Isolation, Characterization and Molecular Identification of Cryptosporidium spp. Causing Diarrhea in Young Calves by Multiplex Nested-PCR

Document Type : Parasitology & Parasitic Diseases

Authors

Laboratory of Protozoology, Department of Parasitology, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Alborz, Iran

Abstract

BACKGROUND: Diagnosis of Cryptosporidium species based on morphological characteristics is very limited and has no taxonomic value alone, and therefore the use of molecular methods removes these limitations to some extent.
OBJECTIVES: The aim of this study was to determine the predominant Cryptosporidium genotypes in calves with diarrhea.
METHODS: Study were conducted in calves aged less than 3 months for a period of 2 years. During the study period, 160 dung samples were collected from neonatal calves and examined first microscopically and then by molecular techniques. Stools were analyzed for the presence of Cryptosporidium oocysts by Sheather's Sugar Flotation Solution followed by Ziel-Neelsen staining method. DNA of parasite was extracted and multiplex nested-PCR protocol basis on the 18srRNA were done to identify three cattle-adapted species (C. andersoni, C. bovis and C. ryanae) plus the zoonotic species C. parvum.
RESULTS: 110 fecal samples were collected from livestock in Alborz province and 50 fecal samples were collected from livestock in Shahroud city. Of the 160 animals examined, 90 were female and 70 were male. In total, out of 160 animals examined, 85 cases (53.12%) had diarrhea, of which 55 cases (34.37%) were positive using Ziel-Neelsen staining. Since all positive cases were related to diarrhea samples and related to calves under one month old, a significant relationship was observed between diarrhea status and the presence of this parasite (p < /em><0.05). In terms of seasonal distribution, no difference was observed in the rate of diarrhea and positive parasitic cases. The presence of 305 bp band in all Ziel-Neelsen positive samples confirmed the presence of C. parvum in all samples.
CONCLUSIONS: Neonatal calves are more likely to be infected with Cryptosporidium parvum, as confirmed by the present study.

Keywords

Full Text

مقدمه


کریپتوسپوریدیوم پارووم یک انگل کوکسیدیایی کوچک داخل سلولی متعلق به شاخه اپی‌کمپلکسا با توزیع جهانی و یکی از مهم‌ترین پاتوژن‌های روده‌ای به خصوص در افراد با نقص ایمنی می‌باشد (3،5). در تحقیقات مختلف نشان داده شده است که چهار گونه اصلی قادر به ایجاد عفونت در گاو­ها می­باشند. اولین گونه کریپتوسپوریدیوم پارووم است که بیش‎تر از 150 گونه از پستانداران از جمله گاو­ها به ‌عنوان میزبان برای آن یا کریپتوسپوریدیوم شبه ‌پارووم شناخته شده‌اند (2،16). دومین گونه کریپتوسپوریدیوم اندرسونی است که در شیردان گاو ایجاد عفونت کرده و اوسیست‌های آن از نظر مورفولوژی به کریپتوسپوریدیوم موریس شباهت داشته اما اندازه آن کمی بزرگ‌تر است (10). در گذشته انگل‌های کریپتوسپوریدیوم که موجب عفونت در انسان‌ها می‌شده با نام کریپتوسپوریدیوم پارووم ژنوتیپ انسانی، ژنوتیپ 1یا ژنوتیپ H به رسمیت شناخته می‌شد، اما امروزه بر اساس تفاوت‌های زیست‌شناسی و مولکولی به‌ نام کریپتوسپوریدیوم هومینیس توصیف می‌شود (17). کریپتوسپوریدیوم هومینیس از نظر ریختی مشابه کریپتوسپوریدیم پارووم می‌باشد و در گاو ایجاد عفونت می­نماید (17). از نظر خصوصیات ژنتیکی، به ‌طور قطعی تفاوت آشکاری بین دو گونه کریپتوسپوریدیوم هومینیس و کریپتوسپوریدیوم پارووم در طیف وسیعی از محل‌های ژنی نشان داده شده است (27). گونه چهارم گونه جدید کریپتوسپوریدیوم رایانه است که در گاو توصیف شده است. اوسیست کریپتوسپوریدیوم رایانه که قبلا به عنوان ژنوتیپ شبیه آهوی کریپتوسپوریدیوم شناخته شده بود مشابه کریپتوسپوریدیوم پارووم و کریپتوسپوریدیوم بوویس، اما کوچک‎تر است. گزارش شده است که این ژنوتیپ در گاو در سراسر جهان شایع است. اوسیست‌های مربوط به این گونه کوچک‌ترین اندازه اوسیست­های کریپتوسپوریدیوم که در پستانداران گزارش شده است را دارا می­باشد. این انگل که از نظر جغرافیایی بسیار گسترده می­باشد، تنها در گاوهای نژاد بوس تاروس یافت شده و به عنوان یک گونه جدید تلقی می­شود (11).

