Document Type : Food Hygiene
Authors
1 Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Shiraz University, Shiraz, Iran
2 Central Laboratory, Faculty of Veterinary Medicine, Shiraz University, Shiraz, Iran
Abstract
Keywords
فلورفنیکل نسل سوم کلرومایستین، یکی از مشتقات کلرامفنیکل بوده که به عنوان یکی از مهمترین آنتیبیوتیکهای وسیعالطیف در کلینیکهای دامپزشکی شناخته میشود. این عامل ضد میکروبی دارای خاصیت باکتریواستاتیک وابسته به دوز بوده و با اتصال به زیر واحد S50 ریبوزومهای باکتریهای حساس موجب مهار آنزیم پپتیدیل ترانسفراز گشته، در نتیجه باعث توقف انتقال اسید آمینه به زنجیرههای پپتیدی در حال شکلگیری میگردد (13). بنابراین، این آنتی بیوتیک جزءس گروه آنتی بیوتیکهای مهارکننده سنتز پروتئین به شمار میرود. ماهیت شیمیایی فلورفنیکل به صورت محلول در چربی و دارای pH اسیدی میباشد (20). زیست فراهمی آن نظیر کلرامفنیکل بسیار بالا و معادل 5/96 درصد تعیین شده است. از این رو، برای رسیدن به اهداف بالینی، انتشار دارو رضایت بخش بوده و با توجه به حجم انتشار قابل توجه، مقدار بافتی آن با مقدار پلاسماییاش برابر است. نیمه عمر حذفی برابر با 2/12 ساعت حاکی از این است که نیاز به تجویز روزانه دارد (14). با توجه به اینکه، اثرات دارو بهطور مستقیم به غلظت دارو در محل ایجاد عفونت بستگی دارد و با توجه به نفوذ قابل قبول این آنتی بیوتیک به بافتهای هدف، در نتیجه رسیدن به دوز اثرگذار این دارو در محل آسیب بوسیله گردش خون بسیار عملکرد مناسبی دارد (16).
این آنتی بیوتیک از نظر جذب دارو در بدن میزبان و حذف شدگی در بدن ماهیان رفتار مناسبی از خود نشان داده است؛ به طوری که در ارزیابی ایمنی فلورفنیکل در مصرف خوراکی تیلاپیا (دوزاژهای 0، 15، 45 و 75 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن به مدت 20 روز متوالی)، بیشتر از 9/96 درصد دارو در بافتهای هدف دریافت گردید (7). علاوه بر این، مطالعه Bowser و همکاران در سال 2009 حاکی از نیمه عمر حذف کوتاهتر فلورفنیکل نسبت به سایر آنتی بیوتیکها بوده است، که در این میان، دارو حذف شدگی سریعتری از بدن ماهیان کوچکتر نسبت به ماهیان بازاری داشت (5). به طور کلی آنتی بیوتیکهای مصرفی در آبزیپروری دوره خروج (تخلیه از بدن) متفاوتی دارند. به طوری که برای آموکسی سیلین، آمپی سیلین و فلورفنیکل در حدود 5 روز و برای اریترومایسین، اسپیرامایسین، اکسی تتراسایکلین، هیدروکلراید، سولفادیمتوکسین، انروفلوکساسین و اکسولینیک اسید حدود 30 روز ذکر شده است (3،15). در عمل نیز بکارگیری آنتی بیوتیکهای با دوره پرهیز از مصرف طولانیتر (اکسی تتراسایکلین، اریترومایسین و انروفلوکساسین) برای درمان عفونتهای باکتریایی ماهیان قزلآلای پرورشی در ایران (استان چهارمحال و بختیاری) سبب شده تا محصول بازاری از نظر باقیمانده دارویی دارای حدود بالاتر از استانداردهای بهداشت مواد غذایی باشد و این مسئله نیازمند توجه جدی و فوری میباشد (19).
