مقدمه

انگل‌های زئونوز (Zoonoses) در بسیاری از گونه‌های ماهی دیده می‌شوند. معمولاً آلودگی و عفونت ایجاد ‌شده از این انگل‌ها در انسان، با مصرف ماهی به‌صورت خام یا نیم ‌پخته ایجاد می‌شود، عادت‌های تغذیه‌ای و مصرف غذاهای دریایی که به‌صورت خام به مصرف می‌رسند، عمدتاً باعث انتقال انگل‌های خانواده آنیزاکیده می‌شود (14).

 ماهی هامور معمولاً در مناطق کم‌ عمق ساحلی تا اعماق متوسط دریا زندگی می‌کند و بندرت تا عمق 200 متری یافت می‌شود (3). ماهی‌ هامور بیشتر در مناطق سنگی و برجستگی کف دریا زندگی می‌کند، اما بعضی از گونه‌ها بسترهای ماسه‌ای و گلی پوشیده از علف‌های دریایی را جهت زیستن ترجیح می‌دهند (2). نماتودهای مرتبط با آبزیان به 17 خانواده تعلق دارند و از بین آن‌ها تنها 5 خانواده اختصاص به ماهیان دارند. غالباً حضور این انگل‌ها به شکل کیستی در داخل عضلات، کبد، سطح اندام‌های داخلی حفره بطنی، روده و گاهی در زیر پوست ماهی‌ها می‌باشند. همچنین ممکن است قلب، عروق خونی، چشم و غدد تناسلی نیز مورد آلودگی با انگل‌ها قرار‌ گیرند. یکی از بیماری‌های مهم مشترک بین انسان و ماهی آنیزاکیازیس (Anisakiasis) است. عامل انگلی این بیماری مرحله نوزادی نماتودهای آسکارید از جنس آنیزاکیس (Anisakis) می‌باشد (1).

 Pseudoterranova با نام‌های پوروسکوم (Porrocaecum) یا ترونووا (Terranova) شناخته می‌شود. بیماری ایجاد شده از این جنس همانند سایر جنس‌های خانواده آنیزاکیده، آنیزاکیازیس نام دارد. این نماتود قادر به آلوده کردن گونه‌های مختلف ماهی است. انسان از طریق خوردن این نماتود آلوده می‌شود. این بیماری از دسته بیماری‌های مشترک یا زئونوز است. گونه‌های سودوترونووا که اکنون به نام Sealworm شناخته می‌شوند قبلاً با نام Codworm شناسایی می‌شدند (10).

در نماتودهای این جنس، مری در انتهای خلفی، شکمچه‌ای استوانه‌ای یا مستطیلی دارد. ممکن است ضمیمه‌ای از آن جدا شده و به ‌طرف خلف کرم امتداد یابد. روده کور روده‌ای یا موجود است و یا وجود ندارد. کرم بالغ به طول 20 میلی‌متر و عرض 4/0 میلی‌متر است و در انتهای قدامی یک ‌دندان دارد. روده کور روده‌ای ندارد ولی شکمچه مری موجود و استوانه‌ای است (تصویر 1). منفذ تناسلی نزدیک انتهای قدامی است (5).

Pahlavan و همکاران در سال 2013 در مطالعه‌ای به جداسازی و شناسایی نماتودهای جداشده از ماهی حسون دریای عمان در چابهار پرداختند (10). آن‌ها آنیزاکیس جدا شده را با نام آنیزاکیس پگرفی در بانک ژن با شماره KF208687 ثبت کردند. گزارش آن‌ها اولین مطالعه مولکولی انگل آنیزاکیس در ماهی تجاری حسون دریای عمان بود و نشان داد که انگل‌های خانواده آنیزاکیده در دریای عمان نیاز به بررسی بیشتر و تشخیص گونه دارند.

Mattiucci و همکاران در سال 2020 به شناسایی مولکولی نوزاد آنیزاکیس ماهی‌های تجاری جنوب شرقی اقیانوس آرام در سواحل پرو پرداختند (6). تعداد 348 نمونه ماهی مورد بررسی قرار‌ گرفت و از آغازگرهای میتوکندریایی cox2 جهت تعیین توالی استفاده شد. بعد از تحلیل‌های فیلوژنتیکی و تشخیص گونه مشخص شد که Anisakis pegreffii هم گوشت و هم احشاء را آلوده می‌کند، اما سایر گونه‎های آنیزاکیس فقط در احشاء ایجاد آلودگی می‎کنند. نتایج بدست آمده از این نوع مطالعات به بهبود دانش در مورد توزیع و پراکنش گونه‌های مختلف آنیزاکیس کمک می‌کند.

