عفونت‌های انگلی کرمی منتقله از خاک(Soil-transmitted helminths) ، یکی از معضلات مهم بهداشتی در کشورهای فقیر و در حال توسعه بوده که نیاز به آلودگی مدفوع محیطی جهت انتقال دارند. مصرف سبزیجات خام بدون شستشوی مناسب یکی از راههای اصلی جذب انگل‌های روده است. آلودگی خاک مکان‌های عمومی نظیر پارک‌ها و محل بازی کودکان بوسیله تخم انگل‌های کرمی که توسط حیوانات اهلی و وحشی صورت گرفته باشد، می‌تواند جوامع بشری را از نظر سلامت و بهداشت عمومی به مخاطره بیاندازد. مردم به خصوص کودکان به علت عدم رعایت موازین بهداشتی نظیر تماس با خاک آلوده و خاک خوری بیشتر در معرض آلودگی قرار دارند (3،5).

توکسوکاریازیس بیماری زئونوز منتقله از خاک است که با انتشار تخم‌ انگل توکسوکارا به محیط از طریق مدفوع میزبانان مخزن نظیر سگ و گربه‌ها رخ می‌دهد. توکسوکاریازیس انسانی در اثر ابتلاء افراد به مرحله لاروی انگل نماتودی گونه‌های توکسوکارا، توکسوکارا کنیس (Toxocara canis) و توکسوکارا کتی (Toxocara cati)، ایجاد می گردد. این انگل از دسته بیماری‌های کرمی مشترک بین انسان و حیوان و جزء بیماری های انگلی فراموش شده می‌باشد (Neglected diseases) (2). آلودگی از طریق خوردن تخم انگل همراه با آب یا مواد غذائی، متعاقب تماس دست با خاک آلوده به انگل، و یا مصرف گوشت یا جگر آلوده به لارو انگل به صورت نیم پز یا خام به انسان انتقال پیدا می‌کند. تخم‌های آلوده کننده توکسوکارا توانایی آن را دارند به مدت چند ماه و یا حتی چند سال حیات خود را در خاک حفظ نمایند (1). تخم‌های آلوده کننده (حاوی لارو) پس از ورود به بدن میزبان تحت تاثیر ترشحات معدی-روده‌ای باز و لاروهای آزاد شده به اندام‌ها و بافت‌های گوناگون بدن مهاجرت و عوارضی نظیر لاروهای مهاجر احشایی (Visceral larva migrans)، لاروهای مهاجر چشمی (Ocular larva migrans)، توکسوکاریازیس عصبی (Neurotoxocariasis)، و توکسوکاریازیس نهفته (Covert toxocariasis) را ایجاد می‌کنند (12).

به منظور بررسی شیوع آلودگی خاک مناطق مختلف به گونه‌های مختلف توکسوکارا، نیاز به جداسازی (Recovery) و شناسایی تخم‌های موجود انگل در خاک بوسیله روش‌های سهل و آسان می‌باشد. امروزه با استفاده از توری‌های معمولی (Mesh) و روش‌های مرسوم و استاندارد شناورسازی محلول ساکاروز در نمونه خاک‌های جمع آوری شده، اقدام به جداسازی و شناسایی تخم انگل توکسوکارا می‌گردد که مشاهده تخم انگل به دلیل وجود آرتیفکت‌ها (ضایعات و مواد بی‌ارزش از نظر تشخیصی) به میزان کم امکان پذیر می‌باشد. لذا هدف از انجام این مطالعه استفاده از یک وسیله مناسب و ارایه یک روش ساده و ارزان جهت جداسازی حداکثری تخم انگل توکسوکارا‌ موجود در نمونه خاک‌های مورد آزمون و اثبات یک روش جایگزین مناسب با روش‌های مرسوم و استاندارد و موجود می‌باشد.

مواد و روش‌کار

بررسی حاضر به منظور بکارگیری و ارزیابی الک عمودی غربالگری طراحی شده و استفاده از روش اصلاح شده شناور سازی ساکاروز و مقایسه آن با روش مرسوم و متداول شناورسازی ساکاروز یا شیتر (Sheather's sugar flotation) جهت شناسایی تخم گونه‌های توکسوکارا در نمونه خاک‌ها جمع آوری شده در چندین مرحله و به شرح زیر انجام گرفته است.