در مقابل، مکانیسم حدف سریع فلورفنیکل از بدن ماهیان سبب شده که باقیمانده دارویی در محصول نهایی (ماهیان بازاری) از حدود قابل قبولی (بر مبنای رهنمود اتحادیه اروپا) برخوردار باشد. به نحوی که بالاترین و پائینترین میزان آنتی بیوتیک به ترتیب برابر با 42/31 (در ماهیان بالای 150 گرم) و 35/10 نانوگرم بر گرم وزن بدن (در ماهیان زیر 50 گرم) در کبد، و مقادیر 84/48 (ماهیان 150-50 گرم) و 2/18 نانوگرم بر گرم وزن بدن (ماهیان بالای 150 گرم) بوده است. بنابراین باقیمانده فلورفنیکل پائینتر از بیشینه تراز قابل قبول بوده است (6). البته در نواحی که دارای اپیدمی برخی بیماریهای باکتریایی میباشند، به دلیل مصرف بی رویه از آنتی بیوتیکها ممکن است باقیمانده دارویی بیش از حد مجاز (1 میکروگرم بر گرم) باشد. برای مثال Ansari و همکاران در سال 2012 نشان دادند که غلظت آنتی بیوتیک در فیله قزلآلا در دامنه 6/3-4/0 میکروگرم بر میلیلیتر و با میانگین 8/0 میکروگرم بر میلیلیتر بوده است (2). Barani و Fallah در سال 2015 نیز از سطوح بالای باقیمانده آنتی بوتیکهای فلورفنیکل و اکسی تتراسایکلین در گوشت قزلآلای رنگینکمان پرورشی در گستره جغرافیایی گوناگون ایران خبر دادند. به طوری که پتانسیل خطر نسبتاً بالایی برای بهداشت عمومی به دنبال مصرف مداوم وجود دارد (4). مطالعه دیگری که در گستره وسیعی (شمال، شمال غرب، غرب و نواحی مرکزی ایران) صورت گرفت نیز نشان داد که فلورفنیکل پس از اکسی تتراسایکلین و انروفلوکساسین مصرف بی رویهای در صنعت سردابی کشور داشته و شوربختانه نزدیک به 50 درصد ماهیان قزلآلای بازاری دارای مقادیر بالای (61/2-21/0 میکروگرم بر گرم) باقیمانده در بافت عضلانی بودهاند (1).
این مطالعات میتوانند کاربرد آکوافلور در دوزهای بالاتر از مقادیر پیشنهادی توسط NACA (12) و US.FDA (18) برابر با 10 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن را تأیید نمایند که در کنترل مرگ و میر آزاد ماهیان بیمار در اثر عفونت ناشی از Flavobacterium psychrophilum اثربخشی بهتری دارد و میتواند علاوه بر بهبود سیستم ایمنی سبب افزایش نرخ تولید ماهی شده و در عین حال سلامت مصرف کنندگان را تأمین کند (11). در مطالعه دیگری نشان داده شد که بکارگیری تجربی 15 میلیگرم فلورفنیکل بر کیلوگرم وزن بدن به مدت 10 روز متوالی برای مهار بیماری استرپتوکوکوزیس/ لاکتوکوکوزیس در قزلآلای رنگین کمان، نیازمند دوره بازیابی (Recovery) 10 روزه برای ماهیان بازاری پس از تجویز دارو است تا خطری متوجه مصرف کنندگان محصول نباشد (17). باید دقت شود که این دوره بازیابی کاملاً وابسته به شرایط محیطی ماهی پرورشی به ویژه دمای آب است (10).
نظر به اینکه اطمینان از کیفیت بهداشتی یک محصول کشاورزی و غذایی برای مصرف کنندگان اهمیت زیادی دارد، میتواند نقش تعیین کنندهای از نظر جذب و حفظ بازار برای تولید کنندگان داشته باشد. از سوی دیگر، پایش باقیمانده فلورفنیکل در ماهیان بازاری به عنوان یکی از پرمصرفترین آنتی بیوتیکها در صنعت تولید ماهیان سردابی کشور نیازمند توجه بیشتری است. مطالعه حاضر در نظر دارد تا باقیمانده این داروی آنتی باکتریال را در بافت خوراکی (ماهیچه) قزلآلای پرورشی در منطقه سپیدان استان فارس به عنوان یکی از قطبهای تأمین بازار شهر شیراز، تعیین نماید.