در مطالعه حاضر به بررسی ریخت‌شناسی و مولکولی نماتود سودوترونووا کربی جدا شده از ماهی هامور دریای عمان پرداخته ‌شده ‌است. ماهی هامور یکی از ماهیان تجاری است که مصرف‌کنندگان بسیاری دارد و از این رو ارزیابی آن از لحاظ حضور انگل‌های مشترک بین انسان و ماهی دارای اهمیت است.

مواد و روش‌کار

تعداد 15 قطعه ماهی هامور از نظر وزن در سه سایز کوچک (وزن تا 500 گرم)، متوسط (وزن 500 گرم تا 1 کیلوگرم) و بزرگ (وزن بیش از 1 کیلوگرم) دسته‌بندی شد. جهت بررسی‌های انگلی به آزمایشگاه منتقل شدند و اندام‌های مختلف بدن این ماهی‌ها پس از انتقال به آزمایشگاه، مورد ارزیابی انگل شناسی قرار گرفتند. سطح شکمی بدن ماهی از ناحیه مقعد تا قسمت سرپوش آبششی، برشی ذوزنقه‌ای داده‌ شد و با چشم غیرمسلح مورد ارزیابی قرار‌ گرفت، برای دقت بیشتر با استفاده از میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار ‌گرفتند. برای ارزیابی حضور انگل در لوله گوارش برش‌هایی بالای معده و در قسمت انتهایی روده زده‌ شد، مخاط معده و روده بررسی‌ شد و انگل‌های متصل به مخاط جمع‌آوری و با میکروسکوپ مورد ارزیابی قرار گرفتند (15).

برای استخراج DNA، قسمت سر و انتهای نماتودهای یافت ‌شده را جدا و در داخل لوله اپندورف حاوی الکل 70 درجه، برای بررسی‌های ریخت‌شناسی قرار‌ داده ‌شد و قسمت میانی نماتود برای استخراج DNA مورد استفاده قرار ‌گرفت. استخراج DNA با استفاده از روش فنل – کلروفرم انجام شد (11).

در مطالعه حاضر از یک جفت آغازگر (LCO1490F, HCO2198R) مربوط به ناحیه COXI از ژنوم میتوکندری استفاده ‌شد (17). مواد مورد استفاده در واکنش شامل بافر X10 شرکت سیناکلون 5 میکرولیتر،MgCl2  25 میلی مولار 5 میکرولیتر، dNTP mix 5/2 میلی‌مولار 5 میکرولیتر، آغازگرهای پیش‌رو و پس‌رو 10 پیکومول هرکدام 5/2 میکرولیتر، آنزیم تک‌پلیمراز 2 یونیتی 1 میکرولیتر و متناسب با غلظت DNA استخراجی، طوری که غلظت DNA در لوله‌ها 30 نانوگرم باشد، به لوله‌ها DNA استخراجی افزوده ‌شد. حجم نهایی واکنش 50 میکرولیتر بود. برنامهPCR  برای دستگاه ترموسایکلر (Quanta Biotech, England) شامل واسرشت‌سازی اولیه در 94 درجه سانتی‌گراد 3 دقیقه، 35 سیکل شامل واسرشت‌سازی در 94 درجه سانتی‌گراد 30 ثانیه، اتصال پرایمر در 52 درجه سانتی‌گراد 30 ثانیه، طویل‌سازی در 72 درجه سانتی‌گراد 1 دقیقه انجام شد و طویل‌سازی نهایی در 72 درجه به مدت 5 دقیقه انجام شد. محصول PCR به دست آمده با ژل 1 درصد آگارز وارد الکتروفورز گردید و در نهایت نمونه‌های مناسب جهت تعیین توالی به شرکت زیست فن‌آوری کوثر فرستاده ‌شدند. نتایج به‌دست ‌آمده از تعیین توالی محصولات با استفاده نرم‌افزار Mega 6 مورد آنالیزهای فیلوژنتیکی قرار ‌گرفت.

