌آلای رنگین‌کمانg 250 استفاده شد. ماهیان خریداری و پس از دم‌زنی و خارج کردن محتویات آن‌ها، به فیله‌های g 25 تقسیم و در دمای مناسب (ºC 2) در کیسه‌های زیپ‌دار و همراه با یخ به منظور استریل به سازمان انرژی اتمی جهت تابش اشعه گاما تا حدود kGy 5 ارسال و مجدداً در مجاورت یخ به آزمایشگاه منتقل شدند (9). سپس غلظت‌های مختلف اسانس دارچین (0، 4/0 و 8/0 درصد) و نایسین (µg/ mL 0، 25/0 و 75/0) و ترکیب غلظت‌های فوق با هم به شیشه‌های دربدار استریل اضافه شد.

تهیه باکتری و تعیین بار میکروبی: کشت لیوفلیزه لاکتوکوکوس گارویه (Ir-170A 856bp) (Lactococcus garvieae) از گروه بهداشت و بیماری‌های آبزیان دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران تهیه شد (14). جهت کشت متوالی، از محیط براث BHI و درºC 37 به مدتh 18 استفاده شد. سپس کشت حاصله، به میزان 5 به 1 با گلیسیرین مخلوط و در لوله‌های میکروسانتریفیوژ در ºC 20- نگهداری شد. جهت تعیین بار میکروبی، باکتری در زیر هود به صورت تلقیح نقطه‌ای در 10 نقطه و جمعاً µm 100 به فیله‌ها تلقیح و به دو دمایºC 4 و 8 منتقل شدند. بدین ترتیب در هر بار انجام آزمایش (در شرایط مواد غذایی10³ باکتری در mL) با مشخص شدن جذب نوری که تقریباً معادل 105 باکتری در mL بود (که بعد با کشت Pour Plate، کشت مخلوط نیز تایید می‌شد) لوله کووت حاوی تقریباً 10⁵ باکتری mL مشخص گردید. سپس mL 1 از این کووت را برداشته و در شیشه زیمکس،mL 39 از آب پپتونه استریل به آن افزوده گردید تا در نهایت در هر 100µL از محتویات شیشه زیمکس10⁸× 4/1 باکتری موجود باشد (با کشت بر روی آگار این تعداد تایید می‌شود). در زمان تلقیح برش‌های ماهی از µL 100 محتویات شیشه زیمکس استفاده می‌شد تا در cm2 از برش ماهی 10³ ×1 باکتری موجود باشد. شمارش باکتری‌ها در روزهای 0، 3، 6، 9، 12 و 15 پس از تلقیح صورت پذیرفت (14).

تجزیه و تحلیل آماری: داده‌های مربوط به نتایج مربوطه با استفاده از نرم افزار SPSS 20.0 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. از تجزیه واریانس یک طرفه جهت مقایسه میانگین‌ها استفاده شد و در مواردی که بین میانگین‌ها اختلاف معنی‌دار (05/0>P) وجود داشت جهت جداکردن آن‌ها از تست توکی استفاده شد.

نتایج

نتایج آنالیز GC-MS: آنالیز اسانس دارچین نشان داد که E-سینامالدهید با 24/85 درصد و آلفا-کوپائین با 30/2 درصد بیشترین ترکیبات اسانس دارچین را بخود اختصاص داده‌اند (جدول 1).

نتایج آزمون میکروبی: لگاریتم رشد باکتری در غلظت‌های مختلف نایسین در ºC 4 در فیله قزل‌آلای رنگین‌کمان در جدول 2، نشان داده شده است. بر اساس نتایج این جدول، در غلظت‌هایµg/mL 25/0 و 75/0 با افزایش روز، لگاریتم رشد باکتری تحت تأثیر نایسین به شکل معنی‌داری کاهش یافت (05/0>P) و در بیشترین غلظت نایسین (µg/ mL 75/0) تعداد باکتری از log cfu/g 00/0 ±00/4 به log cfu/g 02/0±88/2 باکتری رسید. همچنین غلظت‌های µg/ mL 25/0 و 75/0 از نایسین در دمایCº 4 در فیله ماهی با نتایج لگاریتم تعداد باکتری در گروه کنترل اختلاف معنی‌دار داشتند (05/0>P) اما دو گروه µg/ mL 25/0 و 75/0 نایسین به جز روز پانزدهم در سایر روزها با یکدیگر اختلاف معنی‌دار نداشتند (05/0<P).