برطبق شواهد و آثار منتشر شده عفونت کریپتوسپوریدیوم در ایران شایع بوده و لزوم مطالعه در زمینه­های مختلف حضور این انگل وجود دارد. از طرفی انجام یک ارزیابی جامع از خطرات حضور این انگل هنگامی میسر خواهد بود که نمونه­ها تعیین گونه و ژنوتیپ/ ساب­تایپ شوند. این یک پیش نیاز برای درک نقش گونه‌های میزبان­های مختلف و ژنوتیپ/ساب­تایپ­های انگل از نظر انتقال بیماری به انسان و حیوانات  محسوب می­گردد. در مطالعه­ای 940 نمونه مدفوع گوساله­های 2 ماهه تا یک ساله شهرستان شهریار به روش ذیل نلسون اصلاح شده رنگ­آمیزی شدند. سپس جهت مطالعه مولکولی دی ان آ انگل استخراج گردید و قطعه 845 جفت بازی ژن srRNA18 کریپتوسپوریدیوم در نمونه­های مثبت با روش Nested PCR  تکثیر گردید و محصول توسط دو آنزیم Ssp1 و Vsp1 برش داده شد. طبق نتایج این تحقیق، 23 نمونه (44/2 درصد) در روش رنگ­آمیزی از نظر آلودگی به انگل کریپتوسپوریدیوم مثبت بودند. تمامی نمونه­های مثبت در روش Nested PCR  دارای الگوی مشابه با کریپتوسپوریدیوم آندرسونی بودند (9). در تحقیقی دیگر مطالعه انگشت‌نگاری دی ان آ ایزوله‌های جدا شده از گاوهای آلوده در استان قزوین براساس بررسی توالی به دست آمده از ژن GP60 انجام گردید و مجموعاً 25 ایزوله کریپتوسپوریدیوم پارووم جدا شده از گاوهای آلوده در دامداری‌های استان قزوین مورد بررسی قرار گرفت. به منظور بررسی ساب ژنوتایپ، نمونه‌ها با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن GP60 تکثیر و سپس، توالی آن­ها تعیین شد. بررسی توالی ژن GP60 در 25 ایزوله کریپتوسپوریدیوم پارووم وجود دو ساب ژنوتیپ اصلی و همچنین وجود سه ساب ژنوتیپ فرعی در این ایزوله‌ها را مشخص نمود (18).

مروری بر مطالعات انجام شده بر روی ژنوتایپینگ کریپتوسپوریدیوم در خلال چند سال گذشته نشان­ دهنده استفاده از ژنSSU rRNA در 100 اثر در بین 116 (86 درصد) آثار منتشر شده بوده ­است. بویژه روش PCR-RFLP که قطعه تقریباً 830 بیس پیری از ژن را هدف قرار می­دهد و از آنزیم­های محدود­الاثر VspI و SspI برای ژنوتایپینگ در آن استفاده شده است (27،24). در مطالعه بر روی نحوه انتقال کریپتوسپوریدیوم هومینیس در انسان­ها و کریپتوسپوریدیوم پارروم در انسان­ها و نشخوارکنندگان، روش­های ساب­تایپینگ نیز مورد استفاده قرار گرفته است. یکی از روش­های مورد استفاده در ساب­تایپینگ گونه­های انگل، آنالیز توالی دی ان آ در بخش گلیکوپروتئین 60 کیلو دالتونی می­باشد.

واضح است که گونه­ها/ژنوتیپ‎های که تاکنون در ایران جدا شده است نمی­توانند نمایانگر تمامی آن­ها باشند و بنابراین پایش، بررسی و ژنوتایپینگ در حد گسترده­تری نیاز است تا به درک بهتری از راه­های انتقال کریپتوسپوریدیوم در ایران دست یابیم. مطالعات صورت گرفته نقش پراهمیت احشام مانند گاو، گوسفند، اسب و شتر را در چرخه عفونت ناشی از کریپتوسپوریدیوم نشان داده است و مشخص شده کریپتوسپوریدیوم پارووم شایع­ترین گونه در این میزبان­ها و در انسان می­باشد. لازم به ذکر است تعیین ژنوتیپ ایزوله­های کریپتوسپوریدیایی، به‌منظور شناسایی دقیق منشاء آلودگی و تبیین روش­های کنترل و پیشگیری مناسب  ضروری می‌نماید (1،7،8،27)، که به همین منظور تحقیق حاضر برای اولین بار در ایران و با استفاده از روش مولتیپلکس نستد پی سی آر بر روی موارد اسهالی حاصل از گوساله­های دامداری­های استان البرز و شهر شاهرود انجام پذیرفت.

مواد و روش ﮐﺎر

جمع‌آوری نمونه‌های مورد مطالعه: نمونه‌برداری از اواخر اسفند ماه 1394 شروع و تا مهر ماه 1396 صورت گرفت. کلیه نمونه­ها از دامداری­های صنعتی و از گاو­های اصلاح نژاد شده استان البرز و شهر کرج و همین‌طور شهر شاهرود تهیه شد. بعد از هماهنگی با مسئولین شبکه­های دامپزشکی مربوطه، پس از اخذ رضایت‌نامه آگاهانه از دامدارها و ثبت اطلاعات دموگرافیک و برخی اطلاعات دیگر از جمله سن، جنس و غیره، در ظروف مخصوص از گوساله­ها نمونه مدفوع گرفته شد. نمونه‌گیری به روش توشه رکتال انجام گردید. در مواردی که توشه رکتال امکان­پذیر نبود از بستر حیوان تازه­ترین نمونه مدفوع جمع­آوری گردید. پس از انتقال دادن نمونه‌ها به آزمایشگاه تک­یاخته شناسی بخش تحقیق و تشخیص بیماری­های انگلی موسسه تحقیقات واکسن و سرم­ سازی رازی کرج، وضعیت فیزیکی و قوام مدفوع را بررسی کرده و آن را در برگه مخصوص ثبت نموده و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد یخچال نگه‌داری ‌شدند.