نتایج

نوزادهای جدا شده از دستگاه گوارش ماهی هامور در محدوده 1 تا 3 سانتی‌متر طول داشتند. این نوزادها سفید رنگ بوده و اغلب پیچ‌ خورده بودند. در بررسی ریخت‌شناسی در تعدادی از نوزادهای جداشده در انتهای قدامی انگل تکمه‌ای به‌ وضوح دیده می‌شد (تصویر 2). در برخی از نوزادها خار انتهایی قابل‌ مشاهده بود (تصویر 2) و همچنین در برخی از نوزادها شکمچه کوچک در انتهای مری قابل ‌رؤیت بود. موارد مشاهده‌ شده فوق اثبات می‌کنند که تمام نوزادهای جدا شده از خانواده آنیزاکیده هستند و برای تشخیص جنس و گونه احتمالی حتماً باید از روش‌های مولکولی استفاده کرد.

از 26 نمونه نماتود به‌دست ‌آمده، بعد از بررسی‌های ریختی 8 نمونه آنیزاکیس تشخیص داده شد. این نمونه‌ها دارای خار انتهایی و سه لب قدامی بودند. از تمام 26 نماتود استخراج DNA انجام‌ شد و بعد از انجام واکنش PCR همگی در محدوده 710 جفت بازی باند مثبت را نشان دادند. 8 نمونه مثبت از نظر ریخت‌شناسی برای تعیین توالی به شرکت زیست فن آوری کوثر ارسال شد. از میان 8 نمونه که مورد تعیین ترادف ژن قرار‌گرفت بعد از بررسی نتایج، همگی از جنس Pseudoterranova از خانواده آنیزاکیده تشخیص داده‌ شدند. تطبیق ترادف‌های به‌دست ‌آمده با ترادف‌های موجود در بانک جهانی ژن با برنامهMega6  انجام شد. درخت شجره‌ای، با استفاده از دو روش Maximum Likelihood و joining Neighbor رسم شد، در این درخت‌ها از Parascaris univalence به‌عنوان خارج گروهی استفاده شد و نشان داد که گونه موجود در این بافت‌ها با اختلاف چند نوکلئوتید از گونه‌های Pseudoterranova متفاوت است و سپس توالی با شماره شناسایی MK317965 در بانک جهانی ژن (NCBI) ثبت ‌شد.

درخت نشان‌ داده ‌شده در تصویر 3 جدا بودن گونه به‌دست ‌آمده با گونه‌های ثبت ‌شده در بانک ژن، شامل گونه‌های جنس آنیزاکیس و جنس سودوترونووا را نشان می‌دهد. گونه به‌دست ‌آمده با 84 درصد بوت‌استرپ از گونه‌های جنس آنیزاکیس و با 98 درصد بوت‌استرپ از گونه‌های جنس سودوترونووا حمایت می‌شود، که نشانه نزدیک بودن این‌گونه با گونه‌های سودوترونووا است. گونه سودوترونووای مطالعه حاضر با سودوترونووا کربی بیشترین قرابت و هم‌پوشانی را نشان داد. تحلیل درخت شجره شناسی به‌دست ‌آمده نشان ‌داد که گونه به‌دست ‌آمده در این مطالعه رابطه خواهری با سودوترونوواها و آنیزاکیس‌های موجود در بانک ژن نشان نمی‌دهد که با ایجاد کلاد جداگانه پارافایلیتیک مسیر خود را جدا نموده ‌است (تصویر 4).

این نتایج ممکن است به دلیل کم بودن توالی‌های ثبت ‌شده سودوترونووا و آنیزاکیس در بانک ژن باشد که نیاز به مطالعه وسیع‌تر در ماهیان مختلف دریای عمان و سایر مناطق ایران را دارد. با این ‌حال با وجود فاصله ژنتیکی مشاهده ‌شده در تصویر 4 گونه به‌دست ‌آمده با 96 درصد بوت استرپ از گونه‌های آنیزاکیس و انواع سودوترونووا موجود در بانک ژن حمایت می‌شود که نشانه داشتن قرابت ژنتیکی اما نه به‌صورت خواهری است.

