Document Type : Aquatic Animal Health Management
Authors
1 Department of Aquaculture, Faculty of Marine Sciences University of Tarbiat Modares, Noor, Iran
2 National Cell Bank of Iran, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran
3 Human and Animal Cell Bank, Iranian Biological Resource Center, ACECR, Tehran, Iran
Abstract
Keywords
در سالهای اخیر، نانوذرات دیاکسید تیتانیوم در مقایسه با ذرات میکرونی، بهدلیل فعالیت کاتالیزوری قویتر بهطور گسترده در محصولات صنعتی و مصرفی استفادهشده است. این افزایش فعالیت کاتالیزوری به اندازة کوچکتر این نانوذرات (افزایش نسبت سطح به حجم) نسبت دادهشده است (9). این خواص نانوذرات دیاکسید تیتانیوم بهدلیل فعالیت زیستی و ایجاد چالش برای سلامت انسانها، نگرانیهایی را ایجاد کرده است (27). از 1628 محصول مصرفی در 30 کشور جهان که بر اساس فناوری نانو تولیدشدهاند، برای تولید 179 محصول (تقریباً 11 درصد کل محصول) از نانوذرات تیتانیوم ازجمله دیاکسید تیتانیوم (TiO2) استفادهشده است (13). در حال حاضر نانوذرات دیاکسید تیتانیوم در انواع محصولات مانند کرمهای ضدآفتاب و دیگر لوازمآرایشی، پوشش و رنگهای ویژه (27) و در فرآیندهای فتوکاتالیستی صنعتی و تولید شیشههای خود تمیز شونده (23) استفاده میشود.
رشد سریع تعداد مطالعهها در این زمینه تأیید میکنـد که نگرانـی زیادی در زمینة ایمنی و بیخطری نانوذرات دیاکسید تیتانیوم وجود دارد. در این زمینه، حیوانات مدل گوناگونی با روشهای مختلف مواجهه مورد آزمایش قرارگرفتهاند (9). همة این مطالعهها نشان دادهاند که نانوذرات دیاکسید تیتانیوم از دیاکسید تیتانیوم میکرونی سمیترند (17،25). استفادة وسیع از نانوذرات دیاکسید تیتانیوم احتمال قرارگرفتن انسانها در معرض این نانومواد و رهایش آنها به محیطزیست را افزایش داده است که میتواند خطر بالقوه برای سلامتی انسانها، حیوانات و اکوسیستم باشد (25). بسیاری از مطالعهها در زمینه سمیت حاد نشان دادهاند که نانوذرات دیاکسید تیتانیوم سمیت کمی برای موجودات زنده آبزی دارند یا برای آنها بیخطرند (7)، اما مطالعههای اخیر بیانگر آن است که نانوذرات دیاکسید تیتانیوم میتواند اثر نامطلوبی بر موجودات آبزی داشته باشد. برای مثال، این یافتهها نشان میدهند که مواجهه با نانوذرات دیاکسید تیتانیوم سبب تغییر در بیان برخی از ژنهای ماهی گورخری (5)، مرگ دافنی ماگنا (18)، نارسایی تنفسی و سایش اپیتلیوم روده و تنش اکسیداتیو در قزلآلای رنگینکمان (10) شده است. بنابراین، افزایش استفاده از نانوذرات دیاکسید تیتانیوم در کالاهای مختلف و استفاده احتمالی آنها در صنایع شیلاتی، بررسی آثار این نانوذرات بر آبزیان را ضروری کرده است، ازاینرو، در این پژوهش با استفاده از نشانگرهای زیستی هیستوپاتولوژیکی آثار نانوذرات دیاکسید تیتانیوم در سمیت حاد بر بافتهای آبشش، کبد و رودة ماهی آزاد دریای خزر بهعنوان گونة در معرض خطر و یکی از گزینههای اصلی برای تنوعبخشی به ماهیان سردابی پرورشی کشور، موردبررسی قرارگرفته است.
ویژگیهای نانوذرات دیاکسید تیتانیوم آناتاز: نانوذرات پودری دیاکسید تیتانیوم آناتاز (CAS number= 13463-67-7) محصول شرکت Us-nano آمریکا از شرکت پیشگامان نانو مواد ایرانیان خریداری شد. بنا بر اطلاعات شرکت سازنده، مشخصات نانوذرات دیاکسید تیتانیوم آناتاز به این شرح میباشد: خلوص 99 درصد، متوسط اندازه 10-15 نانومتر، مساحت سطح ویژه 200-240 مترمربع در گرم، رنگ سفید، دانسیته توده 24/0 گرم در سانتیمتر مکعب و دانسیته واقعی 9/3 گرم در سانتیمتر مکعب.
