سیکل فحلی در سگ سانان از نوع مونواستروس غیرفصلی است که به 4 فاز تقسیم می‌شود:  پرواستروس 9 روز، استروس 9 روز، دایستروس 65 روز و آنستروس 120روز. پرواستروس از اولین روز ترشحات خونی از فرج آغاز می‏شود و در اولین روز پذیرش سگ نر برای جفت‌گیری پایان می‏یابد. شروع این فاز همراه با یک سری نشانه‏های بالینی از جمله تورم فرج و ترشحات سروزی خونی از فرج است. افزایش شاخی شدن و ادم اپیتلیوم واژن در این فاز اتفاق می‏افتد (11). پروفایل سلول‏های اپیتلیوم واژن شامل: سلول‏های پارابازال (Parabasal cells)، تعداد زیادی سلول‏های واسطه‏ای کوچک (Small intermediate cell) و واسطه‏ای بزرگ (Large intermediate cell) و تعداد زیادی گلبول قرمز است. هرقدر که سگ به اواخر پرواستروس نزدیک می‏شود تعداد سلول‏های شاخی بدون هسته (Anuclear keratinized) هم بیشتر می‏شوند. شاخی شدن به طور متوسط بین 1 تا 6 روز قبل از غلیان LH رخ می‏دهد (9). زمان فحلی و آغاز آن از اولین روز ایستادن سگ ماده برای سگ نر و پذیرش جفت‌گیری مشخص می‏شود. از لحاظ آناتومیک، چروکیدگی و ترشح موکوسی واژن در فاز استروس با واژینوسکوپ قابل مشاهده است. این تغییرات در پاسخ به کاهش شدید نسبت استروژن به پروژسترون اتفاق می‏افتد. کاهش ترشح استرادیول از مقادیر پیک در اواخر پرواستروس تا مقادیر متوسط 20- 10 پیکوگرم در میلی لیتر ادامه می‏یابد. پروژسترون سرم سریع افزایش می‏یابد و به بالاتر از  3- 1 نانوگرم در میلی لیتر در زمان غلیان LH می‏رسد و بلافاصله یا با یک فاصله‏ی 1 تا 3 روزه شدیداً افزایش می‏یابد و نهایتاً به 25- 10 نانوگرم در میلی لیتر در حدود روزهای 10 از فاز استروس یا کمی بعد از پایان استروس می‏رسد. پروفایل سلول‏های اپیتلیوم واژن شامل: سلول‏های واسطه‏ای بزرگ و غالبیت سلول‏های بزرگ شاخی است. در اوایل استروس گلبول قرمز به میزان کم نیز مشاهده می‏شود.

دی‏استروس با امتناع سگ ماده برای جفت‏گیری آغاز می‏شود و به طور متوسط 65 روز طول می‏کشد (بازه 50 تا 80 روز). پایانِ مت استروس و آغاز آنستروس هنگامی است که اندومتریوم رحم از لحاظ بافت‌شناسی ترمیم گردد و یا زمانی که بزرگ شدن پستان در پاسخ به فاز لوتئال کاهش یابد و یا طی تعریف متداول دهه گذشته هنگامی‌که پروژسترون سرم به سطوح زیر 1 نانوگرم کاهش یابد. در روزهای 20 و 35 دوره دای استروس پروژسترون به میزان پیک خود 15تا 180 نانوگرم در هر میلی لیتر می‌رسد سپس به مرور کاهش یافته و در روزهای 55 تا 90 به زیر 1 نانوگرم می‏رسد (1). با ورود به مرحله دای استروس سلول‏های بزرگ شاخی دیگر مشاهده نمی‏شوند و میزان نوتروفیل‏ها بسیار افزایش می‏یابد. آنستروس به طور متوسط 120 روز طول می‏کشد اما ممکن است از 40 تا 270 روز متغیر باشد (9). در این مرحله ترمیم بافت اندومتریوم رحمی در روزهای 120تا 130 کامل می‏شود. در این مرحله مخاط واژن نازک بوده و سطحی شکننده دارد (1). پروفایل سلول‏های اپیتلیومی واژن فقط شامل تعداد کمی سلول‏های پارابازال است. در اوایل و اواخر آنستروس کمی سلول‏های واسطه‏ای کوچک نیز مشاهده می‏شود.