بررسی میکروسکوپی انگل: در ابتدا جهت جستجوی انگل­ها تغلیظ نمونه­ها به روش رسوبی فرمالین اتر انجام پذیرفت. پس از تهیه‌ گستره از رسوب و خشک شدن آن، با متانول فیکس شده، سپس به روش تغییر­یافته ذیل نلسون رنگ­آمیزی شدند، به این شکل که رنگ کربول فوشین روی لام‌ها ریخته و بعد از مدت زمان پانزده دقیقه با آب شیر شستشو شده و سپس با استفاده از اسید- الکل 1 درصد (اسید کلریدریک- اتانول، 1 به 99) رنگ‌بری شد تا تقریباً لام از نظر رنگ کربول فوشین بی‌رنگ شود. دوباره لام‎ها با آب شیر شستشو شده و به مدت 30 ثانیه رنگ زمینه‌ای متیلن بلو 4/0 درصد روی آن ریخته و در نهایت پس از شستشوی نهایی لام‌ها با آب شیر و خشک شدن آن‌ها در مجاورت هوا در دمای آزمایشگاه با روغن ایمرسیون و با درشت‌‌نمایی 100 میکروسکوپ نوری زمینه‌ روشن لام‌ها از نظر وجود اوسیست‌های کریپتوسپوریدیوم بررسی شدند. در بررسی میکروسکوپی می‌توان انگل را به رنگ قرمز و اندازه‌ 4 تا 6 میکرون در زمینه آبی تشخیص داد. پس از تأیید حضور انگل، جهت استخراج دی ان آ و انجام مراحل مولکولی، تغلیظ اوسیست‌ها در نمونه‌های مثبت با استفاده از شناورسازی با آب و شکر به روش شیتر و مطابق منابع انجام پذیرفت (13). با استفاده از یک پیپت پاستور اوسیست‌ها از سطح محلول شیتر در لوله‌ای جداگانه جمع‌آوری شده و با سرم فیزیولوژی دو تا سه بار شستشو داده شده و به منظور جداسازی دی ان آ در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد نگه‌داری شدند.

بررسی مولکولی (استخراج دی ان آ با روش فنل- کلروفرم- ایزوآمیل الکل تغییر یافته): جهت استخراج دی ان آ از روش Boom و همکاران در سال 1990 (6) با برخی تغییرات استفاده شد. بدین صورت که250 میکرولیتر از اوسیست تغلیظ شده و شسته شده در سرم فیزیولوژی در یک میکروتیوب 2 میلی‌لیتری ریخته، سپس با سرعت 4000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شده و مایع رویی دور ریخته شد. سپس رسوب حاصله 5 مرتبه در نیتروژن مایع منجمد و در بن ماری 60  درجه سانتی‌گراد و به جهت سست شدن دیواره اوسیست­ها ذوب گردید. در مرحله بعد 1 میلی­لیتر از بافر لیز کننده اضافه و کاملاً با رسوب مخلوط شد. آنگاه محلول SDS در آب در غلظت نهایی 1 درصد و پروتئیناز K در غلظت نهایی 100 میکروگرم/ میلی­لیتر به لوله اضافه شده و کاملاً ‌مخلوط و به مدت یک شب (جهت هضم پروتئین‌ها و اتصالات بین سلولی) در دمای 60 درجه سانتی‌گراد و در بن ماری انکوبه شد. در این مرحله جهت حذف آر ان آ موجود در واکنش، آنزیم ربیونوکلئاز  Aدر غلظت نهایی 100 میکروگرم/ میلی­لیتر به لوله اضافه و به مدت 1 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی­گراد قرار داده شد. سپس جهت جداسازی ناخالصی­ها به هر لوله 300 میکرولیتر محلول کلرید سدیم 5 مولار اضافه و ده دقیقه در یخچال 4 درجه سانتی­گراد قرار داده­ شد. پس از آن 1 میلی­لیتر از ترکیب فنل (24 حجم)- کلروفرم (24 حجم)- ایزوآمیل الکل (1 حجم) به لوله اضافه و لوله به آرامی در طی 10 دقیقه سر و ته شد. سپس به مدت 10 دقیقه در 14000 دور در دقیقه سانتریفوژ شده، مایع رویی برداشته و به لوله 2 میلی­لیتری جدیدی انتقال داده شد. هم حجم فاز شفاف جدا شده کلروفرم اضافه نموده و لوله به آرامی سر و ته شده، سپس در 14000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه و به جهت حذف مولکول‌های فنل سانتریفوژ گردید. این مرحله شستشو با کلروفرم یک بار دیگر تکرار گردید. مایع رویی به لوله تمیزی انتقال داده و هم حجم آن ایزوپروپانول سرد و یک دهم حجم آن استات سدیم 3 مولار اضافه گردید. لوله حاوی دی ان آ به مدت یک شب در فریزر 20- درجه سانتی­گراد قرار داده­ شد. سپس به مدت 30 دقیقه در 14000 دور در دقیقه سانتریفوژ گردید. محلول رویی دور ریخته، سپس لوله­ها با اتانول 70 درصد سرد پر شده و به مدت 15 دقیقه در 14000 دور در دقیقه سانتریفوژ گردید. مرحله شستشو یک بار دیگر تکرار شد. اتانول 70 درصد به‌طور کامل خالی شده و درب لوله 15-10 دقیقه باز گذاشته شد تا اتانول تبخیر گردد. سپس رسوب خشک شده در 50 میکرولیتر آب مقطر به خوبی حل گردیده و محلول حاصل تا هنگام استفاده جهت PCR در دمای 20- درجه سانتی­گراد ذخیره شد.