جمع آوری خاک: در مطالعه حاضر با در نظر گرفتن خطای نسبی 10 درصد و فاصله اطمینان (Confidence Interval; CI) 95 درصد، با استفاده از لوله پلی وینیل کلراید مدرج، به ازای هر 2مترمربع از عمق  5-3 سانتی‌متر مناطق مورد نظر میزان 10 گرم خاک به تعداد 200 عدد نمونه برداری گردید. نمونه‌های جمع آوری شده به داخل کیسه منتقل و به آزمایشگاه انگل شناسی دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی البرز انتقال داده شدند. در آزمایشگاه، نمونه‌ها به خوبی مخلوط و جهت خشک شدن به مدت یک شب در شرایط آزمایشگاه (37درجه سانتی‌گراد) بر روی سطح کاغذی پخش گردیدند (10).

استفاده از روش استاندارد شناورسازی ساکاروز: جهت انجام روش مرسوم و متداول از روش شناور سازی شیتر (آب شکر اشباع) استفاده شد. بدین ترتیب که ابتدا داخل هر لوله حاوی 2 گرم خاک صاف شده با توری معمولی با قطر منافذ 200میکرومتر، حدود  2 تا 1 میلی‌لیتر آب شکر اشباع (gr 500 ساکاروز،  ml350 آب مقطر،  gr1 کریستال فنل) افزوده شد و به کمک همزن (Shaker) لوله به خوبی با رسوب مخلوط شدند. در ادامه داخل هر یک از لوله‌ها، لبالب با آب شکر اشباع پر، روی آن با لامل پوشانده به مدت 20 دقیقه به حالت ثابت نگهداشته شدند و پس از این مدت، لامل‌ها  به روی لام منتقل گردید و از نظر تخم انگل توکسوکارا به روش میکروسکوپی مورد بررسی قرار گرفت (8).

الک عمودی غربالگر: نمونه خاک‌های خشک شده جهت جداسازی بوسیله الک غربالگری طراحی شده در کیسه‌های پلاستیکی جمع آوری گردیدند. الک عمودی غربالگر تخم‌های گونه های توکسوکارا از اجزاء زیر تشکیل شده بود:

الف) لوله (بدنه) از جنس پلی وینیل کلراید به ابعاد  150 × 50 میلی‌لیتر که یک انتهای آن توری صافی به قطر سوراخ‌هایی به ابعاد 150 میکرومتر تعبیه شده بود (تصویر 1، الف).

ب) درب الک غربالگر که در انتهای دیگر لوله قرار گرفته و مانع از خروج و انتشار ذرات در حین صاف کردن خاک می شد (تصویر 1، ب).

ج) حلقه محاط کننده الک غربالگر که در ثابت نگه داشتن کیسه محتوی خاک صاف شده نقش داشتند (تصویر 1، ج). 

استفاده از الک و روش اصلاح شده محلول اشباع شده ساکاروز: نمونه خاک‌های خشک شده بداخل الک عمودی غربالگر مدرج انتقال داده شدند. پس از صاف کردن (به مدت 1 دقیقه الک به صورت عمودی در جهت بالا و پایین تکان داده شد) (تصویر 2)، حدود 2 گرم از نمونه خاک‌های صاف شده بداخل لوله‌های آزمایش حاوی محلول 5/0 درصد توئین 20 (Tween 20) اضافه، مخلوط و در دور 1500 دور در دقیقه (rpm) به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی (Supernatant) لوله‌ جدا و دور ریخته شد. رسوب تشکیل شده در انتهای لوله مجدداً با 8 میلی‌لیتر آب مقطر محلول و همانند شرایط قبل سانتریفیوژ شد. همانند مرحله قبل مایع رویی دور ریخته شده و رسوب با محلول ساکاروز با چگالی مخصوص 1:200  به حجم 10 میلی‌لیتر رسانده شد. سوسپانسیون فوق با استفاده از همزن لوله ورتکس (Vortex) به خوبی مخلوط به مدت 10 دقیقه در 1500 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید. پس از این مدت لوله با استفاده از محلول ساکاروز اشباع به صورت لبالب پر و لامل بر روی آن قرار گرفت (تصویر 3). پس از سانتریفیوژ نهایی لوله آزمایش همراه با لامل در دور 600 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه، لامل بلافاصله بر روی یک لام منتقل و زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار گرفت.