غلیان LH پیش از تخمک‏گذاری در بسیاری از سگ‏ها در 2 روز آخر پرواستروس یا 2 روز اول فحلی اتفاق می‏افتد. با این وجود، عدم همزمانی بین پاسخ‏های رفتاری سگ ماده و غلیان LH پیش از تخمک‏گذاری می‏تواند وجود داشته باشد. در برخی سگ‏های ماده ممکن است غلیان LH در هنگام تخمک‌گذاری در اوایل استروس یا در اولین روزهای فحلی اتفاق بیافتد (12). غلیان LH پیش از تخمک گذاری به طور متوسط 36 ساعت طول می‏کشد و در زمان افزایش شدید میزان استرادیول -17بتا شروع می‌شود. پس از غلیان LH میزان 17- بتا استرادیول در طی تقریباً 80 ساعت به میزان پایه خود (35 پیکومول بر لیتر) می‏رسد. میزان هورمون LH پیش از غلیان و پس از آن تفاوت زیادی ندارد. غلیان FSH پیش از تخمک‏گذاری همزمان یا کمی قبل از غلیانLH  پیش از تخمک‏گذاری شروع می‏شود (4). لوتئینی شدن سریع و گسترده در طی غلیان LH پیش از تخمک‏گذاری اتفاق می‏افتد. بنابراین فولیکول غالب قبل از تخمک‏گذاری مشخصاتی از رشد سریع جسم زرد را دارا می‏باشد (4). غلظت هورمون پروژسترون در زمان پیک LH 6 تا 13 نانومول بر لیتر (8/1 تا 4 نانوگرم در میلی لیتر) و در زمان تخمک‏گذاری 7/4 تا 8/7 نانوگرم در میلی لیتر است و در بیشتر گونه‏ها 36 تا 48 ساعت پس از غلیان LH تخمک‏گذاری اتفاق می‌افتد. رفتارهای فحلی معمولاً همزمان با غلیان LH پیش از تخمک‏گذاری اتفاق می‏افتد، اما در برخی از سگ‏ها ممکن است روزها قبل و یا بعد از غلیان LH اتفاق بیافتد. چروکیده شدن سطح واژن در اواسط فاز فولیکولی شروع می‏شود و تا هنگام تخمک‏گذاری ادامه می‏یابد که در این دوره چین‏های طولی زیادی در دیواره واژن مشاهده می‏شود (4).

در سگ ماده، جفت‏گیری چه در اولین روز فحلی یا آخرین روز فحلی اتفاق بیافتد آبستنی امکان‏پذیر است. هنگامی که سگ‏های ماده تنها یک بار در اولین روز یا هفتمین روز فحلی جفت‏گیری می‏کنند آبستنی و میزان لقاح تفاوتی ندارد. این دوره باروری طولانی ناشی از بقای طولانی مدت اسپرم‏ها در مهبل و رحم سگ و بقای طولانی مدت تخمک‏ها در اویداکت می‏باشد (12). دلیل توجه به تعیین مرحله سیکل جنسی و زمان تخمک گذاری در سگ‏ها تمایل صاحبان آن‏ها به تعیین زمان دقیق مرحله آنستروس برای استفاده از روش‏های القای فحلی مانند استفاده از داروی خوراکی کابرگولین و کاهش فواصل بین فحلی در سگ‏ها و افزایش تعداد توله‏های متولد شده در یک سال است.

هم چنین تعیین زمان تخمک گذاری برای صاحبان سگ به لحاظ زمان مناسب جفت‌گیری و تلقیح مصنوعی حائز اهمیت است. با اندازه‏گیری میزان پروژسترون می‏توان مرحله سیکل جنسی و زمان تخمک گذاری سگ ماده را به طور تقریبی تعیین کرد. اندازه‌گیری پروژسترون با نوارهای پروژسترونی گاوی نسبت به اندازه‏گیری پروژسترون با روش RIA (Radio Immuno Assay) مزایایی دارد. برای اندازه گیری پروژسترون به روش RIA به زمان بیشتر، تکنیسین‏های مجرب، آزمایشگاه مجهز برای این روش، صرف هزینه بالا، دسترسی به مواد رادیو ایزوتوپ مناسب و روش مناسب حذف مواد باقیمانده نیاز است. اما در استفاده از نوارهای پروژسترونی یک نفر قادر است تمام مراحل آزمایش را در کمترین زمان اجرا کند، به علاوه این روش برخلاف روش RIA خطرناک نبوده، به تجهیزات بسیار پیچیده نیاز نداشته و آسان‌تر و سریع‌تر اجرا می‌گردد. هدف از انجام این طرح ارزیابی توانمندی نوارهای پروژسترون گاوی در تعیین میزان نیمه کمی پروژسترون در سرم خون سگ‏های ماده است.