بحث

 یکی از منابع مهم پروتئین در دنیا ماهی می‎باشد، ماهی در بالای زنجیره غذایی قرار‌ دارد و بخش مهمی از رژیم غذایی انسان را به دلیل کیفیت بالای آن تشکیل می‌دهد. آلودگی‌های مختلف از جمله آلودگی‌های انگلی می‌تواند از عوامل تهدید کننده سلامت آبزیان باشد. با در نظر گرفتن این‌که منابع دریایی آبزیان محدود است و نیاز برای تکثیر و پرورش آبزیان وجود دارد، شناسایی و بررسی فراوانی انگل‌های آن‌ها و بررسی روش‌های کنترل بهداشتی می‌تواند از نظر اقتصادی در تولید آبزیان اثرگذار باشد (13).

مصرف ماهی به‌صورت خام یا نیم‌پخته باعث ایجاد کانون‌های اپیدمی مرتبط با بیماری‌های انگلی در برخی از مناطق دنیا به‌خصوص جنوب شرقی آسیا که تمایل به مصرف ماهی به‌صورت خام دارند، شده است. تغییر ذائقه غذایی و میل به خوردن ماهی و آبزیان دریایی به‌صورت خام در دنیا رو به افزایش است و به دنبال آن شیوع بیماری‌های قابل ‌انتقال از ماهی نیز زیاد شده است (4).

با توجه به ارزش تجاری ماهیان دریای عمان، گزارش در مورد آلودگی‌های انگلی بسیار کم و یا در بعضی از ماهی‌ها وجود ندارد. در سال‌های اخیر مطالعات بر اساس خصوصیات ریخت‌شناسی در ایران و بسیاری از کشورها انجام‌ شده ‌است که در نتیجه آن انگل‌های بسیاری از قسمت‌های مختلف بدن ماهی جدا شده ‌است. در مطالعاتی فراوانی انگل‌های کرمی ماهی شوریده، حلوای سیاه، سنگسر و سرخوی خلیج‌فارس، سستودهای گریلوشیا (Grillotia sp.)، کاریوفیلوس (Caryophyllaeus sp.) و تترارینکوس(Tetrarhynchus sp.)  به‌صورت کیست در اندام‌های مختلف دیده ‌شده‌اند و ماهیان مورد مطالعه میزبان واسط برای سستودهای ذکر شده هستند (15).

نوزادهای خانواده آنیزاکیده با هجوم به دستگاه گوارش انسان سندرومی به نام ائوزینوفیلیک گرانولوما را ایجاد می‌کند (14). در سال‌های اخیر، آنیزاکیازیس به‌عنوان یکی از عوامل اصلی و مهم گاستروانتریت در نقاط مختلف دنیا شناخته ‌شده است، در مطالعاتی که بر روی بیماران با دردهای شکمی و علائم آپاندیسیت مراجعه ‌کننده به بیمارستان در کشورهای مختلف از جمله ایتالیا انجام‌ شده است نماتود آنیزاکیس پگرفی از یک مرد و دو زن جدا و با استفاده از روش‌های مولکولی و تعیین توالی شناسایی و تأیید شده‌اند (9). این مطالعات نشان‌ دهنده اهمیت ردیابی و بررسی نماتودهای زئونوز در ماهیان تجاری مورد مصرف انسانی می‌باشد و همچنین اهمیت استفاده از روش‌های مولکولی برای تشخیص سریع و کارآمد نماتودهای انگلی را نشان می‌دهد.

در ایران به دلیل استفاده ماهی به‌صورت پخته و عدم استفاده از آن به‌صورت خام تاکنون مواردی از انگل‌های نماتودی گزارش نشده است. البته باید مطالعات دقیق‌تر بر روی بیماران مراجعه ‌کننده با علائم گاستروانتریت و آپاندیسیت انجام شود تا به‌طور مطمئن از نبود نماتود یقین حاصل شود (12).