بررسی اثر سمیت حاد نانوذرات دیاکسید تیتانیوم گونة ماهی: بچه ماهیان آزاد دریای خزر (Salmo caspius) برای این آزمایش با میانگین وزن 3/4±46/27 گرم از مرکز بازسازی ذخایر آزادماهیان شهید باهنر کلاردشت تهیه شدند.
شرایط اجرای آزمایش: بچه ماهیان در دانشکدة علوم دریایی دانشگاه تربیت مدرس به مدت یک هفته با شرایط آزمایشگاهی در مخازن آب شیرین (تانکهای 300 لیتر) سازگار و با غذای تجاری (بیومار) تغذیه شدند (1 درصد وزن بدن). سپس، بهمنظور جلوگیری از جذب نانوذرات بهوسیله مدفوع، 24 ساعت قبل از شروع آزمایش، غذادهی به ماهیها قطع شد (13). در طول دورة سازگاری تلفاتی در بین ماهیان مشاهده نشد. بعدازاین مدت ماهیها بهطور تصادفی به تانکهای آزمایش (100 لیتر) انتقال داده شدند. میزان تراکم ماهیها در هر تانک 100 لیتری حدود 7/2 گرم در لیتر بود (در هر تانک 7 ماهی). شاخصهای کیفی آب مانند PH، اکسیژن محلول، دما، سختی کل در طول آزمایش با استفاده از دستگاه دیجیتال (Lovibond water testing) اندازهگیری شد. میانگین دما (درجه سانتیگراد)، pH، سختی (میلیگرم کربنات کلسیم) و اکسیژن محلول (درصد اشباع) به ترتیب 26/0±62/18، 08/0± 25/8، 34/6±246، 04/2±6/90 بود. آزمایش تحت شرایط نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی انجام شد. برای آزمایش از آب شهری کلرزدایی و هوادهیشده استفاده شد.
غلظتهای 0، 01/0، 1/0، 1، 10 و 100 میلیگرم در لیتر انتخاب و برای هر تیمار سه تکرار در نظر گرفته شد. آزمایش به مدت 4 روز (96 ساعت) تحت شرایط ساکن با تعویض آب و تجدید غلظتها انجام شد و آب مخازن مورد آزمایش هر 24 ساعت یکبار تعویض و غلظتهای نانوذرات موردمطالعه مجدداً در مخازن اضافه شد. در طول آزمایش برای جلوگیری از جذب نانوذرات به غذا و مدفوع ماهیها، غذادهی انجام نشد. ماهیهای گروه شاهد تحت شرایط یکسان با گروههای آزمایشی قرار داشتند.
برای آزمایش هیستوپاتولوژی، در پایـان دوره از هـر تیـمـار 6 ماهی بهطور تصادفی برای نمونهبرداری از بافت آبشش، کبد و روده انتخاب شدند. ماهیها در پودر گل میخک (100 میلیگرم در لیتر) بیهوش شدند. بهمنظور تثبیت نمونهها، بافتها بلافاصله به محلول بوئن انتقال داده شدند. برای انجام مطالعات بافتشناسی ابتدا نمـونههای بافتی از محلول بوئن خارج و به الکل 70 درصد انتقال داده شدند. سپس نمونههای بافتی در دستگاه خودکار آمادهسازی بافت (Tissue processor, DID SABZ DS 2080/H) آبگیری، شفافسازی و پارافینه شدند. در ادامه نمونههای قالبگیریشده با دستگاه میکروتوم (Accu-Cut SRM 200 Rotary Microtome) با ضخامت 5 میکرومتر برش داده شدند. از هر نمونه 3 لام سریالی با کیفیت مناسب تهیه شد و رنگآمیزی لامهای حاصله به روش رایج هماتوکسیلین و ائوزین انجام گرفت. برشهای ایجادشده با چسب انتالان روی لام چسبانده شدند، سپس لامهای تهیهشده با میکروسکوپ نوری (OPTIKA) مجهز به دوربین در بزرگنماییهای مختلف مورد بررسی قرار گرفتند. برای مطالعه آسیبشناسی بافت آبشش در هر تیمار 500 تیغه ثانویه شمارش شد و تعداد تیغه ثانویهای که دچار آسیب شده بودند نسبت به تعداد کل تیغه ثانویه سنجیده شد. شدت تغییرات کمتر از 10 درصد، "بدون تغییر (-)"؛ شدت تغییرات بین 10 تا 30 درصد "تغییر ملایم (+)"؛ شدت تغییرات بین 31 تا 60 درصد "تغییر متوسط (++)" و شدت تغییرات بین 60 تا 100 درصد "تغییر شدید (+++)" در نظر گرفته شد. همچنین، برای تعیین آسیبدیدگی روده و کبد در تیمارهای آزمایشی حالتهای غیرطبیعی ساختمان این دو اندام بهصورت کیفی در چهار سطح بدون تغییر (-)، تغییر ملایم (+)، تغییر متوسط (++) و تغییر شدید (+++) مورد بررسی قرار گرفتند (6،26).
