Designing B and T Cell Multi-Epitope Vaccine for Cross Protection Against Haemophilus Strains: An Immunoinformatics Approach

Document Type : Microbiology and Immunology

Authors

1 Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran

2 Fertility and Sterility Research Center, Kermanshah University of Medical Sciences and Department of microbiology, School of Medicine, Kermanshah University of Medical Sciences, Kermanshah, Iran

3 Medical Technology Research Center, Kermanshah University of Medical Sciences and Department of microbiology, School of Medicine, Kermanshah University of Medical Sciences, Kermanshah, Iran

4 Department of Immunology, School of Medicine, Kermanshah University of Medical Sciences, Kermanshah, Iran

Abstract

BACKGROUND: Despite the availability of effective conjugate vaccines, Haemophilus influenza (HI) and Haemophilus somnus (HS) still result in enormous global morbidity in both human and cattle. Vaccines failure to protect against different strains can lead to the spread of Hemophilus infections. The absence of various epitopes from Haemophilus strains in existing vaccines is one of their weaknesses. Therefore, selection of a conserved and common set of proteins in the invasive strains of HI and HS is essential for predicting epitopes as potential vaccine candidate.
OBJECTIVES: The aim of this study was to design an effective polyepitopic vaccine against invasive HI and HS strains using in silico approaches.
METHODS: First, the protein sequences were retrieved from the databases and were aligned to determine the conserved areas with the Clustal omega software. Then, B and T cell epitopes identification was done for OapA, OMP6, PD, D15, IgA1 Protease and TbpA proteins using various immunoinformatic servers. The high ranked epitopes were selected from mentioned proteins. The selected epitopes were fused together by appropriate linkers. This designed construct was analyzed for physicochemical and structural characteristics using related servers.
RESULTS: 6 TCD4+ and 3 B cell epitopes were selected to design the final construct from 6 common proteins. The immunoinformatics analysis revealed that the designed polyepitopic peptide is a safe, soluble, hydrophilic and thermostable antigen that could be a potential vaccine.
CONCLUSIONS: The polyepitopic construct can be considered as a vaccine candidate against Haemophilus.

Keywords

Full Text

مقدمه


هموفیلـوس آنفلوانزای تیـپ b (Hib) از عوامل شایع مننژیت در سراسر جهان است. همچنین سویه‌های بدون کپسول (NTHi) این باکتری با اوتیت حاد در کودکان و تشدید بیماری مزمن انسدادی ریه در بزرگسالان مرتبط هستند (36،45). بــه گــزارش ســازمان جهــانی بهداشــت (WHO) هموفیلـوس آنفلوانزای تیـپ b باعث حداقل 3 میلیون مورد بیماری جدی و تقریباً 400000 مرگ سالیانه به علت مننژیت یا پنومونی در کودکان سراسر جهان است (11،41). به علاوه در صنعت دامپروری نیز برخی سویه­ها نظیر هموفیلوس سومنوس سبب مننگوانسفالیت ترومبوتیک، میوکاردیت، پنومونی، سقط، عفونت‌های دستگاه تناسلی و ورم پستان در گاوها و تحمیل زیان اقتصادی قابل توجهی می­شود (31).

رایج­ترین نوع واکسیناسیون استفاده از واکسن­های ترکیبی شامل کونژوگه کپسول هموفیلوس، توکسوئید کزاز، دیفتری، سیاه سرفه و آنتی­ژن­ سطحی هپاتیتB  است. از محدودیت­های این واکسن­های ترکیبی می­توان به پاسخ آنتی­بادی ضعیف ضد کپسول به دلیل وجود اپی­توپ­های سرکوب کننده در پروتئین­های حامل اشاره کرد. به علاوه با وجود موفقیت نسبی واکسن­های کونژوگه در برابر بیماری‌های ناشی از Hib به دلیل عدم کارایی این واکسن­ها در برابر سویه­های NTHi عفونت­های ناشی از آن­ها شیوع یافته است (12،34). لذا با توجه به بار بیماری­های ناشی از هموفیلوس آنفلوانزا و مشکلات درمان و پیشگیری از این عفونت­ها مانند مقاومـت­هـای میکروبـی در حـال گسترش، عدم کارایی 100 درصدی واکسن‌های موجود، مؤثر نبودن واکسن‌های موجود ضد همه سویه‌های هموفیلوس آنفلوانزا و قیمت بالای تولید واکسن‌های موجود و از طرف دیگر اهمیت بیماری‌های ناشی از هموفیلوس سومنوس در گله‌های گاو و نیاز به دوره طولانی مدت آنتی­بیوتیک­تراپی، طراحی واکسن‌های مؤثرتر ضروری به نظر می­رسد (11،31،41).

در این زمینه طراحی واکسن­هایی حاوی چندین فاکتور ویرولانس که در گونه­های بیما­ریزای هموفیلوس محافظت‌شده باشد جهت پیشگیری از عفونت در انسان و حیوان بیشتر مورد توجه است. فاکتور اساسی در پاتوژنز سویه‌های هموفیلوس چسبیدن به مخاط دستگاه تنفس می‌باشد. به علاوه غلبه بر مکانیسم­های کلیرانس میزبان همانند سیستم موکوسیلیاری و ایمنی موضعی سبب تهاجم باکتری به سلول­های اپیتلیوم و ورود به سایر قسمت­های بدن می‌گردد. از جمله این فاکتورها که حاوی اسیدآمینه­های حراست شده می­باشند و دارای همولوژی بالایی در بین سوش­های هموفیلوس آنفلوانزا و هموفیلوس سومنوس هستند، می­توان به پروتئین­ غشای خارجی (Outer Membrane protein, OMP6)، پروتئین پوشش سلولی (Opacity Associated Protein A, OapA)، پروتئین باند شونده به ترانسفرین (Transfern Binding Protein A, TbpA)، پروتئینD  (PD) و D15 اشاره کرد (1،24).

پروتئین IgA1 protease که در سویه­های کپسول‌دار و بدون کپسول هموفیلوس آنفلوانزا وجود دارد با غلبه بر مکانیسم­های ایمنی موضعی از جمله حضور IgA1 ترشحی در ایجاد مننژیت و تهاجم به سلول­های اپی­تلیال تنفسی نقش دارد. از آنجا که مطالعات مختلف تولید آنتی بادی ضد IgA1 proteases را نشان داده‌اند؛ لذا این پروتئین یک کاندید مناسب واکسن ضد سویه­های Hib و NTHi است (23،54). همچنین پروتئین حفاظت شده غشای خارجی  OMP6در گونه­های هموفیلوس با توجه به وجود اپی‌توپ‌هایی که منجر به فعال­سازی سلول­های B و تولید آنتی­بادی باکتریسیدال می­شوند و نقش ایمونومدولاتوری که دارد به عنوان کاندید مهمی در تولید واکسن مطرح است (6،35). به علاوه پروتئین 5/17 کیلودالتونی در OMP هموفیلوس سومنوس یک لیپوپروتئین مرتبط با پپتید وگلیکان محافظت شده و مشابه OMP6  در هموفیلوس آنفلوانزا می­باشد که هدف ارزشمندی در تهیه واکسن محسوب می­شود (51). مطالعات پیشین پروتئین شدیداً محافظت­شده در میان سویه­های هموفیلوس آنفلوانزا به نام OapA مسئول ایجاد فنوتیپ کلونی شفاف و کلونیزاسیون باکتری هموفیلوس آنفلوانزا به سلول­های اپی­تلیال را به عنوان یک پروتئین ایمونوژن در طراحی واکسن ضد باکتری هموفیلوس مطرح کرده­اند (42،44). پروتئین TbpA نیز پروتئینی غشایی است که جهت استفاده از هم (Heme) و همچنین برای حدت باکتری ضروری است (5،19). پروتئین PD با اختلال در عملکرد سیستم سیلیاری نقش مهمی در پاتوژنز داشته و دارای ویژگی­هایی همانند درجات بالایی از حراست­شدگی در سویه­های کپسول­دار و بدون کپسول، لوکالیزاسیون سطحی و توزیع گسترده است (4،43). پروتئین D15 با وزن مولکولی تقریبی 80 کیلودالتون که در سویه­های Hib، NTHi و هموفیلوس سومنوس شدیداً محافظت­شده است، اهداف مهم آنتی­بادی­های باکتریسیدال بوده و یک جزء مهم واکسن تحت واحد محسوب می­شود (29،52).