مواد و روش‌کار

در این مطالعه پنج قلاده سگ نژاد بزرگ مخلوط با وزن 16 تا 24 کیلوگرم و سن 2 تا 3 سال که از نظر سلامت عمومی و پروفایل خونی سالم بودند و در اولتراسونوگرافی تخمدان‏ها و رحم طبیعی بودند استفاده شد. از تمام سگ‏ها قبل از ورود به طرح اسمیر واژن گرفته شد. برای رنگ‌آمیزی لام‏ها از رنگ Diff Quick استفاده شد. با استفاده از میکروسکوپ و بزرگنمایی 40×، درصد هر یک از سلول‏های پارابازال، سلول‏های اینترمدیت و شاخی مشخص گردید. تعداد کم سلول که غالبیت آن را سلول‏های پارابازال تشکیل می‏داد به منزله‏ی فاز آنستروس در نظر گرفته می‏شد. همچنین در صورتی که در اولتراسونوگرافی، تخمدان آن‌ها فاقد فولیکول بود یک نمونه خون برای اندازه‏گیری میزان پروژسترون و تأیید فاز آنستروس به آزمایشگاه فرستاده شد. میزان پروژسترون زیر 1 نانوگرم در میلی لیتر به منزله تأیید مرحله آنستروس است. سگ‏هایی که برای طرح انتخاب شده بودند به مدت 10 روز تحت مراقبت کامل قرار گرفتند و دو مرحله واکسیناسیون (DHppil Vaccination) به فاصله یک ماه و دو مرحله درمان ضد انگلی به فاصله دو هفته انجام گردید. حیوانات در پانسیون نگهداری سگ‏ها در کلینیک دامپزشکی دانشگاه فردوسی مشهد نگهداری شدند. یک وعده غذایی در روز به آن‌ها داده می‏شد و آب به صورت آزاد در دسترس حیوانات بود. خون‏گیری از ورید سفالیک سگ‏ها انجام شد. از هر قلاده سگ 5  سی‌سی خون گرفته شد. نمونه‏های خون در آزمایشگاه سانتریفیوژ گردید و سرم هر سگ در دو میکروتیوب جداگانه ریخته شد. یک سرم که برای اندازه‏گیری میزان هورمون پروژسترون بود تا قبل از بردن به آزمایشگاه پس از انتهای نمونه گیری از تمامی سگ‌ها در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری می‏شد و در سرم دیگر یک نوار پروژسترون گاوی ساخت شرکت Lancaster DHIA با نام تجاری Rapid P4قرار داده می‏شد. جهت استفاده از دیپ استیک Rapid P4پد انتهایی این نوار به مدت 5 تا 10 دقیقه در سرم قرار داده می‏شد و سپس میزان تقریبی هورمون پروژسترون بر اساس خط استاندارد (بالایی) و خط آزمون (پایینی) مورد سنجش قرار می‏گرفت (تصویر 1). سگ‏هایی که در فاز آنستروس بودند خط آزمون (پایینی) پررنگ و خط استاندارد (بالایی) بسیار کمرنگ بود. در سنجش میزان هورمون پروژسترون سرم در آزمایشگاه انسانی با دستگاه گاماکانتر با روش RIA (Radio Immuno Assay) انجام شد. به‌دنبال تخمین غلظت پروژسترون خون با استفاده از نوار پروژسترونی، نتایج حاصله مطابق با جدول 1 به 5 اسکور طبقه بندی شدند. این طبقه بندی بر اساس شرکت سازنده نوار پروژسترون گاوی تعریف شده است.