استفاده از روش Multiplex Nested PCR جهت تعیین هویت مولکولی انگل: جهت Multiplex Nested PCR کریپتوسپوریدیوم از 6 جفت پرایمر اختصاصی استفاده گردید (22،23). جفت پرایمر اول یک قطعه به طول 1300 بیس پیر از ژن srRNA18 را جدا نمود. پس از انجام مرحله اول PCR تحت شرایط استاندارد، 1 میکرولیتر از محصول PCR اول به‌عنوان الگو در مرحله دوم PCR مورد استفاده قرار گرفت. در این مرحله از جفت پرایمرهای دوم استفاده شد که یک قطعه به طول 241 تا 840 جفت باز (بسته به گونه انگل) را تکثیر نمود. به عبارتی در یک واکنش مولتیپلکس از پرایمرهای اینترنال فوروارد هر چهار گونه (CaF-CrF-CphF-CbF) به علاوه پرایمر اینترنال ریورز در حد جنس (3032AL) استفاده شد تا در یک واکنش مولتیپلکس گونه موجود شناسایی گردد. حجم نهایی 28 میکرولیتری تنظیم و میزان پرایمر 20 پیکومول در نظر گرفته شد. در پی سی آر دوم از برنامه مشابه پی سی آر اول استفاده شد، بجز اینکه دمای اتصال را از 55 به 56 درجه سانتی­گراد رسانده شد. پس از هر مرحله PCR، محصول حاصل روی ژل آگارز 5/1درصد همراه با سایبر سیف (اینویتروژن) الکتروفورز شده و با ژل داکیومنت باندهای مربوطه در کنار سایز مارکر مشاهده گردید. در کلیه مراحل از کنترل­های مثبت کریپتوسپوریدیوم و منفی (اواوسیست آیمریا) نیز استفاده گردید.

نتایج

110 نمونه مدفوع از دامداری­های موجود در استان البرز و 50 نمونه مدفوع نیز از دامداری­های شهر شاهرود جمع­آوری گردید. از 160 راس حیوان مورد آزمایش 90 راس ماده و 70 راس نر بودند. به کمک رنگ‌آمیزی ذیل ‌نلسون اصلاح شده در 8 نمونه (16 درصد) از 50 نمونه مدفوع جمع­آوری شده از شاهرود تک‌یاخته‎ جنس کریپتوسپوریدیوم تشخیص داده ­شد. از 50 نمونه جمع­آوری شده در این منطقه 15 نمونه اسهالی بودند که تمام موارد مرتبط با گوساله­های زیر یک ماه بود و لذا ارتباط معنی­داری مابین وضعیت اسهال و حضور این انگل مشاهده گردید (05/0P<). از 110 راس دام مورد بررسی در استان البرز، 90 راس آن مربوط به گوساله­های زیر یک ماه بود که  70 مورد از آن­ها دچار اسهال بودند. کلیه موارد اسهالی مربوط به گوساله­های زیر یک ماه بود. از میان 70 راس دام اسهالی 47 مورد (72/42 درصد) آن­ها از نظر میکروسکوپی و با استفاده از رنگ‌آمیزی ذیل ‌نلسون اصلاح شده مثبت تشخیص داده شدند. در مجموع در میان 160 راس دام مورد آزمایش 85 مورد (12/53 درصد) مبتلا به اسهال بودند که 55 مورد (37/34 درصد) از این تعداد حیوان تحت آزمایش با استفاده از رنگ‌آمیزی ذیل‌ نلسون اصلاح شده مثبت تشخیص داده شدند. از آنجایی که تمام موارد مثبت مربوط به نمونه‌های اسهالی و مرتبط با گوساله­های زیر یک ماه بود، ارتباط معنی‌داری مابین وضعیت اسهال و حضور این انگل مشاهده گردید (05/0P<). از نظر توزیع فصلی تفاوتی در میزان موارد اسهالی و موارد مثبت انگلی مشاهده نشد.