امروزه با وجود اطلاعات فراوان و در دسترس در زمینه پروتئوم طراحی واکسن مبتنی بر رهیافت­های نرم افزاری در حال پیشرفت است و ایمونوانفورماتیک نقش مهمی در انتخاب اپی­توپ­های ایمونودامیننت و حراست­شده دارد. لذا طراحی واکسن­های پلی ­اپی­توپی بر پایه روش­های in silicoبا تمرکز بر پروتئین­های ایمونوژن در مقایسه با سایر روش­های تولید واکسن، مؤثرتر و مقرون به صرفه است (39).

 هدف مطالعه حاضر طراحی ایمونوانفورماتیک واکسن پلی ­اپی­توپی مؤثر ضد سویه­های بیماریزای هموفیلوس آنفلوانزا و هموفیلوس سومنوس با استفاده از آنتی­ژن­های ایمونوژن و حراست­شده OapA، OMP6، PD،D15 ، IgA1 Protease و TbpA بود.

مواد و روش کار

بازیابی توالی آمینواسیدی پروتئین­ها و بررسی همولوژی: درگام نخست توالی کامل پروتئین­های OapA (شماره دسترسی: P44415)، Omp6 (شماره دسترسی: P10324)، IgA1 protease (شماره دسترسی: P45386)، D15 (شماره دسترسی: P46024)، PD (شماره دسترسی: Q06282) و TbpA (شماره دسترسی: P44970) از باکتری هموفیلوس آنفلوانزا و OapA (شماره دسترسی: Q0I4U6)، Omp6 (شماره دسترسی: Q0I1N0)، D15 (شماره دسترسی: Q0I385)، PD (شماره دسترسی: Q0I242) و TbpA (شماره دسترسی: Q0I2A4) از باکتری هموفیلوس سومنوس از پایگاه داده UniprotKB (http://www.uniprot.org) بازیابی شد. برای تعیین شباهت میان پروتئین­ها در سویه­های مختلف باکتری هموفیلوس آنفلوانزا و هموفیلوس سومنوس توالی آن­ها بلاست (BLAST) شد. هم چنین جهت شناسایی نواحی مشترک بین پروتئین­های هموفیلوس آنفلوانزا و هموفیلوس سومنوس، با استفاده از ابزار Clustal omega (http://www.genome.jp/tools/clustalomega/) همردیفی صورت گرفت.

تعیین دومین­های حفاظت­شده: دومین­های حفاظت­شده پروتئین­های OapA، OMP6، PD،D15 ، IgA1 Protease و TbpA با استفاده ازجستجو در پایگاه داده NCBI’s Conserved Domains Database (CDD) بر اساس همردیفی توالی­ها و با کمک منابع داده خارجی Pfam، SMART،COG ،PRK  و TIGRFAMs (حد آستانه 1e-05) انجام شد.

پیشگوییساختار سوم پروتئین­ها: مدل­سازی ساختار سه­ بعدی پروتئین­ها توسط سرور I-Tasser (http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER) انجام شد (56). بهترین مدل­های ساخته شده بر اساس امتیاز C (C-score) حاصل از سرور  I-TASSERبرای پروتئین­هایOapA ، PD،D15 ،IgA1 protease ، OMP6 و TbpA انتخاب شدند.

پیشگویی اپی­توپ­های سلول B: به منظور پیشگویی بهترین اپی­توپ­های سلول­ B از پنج سرور مختلف استفاده شد و با مقایسه نتایج حاصل از سرورهای گوناگون اپی­توپ­های خطی مشترک در تمامی سرورها انتخاب گردیدند. در سرور BCPreds (http://ailab.ist.psu. edu/bcpred/predict.html) از دو روش AAP و BCPred با استفاده از ویژگی­های هیدروفیلیسیتی، دسترسی سطحی و انعطاف پذیری بر پایه الگوریتم­های subsequence kernel based SVM  و amino acide pair antigenisity scale استفاده شد (7،10). در سرورBepiPred-1.0  (http://www.cbs.dtu.dk/ services/BepiPred/) بر پایه روش­های hidden Markov model و propensity scale، با مشخصه (حد آستانه 35/0) پیشگویی اپی­توپ­های خطی صورت گرفت (25). از طرف دیگر سرور BcePred (http://www. imtech.res.in/ raghava/bcepred) با استفاده از ویژگی­های فیزیکی – شیمیایی و آستانه­های پیش­فرض (3 تا 3-)، اپی­توپ­های خطی سلول B را مشخص می­کند (46). همچنین سرور ABCpred (http://www.imtech.res. in/raghava/ abcpred/ABC_submission.html) با الگوریتم شبکه عصبی مصنوعی (حد آستانه 51/0) جهت پیشگویی اپی­توپ­های خطی مورد استفاده قرار گرفت (48). برای پیشگویی اپی‌توپ­های فضایی براساس توالی اولیه پروتئین­ها سرور CBTOPE (http://www.imtech.res.in/ raghava/cbtope) به کار رفت (2). استفاده از سرورهای مختلف صحت اپی­توپ­های خطی انتخابی را افزایش می­دهد.

پیشگویی اپی­توپ­های سلول T: پیشگویی اپی‌توپ‌های متصل­شونده به مولکول­هایMHC-II  انسانی (HLA) بر اساس آلل­های شایع در پایگاه Allelefrequencies  با بیشترین پوشش جمعیتی صورت گرفت و از آنجا که تاکنون هیچ سروری آلل‌های MHC-II گاوی را جهت پیشگویی اپی­توپ‌های ایمنی­زای سلول T ارائه نکرده است؛ بر طبق نتایج حاصل از پژوهشGhorbanpour  و همکاران در سال 2018 آلل‌های MHC انسانی مشابه با آلل­های  MHCگاوی موجود در جمعیت هلشتاین ایران، به عنوان آلل‌های معادل برای پیشگویی اپی­توپ­ها مورد استفاده قرار گرفتند (14). پیشگویی اپی­توپ­های نونامری متصل شونده به MHC کلاس II با استفاده از سه سرور TEPITOPEpan، ProPred  و HLAPred انجام گرفت و تا حد امکان سعی شد که اپی­توپ­های مشترک با امتیاز بالاتر در بیشتر سرورها جهت طراحی سازه نهایی انتخاب شوند. با استفاده از سرور TEPITOPEpan (http://datamining-iip.fudan.edu.cn/service/ TEPITOPEpan/TEPITOPEpan.html) پپتیدهای متصل شونده به مولکول­های MHC-II برپایه ماتریس امتیاز براساس موقعیت (PSSM) پیشگوی شدند (37). سرورهای HLAPred (http://crdd.osdd.net/raghava/hlapred/team.html) و ProPred (http://www.imtech.res.in/raghava/propred) با اجرای ماتریس­های کمی (حد آستانه 3 درصد) جهت پیشگویی اپی­توپ­های متصل­شونده به MHC کلاس II به کار رفتند (49،50). همچنین سرور TEPITOPEpan جهت پیشگویی اپی­توپ­های متصل­شونده به آلل‌های MHC انسانی (HLA) معادل با آلل های MHC گاوی، استفاده گردید.

طراحی سازه پلی ­اپی­توپی: سازه پلی ­اپی­توپی با اتصال اپی­توپ­های انتخابی سلول­های T و B طراحی گردید. اپی‌توپ‌های سلول T به کمک لینکر GPGPG و اپی­توپ­های سلول B به کمک توالی GGGGSS به همدیگر متصل گردیدند. لینکر GPSL جهت اتصال اپی­توپ­های سلول­های T و B به همدیگر استفاده گردید (22).