نمونه برداری از مزارع پرورش ماهی: تعداد 50 قطعه ماهی از 7 مزرعه در منطقه سپیدان (30°10’N 52°00’E) و در فاصله زمانی آبان الی اسفند 1397 به صورت تازه خریداری شده و طبق آئیننامه اخلاق زیستی دانشگاه شیراز برای نگهداری و استفاده از جانوران مهرهدار در مطالعات آزمایشگاهی (IACUC. No. 4687/63) کشته شدند. نمونه برداری از ماهیچه پهلویی آنها صورت گرفته و نمونهها تا زمان انجام تستهای باقیمانده دارویی در دمای 18- درجه سلسیوس نگهداری شدند (21).
تهیه رونشین (Supernatant): پس از یخزدایی، توزین آنها به مقدار 1 گرم صورت گرفت، به آنها 4 میلیلیتر اتیل استات اضافه شد و به صورت دستی هموژن شدند. پس از سانتریفیوژ (4000 دور به مدت 10 دقیقه) رونشین جدا شده و به عنوان منبع برای سنجش شیمیایی مورد استفاده قرار گرفت (9).
آماده سازی نمونهها: روش آماده سازی در مطالعه Shiry و همکاران در سال 2019 شرح داده شده است (16). به طور خلاصه، مقدار 200 میکرولیتر نمونه به حجم 30 میکرولیتر کلرامفنیکل با درجه خلوص بالای 98 درصد (سیگما-آلدریچ، سنت لوئیس، ایالات متحده آمریکا) به غلظت 10 میکروگرم بر میلیلیتر، به عنوان استاندارد داخلی افزوده شد. هر نمونه به مدت 2 دقیقه به خوبی ورتکس شده و سپس 4/1 میلیلیتر اتیل استات به عنوان رسوب دهنده پروتئینها به هر یک افزوده گردید و بلافاصله سانتریفیوژ (5000 دور برای 3 دقیقه) انجام شد. میزان 1300 میکرولیتر از رونشین هر نمونه برداشت شد و فرایند تبخیر مایعات آنها تحت بخار نیتروژن در دمای 40 درجه سلسیوس به مدت 45 دقیقه صورت گرفت. به باقیمانده (جامدات) هر نمونه حجم 200 میکرولیتر فاز متحرک (مایع) شامل آب و استونیتریل با نسبت حجمی 25:75 افزوده شد و سپس از فیلتر سرسرنگی 45/0 میکرومتر عبور داده شد. نمونههای حاصل شده به مدت 15 دقیقه انکوبه شدند و در پایان هر نمونه به حجم 60 میکرولیتر یکی پس از دیگری به دستگاه تزریق شدند (16،17).
سنجش شیمیایی: غلظت فلورفنیکل از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) و با بکارگیری دستگاه Knauer-HPLC (برلین، آلمان) مجهز شده به یک دتکتور UV (مدل K2500) و انژکتور Rheodyne (مدل 7125) تعیین شد. جداسازی مواد در دمای 40 درجه سلسیوس بر روی یک ستون 200×6/4 میلیمتری با 120-A C18 به عنوان فاز ثابت (جامد) انجام شد. فاز مایع (آب- استونیتریل) از فیلتر سرسرنگی 45/0 میکرومتری عبور داده شد و از طریق هموژنایزر اولتراسونیک گاززدایی گردید. نرخ جریان فاز مایع بر روی ستون معادل 1 میلیلیتر در دقیقه بود.