در آزمایش سمیت حاد نانوذرات دیاکسید تیتانیوم در مدت 96 ساعت، هیچ گونه تلفاتی در غلظتهای موردمطالعه مشاهده نشد. بر اساس دستورالعمل آزمون سمیت حاد ماهیها (20)، اگر در غلظت 100 میلیگرم در لیتر در حداقل 7 ماهی، مرگومیری مشاهده نشود با حدود اطمینان 99 درصد میتوان گفت که LC50 آن ماده بیشتر از 100 میلیگرم در لیتر است. بنابراین، در مطالعة حاضر LC50 نانوذرات دیاکسید تیتانیوم بیشتر از 100 میلیگرم در لیتر خواهد بود.
تغییرات بافتشناختی در بافتهای مورد آزمایش (آبشش، کبد و روده) ماهی آزاد دریای خزر در طول دورة سمیت حاد در جدول 1 خلاصهشده و این تغییرات در تصاویر 1 تا 3 نشان دادهشده است.
بافتشناسی طبیعی آبشش در ماهیان گروه شاهد در تصویر a1 نشان دادهشده است که بهخوبی سلولهای کلراید، سلول ستونی (پیلار)، رشتههای آبششی و سلولهای اپیتلیالی با ساختار طبیعی قابلمشاهدهاند. آبشش ماهیانی که در معرض دیاکسید تیتانیوم قرارگرفته بودند بهطور وابسته به دوز دچار تغییرات بافتشناختی شد. در بالاترین دوز نانوذرات دیاکسید تیتانیوم (100 میلیگرم در لیتر)، تغییرات هیستوپاتولوژیکی آبشش شامل چماقی شکل شدن رأس تیغه آبششی، هایپرپلازی، کوتاهی تیغة ثانویه، هایپرتروفی، جوشخوردگی تیغه آبششی، ادم (خیز) و جداشدگی اپیتلیالی بود (تصویر b,c1).
کبد گروه شاهد ساختار بافتی طبیعی را نشان داد (تصویر a2). مواجهة ماهیان با نانوذرات دیاکسید تیتانیوم به میزان 1/0 میلیگرم در لیتر به تجمع ملانوماکروفاژها، احتقان سینوزوئید و هستة پیکنوتیک پراکنده در سلولهای کبدی منجر شد. تجمع ملانوماکروفاژها، سلولهای کبدی با هستة پیکنوتیک و واکوئلاسیون در کبد ماهی آزاد دریای خزر قرارگرفته در معرض 1 میلیگرم در لیتر نانوذرات دیاکسید تیتانیوم مشاهده شد. تغیـیـرات بافـتشـناختی در ماهـیان قرارگرفته در معرض 10 و 100 میلیگرم در لیتر نانوذرات دیاکسید تیتانیوم آشکارتر بود. این ضایعات شامل افزایش تجمع ملانوماکروفاژها، اتساع سینوزوئیدها و تجمع سلولهای خونی، سلولهای کبدی با هستة پیکنوتیک، واکوئلاسیون و کانونهای نکروزه بود (تصویر b,c2).