پیشگویی ساختار دوم و سوم سازه پلی ­اپی­توپی: جهت پیشگویی ساختار دوم سازه واکسن از سرور GOR4 (http://cib.cf.ocha.ac.jp/bitool/GOR/GOR.php GORIV) با الگوریتم مبتنی بر تئوری اطلاعات درترکیب با آمار بیزی استفاده شد. همچنین مدل­سازی واکسن پلی‌اپی‌توپی بر اساس توالی سازه پروتئینی با استفاده از سرور (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) I-TASSER  انجام شد (56).

بهینه­سازی و ارزیابی اعتبار و پایداری ساختار پیشگویی شده سازه پلی ­اپی­توپی:  بهینه سازی مدل سه بعدی به دست آمده برای واکسن پلی اپی­توپی در یک فرایند دو مرحله­ای با استفاده از سرورهای ModRefiner (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ModRefiner/) و GalaxyRefine (http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi type=REFINE) انجام شد. بهینه‌سازی ساختارهای پروتئینی توسط سرور ModRefiner بر اساس به حداقل رساندن انرژی در مرحله اتمی انجام می­شود که منجر به بهبود هر دو ساختارهایlocal  و global با موقعیت­های زنجیره جانبی دقیق­تر، شبکه­های اتصال به هیدروژن بهتر و همپوشانی اتمی کمتری می­شوند (55).از طرف دیگر سرور GalaxyRefine در ابتدا زنجیره­های جانبی را مجدداً بازسازی می­کند و دوباره بسته بندی زنجیره­ای را انجام داده و متعاقباً از شبیه سازی دینامیک مولکولی برای دستیابی به ساختار کلی استفاده می­نماید (18). به منظور ارزیابی پایداری ساختار و کیفیت نتایج استریوشیمی ساختار بهینه‌شده سازه واکسن، از نقشه راماچاندران در نرم­افزارهای PROCHECK (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/ software/PROCHECK) و RAMPAGE (http://mordred. bioc.cam.ac.uk/~rapper/rampage.php) استفاده شد. نقشه Ramachandran روشی برای تجسم انرژی زاویه­های مجاز و غیرمجاز (ψ)psi   و (φ)phi  یک اسیدآمینه است و بر اساس شعاع واندروالس زنجیره جانبی محاسبه می­شود. نتایج حاصل از RAMPAGE شامل درصد اسیدآمینه­ها در مناطق مجاز و غیرمجاز است که کیفیت ساختار مدل سه بعدی را تعیین می­کنند. سرور RAMPAGE برای اعتبارسنجی ساختار سوم پروتئین از نقشه Ramachandran و نقشه­های مربوط به اسیدآمینه­های گلیسین و پرولین استفاده می­کند (26،30).

تجزیه و تحلیل پارامترهای فیزیکوشیمیایی: پارامترهای فیزیکوشیمیایی سازه واکسن با استفاده از ابزارProtParam  (http://web.expasy.org/protparam/) مورد ارزیابی قرار گرفتند. پارامترهای محاسبه شده شامل وزن مولکولی، نیمه عمر، نقطه ایزوالکتریک، شاخص آلیفاتیک و مقدار (GRAVY)Grand average of hydropathicity می­باشند. حلالیت سازه با نرم افزار Protein-Sol (https://protein-sol.manchester.ac.uk/) بر اساس ویژگی­های توالی پروتئین پیشگویی گردید (17).

بررسی تغییرات پس از ترجمه: برای بررسی تغییرات پس از ترجمه سازه پلی اپی­توپی از نرم­افزارهای آنلاین NetNGlyc1.0 و (http://www.cbs.dtu.dk/services/) استفاده شد. سرور NetOGlyc4.0 با استفاده از الگوریتم شبکه عصبی مکان­های O-گلیکوزیلاسیون را پیشگویی می‌کند. سرور  NetNGlyc1.0بر پایه الگوریتم شبکه عصبی توالی (Asn-Xaa-Ser/Thr) را برای پیشگویی مکان­های N-گلیکوزیلاسیون بررسی می­کند.

ترجمه معکوس و بهینه­سازی کدون: ترجمه معکوس سازه پلی ­اپی­توپی به توالی نوکلئوتیدی و اپتیمایز نمودن کدون­های ژنی برای بیان در میزبان Escherichia coliبه ترتیب توسط نرم­افزارهای آنلاین Backtranseq (http://www.ebi.ac.uk/tools/st/emboss_backtranseq/) و JCat (http://www.jcat.de) انجام شد (15،27).

ارزیابی آلرژنسیتی و آنتی­ژنسیتی: آلرژنسیتی سازه با استفاده از سرور AlgPred (http://www.imtech. res.in/raghava/algpred/) بررسی گردید. سرور AlgPred، آلرژنسیتی را براساس شباهت اپی­توپ­های شناخته شده با هر ناحیه از پروتئین مورد نظر پیشگویی می­نماید. این سرور شش رهیافت پیشگویی دارد که در مطالعه حاضر از رهیافت هیبرید (SVMc+IgE epitope+ARPs BLAST+MAST) استفاده شد (47). هچنین پیشگویی آنتی­ژنسیتی سازه واکسن با استفاده از سرور VaxiJen (http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/ VaxiJen/VaxiJen.html) بدون انجام همردیفی و بر اساس ویژگی­های مختلف فیزیولوژیکی پروتئین با رهیافت ACC output (حد آستانه 4/0) صورت گرفت (9).

نتایج

بررسی اولیه توالی پروتئین­ها: در مطالعه حاضر توالی اسیدآمینه­ای پروتئین­هایOapA ،OMP6 ،PD ،D15 ،  TbpAو IgA1 protease بدون توالی سیگنال پپتید جهت انتخاب اپی­توپ­های سلول­های T و  Bبا کمک روش­های ایمونوانفورماتیک مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نتایج بلاست توالی کامل اسیدآمینه­ای پروتئین‌هایOapA ،OMP6 ،PD ،D15 ،  TbpAو IgA1 protease به ترتیب 4/98، 100، 9/98، 6/97، 1/94 و 3/67 همولوژی را بین Hib  و NTHi نشان داد. همچنین نتایج بلاست توالی کامل اسیدآمینه­ای پروتئین­های OapA،OMP6 ،PD ،  D15و TbpA به ترتیب 8/39، 2/75، 3/77، 9/62 و 8/40 همولوژی را بین هموفیلوس آنفلوانزا و هموفیلوس سومنوس آشکار کرد. بر اساس نتایج حاصل از همردیفی با کمک ابزار Clustal omega نواحی مشترک میان پروتئین­های هموفیلوس آنفلوانزا و هموفیلوس سومنوس جهت انتخاب اپی­توپ­های سلول­های  TوB  تعیین گردیدند.

دومین­های حفاظت­شده: نتایج جستجو در پایگاه دادهNCBI’s- CDD  بر اساس الگوریتم RPS-BLAST فهرستی از دومین­ها با فواصل مشخص و امتیاز E  (حد  آستانه 05-e1) می­باشد. لذا بر اساس امتیاز E، مناطق حفاظت­شده پروتئین­ها جهت انتخاب اپی­توپ­ها مورد استفاده قرار گرفت.

ساختار سوم پروتئین­ها: بهترین مدل­های پیشگویی شده برای ساختار سوم بر اساس نتایج سرور I-TASSER برای پروتئین­هایOapA ،PD ،D15 ، TbpA، IgA1 protease  و OMP6 به ترتیب با بالاترین C-score برابر با 24/2-، 45/0-، 21/1+، 79/0-، 41/2- و 81/0- انتخاب  شدند.