به منظور انجام اولتراسونوگرافی، موهای قسمت شکمی تمامی سگ‏های مورد مطالعه تراشیده شد و از 12 ساعت قبل از اولتراسونوگرافی به سگ‌ها غذا داده نشده بود. سگ‏ها در حالت خوابیده به پشت قرار گرفتند و با استفاده از مقادیر کافی ژل اولتراسونوگرافی و با استفاده از پراب خطی با فرکانس 5/7 تا 12 مگاهرتز و دستگاه سونوگرافی داپلر Esaote- My lab 30 Gold (ایتالیا) انجام می‏شد و تصاویر مربوطه ذخیره شد. به همه‏ی 5 قلاده سگ در یک روز مشخص داروی کابرگولین با نام تجاری Cabolin (ساخت شرکت داروسازی ابوریحان، ایران به صورت قرص 1 میلی‏گرمی) با دوز 5 میکروگرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به صورت خوراکی و روزانه تا شروع پرواستروس داده شد. با توجه به دوز تجویزی پایین کابرگولین امکان تجویز قرص به صورت مستقیم وجود نداشت. به همین دلیل قرص کابرگولین را در 10 سی‏سی اسید استیک 1 درصد حل کرده سپس تجویز شد. یک سی سی از این محلول حاوی 100 میکروگرم کابرگولین است. با شروع درمان فرج سگ‏ها روزانه یک بار جهت مشاهده هر گونه تغییری شامل ادم فرج و ترشحات سروزی خونی بررسی شد. همچنین تا شروع فاز پرواستروس یک روز در میان از تمام سگ‏ها گسترش (اسمیر) واژن گرفته می‏شد. خون‏گیری و جدا سازی سرم هم روزانه از روز 7 پرواستروس انجام می‏شد و سرم هر سگ در دو میکروتیوب جداگانه قرار داده می‏شد و یک سرم برای اندازه‏گیری هورمون پروژسترون تا پایان طرح در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری می‌شد و در سرم دیگر یک نوار پروژسترون گاوی (Rapid P4) به مدت 10 دقیقه قرار داده می‏شد. 7 روز بعد از شروع خونریزی اولتراسونوگرافی به منظور ارزیابی تغییرات تخمدانی آغاز گردید  و در صورت مشاهده تخمک گذاری تا 2 روز بعد از آن ادامه پیدا کرد. اندازه قطر فولیکول در تخمدان‏های چپ و راست هر سگ به صورت روزانه، قطر بزرگ‌ترین فولیکول مشاهده شده در هر سگ و زمان تخمک گذاری ثبت گردید. به منظور تجزیه و تحلیل آماری از نرم افزار SPSS (ویرایش ۱۶، آمریکا) استفاده شد و در تمامی مراحل مقادیر P value کمتر از 05/0 معنی‌دار تلقی شد. همبستگی بین نتایج اندازه‌گیری پروژسترون خون با دو روش RIA و نوار پروژسترون گاوی با استفاده از آزمون غیر پارامتریک Spearman مورد بررسی قرار گرفت. با استفاده از روش ROC ارزش تشخیصی نوار پروژسترون گاوی مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور ارزش تشخیص این نوار در سه سطح پروژسترون سرم خون (سطح اول مقادیر کمتر از 2 و بیشتر مساوی 2، سطح دوم مقادیر کمتر از 5 و بیشتر مساوی 5 و سطح سوم مقادیر کمتر از 10 و بیشتر مساوی 10 نانوگرم در میلی لیتر) در مقایسه با روش RIA ارزیابی شد. به منظور ارزیابی میزان توافق این دو روش در سه سطح (سطح اول مقادیر کمتر از 2 و بیشتر مساوی 2، سطح دوم مقادیر کمتر از 5 و بیشتر مساوی 5 و سطح سوم مقادیر کمتر از 10 و بیشتر مساوی 10 نانوگرم در میلی لیتر) از آزمون Kappa استفاده شد. هدف از انتخاب این سه سطح ارزیابی توانمندی نوارهای پروژسترونی در تعیین زمان تقریبی غلیان LH (2 نانوگرم در میلی‏لیتر)، زمان تخمک گذاری (5 نانوگرم در میلی‏لیتر)، زمان مناسب برای تلقیح مصنوعی (10 نانوگرم در میلی لیتر) است.

نتایج

در سگ‏های مورد استفاده در طرح در روز اول محدوده میزان هورمون پروژسترون بین 2/1 تا 5/0 نانوگرم قرار داشت که فاز آنستروس را تأیید می‏کرد.  سگ‌های 1 تا 5 به ترتیب طی مدت 15، 40، 6، 177 و 10 روز دریافت کابرگولین وارد مرحله پرواستروس شدند. اولتراسونوگرافی از روز 7 پرواستروس تا 2 روز بعد از تخمک‌گذاری انجام شد و قطر بزرگ‌ترین فولیکول ثبت شده در 5 سگ مورد مطالعه به ترتیب 8/0، 8/0، 8/0، 23/1 و 2/1 سانتی‌متر بود در مورد سگ چهارم تخمک‌گذاری در طول انجام مطالعه انجام نشد. میانگین بزرگ‌ترین فولیکول ثبت شده 19/0 ± 89/0 ثبت شد و میانگین زمان مشاهده بزرگ‌ترین فولیکول 39/2 ± 2/11 روز پس از شروع پرواستروس ثبت شد.