یافته‌های بررسی مولکولی: نمونه­هایی که به واسطه رنگ‌آمیزی ذیل نلسون مثبت تشخیص داده شده بودند با به کارگیری پرایمرهای اختصاصی گونه­های کریپتوسپوریدیوم در گاو و با استفاده از روش nested PCRMultiplex مورد ارزیابی قرار گرفتند. مراحل استخراج دی ان آ به خوبی انجام پذیرفت و استفاده از روش انجماد- ذوب با به کارگیری ازت مایع و بن ماری 60 درجه سانتی­گراد در ۵ نوبت جهت شکستن دیواره اواوسیست­ها و استخراج دی ان آ انگل کفایت نمود. جهت Multiplex Nested PCR کریپتوسپوریدیوم از 6 جفت پرایمر اختصاصی استفاده گردید (22). در مرحله اول با استفاده از جفت پرایمرهای اختصاصی جنس کلیه 55 نمونه مثبت از نظر میکروسکوپی مورد ارزیابی قرار گرفتند که در این مرحله قطعه­ای به طول تقریبی 840 بیس پیر از ژن srRNA18 تکثیر و بر روی ژل آگاروز الکتروفورز گردید که تأیید کننده حضور انگل کریپتوسپوریدیوم در حد جنس بود (تصویر 1). در مرحله دوم با به کارگیری 4 پرایمر فوروارد اختصاصی 4 گونه و ریورز اختصاصی جهت جداسازی در حد جنس در یک واکنش (5 پرایمر در یک واکنش مولتیپلکس) کلیه 55 نمونه مورد ارزیابی قرار گرفتند که در این مرحله در تمام نمونه­ها قطعه­ای به طول تقریبی 305 بیس پیر تکثیر و بر روی ژل آگاروز الکتروفورز گردید که تأیید کننده حضور گونه کریپتوسپوریدیوم پارووم بود (تصویر 2).

بحث

بررسی وضعیت مولکولار اپیدمیولوژی کریپتوسپوریدیوم و تعیین وفور ژنوتیپ‌های زئونوتیک و آنتروپونوتیک انگل در منطقه می‌تواند اطلاعات مفیدی جهت تصمیم‌گیری و برنامه‌ریزی‌های بهداشتی در خصوص کنترل و پیشگیری بیماری‌ در منطقه فراهم نماید. تاکنون دو گونه از جنس کریپتوسپوریدیوم با نام‌های کریپتوسپوریدیوم پارووم و کریپتوسپوریدیومآندرسونی شایع‌ترین گونه‌های شناسایی شده در گاوها و گوساله‌ها بوده‌اند. گونه اول شیوع بیش‌تری داشته و در دام‌های شیرخوار بیش‌تر با اسهال همراه است، اما  کریپتوسپوریدیومآندرسونی در گوساله‌های بالغ و جوان شیوع بیش‌تری دارد. گاو معمولاً با گونه­های کریپتوسپوریدیومملهآگریدیس، کریپتوسپوریدیوم رایانه، کریپتوسپوریدیوم بوویسو کریپتوسپوریدیوماندرسونیعلاوه بر گونه پارووم نیز مبتلا می­شود. مطالعات پیشین در آمریکا از وجود رابطه بین سن و بروز گونه­های کریپتوسپوریدیومحکایت می­کند (22،26). آﻟﻮدﮔﻲ ﮔﺎوﻫﺎ در ﻛﺸﻮرﻫﺎی ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺟﻬﺎن ﻣﺘﻐﻴــﺮ بوده و  ماﺑﻴﻦ 5 درصد ﺗــﺎ 41 درصد ﻣــﻲﺑﺎﺷــد و به طور مثال در تحقیقی Huber و همکاران در سال 2007 خصوصیات ژنتیک و فیلوژنتیک جنس کریپتوسپوریدیوم را در تعدادی از حیوانات اهلی در برزیل بررسی کردند. در این مطالعه نمونه‌های مدفوع از جوجه­ها، اردک­ها، خوکچه­ها، گوساله­ها، سگ­ها و گربه­ها جمع­آوری شد و اوسیست‎های استخراج شده به روش RFLP و با استفاده از توالی‌های ژن srRNA18 مورد آنالیز قرار گرفتند که در یکی از گوساله­ها کریپتوسپوریدیومپارووم شناسایی شد (15). Bajer در سال 2008 ضمن مطالعه­ای روی عفونت کریپتوسپوریدیوم در انسان، حیوان و محیط زیست در لهستان گزارش کردند گاوها مهم‌ترین مخزن کریپتوسپوریدیوم پارووم هستند (4). البته ﻣﻄﺎﻟﻌــﺎت اﻧﺠــﺎم پذیرفته در ﻣﻨﺎﻃﻖ ﻣﺨﺘﻠﻒ اﻳﺮان نشان دهنده آن اﺳﺖ ﻛﻪ ﻣﻴﺰان آﻟﻮدﮔﻲ ﺑﻪ ﻛﺮﻳﭙﺘﻮﺳﭙﻮرﻳﺪﻳﻮم در ﮔﺎوﻫﺎی اﻳﺮان ﻛﻤﺘﺮ از ﺳﺎﻳﺮ ﻛﺸﻮرﻫﺎ بوده و ماﺑﻴﻦ 61/1 تا 9/14 درصد می‌باشد (3،21)، به طوری که در تحقیقات گذشته در ایران شیوع بیماری در گاوهای کرمان، بابل، اطراف تهران، اصفهان، سنندج و آمل را  به‌ترتیب 9/18، 33/7، 9، 2/66، 1/4 و 92/3 درصد گزارش نموده­اند (20).