اپی­توپ­های سلول­ B: نتایج پیش­بینی اپی­توپ­های مشترک سلول­ B در جدول 1 آورده شده است. در این مطالعه از بین تمامی اپی­توپ­های خطی پیشگویی شده بر اساس الگوریتم‌های مختلف در سرورهای BcePred،ABCpred ،BCPred  و BepiPred اپی­توپ­های مشترک با امتیاز بالاتر انتخاب شدند. سرور CBTOPE اسیدآمینه­هایی که امتیاز 4 به بالا دارند را اپی‌توپ  فضایی در نظر می­گیرد که برای پروتئین OapA توالی LNISDVNAM در 7 مکان، OMP6 توالی LGHDEAAYSKNRRAVLAY در 15 مکان،  PD توالی TKDGKQAQVYPN در 6 مکان،  D15توالی GGRVTIPGSDNK و LVFSYAKPI در 4 و یک مکان، TbpA توالیIRGMDRNRV در یک مکان و IgA1 protease توالی WLFLGSYDF در 4 مکان اسیدآمینه­ها به ترتیب با بیشترین نمره 4، 5 و 6 به عنوان اپی‌توپ فضایی سلول B پیش­بینی شدند. در نهایت اپی­توپ­های خطی که در سطح ساختار 3 بعدی پروتئین­های کاندید و سازه واکسن قرار داشتند، جهت طراحی سازه واکسن استفاده شدند.

اپی­توپ­های سلول T: بر اساس مقایسه نتایج سه سرور ProPred، HLAPred و TEPITOPpan اپی­توپ­های سلول T  CD4+که میان شایع­ترین آلل­های موجود در جمعیت انسانی و همچنین برای آلل‌های انسانی با بیشترین شباهت به آلل‌های گاوی (HLA-DRB1*13:11 ، HLA-DRB1*14:82،HLA-DRB1*11:89 ،HLA-DRB1*14:14 ،HLA-DRB1*14:51 ) در حد آستانه 3 درصد  مشترک بودند، انتخاب شدند (جدول 2).

طراحی سازه واکسن: جهت طراحی سازه نهایی، 6 اپی‌توپ سلول T  CD4+و 3 اپی­توپ سلول B از 6 پروتیین کاندید به کمک لینکرهای مناسب به یکدیگر متصل شدند. توالی اسیدآمینه­ای سازه پلی اپی­توپی به شرح­ ذیل است:

LGHDEAAYSGPGPGLVFSYAKPIGPGPGLNISDVNAMGPGPGWLFLGSYDFGPGPGIRGMDRNRVGPGPGMVYLQTFDFGPSLGGRVTIPGSDNKGGGGSSLGHDEAAYSKNRRAVLAYGGGGSS

TKDGKQAQVYPN

ساختار دوم و سوم پیش­بینی شده سازه واکسن: نتایج پیشگویی ساختار دوم نشان داد که درصد رندوم کویل (42/66) بیشتر از استرند بتا (55/25) و آلفا هلیکس (03/8) می­باشد. از آنجا که قسمت­های کویل انعطاف­پذیری بیشتری دارند، به لحاظ آنتی‌ژنسیتی مناطق مناسب­تری برای اپی­توپ­ها هستند. ساختار 3 بعدی پپتید پلی­ اپی­توپی با استفاده از سرور I-TASSER پیش‌بینی شدند. سرورI-TASSER، 5 مدل را با امتیاز C مختلف پیشگویی می­کند. بازهC-score  برابر با (2 تا 5-) است که امتیاز بالاتر بیان کننده مدل با کیفیت بهتر می­باشد؛ لذا در مطالعه حاضر بهترین مدل با بالاترین C-score برابر با 44/ 2 - را انتخاب شد. با استفاده از نرم افزار کایمرا UCSF ساختار سه بعدی و موقعیت اپی­توپ­ها بررسی شد (تصویر1).

بهینه­سازی و ارزیابی اعتبار و پایداری ساختار سوم پیشگویی شده سازه واکسن: بهینه­سازی مدل سه بعدی واکسن با سرور ModRefiner و پس از آن بهینه­سازی  بیشتر با سرور GalaxyRefine، پنج مدل را به همراه داشت. براساس نمرات کیفیت مدل برای همه مدل­های بهینه­شده، مدل 1 بر اساس ویژگی­های مختلف از جمله GDT-HA، RMSD و MolProbity به ترتیب برابر با 9648/0، 366/0 و 509/2 بهترین مدل را نشان داد و  Clash scoreبرابر با 4/17،Poor rotamers برابر با 1 و Rama favored برابر با 9/77 درصد بود. این مدل به عنوان مدل واکسن نهایی برای تجزیه و تحلیل بیشتر انتخاب شد. ارزیابی نهایی اعتبار مدل پیش­بینی شده با استفاده از نقشه راماچاندران در نرم­افزارهای PROCHECK و Rampage انجام شد. بررسی نقشه راماچاندران قبل و بعد از بهینه­سازی صورت گرفت. بعد از بهینه­سازی 100 درصد اسیدآمینه­ها در نواحی مطلوب و مجاز (مطلوب‌ترین، مجاز فرعی، مجاز سخاوتمندانه) سرور PROCHECK و 8/97 درصد اسیدآمینه­ها در نواحی مطلوب و مجاز سرور Rampage بودند. نتایج در تصویر 2 آورده شده است.

تجزیه و تحلیل پارامترهای فیزیکو شیمیایی: برحسب نتایج سرور PratParam، وزن مولکولی پپتید پلی اپی توپی 86/14297 دالتون است. نقطه ایزوالکتریک (PI) پپتید پلی ­اپی­توپی 25/8 محاسبه شد، بنابراین سازه پلی ­اپی­توپی قلیایی است. با توجه به شاخص ناپایداری (Ii) محاسبه شده توسط سرور (69/32) این پپتید جزء پایدارها طبقه بندی می‎شود. مقدار GRAVY این پپتید 423/0- می­باشد. مقدار منفی GRAVY نشان دهنده هیدروفیلیسیتی پپتید و واکنش بهتر با مولکول­های آب اطراف است. شاخص آلیفاتیک محاسبه شده برای این سازه 45/58 است. شاخص آلیفاتیک بالاتر پایداری پپتید در دماهای مختلف را بیان می­کند. نیمه عمر تخمین زده شده این توالی در یاخته پستاندار یک ساعت، در مخمر 30 دقیقه و در E.coli بیشتر از 10 ساعت می­باشد. سرور SolPro با استفاده از داده­های موجود برای حلالیت پروتئین E.coli در یک سیستم بیان بدون سلول (حد آستانه 45/0) حلالیت این توالی را برابر با 574/0 پیشگویی نمود.

بررسی تغییرات پس از ترجمه:  نتایج سرور NetNGlyc بیانگر یک N-گلیکوزیلاسیون در اسیدآمینه آسپارژین (NISD) بود.  اما در سرور NetOGlyc هیچ جایگاهی برای احتمال O-گلیکوزیلاسیون پیشگویی نشد. نتایج نشان داد که سازه واکسن عاری از تغییرات پس از ترجمه­ای است که می­تواند ایمونوژنسیتی را تحت تأثیر قرار دهد.

بهینه­سازی کدون: یکی از روش­های افزایش بیان پروتئین­های خارجی، اپتیمایز نمودن کدون­های ژنی می­باشد. ترجمه معکوس توالی آمینواسیدی پپتید پلی اپی­توپی و بهینه‌سازی کدونی به ترتیب با نرم­افزارهای آنلاین Backtranseq و JCat انجام شد. درصد محتوای CG و شاخص ارجحیت کدون ژن (CAI) به ترتیب برابر با 56 درصد و 1 محاسبه گردید. محدوده درصد مطلوب محتوای GC باید بین 30 تا 70 درصد باشد.