مطالعات مختلف درباره استفاده از آغازگرهای میتوکندریایی از جمله Mattiucci و همکاران در سال 2020 و Prosser و همکاران در سال 2013 آغازگرهای مناسب برای شناسایی انگل‌ها را نشان می‌دهد، که توالی قسمتی از ژن سیتوکروم اکسیداز یک و دو (Cox1 و Cox2) بارکدینگ و شناسایی مولکولی گونه‌های انگلی مختلف از جمله خانواده آنیزاکیده مفید می‌باشد و می‌تواند اختلافات ژنتیکی را به نمایش بگذارد. آغازگرهای سیتوکروم اکسیداز زیر واحد یک بودند که نتایج مطالعه آن‌ها با نتایج مطالعه حاضر مطابقت نشان می‌دهد.

Timi و همکاران در سال 2014 شناسایی ریخت‌شناسی و مولکولی نوزادهای سودوترونووای جدا‌شده از نمونه‌های ماهی را در آب‌های آرژانتین انجام ‌دادند (16). نوزادها با آغازگرهای سیتوکروم C اکسیداز، زیرواحد II ((mtDNA cox2،ITS-1  و ITS-2 تکثیر شدند و سپس تعیین توالی شدند و با تمام گونه‌های P. decipiens (sensu lato) ثبت ‌شده در بانک ژن مقایسه‌ شدند. نتایج نشان داد که گونه مورد مطالعه با گونه‌های جداشده و ثبت شده از شیر دریایی جنوبی (Otaria flavescens) از آرژانتین و سواحل شیلی دارای مشابهت ژنتیکی است. تعیین توالی برای Cox2 100 درصد مشابهت ژنی را با توالی‌های ثبت شده در دسترس در بانک ژن برای گونهPseudoterranova cattani  نشان ‌دادند.

در مقایسه نتایج به دست‌آمده از مطالعه حاضر با سایر مطالعات انجام‌ شده نشان داد که استفاده از روش‌های ریخت‌شناسی برای شناسایی جنس انگل وگاهی برای تشخیص گونه انگل مفید است اما با استفاده از روش‌های مولکولی با استفاده از توالی‌های مختلف میتوکندریایی از جمله Cox1، Cox2 همچنین توالی‌های DNA ریبوزومی می‌توان روابط ژنتیکی این گونه‌ها و شناسایی دقیق آن‌ها را به دست ‌آورد. همچنین می‌توان میزبان‌های واسط و نهایی را در مناطق مختلف جغرافیایی و در نتیجه چرخه زندگی انگل در هر ناحیه جغرافیایی را تعیین و با نقاط مختلف دنیا مقایسه نمود.

در طی مطالعه حاضر از ماهی‌های هامور که از نظر وزن در سه سایز کوچک (وزن تا 500 گرم)، متوسط (وزن 500 گرم تا 1 کیلوگرم) و بزرگ (وزن بیش از 1 کیلوگرم) دسته‌بندی شده بودند، استفاده ‌شد که در ماهی‌های با سایز کوچک و متوسط انگل جداسازی نشد و تنها در ماهی‌های با سایز بزرگ این نماتود جداسازی گردید. در ماهی‌های سایز بزرگ علاوه بر نماتودهای انگلی مشاهده‌ شده در دستگاه گوارش، در بافت ماهی انگل‌های دیگری نیز مشاهده شد، از جمله کیست‌های مربوط به انگل‌های سستودی که در دیواره شکمی ماهی هامور مشاهده شد. همچنین انگل فیلومترا در یکی از نمونه‌ها قابل‌ مشاهده ‌بود. به‌طور کلی هر چه سایز و وزن ماهی بیشتر بود به تعداد انگل‌های موجود در ماهی افزوده می‌شد که این نتیجه با نتیجه Rasoli در سال 2014 که بر روی جداسازی نماتودهای خانواده آنیزاکیده در شانک ماهیان زرد‌باله (Acanthopagrus latus) وحشی و پرورشی در خلیج‌فارس کار نمودند مطابقت ‌دارد. آن‌ها در مطالعه خودشان ارتباطی معنی‌دار و مثبت بین وزن ماهی و بار انگلی مشاهده‌کردند و نتیجه گرفتند که با افزایش وزن بر بار انگلی مربوط به آنیزاکیس افزوده ‌می‌شود. همچنین در مطالعه Ebrahimzadeh Mosavi و همکاران در سال 2014 میزان فراوانی آلودگی به نماتود آنیزاکیس 5 درصد بود (4). آن‌ها اختلاف بین میانگین وزن در ماهی سالم و ماهی آلوده را معنی‌دار اعلام نمودند که با نتایج مطالعه حاضر مطابقت دارد. تطبیق ترادف‌های به‌دست ‌آمده با ترادف‌های موجود در بانک جهانی ژن با برنامه Mega 6 انجام‌ شد و نشان ‌داد که گونه موجود در این بافت‌ها با اختلاف چند نوکلئوتید از گونه‌های سودوترونووا کربی ثبت‌ شده در بانک ژن متفاوت است.