محاسبات: محاسبه غلظت فلورفنیکل بر مبنای سطح زیر پیک حاصل شده در نمودارها بود. به طوری که نخست منحنی استاندارد به عنوان همبستگی دو متغیر غلظت فلورفنیکل افزوده شده به پلاسما (Y) و مساحت پیکهای فلورفنیکل (X) ترسیم گردید. غلظتهای فلورفنیکل مورد استفاده شامل 5/2، 5، 5/12، 25، 50، 100 و 200 میکروگرم بر میلیلیتر بر غلظت استاندارد داخلی (10 میکروگرم بر میلیلیتر) تقسیم شدند، تا غلظتهای حقیقی فلورفنیکل حاصل شوند. سپس در نمونهها (مجهول)، نسبت مساحت زیر پیکهای فلورفنیکل به مساحت زیر پیکهای کلرامفنیکل محاسبه شد و به عنوان متغیر X در معادله خط منحنی استاندارد قرار گرفتند. بدین ترتیب غلظتهای مجهول بر حسب میکروگرم بر میلیلیتر (قسمت در میلیون) به عنوان متغیر Y بدست آمدند.
محدودیت تشخیص (LOD) و محدودیت مقدارسنجی (LOQ) با استفاده از روابط ذیل تعیین شدند:
(معادله 1)
(معادله 2)
جایی که Sd انحراف معیار، intercept عرض از مبدا (b) و X-variable شیب خط (a) هستند.
به منظور محاسبه انحراف معیار نسبی (RSD%)، متوسط خطای نسبی (RE%) و میانگین نرخ بازیابی نسبی (RR%) به عنوان شاخصهای صحت اندازهگیری، پس از انتخاب غلظتهای کمینه (min)، بهینه (opt) و بیشینه (max) به شرح معادلات ذیل استفاده گردید:
(معادله 3)
(معادله 4)
(معادله 5)
جایی که Sd انحراف معیار، میانگین نمونه بوده و مقدار اندازهگیری شده از قرار دادن متغیر X در معادله استاندارد بدست میآید و مقدار واقعی نیز همان مقدار معلوم (غلظت فلورفنیکل افزوده شده به پلاسما) میباشد (8).
تجزیه و تحلیل اماری: باقیمانده دارویی در نمونههای ماهیچه با استفاده از تی تست تک نمونهای با استاندارد ارزیابی محصولات دارویی (6) (برابر با 1 میکروگرم بر گرم) مقایسه گردید. همچنین قیاس بین میانگینهای غلظت فلورفنیکل در نمونههای مزارع مختلف با یکدیگر از طریق آنالیز واریانس یک طرفه انجام شد. کلیه عملیات آماری در محیط نرم افزار SPSS (نسخه 20) صورت گرفت.
منحنی استاندارد ترسیم شده فلورفنیکل در نمودار 1 نشان داده شده است. محدودیتهای تشخیص و مقدارسنجی فلورفنیکل توسط سیستم به ترتیب برابر با 024/0 و 073/0 قسمت در میلیون تعیین شدند. انحراف معیار نسبی دادههای منحنی استاندارد مربوط به غلظتهای کمینه، بهینه و بیشینه به ترتیب معادل 87/19، 84/5 و 5/5 درصد بدست آمدند. همچنین متوسط خطای نسبی (به عنوان شاخص صحت اندازهگیری) و میانگین نرخ بازیابی نسبی دارو به ترتیب معادل 81/3 و 18/96 درصد ثبت شدند.
نتایج حاصل از تحلیل نمودارهای کروماتوگرافی نشان داد که کمینه، میانگین و بیشینه مقادیر فلورفنیکل تجمع یافته در نمونهها، برابر با 0 (غیر قابل تشخیص)، (04/0±) 713/0 و / (09/0±) 34/1 میگروگرم بر گرم بودند.
بر اساس آزمون کولموگروف اسمیرنوف، تفاوت معنیداری بین فراوانی باقیمانده دارویی در عضله ماهیان نمونه با مقادیر مورد انتظار وجود نداشت و توزیع جامعه نرمال بود. بنابراین به منظور مقایسه آماری، میتوان از آزمونهای پارامتریک بهره گرفت.
نتایج حاصل از آنالیز واریانس (نمودار 2) نشان دهنده این بود که باقیمانده دارویی در نمونههای مربوط به مزارع E و F به طور معنیداری بیشتر از سایر مزارع بوده است (05/0P<).