آلرژنسیتی و آنتی­ژنسیتی: بر اساس نتایج سرور AlgPred، رهیافت هیبرید این پپتید را غیرآلرژن معرفی کرد و همچنین در روش SVM بر پایه توالی اسیدآمینه‌ای امتیاز این سازه برابر با 89841668/0- است، لذا غیر آلرژن می­باشد. سایر روش­ها همچون اپی­توپ IgE، BLAST وMAST نیز این پپتید را غیرآلرژن شناختند. سرور Vaxijen با حد آستانه 4/0 برای مدل­های باکتریایی، آنتی­ژنسیته این سازه را برابر با 1997/1 پیشگویی کرد؛ لذا با احتمال بالا این پپتید یک آنتی­ژن می­باشد.

بحث

امروزه بروز مقاومت و یا کاهش حساسیت نسبت به آنتی‌بیوتیک­ها در بسیاری از سویه­های هموفیلوس مشاهده می‌شود (20). اگر چه واکسن­های کونژوگه کنونی تا حدودی منجر به کاهش بار بیماری­های ناشی از سویه­های هموفیلوس شده است، اما به دلیل پوشش پایین، کارایی کم و قیمت بالای تولید این نوع واکسن­ها به خصوص در کشورهای درحال توسعه توجه به طراحی واکسن‌های جدید با پوشش بیشتر، هزینه و زمان تولید کمتر ضروری است (16،33).

واکسن­های پپتیدی به دلیل امکان استفاده از اپی­توپ­های ایمونودامیننت حراست­شده میان سرووارها می­تواند منجر به ایمنی در برابر طیف وسیع­تری از سرووارها و سویه­ها شود. از این حیث واکسن­های پپتیدی مولتی والان می­توانند واکسن‌هایی مطمئن و مقرون به صرفه­ای باشند (28). به همین دلیل طراحی واکسن­ها بر پایه پپتیدهای ایمونوژن سنتتیک برای تولید پاسخ­های ایمنی اختصاصی در سال­های اخیر افزایش یافته است. به طوری که استفاده از واکسن­های پپتیدی ضد ایدز، هپاتیت، آنتراکس و تب برفکی در مراحل مختلف تکامل هستند (28). به علاوه واکسن­های مولتی ­اپی­توپی با کمک رهیافت­های بیوانفورماتیک ضد سرووارهای مختلف سالمونلا و شیگلا طراحی شده­اند (38،53). اما در زمینه طراحی واکسن پلی اپی­توپی مؤثر ضد هموفیلوس این خلاء هنوز وجود دارد.

عفونت با هموفیلوس عمدتاً منجر به تولید آنتی­بادی­های اختصاصی توسط سلول B می­شود. از آنجا که سلول­های T در هر دو پاسخ ایمنی همورال و سلولی نقش دارند؛ لذا برای افزایش ایمنی لازم است که اپی­توپ­های سلول B با اپی­توپ­های سلول T کمکی کونژوگه شوند. بنابراین در این مطالعه پیشگویی اپی‌توپ­های سلول­های B و T به صورت تواماً انجام شد.
مطالعه حاضر برای شناسایی اپی­توپ­های سلول­های B و T در بین پروتئین­های مختلفی از باکتری هموفیلوس جهت طراحی واکسن ضد باکتری­های هموفیلوس آنفلوانزا و هموفیلوس سومنوس صورت گرفت. برای طراحی واکسن پلی ­اپی­توپی قوی توجه به انتخاب آنتی­ژن­های مناسب اهمیت دارد؛ لذا ما به دنبال پروتئین­های حراست­شده و ایمونوژن مناسب جهت پیشگویی اپی­توپ­ها بودیم که با بررسی مطالعات مختلف از میان پروتئین­های مختلف هموفیلوس نهایتاً 6 پروتئین OapA، OMP6، PD،D15 ، TbpA و IgA1 Protease جهت پیشگویی اپی­توپ­ها انتخاب شدند (6،19،43،44،53،54).
در مطالعه حاضر با کمک سرورهای BcePred،ABCpred ،BCPreds  و BepiPred اپی­توپ­های خطی سلول­ B برای هر یک از 6 پروتئین OapA، OMP6، PD،D15 ، TbpA و IgA1 Protease پیش­بینی شدند. موقعیت اپی­توپ­های فضایی در ساختار سوم پروتئین‌های کاندید ممکن است در ساختار سه بعدی سازه واکسن متفاوت باشد؛ بنابراین برای پیشگویی اپی­توپ­های فضایی بر پایه توالی پروتئین از سرورCBTOPE  استفاده شد. با مقایسه نتایج سرورهای مختلف اپی­توپ­های مشترک در میان همه سرورها انتخاب شدند. از آنجا که نواحی سطحی روی پروتئین شانس بیشتری جهت اپی­توپ بودن دارند، لذا واکنش بهتری با آنتی بادی خواهند داشت. مشاهده ساختار سه بعدی سازه پلی اپی­توپی با نرم افزار کایمرا نشان داد که سه اپی­توپ انتخابی سلول B در سطح ساختار سه بعدی سازه قرار دارند و مطابق نتایج سرور BcePred، دارای ویژگی­هایی همچون دسترسی سطحی، انعطاف پذیری و هیدروفیلیسیتی هستند، لذا جهت طراحی سازه واکسن انتخاب شدند. 
یکی از عوامل مهم در طراحی واکسن توزیع متفاوت HLA در سراسر جهان است؛ بنابراین اپی­توپ­های مشترک سلول T برای آلل­های  HLA-II با بیشترین فراوانی و بر پایه ویژگی­های فیزیکوشیمایی و الگوریتم­های مختلف پیشگویی شدند. از آنجا که تاکنون هیچ سروری آلل‌های MHC-II گاوی را جهت پیشگویی اپی­توپ‌های ایمنی­زای سلول T ارائه نکرده‌است؛ آلل‌های انسانی مشابه با 5 آلل­ فراوان موجود در جمعیت گاوهای هلشتاین ایران، به عنوان آلل‌های معادل برای پیشگویی اپی­توپ­ها استفاده شدند. جهت افزایش صحت اپی‌توپ­های انتخابی ترکیبی از سرورهای HLAPred، ProPred و TEPITOPpan با الگوریتم­های مختلف استفاده شد. در مقایسه نتایج، اپی­توپ­هایی که در هر سه سرور و در بین تمامی 20 آلل با فراوانی بالا مشترک بودند، انتخاب شدند. با مقایسه نتایج معلوم شد که برخی از اپی­توپ­ها محرک هر دو سلول B و T می­باشند. اعتبار ابزارهای ایمونوانفورماتیکی مبتنی بر ارزیابی­های in vivo وin vitro  اپی­توپ­های پیشگویی شده می­باشد. مطالعات گذشته نشان داده است که اپی­توپ­های سلول­های B و T حاصل از پیشگویی سرورهای ABCpred،TEPITOPpan ،BcePred ، ProPred و BepiPred در ارزیابی­های آزمایشگاهی سبب تولید آنتی بادی و افزایش سطح سایتوکاین­ها می­گردند (13،38،57). با توجه به نتایج موفق بدست آمده از مطالعات مذکور، در مطالعه حاضر نیز جهت پیشگویی اپی­توپ­ها از همان سرورها استفاده شد.