در تحقیقات مقدماتی نشان داده شده بود که گوساله­های شیرخوار بیشتر با کریپتوسپوریدیومپارووم و گوساله­های از شیر گرفته شده بیشتر با کریپتوسپوریدیومبوویسو کریپتوسپوریدیومرایانهآلوده می­شوند و کریپتوسپوریدیوماندرسونی بیشتر در گوساله­های سن­دار و بالغ دیده شده است و مطالعات بعدی نیز نشان دهنده این مطلب بودند و بدین ترتیب می­توان نتیجه گرفت که در گوساله­های شیرخوار بیشترین میزان ابتلا با کریپتوسپوریدیومپارووم دیده می­شود (12) که تحقیق حاضر نیز موید این مطلب بود. مطﺎﻟﻌﺎت ﺟﺪﻳﺪ ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ ﺣﺎﻛﻲ از آن اﺳﺖ ﻛﻪ ﮔﻮﻧﻪ­ﻫﺎی ﻛﺮﻳﭙﺘﻮﺳﭙﻮرﻳﺪﻳﻮم ﻫﻮﻣﻴﻨﻴﺲ و ﻛﺮﻳﭙﺘﻮﺳﭙﻮرﻳﺪﻳﻮم ﭘﺎرووم در اﻳﺠـــﺎد آﻟـــﻮدﮔﻲ اﻧـــﺴﺎن دارای ﻧﻘـــﺶ ﻣـــﻲ­ﺑﺎﺷـــﻨﺪ و ﻛﺮﻳﭙﺘﻮﺳﭙﻮرﻳﺪﻳﻮم ﭘﺎرووم ﻣﻲ­ﺗﻮاﻧﺪ در ﮔﺎو و اﻧﺴﺎن ﺑﻴﻤـﺎری اﻳﺠﺎد ﻛﻨﺪ و ﺑﻪ‌ﻋﻨﻮان ﺗﻨﻬـﺎ ﮔﻮﻧـﻪ­ای از ﻛﺮﻳﭙﺘﻮﺳـﭙﻮرﻳﺪﻳﻮم ﻣﻲ­ﺑﺎﺷﺪ ﻛﻪ از ﻧﻈﺮ اﻳﺠﺎد ﺑﻴﻤﺎری ﻣﺸﺘﺮک ﺑﺎ ﻣﻨـﺸﺎء داﻣـﻲ ﻣﻄﺮح ﻣﻲ­ﺑﺎﺷﺪ. اﻳﻦ ﻣﻮﺿﻮع اﻫﻤﻴﺖ ﻧﻘـﺶ ﮔـﺎو (ﺑﻪ وﻳﮋه ﮔﻮﺳﺎﻟﻪ­ﻫﺎی ﺷﻴﺮی) را ﺑﻪ ﻋﻨﻮان ﻳـﻚ ﻣﻨﺒـﻊ ﻣﻬـﻢ آﻟﻮدﮔﻲ ﺑﺮای ﺟﻮاﻣﻊ اﻧﺴﺎﻧﻲ در اﻳﺮان را ﻣﻄﺮح ﻣﻲ­ﻛﻨﺪ (14). ﺗﻤﺎس ﺑﺎ ﮔﻮﺳﺎﻟﻪﻫﺎی آﻟﻮده ﻋﺎﻣﻞ ﺑﺴﻴﺎری از ﻫﻤﻪ­ﮔﻴﺮی‌های ﻛﺮﻳﭙﺘﻮﺳﭙﻮرﻳﺪﻳﺎﻳﻲ در داﻧﺸﺠﻮﻳﺎن داﻣﭙﺰﺷﻜﻲ، ﻛﺎرﺷﻨﺎﺳـﺎن آزﻣﺎﻳﺸﮕﺎﻫﻲ و ﺗﺤﻘﻴﻘﺎﺗﻲ و ﻛﻮدﻛﺎﻧﻲ ﻛﻪ ﺑﺎ ﻣﺰارع ﭘﺮورش ﮔﺎو در ارﺗﺒﺎط ﺑﻮده­اﻧﺪ، در نظر گرفته شده ­اﺳﺖ. آﻟﻮده ﺷﺪن آب و ﻣﻮاد ﻏﺬاﻳﻲ ﻣـﻮرد اﺳـﺘﻔﺎده اﻧـﺴﺎن ﺑـﺎ ﻣـﺪﻓﻮع ﮔـﺎو ﻋﺎﻣـﻞ ﺑﺴﻴﺎری از ﻫﻤﻪ­ﮔﻴﺮی‌های ﻛﺮﻳﭙﺘﻮﺳﭙﻮرﻳﺪﻳﻮزﻳﺲ ﻧﺎﺷـﻲ از آب و ﻏﺬا ﺑﻮده اﺳﺖ (27).

به نظر می­رسد که آلودگی به تک­یاخته فوق تحت تأثیر عوامل متعددی قرار دارد که در این خصوص می­توان به مدیریت پرورش دام به‌ویژه تراکم، تغذیه بد، شرایط بهداشتی نامناسب و هم‌چنین نوع بستر اشاره نمود. داروهایی مانند پارومومایسین، اسپیرومایسین و نیتازوکسانید نیز جهت کنترل دفع انگل مؤثر بوده و به دامداران منطقه توصیه می‌گردد با نظر دامپزشک جهت پیشگیری از آلودگی بیش‌تر گوساله­ها از این داروها استفاده نمایند. مدیریت نگه‌داری دام در کاهش آلودگی تأثیر بسزایی دارد. پس تمیز نگه‌ داشتن محل زندگی دام از مدفوع، خشک نگه داشتن محل و ضدعفونی با محلول آمونیوم 5 درصد توصیه می‌گردد. جلوگیری از تراکم بیش از حد دام در یک مکان بسته و جدا کردن دام‌های بالغ از دام‌های جوان‌تر باعث کاهش انتقال عفونت می‌گردد، زیرا انتقال آلودگی به دام‌های کم سن­تر توسط دام‌های بالغ صورت گرفته و به علت حساس بودن نوزادان شیوع عفونت در آن‌ها بیش‌تر می‌باشد. توصیه می­گردد نوزادان و دام‌های بالغ که دچار اسهال هستند از سایر دام‌ها جدا شده و نوزادان تازه متولد شده از خوردن آغوز مادر محروم نگردند.