شمارش تخم‌ها: از هر یک از نمونه‌های مورد بررسی، 5 تا 10 گسترش تهیه و تمامی سطوح لام‌ها زیر میکروسکوپ با بزرگ‌نمایی 100× مشاهده شدند. نمونه‌هایی که مشکوک به تخم انگل توکسوکارا بودند با بزرگ‌نمایی 400× مورد تآیید قرار گرفتند. سرانجام، نتایج حاصله از آزمایش‌ها با استفاده از آزمون آماری کای دو  (χ²)،  مورد پردازش و تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

نتایج

در مطالعه حاضر به منظور ارزیابی الک عمودی غربالگر طراحی شده و مقایسه آن با روش استاندارد، 200 نمونه خاک از مکان‌های عمومی و پارک‌ها جمع‌آوری و با استفاده از روش استفاده الک عمودی غربالگر و بکارگیری روش اصلاح شده محلول ساکاروز و نیز روش مرسوم و متداول شناورسازی محلول ساکاروز اشباع، اقدام به جمع آوری، جداسازی و شناسایی تخم گونه‌های مختلف توکسوکارا به اشکال مختلف تک سلولی (Mono-cell)، چند سلولی (Pre-embryonated) و حاوی لارو (Embryonated)  گردید.

در خصوص نتایج کمی شمارش تخم‌ها، پس از انجام آزمون با استفاده از الک عمودی غربالگر و روش تغییر یافته شناورسازی ساکاروز در 5/38 درصد (فاصله اطمینان 95 درصد، 40/45-03/32) از 200 نمونه خاک‌ جمع آوری شده تخم گونه‌های مختلف توکسوکارا مشاهده گردید که شامل 24 عدد (2/52 درصد) تک سلولی، 12 عدد (1/26 درصد) چند سلولی، و 10 عدد (7/21 درصد) حاوی لارو آلوده کننده بودند. هم‌چنین پس از انجام آزمون خاک‌ها با استفاده از روش استاندارد متداول و مرسوم شناورسازی محلول ساکاروز، در 5/21 درصد (فاصله اطمینان 95 درصد، 70/27-37/16) از 200 نمونه خاک جمع آوری شده، تخم گونه‌های مختلف انگل توکسوکارا مشاهده شد. تخم‌های شمارش شده شامل 11 عدد (0/50 درصد) تک سلولی، 3 عدد (6/13 درصد) چند سلولی، و 8 عدد (4/36 درصد) به صورت حاوی لارو بودند. آزمون مجذورکای (χ²) نشان داد که تعداد تخم های جداسازی و شناسایی شده با روش‌های آزمون به کار رفته ارتباط معناداری داشت )05/0>(P (تصویر 4).

به منظور تشخیص دقیق مقدار کمی و کیفی تخم توکسوکارا و نیز سایر انگل‌های کرمی در نمونه‌های خاک، جهت تعیین میزان آلودگی خاک به تخم این نوع انگل‌ها بایستی میزان عددی تخم انگل‌ها با پایین ترین میزان خطای ناشی از آرتیفکت‌ها و مواد زائد را مشخص نمود. از روش‌های گوناگونی جهت جدا سازی تخم انگل‌ها از نمونه‌های خاک می‌توان بهره جست. روش به‌کار رفته بایستی دارای خصوصیاتی نظیر قابلیت اجرا در آزمایشگاه و شرایط صحرایی، سهولت در انجام آزمایش، وقت‌گیر نبودن، مقرون به صرفه بودن، قابلیت استفاده برای تشخیص انواع بیشتری از تخم انگل‌ها باشد. لذا به منظور کاهش میزان اشتباه ناشی از وجود ضایعات و مواد بی ارزش از نظر تشخیصی و به دست آوردن هرچه بیشتر و دقیق‌تر تخم انگل‌های کرمی می‌توان از غربالگری توسط الک استفاده کرد. الک عمودی غربالگر طراحی شده متشکل از بدنه پلاستیکی و دارای توری با منافذی مناسب به منظور بیشترین دقت در فعالیت‌های مرتبط با خاک (جدا سازی تخم کرم‌های انگلی)، کمترین بار آلودگی در آزمایشگاه نسبت به الک‌های روزمره که در آزمایشگاههای انگل شناسی استفاده می‌گردد، می‌باشد.