رودة ماهیان در گروه شاهد بافتشناسی طبیعی را نشان داد (تصویر a3). تغییرات بافتی، مانند ضخیمشدن لامینا پروپریا، واکوئلاسیون، جداشدگی اپیتلیال، فرسایش پرزهای روده و نکروز در رودة ماهیانی که در معرض نانوذرات دیاکسید تیتانیوم قرارگرفته بودند، مشاهده شد (تصویرb3).
در پژوهش حاضر، نتایج آزمون سمیت حاد نشان داد که نانوذرات دیاکسید تیتانیوم منتقلشونده از آب به مدت 4 روز اثری بر بقای بچهماهی آزاد دریای خزر موردمطالعه نداشت. با در نظر گرفتن سطوح سمیت (12،13)، طبق نتایج پژوهش حاضر نانوذرات دیاکسید تیتانیوم "نسبتاً غیر سمی" (100<) محسوب میشود.
آبشش ماهیان جزء اندامهای مهم محسوب میشود که وظایف مهمی، ازجمله تبادل گازهای تنفسی، دفع مواد زائد نیتروژنی، تنظیم اسید- باز و تنظیم فشار اسمزی بر عهده دارد (8) و درعینحال مکانی است که در معرض مستقیم آلودگیهای محیطی، ازجمله نانوذرات قرار دارد. بنابراین، آسیب جدی به آبشش میتواند اختلال در وظایف این اندام حیاتی، ازجمله تبادل اکسیژن و دیاکسید کربن و تنظیم اسمزی ایجاد کند و درنتیجه به مرگ ماهیان منجر شود. نتایج مطالعه بافتشناسی اثر کوتاهمدت (حاد) نانوذرات دیاکسید تیتانیوم بر آبشش بچه ماهیان آزاد دریای خزر نشان داد که اگرچه در آزمون تلفات حاد مرگومیری مشاهده نشد ولی در دوزهای متوسط و بالا تغییرات هیستوپاتولوژیکی آبشش شامل چماقی شکل شدن رأس تیغه آبششی، هایپرپلازی، کوتاهی تیغه ثانویه، هایپرتروفی، جوشخوردگی تیغه آبششی، ادم و جداشدگی اپیتلیالی مشاهده شد. ضایعات دیدهشده در پژوهش حاضر، مشابه ضایعاتی بود که در پژوهشهای معدود دیگر در زمینه اثر نانوذرات دیاکسید تیتانیوم بر ماهیان، گزارششده است. هایپرپلازی، آماس، چماغیشدن رأس تیغه ثانویه، تلانژکتازی مویرگی، خـوردگی و چسبندگی (جوشخوردگی) تیغة ثانویه و کوتاهشدن تیغه آبششی در کپور (19)، هایپرتروفی سلولهای کلراید و دژنرهشدن سلولهای موکوسی (16) و خیز و ضخیمشدن تیغهها و رشتههای آبششی در کپور معمولی (12) بعد از مواجهه ماهیان موردمطالعه با نانوذرات دیاکسید تیتانیوم مشاهدهشده است. هایپرپلازی و هایپرتروفی اپیتلیالی تیغة آبششی واکنش جبرانی برای کاهش ورود و جذب مواد سمی است (11). باوجود افزایش فاصله بین آب و خون در اثر این واکنش جبرانی و کاهش جذب مواد سمی، کاهش سطح تنفسی و درنتیجه اختلالات تنفسی ایجاد میشود (22). با کوتاهی تیغة آبششی، تماس آبششها با آب کاهشیافته و درنتیجه در میزان تبادل گازها و یونها اختلال ایجاد میشود (22). عدم تعادل اسمزی ناشی از نانوذرات احتمالاً موجب ادم و جداشدگی اپیتلیالی در تیغه ثانویه شده است (19).