برای 5 اسکور تعریف شده، نوار‏های پروژسترونی، درصد اسکورهایی که نوارهای پروژسترونی استفاده شده در طرح نشان دادند را مشخص کردیم (جدول 2). درصد اسکورهای نشان داده شده توسط نوارهای پروژسترونی استفاده شده در طرح در مراحل مختلف سیکل جنسی را تعیین شد (جدول 3). بدنبال بررسی با آزمون غیر پارامتریک Spearman، همبستگی مثبت معنی‌داری بین اندازه‌گیری پروژسترون خون با دو روش RIA و نوار پروژسترونی مشاهده شد (00/0=P) (929/0=r). با استفاده از روش ROC ارزش تشخیصی نوار پروژسترونی سرمی مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور ارزش تشخیص این نوار جهت اندازه گیری پروژسترون در سه سطح (سطح اول مقادیر کمتر از 2 و بیشتر مساوی 2، سطح دوم مقادیر کمتر از 5 و بیشتر مساوی 5 و سطح سوم مقادیر کمتر از 10 و بیشتر مساوی 10 نانوگرم در میلی لیتر) در مقایسه با روش RIA ارزیابی گردید.

سطح اول: جهت ارزیابی ارزش تشخیص نوار پروژسترونی در سطح اول اسکورهای یک و دو که به ترتیب نشان دهنده غلظت‏های کمتر از 5/0 و 2-5/0 نانوگرم در میلی لیتر پروژسترون خون هستند به عنوان گروه منفی و اسکورهای سه و چهار و پنج به عنوان گروه مثبت در نظر گرفته شدند. با توجه به سطح زیر نمودار منحنی ROC، می‌توان گفت که در سطح ≥2 نانوگرم در میلی لیتر، ارزش تشخیصی این تست 959/0 است (00/0=P) (تصویر 2). سطح دوم: جهت ارزیابی ارزش تشخیص نوار پروژسترونی در سطح دوم اسکورهای یک، دو و سه که به ترتیب نشان دهنده غلظت‏های کمتر از 5/0 و 2-5/0 و 5-2 نانوگرم در میلی لیتر پروژسترون خون هستند به عنوان گروه منفی و اسکورهای چهار و پنج به عنوان گروه مثبت در نظر گرفته شدند. با توجه به سطح زیر نمودار منحنی ROC، می‌توان گفت که در سطح ≥5 نانوگرم، ارزش تشخیصی این تست، 986/0 است (00/0=P) (تصویر 3). سطح سوم: جهت ارزیابی ارزش تشخیص نوار پروژسترونی در سطح سوم اسکورهای یک، دو، سه و چهار که

به ترتیب نشان دهنده غلظت‏های کمتر از 5/0، 2-5/0، 5-2 و 10-5 نانوگرم در میلی‌لیتر پروژسترون خون هستند به عنوان گروه منفی و اسکور پنج که نشان دهنده غلظت پروژسترون بیشتر از 10 نانوگرم در میلی لیتر است به عنوان گروه مثبت در نظر گرفته شدند. با توجه به سطح زیر نمودار منحنی ROC، می‌توان گفت که در سطح ≥10 نانوگرم در میلی‌لیتر، ارزش تشخیصی این تست 959/0 است (00/0=P) (تصویر 4).

به منظور ارزیابی میزان توافق این دو روش در سه سطح آستانه (سطح اول: 2 نانوگرم، سطح دوم: 5 نانوگرم و سطح سوم: 10 نانوگرم در میلی لیتر) از آزمون Kappa استفاده گردید. علاوه بر این حساسیت (Sensitivity)، ویژگی (Specificity)، ارزش پیشگویی مثبت (Positive predictive value) و منفی (Negative predictive value) نوارهای مورد استفاده نیز در سه سطح مذکور با استفاده از فرمول‏های زیر محاسبه گردید:

حساسیت= تعداد مثبت واقعی / (تعداد مثبت واقعی + تعداد منفی کاذب)

ویژگی = تعداد منفی واقعی / (تعداد منفی واقعی + تعداد مثبت کاذب)

ارزش پیشگویی مثبت= تعداد مثبت واقعی / (تعداد مثبت واقعی + تعداد مثبت کاذب)

ارزش پیشگویی منفی= تعداد منفی واقعی / (تعداد منفی واقعی + تعداد منفی کاذب

تعریف مثبت واقعی = نمونه‌هایی که به درستی مثبت نشان داده شده‌اند.

تعریف مثبت کاذب = نمونه‌هایی که به اشتباه مثبت نشان داده شده در حالی که منفی هستند.

تعریف منفی واقعی = نمونه‌هایی که به درستی منفی نشان داده شده‌اند.

تعریف منفی کاذب = نمونه‌هایی که به اشتباه منفی نشان داده شده در حالی که مثبت هستند.