در بررسی پیش رو به منظور مقایسه جمع‌آوری حداکثر تعداد تخم انگل‌ کرمی توکسوکارا از دو روش استفاده از الک عمودی غربالگر و روش تغییریافته محلول اشباع ساکاروز و نیز به‌کارگیری توری معمولی و استفاده از روش استاندارد مرسوم محلول اشباع شده ساکاروز استفاده گردید. نتایج بدست آمده نشان داد در روش اصلاح شده، 5/38 درصد (77 از 200 نمونه) از خاک‌های تحت بررسی حاوی تخم‌های انگل گونه‌های مختلف توکسوکارا بوده در حالیکه تنها در 5/21 درصد (43 از 200 نمونه) از خاک‌های جمع آوری شده و تحت آزمون با استفاده از روش استاندارد مربوط به گونه‌های توکسوکارا بودند.

الک طراحی شده از جنس پلی وینیل کلراید با طول 150 میلی‌متر و سطح مقطع 50 میلی‌متری مجهز به درب، حلقه و توری بوده که در مقایسه با توری‌های معمولی مورد استفاده دارای مزایای زیر می‌باشد: 1) یک انتهای آن توری به قطر منافذ 150 میکرومتر مجهز شده که قادر به فیلتراسیون تخم انگل توکسوکارا (ابعاد 85-72میکرومتر) می‌باشد، 2) دارا بودن درپوش که مانع از انتشار آلودگی در زمان انجام آزمون می‌گردد، و در نهایت 3) مدرج بودن بدنه به نحوی که قادر به تخمین فیلتراسیون میزان مشخصی از نمونه می‌باشد. 

مطالعات گوناگونی به منظور ارزیابی الک عمودی غربالگر طراحی شده جهت ریکاوری تخم انگل توکسوکارا از نمونه خاک‌های مناطق مختلف انجام شده است. در مطالعات صورت گرفته در ایران، در تحقیقی که توسط Zibaei و همکاران در سال 2010 که با استفاده الک عمودی غربالگر و روش اصلاح شده محلول ساکاروز و نیز استفاده از توری معمولی و روش شربت شیتر جهت ارزیابی انجام شد، میزان شیوع تخم‌های گونه‌های انگل توکسوکارا در نمونه‌های خاک پارک‌های عمومی خرم آباد به میزان 3/63 درصد در مقایسه با روش استاندارد (07/38 درصد) گزارش شده است (11). در تحقیق مشابه دیگر که توسط Zibaei و همکاران در سال 2017 و به منظور ارزیابی روش های جمع آوری و شناسایی تخم توکسوکارا انجام گرفت، میزان شیوع تخم‌های انگل گونه‌های توکسوکارا در خاک پارک‌های عمومی شهر کرج با استفاده از الک عمودی غربالگر 4/36 درصد و توری های معمولی با قطر منفذ 200میکرومتر به میزان 17/24 درصد گزارش گردید (13). 

در یک پژوهش انجام شده توسط Mohammadi و همکاران در سال 1394، که در استان مرکزی و با استفاده از روش استاندارد و مرسوم محلول اشباع ساکاروز انجام شد، میزان آلودگی خاک با تخم انگل توکسوکارا در پارک‌های عمومی شهر اراک 6/26 درصد گزارش گردید (7). Saraei و همکاران در سال 2012 خاک پارک‌های عمومی قزوین را با استفاده از روش متداول و استاندارد محلول ساکاروز اشباع مورد آزمون و میزان آلودگی نمونه های مورد بررسی و آلودگی خاک‌ها به تخم گونه‌های توکسوکارا را 8/5 درصد گزارش کردند (8). در تحقیق مشابه دیگر که در سال 2014 توسط Maraghi و همکاران در شهرستان آبادان و با به‌کارگیری صافی معمولی (منافذ 200میکرومتر) و استفاده از روش شناورسازی محلول اشباع ساکاروز بر روی 291 نمونه خاک پارک‌های عمومی آبادان انجام گرفت، میزان آلودگی به تخم انگل توکسوکارا 2/29 درصد گزارش گردید (6).