کبد یکی از مهمترین اندامهای بدن ماهی است که در فرایندهای سمزدایی نقش دارد. هیستوپاتولوژی کبد ماهیان راهی سودمند برای مطالعه اثرات مواجهة حیوانات آبزی با سموم موجود در محیط آبی است (11). تغییرات بافتی مشاهدهشده در بچه ماهیان آزاد دریای خزر قرارگرفته در معرض نانوذرات دیاکسید تیتانیوم در آزمایشهای حاد شامل افزایش تجمع ملانوماکروفاژها، اتساع سینوزوئیدها و تجمع سلولهای خونی، سلولهای کبدی با هسته پیکنوتیک، واکوئلاسیون و کانونهای نکروزه بود. این ضایعات در دوزهای بالاتر مشهودتر بود. نقش مهم ماکروفاژها میتواند جاروکردن نانوذرات باشد (22،24). در پژوهش حاضر، واکوئلاسیون و هستة پیکنوتیک مهمترین تغییر هیستوپاتولوژیکی کبد بچه ماهیان آزاد دریای خزر تیمارشده با نانوذرات دیاکسید تیتانیوم بود. بروز هستة پیکنوتیک نشاندهنده مراحل اولیه نکروز است (1). در پژوهشهای متعددی نشان دادهشده که گونههای اکسیژن فعال (ROS) ناشی از نانوذرات نقش مهمی در ایجاد نکروز/ آپوپتوز سلولها دارند (برای مثال، 2،14). Mansouri و همکاران در سال 2016 (19) نشان دادند که قرارگرفتن کپور معمولی در معرض همزمان نانوذرات دیاکسید تیتانیوم و نانو اکسید مس باعث ناهنجاریهای بافتی در کبد ازجمله واکوئلاسیون، نکروز سلولهای کبدی، تجزیه هسته، اتساع و تجمع خون در سینوزوئید، پیگمنتاسیون و اجتماعات ملانوماکروفاژ شده است. واکوئلاسیون کبد نشاندهندة عدم تعادل بین نرخ سنتز مواد در سلولهای پارانشیمی و نرخ آزادسازی این مواد به گردش خون سیستمیک است (21). اتساع سینوزوئیدهای کبدی احتمالاً برای حمل بیشتر مواد برای سمزدایی و نشان دهندة افزایش جریان خون در بافت کبدی است و بهعنوان سازوکار کمکی برای سمزدایی عمل میکند. بنابراین، سینوزوئیدها بهمنظور تسهیل این جریان خون متسع میشوند (21). احتقان (تجمع خون) میتواند مسئول دژنراسیون سلولی و نکروز کبد ماهی باشد. بهطورکلی، ضایعات کبدی ممکن است ناشی از اثرات تجمع نانوذرات و آسیب اکسیداتیو باشد (30).
روده در تماس مستقیم با آلایندههای موجود در آب بوده و مسیر احتمالی برای ورود بسیاری از نانومواد است (4). در پژوهش حاضر، تغییرات هیستوپاتولوژیکی روده در بچه ماهیان آزاد دریای خزر تیمارشده با نانوذرات دیاکسید تیتانیوم شامل ضخیمشدن لامینا پروپریا، واکوئلاسیون، ساییدگی و نکروز پرزهای روده بود. لامینا پروپریا بافت همبند عروقی حاوی اعصاب و لکوسیتهاست که زیر اپیتلیوم قرار دارد و همراه با لایه اپیتلیوم مخاط (مکوزا) را تشکیل میدهد (29) و افزایش ضخامت لامینا پروپریا ممکن است ناشی از اختلال در گردش خون (3) و / یا پاسخ التهابی (15) باشد. مشابه نتایج پژوهش حاضر، نانوذرات دیاکسید تیتانیوم باعث ساییدگی و جوشخوردگی پرزهای روده و واکوئلاسیون سلولهای اپیتلیالی روده قزلآلای رنگینکمان شده است (10). در پژوهش مشابهای کپور معمولی با نانوذرات دیاکسید تیتانیوم و نانواکسید مس مواجهه همزمان داده شدند که افزایش سلولهای خونی، انبساط ساختار پرز، نکروز و ساییدگی پرز روده مشاهده شد (19). مشخصشده که تنش، ازجمله آلایندههای موجود در آب میتواند موجب افزایش نوشیدن آب محتوی نانوذرات شود (13،28)، بنابراین، در این شرایط دستگاه گوارش بیشتر در معرض نانوذرات قرار میگیرد. ازاینرو، آسیبهای بافتی مشاهدهشده در پژوهش حاضر میتواند ناشی از بلعیدن نانوذرات نقره و دیاکسید تیتانیوم توسط ماهی آزاد دریای خزر باشد.
نتایج این پژوهش نشان داد که اگرچه نانوذرات دیاکسید تیتانیوم در آزمون سمشناسی حاد (کوتاهمدت) مرگومیری ایجاد نکرد و از این نظر ماده نسبتاً غیر سمی محسوب میشود، با توجه به آسیب بافتی مشاهدهشده در آزمون سمیت حاد نشان میدهد که این نانوذرات قابلیت آسیبزایی در این ماهی را دارد.