اپی‌توپ‌های نهایی سلول T برای پروتئین­های OapA،OMP6 ،IgA1 Protease ،PD ،D15  و TbpA به ترتیب نواحی اسیدآمینه­ای 379-371 (LNISDVNAM)، 144-136 (LGHDEAAYS)، 321-313 (WLFLGSYDF)، 788-770 (LVFSYAKPI)، 216-208 (MVYLQTFDF)، 120-112 (IRGMDRNRV) بودند. سه اپی­توپ نهایی سلولB  شامل 18 اسیدآمینه انتهایی بخش C ترمینال OMP6 با توالی LGHDEAAYSKNRRAVLAY در ناحیه اسیدآمینه­ای 152-136، توالی GGRVTIPGSDNK ناحیه اسیدآمینه­ای 599-588 از پروتئین D15 و توالی TKDGKQAQVYPN ناحیه اسیدآمینه­ای 127-138 از پروتئین D (PD) می­باشند. در مطالعه­ای مشابه Hua و همکاران در سال 2016 اپی­توپ­های سلول­های B و T ازOMP6  و PD هموفیلوس آنفلوانزا را پیشگویی نمودند. با بررسی تیتر آنتی­بادی علیه اپی­توپ­های سنتز شده، آن­ها را به عنوان کاندیدهای واکسن مطرح نمودند که اپی­تو­پ­های TKDGKQAQV وDMVYLQTFDF  از PD و  LGHDEAAYSKNRاز OMP6 مشابه اپی‌توپ­های پیشگویی شده مطالعه حاضر می‌باشند (21). در تحقیقی دیگر Beck-Sickinger و همکاران در سال 1994 اپی­توپ­های سلول B از OMP6 هموفیلوس آنفلوانزا را تعیین نمودند که اپی­توپ­ها در نواحی اسیدآمینه­ای (46-31)، (70-59) و در بخش C ترمینال OMP6 قرار داشتند؛ در مطالعه حاضر نیز اپی­توپ انتخاب شده در بخش C ترمینال OMP6 واقع شده است (3).

اتصال اپی­توپ­های انتخابی با لینکرهای GGGGSS و GPGPG توالی­هایی با حداقل ایمنی­زایی را در نواحی اتصالی تولید می­کنند، بنابراین در طراحی منطقی یک واکسن پلی اپی‌توپی قوی مناسب می­باشند. توالی GPSL جهت اتصال اپی‌توپ­های سلول­های T و B به همدیگر استفاده گردید. این نوع لینکرها انعطاف پذیر هستند و پتانسیل تاخوردگی (folding) اپی­توپ­های سلول­های T و B را به طور مستقل فراهم می­کنند (22). در نهایت سازه پلی ­اپی­توپی متشکل از 6 اپی­توپ سلول T و 3 اپی­توپ سلول B دارای امتیاز بالاتر و مشترک میان سرورهای گوناگون (جدول 1،2) طراحی گردید. آنتی­ژنسیتی و خاصیت آلرژن پروتئین سازه نهایی آن­ را به یک واکسن بالقوه تبدیل می‌کند. وزن مولکولی پروتئین واکسن 86/14297دالتون محاسبه شد. شاخص PI سازه پپتیدی 25/8 بود، بنابراین پروتئین واکسن ماهیت بازی داشت. شاخص آلیفاتیک نشان داد که پروتئین با استفاده از زنجیره­های جانبی آلیفاتیک اشغال شده است. شاخص ناپایداری سازه واکسن توسط سرور PratParam کمتر از 40 محاسبه شد، لذا سازه پپتیدی جزء پایدارها طبقه بندی می­شود. مقدار GRAVY واکسن منفی بود، بنابراین پپتید پلی اپی­توپی هیدروفیل می‌باشد. همه این پارامترها بیانگر پایداری سازه واکسن در دماهای مختلف است. بررسی ساختار دوم سازه واکسن نشان داد که درصد عمده­ای از سازه پلی اپی­توپی ساختارهای رندوم کویل هستند و از آنجا که این نواحی انعطاف پذیری بیشتری نسبت به سایر ساختارهای ثانویه دارند، لذا نتایج نشان داد که اپی­توپ­ها نسبتاً انعطاف پذیر می­باشند (40). علاوه بر این، ساختار سه بعدی به دست آمده با استفاده از مدل­سازی همولوژی توسط سرور I-Tasser، شامل اطلاعات کافی در مورد چیدمان فضایی اسیدآمینه­های مهم در پروتئین­ها می­باشد که در مطالعه عملکرد پروتئین و واکنش با سایر پروتئین­ها کمک کننده است. جهت تشخیص خطاها در ساختار مدل سه بعدی واکسن نهایی از ابزارهای اعتبارسنجی ساختار استفاده شد. نقشه راماچاندران در سرورRAMPAGE  نشان داد که درصد اسیدآمینه­ها در نواحی مطلوب، مجاز و خارج از محدوده به ترتیب برابر با 4/91، 4/6 و1/2 و در سرور PROCHECK برای نواحی مطلوب‌ترین، مجاز فرعی، مجاز سخاوتمندانه و غیرمجاز به ترتیب برابر با 8/79، 17، 2/3 و0 بودند. لذا کیفیت کلی مدل مناسب می­باشد.

برای دستیابی به سطح بالای بیان پروتئین واکسن نوترکیب در E.coli، بهینه­سازی کدون برای بهبود رونویسی و ترجمه انجام شد. این کار با تجزیه و تحلیل شاخص سازگاری کدون (CAI) و محتوای کلی GC توالی DNA صورت گرفت. حلالیت پروتئین نوترکیب بیان شده در میزبان E.coli یکی از ملزومات اساسی بسیاری از تحقیقات بیوشیمیایی و عملکردی است و واکسن پروتئینی ما درصد قابل قبولی از حلالیت را نشان داد.

پس از طراحی واکسن­های پلی اپی­توپ یکی از اهداف تولید انبوه آن­هاست. بدین منظور سیستم­های پروکاریوتی مانند E.coli به دلیل راحتی در کشت و تولید بالای پروتئین یکی از مهم‌ترین میزبان­ها است. با این حال فقدان تغییرات پس از ترجمه از مشکلات بیان پروتئین­ها در میزبان پروکاریوتی است. از آنجا که سازه واکسن در این مطالعه فقط یک جایگاه N-گلیکوزیلاسیون داشته و فاقد جایگاه -O گلیکوزیلاسیونی می‌باشد، لذا عدم گلیکوزیلاسیون تأثیری در ساختار پروتئین و تغییر در اپی­توپ­های پیش­بینی شده نخواهد داشت (8).

لازم به ذکر است از آنجا که روش­های تشخیص هموفیلوس آنفلوانزا بر اساس کشت، الیزا و PCR می­باشد و تست­های الیزا جهت تشخیص آنتی­ژن کپسولی بوده و میزان آنتی­بادی ضد پروتئین­های انتخابی این مطالعه را نمی­سنجند، لذا سازه واکسن طراحی شده تداخلی در تشخیص ایجاد نمی‌کند (32).

به طور خلاصه در این مطالعه با استفاده از ابزارهای گوناگون ایمونوانفورماتیک، 6 اپی­توپ سلول­ T و 3 اپی توپ سلول B بر پایه 6 پروتئین ­ایمونوژن سویه­های باکتری هموفیلوس آنفلوآنزا و هموفیلوس سومنوس دارای امتیاز بالاتر و مشترک میان تمامی سرورها جهت طراحی سازه نهایی واکسن انتخاب شدند. بر اساس ارزیابی­های ایمونوانفورماتیکی واکسن فوق یک پادگن بی خطر، محلول، پایدار در دماهای متفاوت و هیدروفیل است. لذا این پپتید پلی ­اپی­توپی می­تواند کاندیدی جهت ایجاد ایمنی ضد باکتری هموفیلوس باشد. در نهایت کارایی واکسن فوق می­بایست در مطالعات vitro inو vivo inارزیابی گردد.