جهت ارزیابی در سطح اول، مقادیر پروژسترون خون کمتر از 2 نانوگرم در میلی‌لیتر در روش RIA و اسکورهای یک و دو نوار به عنوان گروه منفی و مقادیر پروژسترون خون بیشتر مساوی 2 در روش RIA و اسکورهای سه، چهار و پنج نوار به عنوان گروه مثبت در نظر گرفته شدند. با توجه به نتایج آزمون کاپا، توافق آماری بسیار معنی‌داری بین دو روش مشاهده گردید (001/0=P) (552/0=Kappa value). حساسیت و ویژگی نوار تشخیصی در این سطح به ترتیب 100 و 5/45 درصد و ارزش پیشگویی مثبت و منفی نوار تشخیص در این سطح به ترتیب 8/83 و 100 درصد محاسبه گردید (جدول 4). جهت ارزیابی در سطح دوم، مقادیر پروژسترون خون کمتر از 5 در روش RIA و اسکورهای یک، دو و سه نوار به عنوان گروه منفی و مقادیر پروژسترون خون بیشتر مساوی 5 در روش RIA و اسکورهای چهار و پنج نوار به عنوان گروه مثبت در نظر گرفته شدند. با توجه به نتایج آزمون کاپا، توافق آماری معنی‌داری بین دو روش مشاهده گردید (00/0=P) (803/0=Kappa value).  حساسیت و ویژگی نوار تشخیصی در این سطح به ترتیب 5/88 و 7/93 درصد و ارزش پیشگویی مثبت و منفی نوار تشخیص در این سطح به ترتیب 8/95 و 3/83 درصد محاسبه گردید (جدول 5). جهت ارزیابی در سطح سوم، مقادیر پروژسترون خون کمتر از 10 در روش RIA و اسکورهای یک، دو، سه و چهار نوار به عنوان گروه منفی و مقادیر پروژسترون خون بیشتر مساوی 10 در روش RIA و اسکور پنج نوار به عنوان گروه مثبت درنظر گرفته شدند. با توجه به نتایج آزمون کاپا، توافق آماری معنی‌داری بین دو روش مشاهده گردید (001/0=P) (43/0=Kappa value). حساسیت و ویژگی نوار تشخیصی در این سطح به ترتیب 4/82 و 96 درصد و ارزش پیشگویی مثبت و منفی نوار تشخیص در این سطح به ترتیب 3/93 و 9/88 درصد محاسبه گردید (جدول 6).

بحث

ارزش تشخیص و میزان توافق نوارهای پروژسترونی جهت اندازه‌گیری پروژسترون در سه سطح مختلف 2، 5 و 10 نانوگرم در میلی لیتر در مقایسه با روش RIA ارزیابی گردید. حساسیت و ویژگی نوار برای مقادیر کمتر از 2 و بیشتر مساوی 2 به ترتیب 100 و 5/45 درصد و ارزش پیشگویی مثبت و منفی به ترتیب 8/83 و 100 بود (پروژسترون 2 نانوگرم در میلی‌لیتر زمان تقریبی غلیان LH). حساسیت و ویژگی نوار برای مقادیر کمتر از 5 و بیشتر مساوی 5 به ترتیب 5/88 و 7/93 درصد و ارزش پیشگویی مثبت و منفی به ترتیب 8/95 و 3/83 بود (پروژسترون 5 نانوگرم در میلی لیتر زمان تخمک گذاری). حساسیت و ویژگی نوار برای مقادیر کمتر از 10 و بیشتر مساوی 10 به ترتیب 4/82 و 96 درصد و ارزش پیشگویی مثبت و منفی به ترتیب 3/93 و 9/88 بود (پروژسترون 10 نانوگرم در میلی لیتر زمان مناسب جفت گیری). بنابراین نوار‏های پروژسترونی برای مقادیر 5 و 10 نانوگرم در میلی لیتر از حساسیت و ویژگی بالایی برخوردار هستند.

در مرحله آنستروس میزان پروژسترون سرم خون در 5 قلاده سگ بر اساس RIA بین 15/0 تا 3/0 نانو گرم در میلی لیتر اندازه‌گیری شد که نوار مورد استفاده جهت تخمین غلظت پروژسترون در طی انستروس در 40 درصد نمونه‏ها اسکور 1 و در 60 درصد نمونه‏ها اسکور 2 را نشان داد. در انتهای مرحله پرواستروس میزان پروژسترون سرم خون در 5 قلاده سگ بر اساس RIA بین 2/0 تا 6/5 نانو گرم در میلی‌لیتر اندازه‌گیری شد که نوار مورد استفاده جهت تخمین غلظت پروژسترون در طی انتهای مرحله پرواستروس در 20 درصد نمونه‏ها اسکور 2 ،70 درصد نمونه‏ها اسکور 3، 10 درصد نمونه‏ها اسکور 4 را نشان داد. در مرحله استروس میزان پروژسترون سرم خون در 5 قلاده سگ بر اساس RIA بین 2تا 7/37 نانوگرم در میلی لیتر اندازه گیری شد که نوار مورد استفاده جهت تخمین غلظت پروژسترون در طی استروس در 8/14درصد نمونه‏ها اسکور 3 در 6/29 درصد نمونه‏ها اسکور 4 و در 5/55 درصد نمونه‏ها اسکور 5 را نشان داد. در زمان تخمک گذاری پروژسترون سرم خون در 5 قلاده سگ بر اساس RIA بین 3/5 تا 7/37 نانوگرم در میلی لیتر اندازه گیری شد که نوار مورد استفاده جهت تخمین غلطت پروژسترون در طی تخمک‌گذاری در 50 درصد نمونه‏ها اسکور 4 و در 50 درصد نمونه‏ها اسکور 5 را نشان داد.