نگارندگان بر خود لازم میدانند از همکاری کلیه عزیزانی که در اجرای این پژوهش فعالیت مؤثری داشتهاند، تشکر و قدردانی نمایند.
بین نویسندگان هیچ گونه تعارض منافع گزارش نشده است.
جدول 1. یافتههای هیستوپاتولوژیکی آبشش، کبد و رودة ماهی آزاد دریای خزر بعد از مواجهة حاد (4 روزه) با غلظتهای مختلف نانوذرات دیاکسید تیتانیوم.
* بدون تغییر (-)، تغییر ملایم (+)، تغییر متوسط (++) و تغییر شدید (+++).
اندام/ تیمارها میلیگرم در لیتر |
ضایعات بافتی* |
|||||||||
آبشش |
خمیدگی |
ادم |
هایپرپلازی |
هایپرتروفی |
رأس چماقی |
جوشخوردگی تیغه آبششی |
کوتاهی تیغه ثانویه |
جداشدگی اپیتلیالی |
آنوریسم |
نکروز |
0 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
1 |
++ |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
10 |
+ |
- |
++ |
++ |
++ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
100 |
- |
+ |
+++ |
+++ |
++ |
++ |
++ |
+ |
+ |
+ |
کبد |
دژنراسیون سیتوپلاسمی |
نواحی کانونی ملانوماکروفاژها |
اتساع سینوزوئیدها |
احتقان (پُرخونی) |
نکروز هپاتوسیتها |
تجمع سلولهای خونی |
هسته پیکنوتیک |
واکوئلاسیون |
نکروز |
|
0 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
1 |
+ |
+ |
++ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
|
10 |
+ |
++ |
++ |
+ |
+ |
+ |
++ |
++ |
+ |
|
100 |
++ |
++ |
+++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
+++ |
++ |
|
روده |
فیبروزی |
واکوئلاسیون |
فرسایش پرزهای روده |
جوشخوردگی پرزها |
ضخیمشدگی لامینا پروپریا |
نکروز |
جداشدگی اپیتلیال |
|||
0 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|||
1 |
- |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
|||
10 |
- |
++ |
++ |
+ |
++ |
+ |
++ |
|||
100 |
0 |
++ |
+++ |
++ |
++ |
+ |
++ |
تصویر 1. تغییرات بافتشناختی مشاهدهشده در آبششهای ماهی آزاد دریای خزر بعد از 4 روز مواجهه با نانوذرات دیاکسید تیتانیوم. (a) گروه شاهد، (b) 10 میلیگرم در لیتر، (c) 100 میلیگرم در لیتر. هایپرپلازی (Hp)، کوتاهی تیغة ثانویه (SSL)، هایپرتروفی (Ht)، جوشخوردگی تیغة آبششی (LF)، جداشدگی اپیتلیالی (EL). (هماتوکسیلین و ائوزین، بزرگنمایی ×400).
تصویر 2. هیستوپاتولوژی کبد ماهی آزاد دریای خزر بعد از قرارگرفتن در معرض نانوذرات دیاکسید تیتانیوم به مدت 4 روز. (a) گروه شاهد، (b) 10 میلیگرم در لیتر، (c) 100 میلیگرم در لیتر. هپاتوسیت (H)، فضای سینوزوئید (S)، تجمع سلولهای خونی (AB)، کانونهایی از مراکز ملانوماکروفاژ (MA)، هستة پیکنوتیک (PN)، واکوئلاسیون (V) و نکروز (N). (هماتوکسیلین و ائوزین، بزرگنمایی ×400).
تصویر 3. مورفولوژی روده در ماهی آزاد دریای خزر بعد از مواجهه با نانوذرات دیاکسید تیتانیوم به مدت 4 روز. (a) گروه شاهد، (b) 100 میلیگرم در لیتر. سلولهای ستونی (C)، سلولهای جامی (GC)، لامینا پروپریا (LP)، لایة فشرده (Co)، لایة عضلانی داخلی (I) و لایة عضلانی خارجی (E، تصویر a)، واکوئلاسیون (V)، جداشدگی اپیتلیال (EL)، فرسایش پرزهای روده (E) و نکروز (N) (هماتوکسیلین و ائوزین، بزرگنمایی بزرگنمایی ×400).