مطالعهPeyghan  و همکاران در سال 2006 بر روی ماهی هامور، انگل‌های مختلفی از جمله نماتود، ترماتود، سستود و آکانتوسفال در اندام‌های مختلف این ماهی جداسازی نمود؛ که از جمله خانواده آنیزاکیده از بیش‌ترین نماتودهای جدا شده از ماهی هامور بودند (13). نتایج به‌دست ‌آمده در این مطالعه بر اساس بررسی‌های ریخت‌شناسی بود. آن‌ها دریافتند که گونه‎های آنیزاکیس یکی از انگل‌های رایج در ماهی هامور است. نتایج این مطالعه با نتایج مطالعه حاضر مطابقت دارد همان‌طور که انگل‌های دیگری بجز خانواده آنیزاکیده در ماهی هامور دریای عمان مشاهده ‌شد. در مطالعه حاضر علاوه بر استفاده از بررسی‌های ریخت‌شناسی از روش‌های مولکولی هم استفاده شد که نتایج دقیق‌تر و مطمئن‌تر از گونه به‌دست ‌آمده حاصل می‌گردد. با توجه به درخت‌های شجره‌ای حاصل از تطبیق ترادف انگل به‌دست ‌آمده نشان می‌دهد که نیاز به بررسی دقیق‌تر و کامل‌تر انگل‌های به‌دست‌ آمده در ماهی هامور دریای عمان و مقایسه آن با سایر انگل‌های به‌دست ‌آمده از سایر ماهی‌های دریای عمان و سایر نقاط ایران و جهان است؛ زیرا با توجه به کم بودن توالی‌های موجود در بانک ژن آنالیز دقیق‌تر این انگل نیاز به مطالعات اپیدمیولوژیک را نشان می‌دهد تا میزبان‌های واسط و نهایی این انگل در دریای عمان مشخص گردد. نتایج مطالعه حاضر نشان ‌داد که این انگل برای اولین بار در ایران از ماهی هامور دریای عمان جداسازی ‌شده ‌است. همچنین تفاوت بسیار مابین نماتودهای جدا شده از ماهی هامور سایر نقاط ایران با نماتودهای خانواده آنیزاکیده مورد بررسی در این مطالعه وجود ‌دارد. همچنین با بررسی درخت شجره‌ای تفاوت مابین نماتودهای خانواده آنیزاکیده جدا شده از نقاط مختلف دنیا با نماتودهای خانواده آنیزاکیده مورد بررسی در مطالعه حاضر وجود‌ دارد. روابط شجره‌ای میان انگل‌ گوارشی جدا شده از ماهی هامور دریای عمان در مقایسه با دیگر گونه‌های مناطق دیگر دنیا از قرابت ژنتیکی فاصله دوری را نشان می‌دهد که می‌توان نتیجه گرفت که انگل سودوترونووا کربی جدا شده از ماهی هامور در مطالعه حاضر می‌تواند بومی ایران باشد که با مطالعه حضور این انگل در پستانداران دریایی موجود دریای عمان می‌توان مقایسه‌ای بین شباهت ژنی نماتود جدا شده با نماتودهای موجود در این پستانداران انجام داد و در نهایت چرخه زندگی این نماتود را تعیین نمود. با توجه به این‌که مطالعه حاضر برای اولین بار در ایران انجام شده ‌است نیاز به مطالعات دقیق‌تر بر روی سایر ماهیان اهمیت خود را نشان می‌دهد.

سپاسگزاری

مطالعه حاضر مستخرج از پایان نامه کارشناسی ارشد رشته انگل‌شناسی می‌باشد. نویسندگان بر خود لازم می‌دانند از معاونت اداره کل و اداره محترم دامپزشکی چابهار برای همراهی در انجام این پژوهش اعلام قدردانی نمایند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.