لگاریتم رشد باکتری در غلظت‌های مختلف اسانس دارچین در دمایCº 4 در فیله قزل‌آلای رنگین‌کمان در جدول 3، نشان داده شده است. بر اساس نتایج این جدول، در غلظت‌های 4/0 و 8/0 درصد با افزایش روز نگهداری، لگاریتم رشد باکتری تحت تأثیر اسانس دارچین به شکل معنی‌داری کاهش یافت (05/0>P) و در دو غلظت اسانس دارچین (4/0 و 8/0 درصد) تعداد باکتری به کمتر از log cfu/g 2 باکتری رسید. غلظت‌های 4/0 و 8/0 درصد از اسانس دارچین در دمایºC 4 در فیله ماهی با نتایج لگاریتم تعداد باکتری در گروه کنترل اختلاف معنی‌دار داشتند (05/0>P) اما دو گروه 4/0 و 8/0 درصد به جز در روز 6، با یکدیگر اختلاف معنی‌دار نداشتند (05/0<P).

جدول 4، نشان می‌دهد که در بررسی سینرژیسم نایسین و اسانس دارچین با هم بر لگاریتم رشد لاکتوکوکوس گارویه (L. garviea) نسبت به تیمار کنترل، نتایج از نظر آماری اختلاف معنی‌دار داشتند (05/0>P). همچنین مقایسه لگاریتم رشد باکتری نشان می‌دهد که استفاده توام از دو ماده در مقایسه با استفاده منفرد از این مواد، به شکل معنی‌داری مانع رشد باکتری شد (05/0>P). سطح µg/mL 8/0 نایسین و 75/0درصد اسانس دارچین، بهترین کارکرد را داشت و از روز سوم رشد باکتری در این تیمار مشاهده نشد. مطابق این جدول، بین غلظت‌های مختلف استفاده شده، با افزایش سطح نایسین و اسانس دارچین به شکل معنی‌داری رشد لگاریتمی لاکتوکوکوس گارویه کاهش یافت (05/0>P).

لگاریتم رشد باکتری در غلظت‌های مختلف نایسین در دمایºC 8 در فیله قزل‌آلای رنگین‌کمان در جدول 5، نشان داده شده است. بر اساس نتایج این جدول، در غلظت-های µg/mL 25/0 و 75/0 با افزایش روز، لگاریتم رشد باکتری تحت تأثیر نایسین به شکل معنی‌داری افزایش یافت (05/0>P) و در بیشترین غلظت نایسین (µg/mL 75/0) تعداد باکتری از log cfu/g 00/0 ±40/5 به log cfu/g 07/0 ±62/5 باکتری رسید ولی در روزهای نهم و پانزدهم رشد بسیار زیاد بود. همچنین غلظت‌های µg/mL 25/0 و 75/0 نایسین در دمایºC 8 در فیله ماهی با نتایج لگاریتم تعداد باکتری در گروه کنترل اختلاف معنی‌دار داشتند (05/0>P). همچنین دو گروه µg/mL 25/0 و 75/0 نایسین در روز سوم و ششم نیز با یکدیگر اختلاف معنی‌دار داشتند (05/0>P). مطابق جدول 5، در گروه کنترل رشد زیاد باکتری از روز ششم و در دو تیمار 25/0 و 75/0درصد نایسین، از روز نهم رشد زیاد باکتری مشاهد شد.