Johnston و همکاران در سال 1995؛ نشان دادند که میزان پروژسترون در روز پیک LH معادل 2 نانوگرم در میلی‌لیتر است و در روز تخمک گذاری بین 4 تا 10 نانوگرم در هر میلی لیتر است (10). در مطالعه حاضر میزان پروژسترون در روز تخمک گذاری بین 3/5 تا 7/37 اندازه گیری شد. Concannon و همکاران در سال 2011؛ بیان کردند پروژسترون در طول فاز پرواستروس به طور آهسته افزایش می‏یابد و از 2/0-4/0 نانوگرم در میلی لیتر به میزان 8/0-6/0 نانوگرم در میلی‌لیتر یک روز قبل از غلیان LH می‏رسد. سپس میزان پروژسترون از 8/0-5/0 نانوگرم در هر میلی لیتر به 9/0 تا 2/2 نانوگرم در هر میلی لیتر در حین یا چند ساعت قبل از آغاز غلیان LH می‏رسد. اولین روزی که میزان پروژسترون 5 نانوگرم در میلی لیتر یا بالاتر است را باید روز تخمک‌گذاری در نظر گرفت. مجموعه‏ای از نمونه‏های خون در طی پرواستروس و استروس جهت دقت زمان تخمک‌گذاری با استفاده از اندازه‌گیری پروژسترون مورد نیاز است (2). در مطالعه حاضر اولین روزی که میزان پروژسترون 5 نانوگرم در لیتر یا بالاتر است را نمی‏توان روز تخمک گذاری در نظر گرفت زیرا فقط در یک سگ اولین روزی که میزان پروژسترون 5 نانوگرم در لیتر یا بالاتر بود تخمک گذاری رخ داد. در مطالعه Hadley در سال 1974؛ بررسی میزان پروژسترون و استروژن خون سگ‏های آبستن از 3 سگ آبستن در یک نژاد بیگل و دو سگ نژاد مخلوط نشان داده شد که میزان پروژسترون در روز اول پرواستروس 2/0 نانوگرم در هر میلی لیتر سرم خون می‏باشد و میزان پروژسترون در طی این فاز پایین می‏ماند ولی 3 روز قبل از پایان پرواستروس شروع به افزایش کرده و به 2/1 نانوگرم در میلی لیتر در روز اول استروس می‏رسد. افزایش پروژسترون به صورت آرام در طی سه روز فاز استروس ادامه می‏یابد و سپس در طی 5 روز بعدی بخصوص از روز دوم استروس افزایش سریع پروژسترون آغاز می‏شود (6).

در مطالعه حاضر از روز دوم یا سوم استروس افزایش سریع پروژسترون نیز آغاز می‏شود که با نتایج این مطالعه مشابه بود. درمطالعه Graf و همکاران در سال 1978؛ اندازه گیری میزان پروژسترون بر روی 8 سگ نژاد بیگل انجام شد و افزایش مشخصی در میزان پروژسترون در اواخر فاز پرواستروس و استروس مشاهده گردید (5). در مطالعه حاضر هم افزایش پروژسترون در اواخر پرواستروس و استروس نیز صورت گرفت. در مطالعه Heersche و همکاران در سال 1994؛ نوار‏های پروژسترونی را جهت بررسی میزان پروژسترون در شیر گاو استفاده کردند. بر اساس نتایج مطالعه فوق زمانی که نوارهای پروژسترونی میزان بالای پروژسترون را نشان می‏دهند به این معناست که گاو در مرحله استروس قرار ندارد. میزان پایین پروژسترون نشان دهنده فاز فولیکولی مرحله استروس است و نمی‏توان زمان مناسب دقیقی برای تلقیح مصنوعی تعیین کرد (8).