سپاسگزاری

 این مقاله منتج از طرح تحقیقاتی طراحی و ارزیابی برون‌تنی ایمنی­زایی واکسن هموفیلوس مصوب دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه با کد پروژه 96645 و کد اخلاقIR.KUMS. REC.1396.96  می­باشد.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

References

  1. References

     

    1. Agrawal, A., Murphy, T.F. (2011). Haemophilus influenzae infections in the H. influenzae type b conjugate vaccine era. J Clin Microbiol, 49, 3728–3732. https://doi.org/10.1128/ JCM.05476-11 PMID: 21900515   
    2. Ansari, H.R., Raghava, G.P. (2010). Identification of conformational B-cell Epitopes in an antigen from its primary sequence. Immunome Res, 6, 6. https://doi.org/10.1186/1745-7580- 6-6 PMID: 20961417
    3. Beck-Sickinger, A.G., Rotering, H., Wiesmüller, K.H., Dorner, F., Jung, G. )1994(. Mapping of antigenic and immunogenic sites of Haemophilus influenzae outer membrane protein P6 using synthetic lipopeptides. Biol Chem Hoppe Seyler, 375, 173–182.
    4. Behrouzi, A., Bouzari, S., Siadat, S.D., Oloomi, M., Davari, M., Mazaheri, H. (2016). Evaluation of the immunogenic property of NT H.influenzae protein D with Neisseria meningitidis OMV in BALB/c. J Infect Dev Ctries, 10, 1345–1351.  https://doi: 10.3855/jidc.7513 PMID: 28036315
    5. Behrouzi, A., Vaziri, F., Rahimi-Jamnani, F., Afrough, P., Rahbar, M., Satarian, F., Siadat, S.D. (2017). Vaccine Candidates against Nontypeable Haemophilus influenzae: a Review. Iran biomed j, 21, 69-76.  https://doi.org/10.18869/acadpub.ibj.21.2.69 PMID: 28088130
    6. Berenson, C.S., Murphy, T.F., Wrona, C.T., Sethi, S. )2005(. Outer membrane protein p6 of nontypeable Haemophilus influenzae is a potent and selective inducer of human macrophage proinflammatory cytokines. Infect Immun, 73, 2728-2735. https://doi.org/10.1128/IAI.73.5.2728-2735.2005 PMID: 15845475
    7. Chen, J., Liu, H., Yang, J., Chou, K. (2007). Prediction of linear B-cell epitopes using amino acid pair antigenicity scale. Amino Acids, 33, 423-428. https://doi.org/10.1007/s00726-006-0485-9 PMID: 17252308
    8. Dowling, W., Thompson, E.,  Badger,  C., Mellquist,  JL, Garrison AR, Smith, J.M., Pargas, J., Hogan, R.H., Schmaljohn, C. (2007). Influences of glycosylation on antigenicity, immunogenicity, and protective efficacy of ebola virus GP DNA vaccines. J Virol, 8, 1821-1837. https://doi. org/10.1128/JVI.02098-06 PMID: 17151111
    9. Doytchinova, I.A., Flower, D.R. (2007). VaxiJen: a server for prediction of protective antigens, tumour antigens and subunit vaccines. BMC Bioinform, 8, 4. https://doi.org/10.1186/1471-2105-8-4 PMID: 1720727
    10. El-Manzalawy, Y., Dobbs, D., Honavar, V. (2008). Predicting linear B-cell epitopes using string kernels. J Mol Recognit, 21, 243-255. https://doi.org/10.1002/jmr.893 PMID: 18496882
    11. Feikin, D.R., Nelson, C.B., Watt, J.P., Mohsni, E., Wenger, J.D., Levine, O.S. (2004). Rapid assessment tool for Haemophilus influenzae type b disease in developing countries. Emerg infect dis, 10, 1270-1276. https://doi.org/10. 3201/eid1007.030737 PMID: 15324548
    12. Ferreccio, C., Clemens,  J., Avendano, A. (1991). The clinical and immunologic response of Chilean infants to H. influenzae type b polysaccharidetetanus protein conjugated vaccine co-administered in the same syringe with diphtheria tetanus toxoid-pertussis vaccine at two, four and six months of age. Pediatr J Infect Dis, 10, 764-771.
    13. Garcia-Angulo, V.A., Kalita, A., Kalita, M., Lozano, L., Torres, A.G. (2014). Comparative genomics and immunoinformatics approach for the identification of vaccine candidates for enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Infect Immun, 82, 2016-2026. https://doi.org/10.1128/IAI. 01437-13 PMID: 24595137
    14. Ghorbanpour, R., Nikbakhat Brujeni, G., Jalali, S. (2019). Immuno-bioinformatics study of autotransporter protein, antigen 43, in enterotoxigenic Escherichia coli Isolated from calves. J Vet Res, 74, 127-141. https://doi.org/10.22059/jvr. 2018.211721.25
    15. Grote, A., Hiller, K., Scheer, M., Munch, R., Nortemann, B., Hempel, D.C., Jahn,  D. (2005). JCat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host. Nucleic Acids Res, 33, 526-531. https://doi.org/10.1093/nar/ gki376  PMID: 15980527
    16. Harris, F.W., Janzen, E.D. (1989). The Haemophilus somnus disease complex (hemophilosis): a review. Can Vet J, 30, 816-822.
    17. Hebditch, M., Carballo-Amador, M.A., Charonis, S., Curtis, R., Warwicker, J. (2017). Protein-Sol: a web tool for predicting protein solubility from sequence. Bioinform, 33, 3098-3100. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btx345 PMID: 28575391
    18. Heo, L., Park, H., Seok, C. (2013). GalaxyRefine: Protein structure refinement driven by side-chain repacking. Nucleicacids res, 41, W384–W388. https://doi.org/10.1093/nar/gkt458  PMID: 23737448
    19. Holland, J., Parsons, T.R., Hasan, A.A., Cook, S.M., Stevenson, P., Griffiths, E., Williams, P. (1996). Conservation and antigenic cross-reactivity of the transferrin-binding proteins of Haemophilus influenzae, Actinobacillus pleuropneumoniae and Neisseria meningitidis. Microbiol, 142, 3505–3513. https://doi.org/10.1099/13500872-142-12-3505 PMID: 9004513
    20. Hotomi, M., Fujihara, K., Sakai, A., Billal, D.S., Shimada, J., Suzumoto, M., Yamanaka, N. (2006). Antimicrobial resistance of Haemophilus influenzae isolated from the nasopharynx of Japanese children with acute otitis media. Acta Otolaryngol, 126, 240-247. https://doi.org/10.1080/00016480500312455 PMID: 16428188
    21. Hua, C.Z., Hu, W.L., Shang, S.Q., Li, J.P., Hong, L.Q., Yan, J. (2016). Serum concentrations of antibodies against outer membrane protein P6, protein D, and T- and B-cell combined antigenic epitopes of nontypeable Haemophilus influenzae in children and adults of different ages. Clin Vaccine Immunol, 23, 155-161. https://doi.org/10.1128/CVI.00506-15 PMID: 26677200
    22. Kaumaya, P.T.P., Kobs-Conrad, S., Digeorge, A.M., Stevens, V.C. (1994). Peptides: Design, Synthesis, and Biological Activity.  In: “De Novo” Engineering of Peptide Immunogenic and Antigenic Determinants as Potential Vaccines. Basava C., Anantharamaiah, G.M. (eds.). (1st ed.). Birkhäuser Boston. Boston, MA.  p. 133-164.
    23. Kilian, M., Thomsen, B., Petersen, T.E., Bleeg, H. (1983). Molecular biology of Haemophilus influenzae IgAl protease. Mol Immunol, 20, 1051-1058.
    24. Kumavath, R., Prasad, S., Devarapalli, P., Barh, D. (2014). In silico identification of novel candidate drug targets in Haemophilus Influenzae Rd KW20. Inter J Genet Genom, 2, 62-67.
    25. Larsen, J.E.P., Lund, O., Nielsen, M. (2006). Improved method for predicting linear B-cell epitopes. Immunome Res, 2, 2. https://doi.org/10.1186/1745-7580-2-2 PMID: 16635264
    26. Laskowski, R.A., MacArthur, M.W., Moss, D.S., Thornton, J.M. (1993). Procheck: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J Appl Cryst, 26, 283-291.
    27. Li, W., Cowley, A., Uludag, M., Gur, T., McWilliam, H., Squizzato, S., Park, Y. M., Buso, N., Lopez, R. (2015). The EMBL-EBI bioinformatics web and programmatic tools framework. Nucleic Acids Res, 43, W580-W584. https://doi.org/10.1093/nar/gkv279  PMID: 25845596