سپاسگزاری

از کلیه همکارانی که تسهیلات لازم برای اجرای این پروژه را فراهم نمودند، کمال تشکر و قدردانی را داریم. کلیه هزینه­های این تحقیق در قالب پروژه تحقیقاتی به شماره ثبت 950236-029-18-18-2 تأمین مالی و علاوه بر آن فضا و تجهیزات آزمایشگاهی نیز توسط موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی فراهم گردیده است.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

 

تصویر1. الکتروفورز محصول PCRI نمونه­های مورد آزمایش با پرایمرهای اختصاصی جنس که نشان دهنده حضور قطعه‌ای در حدود 840 بیس پیر و تأیید کننده جنس کریپتوسپوریدیوم می­باشد. ستون سمت راست (1) مارکر 100 بیس پیر؛ ستون سمت چپ (2) نمونه.

تصویر2. الکتروفورز محصول PCRII نمونه­های مورد آزمایش با پرایمرهای اختصاصی گونه که نشان دهنده حضور قطعه‌ای در حدود bp305 و تأیید کننده حضور گونه کریپتوسپوریدیوم پارووم می­باشد. ستون سمت راست مارکر Kb 1و ستون سمت چپ نمونه با اندازه تقریبی bp 305.

 

References

  1. Alves, M., Xiao, L., Sulaiman, I., Lal, A.A., Matos, O., Antunes, F. (2003). Subgenotype analysis of Cryptosporidium isolates from humans, cattle, and zoo ruminants in Portugal. J Clin Microbiol, 41(6), 2744–2747. https://doi.org/10.1128/JCM.41.6.2744-2747. 2003 PMID: 12791920
  2. Awad-El-Kariem, F.M., Robinson, H.A., Petry, F., McDonald, V., Evans, D., Casemore, D. (1998). Differentiation between human and animal isolates of Cryptosporidium parvum using molecular and biological markers. Parasitol Res, 84(4), 297–301. https://doi.org/10.1007/s004360050399
  3. Azami, M. (2007). Prevalence of cryptosporidium infection in cattle in Isfahan, Iran. J Eukaryot Microbiol, 54(1), 100–102. https://doi.org/10.1111/j.1550-7408.2006.00236.x
  4. Bajer, A. (2008). Cryptosporidium and Giardia spp. infections in humans, animals and the environment in Poland. Parasitol Res, 104(1), 1–17. https://doi.org/10.1007/s00436-008-1179-x
  5. Barker, I.K., Carbonell, P.L. (1974). Cryptosporidium agni sp. n. from lambs, and Cryptosporidium bovis sp. n. from a calf, with observations on the oocyst. Parasitol Res, 44(4), 289–298. https://doi.org/10.1007/BF00366112
  6. Boom, R., Sol, C.J., Salimans, M.M., Jansen, C.L., Wertheim-van Dillen, P.M., Van der Noordaa, J. (1990). Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol, 28(3), 495–503. PMID: 1691208
  7. Cama, V.A., Bern, C., Roberts, J., Cabrera, L., Sterling, C.R., Ortega, Y., Gilman, R.H., Xiao, L. (2008). Cryptosporidium species and subtypes and clinical manifestations in children, Peru. Emerg Infect Dis, 14(10), 1567. https://doi.org/10.3201/eid1410. 071273 PMID: 18826821
  8. Cama, V.A., Ross, J.M., Crawford, S., Kawai, V., Chavez-Valdez, R., Vargas, D., Vivar, A., Ticona, E., Ñavincopa, M., Williamson, J. (2007). Differences in clinical manifestations among Cryptosporidium species and subtypes in HIV-infected persons. J Infect Dis, 196(5), 684–691. https://doi.org/10.1086/ 519842
  9. Dalimi, A., Tahvildar, f., Kazemi, B. (2015). Molecular identification of Cryptosporidium andersoni in Shahriar calves. Vet J (Pajouhesh va Sazandegi), 28(2), 24–30.
  10. Enemark, H.L., Ahrens, P., Lowery, C.J., Thamsborg, S.M., Enemark, J.M.D., Bille-Hansen, V., Lind, P. (2002). Cryptosporidium andersoni from a Danish cattle herd: identification and preliminary characterisation. Vet Parasitol, 107(1), 37–49. https://doi.org/10.1016/S0304-4017(02)00083-3
  11. Fayer, R., Santín, M., Trout, J.M. (2008). Cryptosporidium ryanae n. sp. (Apicomplexa: Cryptosporidiidae) in cattle (Bos taurus). Vet Parasitol, 156(3), 191–198. https://doi.org/10.1016/j. vetpar.2008.05.024
  12. Fayer, R., Santín, M., Xiao, L. (2005). Cryptosporidium bovis n. sp. (Apicomplexa: Cryptosporidiidae) in cattle (Bos taurus). J Parasitol, 91(3), 624–629. https://doi.org/10.1645/GE-3435