جدول 1 نتایج مقایسه باقیمانده دارویی فلورفنیکل را با مقدار استاندارد اروپایی (1 میکروگرم بر گرم وزن بدن) نشان داده است. بر این اساس، میانگین باقیمانده فلورفنیکل در ماهیچه ماهیان منطقه سپیدان به طور معنیداری کمتر از مقدار استاندارد میباشد (05/0P<)، ولی غلظت این آنتی بیوتیک در نمونههای بدست آمده یکی از مزارع پرورشی از حد استاندارد تجاوز نمود (12/1 میکروگرم بر گرم) که البته این تفاوت معنیدار نبود (05/0P>).
بدیهی است که صیانت از سلامت جامعه به عنوان یک مسئولیت اجتماعی بر همگان ضرورت داشته و به طور ویژه تولیدکنندگان خوراک میبایست در نیل به این امر، مجدانه بکوشند. در این راستا، پژوهش حاضر به عنوان یک مطالعه پایشی در مورد ماهیان منطقه سپیدان استان فارس که تأمینکننده بخش مهمی از ماهیان سردابی بازار شهر شیراز میباشد، صورت گرفته است. از نظر اعتبار دادههای حاصل از سنجش باقیمانده دارویی، لازم به تأکید است که با توجه به ضریب تعیین بالا در منحنی استاندارد، در واقع همبستگی قابل قبولی بین مساحت سطح زیر پیکها با غلظتهای فلورفنیکل افزوده شده به پلاسمای شاهد وجود داشته است. همچنین انحراف معیار نسبی دادههای منحنی استاندارد حاکی از دقت بالا در اندازهگیری فلورفنیکل توسط دستگاه میباشد. بر اساس اندازهگیریها، مقادیر فلورفنیکل تجمع یافته در نمونههای عضله بین 0 تا 34/1 میکروگرم بر گرم بودند که در مقایسه با نتایج Ansari و همکاران در سال 2012 (استان چهارمحال و بختیاری)، از تشابه قابل توجهی برخوردار است (2). مقایسه مقادیر بدست آمده در مطالعه حاضر با یافتههای حاصل از سایر نقاط کشور (1،4) حاکی از این است که این آنتی بیوتیک مصرف بهینهتری در منطقه سپیدان داشته و یا نظارت بیشتری بر مدیریت بهداشتی مزارع این ناحیه انجام شده است.
تجزیه و تحلیل آماری نشان داد که میانگین باقیمانده فلورفنیکل در ماهیچه ماهیان منطقه سپیدان به طور معنیداری کمتر از مقدار استاندارد ارزیابی محصولات دارویی (برابر با 1 میکروگرم بر گرم) میباشد. با توجه به اینکه این آنتی بیوتیک نیمه عمر حذف کوتاهتری نسبت به سایر آنتی بیوتیکها دارد (5،6،7،20)، پرورشدهندگان میتوانند اطمینان خاطر بیشتری نسبت به مصرف آن داشته باشند. گرچه لازم است از توصیههای متخصص بهداشتی بهره گرفته شود تا مشکلاتی نظیر مقاومت دارویی گریبان مزرعه را نگیرد. به ویژه، محاسبه و بکارگیری دوزاژ مصرفی صحیح (حداکثر 15 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن برای 10 روز متوالی)، افزون بر اینکه میتواند از این رخداد پیشگیری نماید، زمان به نسبت دقیق پاکسازی دارو از بدن ماهی را نشان میدهد. برای نمونه دوزاژ اشاره شده نیازمند دست کم 165 درجه روز (درجه سلسیوس × زمان بر حسب روز) به عنوان دوره پرهیز از مصرف دارو است تا باقیمانده دارویی در محصول نهایی (ماهیان بازاری) از حدود قابل قبولی برخوردار باشد (7،17).