    28. Li, W., Joshi, M.D., Singhania, S., Ramsey, K.H., Murthy, A.K. (2014). Peptide Vaccine: Progress and Challenges. Vaccines, 2, 515-536. https://doi.org/10.3390/vaccines2030515 PMID:  26344743
    29. Loosmore, S.M., Yang, Y.P., Coleman, D.C., Shortreed, J.M., England, D.M., Klein, M.H. (1997). Outer membrane protein D15 is conserved among Haemophilus influenzae species and may represent a universal protective antigen against invasive disease. Infect Immun, 65, 3701-3707.
    30. Lovell, S.C., Davis, I.W., Arendall, W.B., de Bakker, P.I., Word, J.M., Prisant, M.G., Richardson, D.C. (2003). Structure validation by Cα geometry: ϕ, ψ and Cβ deviation. Proteins, 50, 437-450.
    31. Madampage, C.A., Wilson, D., Townsend, H., Crockford, G., Rawlyk, N., Dent, D., Evans, B., Donkersgoed, J.V., Dorin, C., Potter, A. (2016). Cattle immunized with a recombinant subunit vaccine formulation exhibits a trend towards protection against Histophilus somni bacterial challenge. PloS one, 11, e0159070.
    32. Mariani, M., Luzzi, E., Proietti, D., Mancianti, S., Casini, D., Costantino, P., Gageldonk  P.V., Berbers, G. (1998). A competitive enzyme-linked immunosorbent assay for measuring the levels of serum antibody to Haemophilus influenzae type b. Clin diagn lab immunol, 5, 667–674.
    33. Morris, S.K., Moss, W.J., Halsey, N. (2008). Haemophilusinfluenzae type b conjugate vaccine use and effectiveness. Lancet Infect Dis, 8, 435-443. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(08)70152-X  PMID: 18582836
    34. Mulholland, K., Levine, O., Nohynek, H., Greenwood, B.M. (1999). Evaluation of vaccines for the prevention of pneumonia in children in developing countries. Epidemiol Rev, 21, 43-55.
    35. Munson, R.S., Granoff, D.M. (1985). Purification and partial characterization of outer membrane proteins P5 and P6 from Haemophilus influenzae type b. Infect Immun, 49, 544-549.
    36. Murphy, T.F. (2006). The role of bacteria in airway inflammation in exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease. Cur Opin Infect Dis, 19, 225-230. https://doi.org/10.1097/01.qco. 0000224815.89363.15 PMID: 16645482
    37. Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. (2010). NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure. Immunome Res, 6, 9. https://doi.org/10.1186/1745-7580-6-9 PMID: 21073747
    38. Pahil, S., Taneja, N., Ansari, H.R., Raghava, G.P.S. (2017). In silico analysis to identify vaccine candidates common to multiple serotypes of Shigella and evaluation of their immunogenicity. PloS one, 12, e0180505. https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0180505 PMID: 28767653
    39. Patronov, A., Doytchinova, I. (2013). T-cell epitope vaccine design by immunoinformatics. Open Biol, 3, 120139. https:// doi.org/10.1098/rsob.120139 PMID: 23303307
    40. Pellequer, J.L., Westhof, E., Van Regenmortel, M.H. (1991). Predicting location of  continuous epitopes in proteins from their structures. Meth Enzymol,  322, 891–901.
    41. Peltola, H. (2000). Worldwide Haemophilus influensetype b disease at the beginning of the 21st century: global analysis of the disease burden 25 years after the use of the polysaccharide vaccine and a decade after the advent of conjugates. Clin Microbiol Rev, 13, 302-317.
    42. Prasadarao, N.V., Lysenko, E., Wass, C.A., Kim, K.S., Weiser, J.N. (1999). Opacity associated protein A contributes to the binding of Haemophilus influenza to chang epithelial cells. Infect Immun, 67, 4153-4160.
    43. Prymula, R., Peeters, P., Chrobok, V., Kriz, P., Novakova, E., Kaliskova, E., Kohl, I., Lommel, P., Poolman, J., Prieels, J.P., Schuerman, L. (2006). Pneumococcal capsular polysaccharides conjugated to protein D for prevention of acute otitis media caused by both Streptococcus pneumoniae andnon-typable Haemophilus influenzae: a randomised double-blind efficacy study. Lancet, 367, 740–748. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(06)68304-9  PMID: 16517274
    44. Rahimi, P., Hanachi, P., Bouzari, S., Siadat, S.D. (2015). Molecular analysis of oapA gene in Haemophilus influenzae strains isolated from Iran: as a domestic vaccine candidate. qom Univ Med Sci J, 8, 17-25.
    45. Rana, R., Dalal, J., Singh, D., Kumar, N., Hanif, S., Joshi, N., Chhikara, M.K. (2015). Development and characterization of Haemophilus influenza type b conjugate vaccine prepared using different polysaccharide chain lengths. Vaccine, 33, 2646–2654. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.04.031 PMID: 25907408
    46. Saha, S., Raghava, G. (2004). BcePred: prediction of continuous B-cell epitopes in antigenic sequences using physico-chemical properties. In: Artificial Immune Systems. Nicosia, G., Cutello, V., Bentley, P.J., Timmis, J. (eds.). (1st ed.). Springer. Heidelberg, Berlin. p. 197-204.
    47. Saha, S., Raghava, G. (2006). AlgPred: prediction of allergenic proteins and mapping of IgE epitopes. Nucleic acids Res, 34, 202-209. https://doi.org/10.1093/nar/gkl343 PMID: 16844994
    48. Saha, S., Raghava, G. (2006). Prediction of continuous B-cell epitopes in an antigen using recurrent neural network. Proteins, 65, 40-48. https://doi.org/10.1002/prot.21078 PMID: 16894596
    49. Singh, H., Raghava, G.P.S. (2001). ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinform, 17, 1236-1237.
    50. Sinigaglia, F.,  Hammer, J. (1994). Defining rules for the peptide-MHC class II interaction. Curr Opin Immunol,  6, 52-56.
    51. Tagawa, Y., Ishikawa, H., Yuasa, N. (1993). Characterization of an immunoreactive 17.5-kilodalton outer membrane protein of Haemophilus somnus by using a monoclonal antibody. Infect Immun, 61, 4153-4157.
    52. Thomas, W.R., Flack, F.S., Callow, M.G., Chua, K.Y. (1992). A high molecular-weight outer membrane protein that is a potential target for protective immunity to type b and untypeable Haemophilus influenza. J Infect Dis, 165, 75–76.
    53. Verma, S., Sugadev, R., Kumar, A., Chandna, S., Ganju, L., Bansal, A. (2018). Multi-epitope dnak peptide vaccine against S.typhi: An in silico approach. Vaccine, 36, 4014-4022. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2018.05.106 PMID: 29861180
    54. Xu, D., Zhang, Y. (2011). Improving the physical realism and structural accuracy of protein models by a two-step atomic-level energy minimization. Biophys j, 101, 2525-2534. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2011.10.024 PMID: 22098752
    55. Yang, J., Yan, R., Roy, A., Xu, D., Poisson, J., Zhang, Y. (2015). The I-TASSER Suite: protein structure and function prediction. Nat methods, 12, 7-8. https://doi.org/10.1038/ nmeth.3213 PMID: 25549265
    56. Yepes-Pérez, Y., López, C., Suárez, C.F., Patarroyo, M.A. (2018). Plasmodium vivax Pv12 B-cell epitopes and HLA-DRβ1*-dependent T-cell epitopes in vitro antigenicity. PloS one, 13, e0203715.
    57.   Vitovski, S., Dunkin, K.T., Howard, A.J., Sayers, J.R. (2002). Nontypeable Haemophilus influenzae in carriage and disease: a difference in IgA1 protease activity levels. JAMA, 287, 1699-1705.

Journal of Veterinary Research
Volume 76, Issue 1
March 2021
Pages 133-145

Files

Share

How to cite

Statistics