در مطالعات انجام شده در سایر کشورها، در یک بررسی توسط Zibaei  و  Uga در سال 2008 در شهر کوبه ژاپن، میزان تخم‌های گونه‌های مختلف توکسوکارا جداسازی شده از نمونه خاک (375 نمونه از 42 مکان بازی کودکان در پارک‌های عمومی) با استفاده از الک عمودی غربالگر و روش تغییر یافته شناورسازی ساکاروز به میزان 67 درصد گزارش گردید (10). در حالیکه در مطالعه مشابه انجام شده توسط Uga و همکاران در سال 1989 در همان منطقه و استفاده از روش مرسوم محلول ساکاروز میزان تخم‌های گونه‌های توکسوکارا جداسازی شده در محل سکونت افراد 18 درصد گزارش گردیده است (9).  

در مطالعات تکمیلی که در سال 2013 توسط Horiuchi و همکاران در شهر Los Baños، استان Laguna در کشور فیلیپین و با استفاده از وسیله الک عمودی غربالگر و روش Sucrose centrifugal flotation انجام گرفت، میزان جداسازی تخم‌های انگل کرمی از 120 نمونه خاک مورد آزمون، به میزان 70 درصد مربوط به تخم گونه‌های مختلف توکسوکارا بوده است (4). نتایج حاصل در مطالعات انجام شده نشان می‌دهد با استفاده از الک عمودی غربالگر و اصلاح نمودن روش استاندارد مرسوم و متداول محلول اشباع ساکاروز، تعداد زیادی تخم گونه‌های توکسوکارا قابل جمع آوری و شناسایی می باشد.

در پایان خاطر نشان می‌سازد با مقایسه مطالعات انجام شده مشخص می‌گردد، در ارزیابی آلودگی خاک مکان‌های عمومی یک منطقه که هر اندازه ابزار تشخیص و تفکیک آلودگی دقیق تر باشد میزان گزارش شیوع با درصد اطمینان بالاتر و بالطبع برنامه ریزی و هدفمند سازی جهت فعالیت‌های بهداشتی در این راستا نیز با دقت بیشتر و مفیدتری انجام خواهد شد. اگرچه روش پیشنهادی در بررسی حاضر سریع، مقرون به صرفه، و قابل انجام در شرایط آزمایشگاهی و غیر آزمایشگاهی (صحرایی) می‌باشد لازم است این روش با تعداد نمونه‌های بیشتر و در مکان‌های جغرافیایی مختلف مورد ارزیابی قرار گیرد.

سپاسگزاری

این مطالعه قسمتی از طرح تحقیقاتی بوده که  با حمایت مالی دانشگاه علوم پزشکی البرز انجام گردیده است (شناسه اخلاق: IR.ABZUMS.REC.1397.068)، لذا از معاونت پژوهشی و کارکنان آزمایشگاه گروه  انگل شناسی و قارچ شناسی به ویژه سرکار خانم لیلا مشکی جهت همکاری در انجام این تحقیق تشکر و قدردانی می‌گردد.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

تصویر 1. الک عمودی غربالگر؛ (A) بدنه از جنس پلی وینیل کلراید، (B) درب الک، (C) حلقه احاطه کننده الک.

تصویر 2. جمع آوری خاک صاف شده با استفاده از الک عمودی غربالگر.

تصویر 3. افزودن محلول ساکاروز و قرار دادن لامل بر روی لوله آزمایش.

تصویر 4. تعداد تخم‌های شمارش شده گونه‌های مختلف توکسوکارا با استفاده از روش‌ الک عمودی غربالگر و روش اصلاح شده شناور سازی ساکاروز (فاصله اطمینان 95 درصد، 40/45-03/32)  و نیز روش استاندارد مرسوم محلول ساکاروز (فاصله اطمینان 95 درصد، 70/27-37/16) . تفاوت معناداری داری از نظر آماری در مقایسه دو روش مشاهده