در مطالعه حاضر زمان تخمک گذاری در سگ را با استفاده از نوارها می‌توان تعیین کرد. که با مطالعه فوق هم خوانی نداشت. علت عدم هم خوانی می‌تواند تفاوت در نوع حیوان باشد. Masayoshi و همکاران در سال 1999؛ رابطه بین تعیین روز تخمک‏گذاری با استفاده از اولتراسونوگرافی و میزان هورمون LH و پروژسترون را بررسی کردند. آن‏ها گزارش کردند که فولیکول‏های تخمدان 8-3 روز (میانگین 5/0±1/5 روز) پس از آغاز خون‏ریزی از فرج توسط اولتراسونوگرافی قابل مشاهده شدند. اندازه فولیکول‏ها در زمان مشاهده 5/0-3/0 سانتی‏متر (میانگین 02/0±4/0 سانتی‏متر) بود. فولیکول‏های تخمدان در طی 12-6 روز (میانگین 60/0±10/9 روز) پس از آغاز خون‏ریزی از فرج به بزرگ‌ترین اندازه خود رسیدند (7).

در مطالعه حاضر فولیکول‏های تخمدان در طی 9 تا 13 روز با میانگین 7/1±5/10 روز پس از آغاز خون ریزی از فرج به بزرگ‌ترین اندازه خود رسیدند که با نتایج این مطالعه هم خوانی داشت. England و همکاران در سال 2009؛ رشد فولیکولی، تخمک‏گذاری و میزان گیرایی را در سیکل طبیعی استروس سگ‏ها بررسی کردند. آن‏ها گزارش کردند که فولیکول‏ها در اواخر آنستروس (60 تا 100 روز مانده به غلیان LH) به وسیله اولتراسونوگرافی قابل تشخیص اند و با نزدیک شدن به شروع سیکل اندازه‏ی آن‏ها افزایش می‏یابد و اندازه‏ی آن‏ها تقریباً دو روز قبل از غلیان LH به بیش از چهار میلی‏متر می‏رسد. فولیکول‏های بزرگ 10 روز قبل از غلیان LH قابل تشخیص‏اند. همچنین آن‏ها رشد فولیکولی را در سگ‏هایی که سیکل استروس در آن‏ها با استفاده از کابرگولین و PMSG القاء شده بود بررسی کردند و گزارش نمودند که رشد فولیکولی در سگ‏هایی که سیکل استروس در آن‏ها با استفاده از کابرگولین با دوز 5 میکروگرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن تا شروع پرواستروس القاء شده بود مشابه رشد فولیکولی در سیکل استروس طبیعی است و تنها تفاوت آن باقی ماندن تعداد بیشتری فولیکول کوچک در فاز لوتئال در سیکل القاء شده با استفاده از کابرگولین در مقایسه با سیکل استروس طبیعی است. در سگ‏هایی که سیکل استروس در آن‏ها با استفاده از PMSG با دوز 20 واحد به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به مدت 5 روز و تجویز 500 واحد hCG در روز پنجم القاء شده بود تعداد زیادی فولیکول کوچک قبل از تخمک‏گذاری در تخمدان وجود داشت که در فاز لوتئال هم حضور داشتند (3). در مجموع نتایج این مطالعه نشان داد که استفاده از نوار پروژسترونی مخصوصاً برای مقادیر 5 و 10 نانوگرم در میلی لیتر از حساسیت و ویژگی بالایی برخوردار است، همچنین هزینه نسبتاً مشابه با اندازه گیری پروژسترون در آزمایشگاه با روش RIA یا الایزا دارد و نکته مهم‌تر اینکه در این روش نتایج پروژسترون در همان لحظه مشخص می‌شود و به دامپزشک کمک می‌کند که جهت انجام تلقیح در همان مراجعه تصمیم بگیرد، لذا به نظر می‌رسد استفاده از نوار پروژسترونی برتری بیشتری نسبت به روش اندازه‌گیری آزمایشگاهی داشته باشد. با این وجود به دلیل تعداد کم سگ‌های مورد مطالعه در طرح پیشنهاد می‌گردد که مطالعات تکمیلی با تعداد دام بیشتر و ترجیحاً با انجام تلقیح مصنوعی انجام گیرد.

سپاسگزاری

از همکار محترم جناب آقای سیدعلی کارگر در کلینیک دانشکده دامپزشکی مشهد که در اجرای این طرح همکاری داشتند صمیمانه سپاسگزاری می‌شود. بودجه انجام طرح از دانشگاه فردوسی مشهد و با کد 40609/3 در تاریخ 27/11/1394 تأمین گردید.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.