  13. Fayer, R., Xiao, L. (200). Cryptosporidium andCryptosporidiosis. (2nd ed.) CRC Press, Boca Raton, FL. p. 1-527.
  14. Heidari H, G.J. (2012). Study of cryptosporidium infection in the livestock (Cattle, Sheep, Dogs, Fowls) and humans, in Hamadan city and its suburbs during 2006-2011. Avicenna J Clin Med, 19(3), 67–74.
  15. Huber, F., Da Silva, S., Bomfim, T.C.B., Teixeira, K.R.S., Bello, A.R. (2007). Genotypic characterization and phylogenetic analysis of Cryptosporidium sp. from domestic animals in Brazil. Vet Parasitol, 150(1), 65–74. https://doi.org/10.1016/j.vetpar. 2007.08.018
  16. Morgan, U.M., Xiao, L., Sulaiman, I., Weber, R., Lal, A.A., Thompson, R.C.A., Deplazes, P. (1999). Which genotypes/ species of Cryptosporidium are humans susceptible to?. J Eukaryot Microbiol, 46(5), 42S - 43S. https://doi.org/10.1111/j. 1550-7408.1999.tb06056.x
  17. Morgan-Ryan, U.M., Fall, A., Ward, L.A., Hdjawi, N., Sulaian, I., Payer, R., Thompson, R.C.A., Olson, M., Lal, A., Xia, L. (2002). Cryptosporidium hominis n. sp. (Apicomplexa: Cryptospor-idiidae) from humans, Homo sapiens. J Eukaryot Microbiology, 49(6), 433–440. https://doi.org/10.1111/j.1550-7408.2002.tb00224.x
  18. Nazemalhosseini Mojarad, E., Taghipour, N., Haghighi, A., Keshavarz, A., Rostami Nejad, M., Z.M.R. (2011). DNA fingerprinting of bovine cryptosporidium isolates in Qazvin province, Iran. Koomesh, 12(4), 408–412.
  19. Peng, M.M., Xiao, L., Freeman, A.R., Arrowood, M.J., Escalante, A.A., Weltman, A.C., Ong, C.S., Mac Kenzie, W.R., Lal, A.A., Beard, C.B. (1997). Genetic polymorphism among Cryptosporidium parvum isolates: evidence of two distinct human transmission cycles. Emerg Infect Dis, 3(4), 567. https://doi.org/ 10.3201/eid0304.970423 PMID: 9366611
  20. Ranjbar-Bahadori Sh., A.M., T. M. (2013). Study on the infection rate to cryptosporidium in suckling calves of Ghuchan district. Iran Vet J, 9(40), 62-68.
  21. Safavi, E.A., Mohammadi, G.R., Naghibi, A., Rad, M. (2011). Prevalence of Cryptosporidium spp. infection in some dairy Herds of Mashhad (Iran) and its association with diarrhea in newborn calves. Comp Clin Path, 20(2), 103–107. https://doi.org/10.1007/ s00580-010-0956-y
  22. Thomson, S., Innes, E.A., Jonsson, N.N., Katzer, F. (2016). A multiplex PCR test to identify four common cattle-adapted Cryptosporidium species. Parasitol Open, 2, e5. Published by Cambridge University Press, 22 April 2016. https://doi.org/10. 1017/pao.2016.2
  23. Thomson, S., Innes, E.A., Jonsson, N.N., Katzer, F. (2019). A multiplex PCR test to identify four common cattle-adapted Cryptosporidium species - corrigendum. Parasitology Open 5, e1, 1. https://doi.org/10.1017/pao.2018.16
  24. Xiao, L., Bern, C., Limor, J., Sulaiman, I., Roberts, J., Checkley, W., Cabrera, L., Gilman, R.H., Lal, A.A. (2001). Identification of 5 types of Cryptosporidium parasites in children in Lima, Peru. J Infect Dis, 183(3), 492–497. https://doi.org/10.1086/318090
  25. Xiao, L., Fayer, R., Ryan, U., Upton, S.J. (2004). Cryptosporidium taxonomy: recent advances and implications for public health. Clin Microbiol Rev, 17(1), 72–97. https://doi.org/ 10.1128/CMR.17.1.72-97.2004 PMID: 14726456
  26. Xiao, L., Feng, Y. (2008). Zoonotic cryptosporidiosis. FEMS Immunol Med Microbiol, 52(3), 309–323. https://doi.org/10. 1111/j.1574-695X.2008.00377.x
  27. Xiao, L., Singh, A., Limor, J., Graczyk, T.K., Gradus, S., Lal, A. (2001). Molecular characterization of Cryptosporidium oocysts in samples of raw surface water and wastewater. Appl Environ Microbiol, 67(3), 1097–1101. https://doi.org/10.1128/AEM.67.3. 1097-1101.2001 PMID: 11229897
Journal of Veterinary Research
Volume 75, Issue 3
September 2020
Pages 271-279

Files

Share

How to cite

Statistics