لگاریتم رشد باکتری در غلظت‌های مختلف اسانس دارچین در دمایºC 8 در فیله قزل‌آلای ‌رنگین‌کمان در جدول 6، نشان داده شده است. بر اساس نتایج این جدول، در غلظت‌های 4/0 و 8/0 درصد اسانس دارچین با افزایش روز نگهداری، لگاریتم رشد باکتری تحت تأثیر اسانس دارچین به شکل معنی‌داری افزایش یافت (05/0>P) و در بیشترین غلظت دارچین (8/0 درصد) تعداد باکتری از log cfu/g 00/0 ±99/4 به log cfu/g 15/0 ±82/5 باکتری رسید، ولی در روزهای نهم و پانزدهم رشد باکتری بسیار زیاد بود. غلظت‌های µg/mL 4/0 و 8/0 اسانس دارچین در فیله ماهی با گروه کنترل اختلاف معنی‌دار داشتند (05/0>P)، همچنین دو گروه µg/mL 4/0 و 8/0 اسانس در روز سوم و ششم با یکدیگر اختلاف معنی‌دار داشتند (05/0>P). مطابق جدول 6، در گروه کنترل رشد زیاد باکتری از روز ششم و در دو تیمار 4/0 و 8/0 درصد دارچین، از روز نهم رشد بالای باکتری مشاهد شد.

جدول 7، نشان می‌دهد که در بررسی سینرژیسم نایسین و اسانس دارچین با هم بر لگاریتم رشد لاکتوکوکوس گارویه نسبت به تیمار کنترل، نتایج از نظر آماری اختلاف معنی‌دار داشتند (05/0>P). با افزایش روز نگهداری، لگاریتم رشد باکتری افزایش معنی‌داری نشان داد. به جز تیمار µg/mL 4/0 نایسین و 25/0 درصد اسانس دارچین، سایر تیمارهای دارای هر دو ترکیب تا روز ششم توانستند جلوی رشد باکتری را بگیرند، اما از روز نهم رشد بالای باکتری مشاهده شد. مقایسه بین تیمارها در روز ششم نشان داد تیمار µg/mL 8/0 نایسین و 75/0 درصد اسانس دارچین به طور معنی‌داری کمترین رشد باکتری را داشت (05/0>P).

جدول 1. آنالیز GC-MS ترکیبات شیمیایی اسانس دارچین

Table 1. GC-MS analysis of chemical composition of cinnamon essential oil (Cinnamomum verum(

ترکیب شیمیایی	زمان جداسازی	درصد
Benzaldehyde	76/13	50/0
bornrol	35/24	17/0
Cinnamaldehyde-Z	90/26	62/0
Cinnamaldehyde-E	82/29	24/85
cyclosativene	22/33	12/0
Copaene-α	50/33	30/2
Muurolene-¥	79/37	43/0
ar-Curcumene	38	21/0
-Amorpheneα	79/38	27/1
Cadinene-ƴ	42/39	16/0
Cadinene-ȣ	56/39	98/0
trans-Calamenene	81/39	97/0
Calacorene-α	34/40	14/0
p-methoxy-Cinnamaldehyde	54/40	25/1
- Calacorene ß	64/40	28/0
Caryophyllenyl alcohol	08/42	17/0
Gleenol	42/42	10/0
-Oploenoneß	11/43	22/0
1,10-di-epi-Cubenol	38/43	20/0
1 -epi-Cubenol	05/44	51/0
epi-α- Muurool	69/44	83/0
Calacorene-ß	77/44	41/0
Muurool-α	13/45	17/0
Cadinol	89/45	74/0
epi-α-Bisabolol	23/46	15/0

جدول 2. لگاریتم رشد باکتری در غلظتهای مختلف نایسین در روزهای مختلف نگهداری در دمایCº 4 در فیله قزلآلای رنگینکمان

Table 2. Logarithm growth of bacteria in different concentrations of nisin in different days of storage at 4 ° C in rainbow trout

(µg/mL نایسین (	دارچین(%)	روز صفر	روز سوم	روز ششم	روز نهم	روز پانزدهم
0	0	^a00/0 ±00/4	^a 02/0 ±60/4	^a06/0 ±93/5	^a 05/0 ±12/6	^a 02/0 ±24/6
25/0	0	^a00/0 ±00/4	^b 21/0 ±50/3	^a20/0 ±19/4	^b 15/0 ±74/3	^c 11/0±11/3
75/0	0	^a00/0 ±00/4	^b 44/1 ±96/3	^c 57/1 ±36/3	^d 88/1 ±17/3	^d02/0±88/2

مقادیر با حروف کوچک متفاوت بیانگر اختلاف معنیدار است (05/0P<).