بخش دیگری از نتایج نشان میدهد که باقیمانده فلورفنیکل در نمونههای بدست آمده یکی از مزارع پرورشی از حد استاندارد تجاوز نمود (12/1 میکروگرم بر گرم). یک علت احتمالی این مسئله را میتوان در نوع سیستم گردش آب این مزرعه جستجو کرد. به طوری که این مزرعه از سیستم مدار بسته با تعویض آب 10 درصد در هفته استفاده مینماید. مطالعهای دیگر که مقایسهای بین نیمه عمر این آنتی بیوتیک در پلاسمای ماهیان پرورش یافته در سیستمهای مداربسته (2/1±3/20 ساعت) و جریاندار (9/0±7/19 ساعت) انجام داد (11)، تأیید کننده این گمانه است. بنابراین به نظر میرسد که افزایش نیمه عمر فلورفنیکل، ارتباط مستقیمی با باقیمانده این دارو در سیستمهای مدار بسته داشته باشد. البته این در شرایطی است که پرورشدهندگان از دامنه پیشنهادی دوزاژ مورد تأیید سازمان بهداشت غذا و داروی ایالت متحده آمریکا (US.FDA) تخطی نکنند، که نمیتوان تا این اندازه خوشبین بود. به طوری که دادههای تجربی و مشاهدات میدانی نشان میدهند معمولاً مصرف آنتی بیوتیکها پس از دوره درمانی نیز تا زمان ناپدید شدن علائم پاتولوژیک در ماهی توسط پرورشدهندگان ادامه مییابد و یا دوزاژ مصرفی درست محاسبه نمیشود (4). بنابراین دلایل دیگری که برای اختلاف مقادیر باقیمانده دارویی این مزرعه با سایرین قابل تصور هستند، مصرف بالاتر آنتی بیوتیک (دوز یا زمان)، و اختلاف دمای آب مزارع و واکنش فیزیولوژیک بدن ماهی به این عامل محیطی است (10).
مقایسهای که بین باقیمانده دارویی در ماهیان استخرهای مختلف منطقه سپیدان انجام شد نشان داد که باقیمانده دارویی در نمونههای مربوط به مزارع E و F به طور معنیداری بیشتر از سایر مزارع بوده است. با توجه به اینکه شماره بندی مزارع از پائیندست (مزرعه A، B و C) به بالادست (مزرعه D، E و F) رودخانه شش پیر انجام شده، احتمالاً عامل دمای آب بر متابولیسم جذب و دفع آنتی بیوتیک مؤثر بوده است. به طوری که مزرعههای E و F در نزدیکی سرچشمه قرار گرفتهاند و سردتر بودن آب این مزارع میتواند سبب کندتر شدن روند پاکسازی دارو گردد. دادههای به اشتراک گذاشته شده توسط انستیتوی پژوهشی شرینگ پلاو (Schering-Plough) در مورد اثرات دما و عوامل محیطی بر نیمه عمر فلورفنیکل با این بخش از نتایج و گمانهزنی مربوط به آن همخوانی دارد (18). مزرعه G در جنوب غربی شهر اردکان واقع شده و آب آن از منبع دیگری تأمین میگردد.
به نظر میرسد که میزان باقیمانده فلورفنیکل در ماهیانی که روانه بازار میشوند به مرز هشدار رسیده است و با اینکه ممکن است از نظر میانگین در یک منطقه در محدوده استانداردهای غذایی باشد، پیشنهاد میشود پایش دورهای در این خصوص توسط نهادهای ذیربط به طور مستمر صورت گیرد تا حقوق مصرف کننده به شکل مناسبتری استیفاء گردد. باید توجه شود که آنتی بیوتیکهای متنوعی از سوی پرورش دهندگان مصرف میشوند که جنبه فصلی پیدا کردهاند و برخی از آنها به حالت سوء مصرف رسیدهاند (نظیر اکسی تترا سایکلین)، پس صرف سالم بودن محصول از نظر باقیمانده فلورفنیکل نمیتوان این یافتهها را تسری داد.
بدین وسیله نویسندگان مقاله از جناب آقای دکتر پاشایی مدیر بخش بازاریابی شرکت رویان دارو به خاطر در اختیار قرار دادن استاندارد فلورفنیکل صمیمانه سپاسگزاری مینمایند.
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
References