Supplementation of Lake Extender with Calcium Compounds to Maintain the Quality Parameters of Rooster Sperm for 72 Hours

Document Type : Basic Sciences

Authors

1 Graduated from the Faculty of Agricultural Sciences, University of Kurdistan, Kurdistan, Iran

2 Department of Animal Sciences, Faculty of Agricultural Sciences, University of Kurdistan, Kurdistan, Iran

Abstract

BACKGROUND: Storing semen at a temperature of 4 degrees Celsius reduces its motility and quality.
OBJECTIVES: This study aimed to determine the effect of adding calcium compounds, including calcimaphor (CMP), calcium gluconate (CG), and calcium chloride (CaCl2), on the motility and progressive motility of rooster sperm kept at refrigerator temperature.
METHODS: This research used five pieces of 45-week-old Lari breed roosters. The liquid diluent added different calcium compounds at 0.56, 0.056, and 0.0056 mM concentrations. After treatment, the diluted seminal samples were cooled at the storage temperature to avoid thermal doubt and then transferred to the refrigerator at 4 degrees Celsius. Parametric factors that were more important such as the percentage of laterality and progressive mobility, were measured visually using the lens of a 40-light microscope, survival was checked using the eosin-nigrosin staining method, acrosome health percentage by formalin citrate method, cell membrane health with hypoosmotic test, lipid peroxidation level, fertility was evaluated using perivitelline membrane sperm reaction 72 hours after storing at 4 degrees Celsius.
RESULTS: Based on the results, different calcium compounds in most concentrations could significantly affect the parameters of survival, mobility, and progressive mobility (P<0.05).
CONCLUSIONS: Most of the sperm-related parameters in the control group decreased after this period of storage in the refrigerator, but the addition of calcium gluconate (0.56, 0.056, and 0.0056), Calcimaphor (0.56, 0.056, and 0.0056) and calcium chloride (0.56, 0.056 and 0.0056) to the semen thinner maintained the quality indicators of rooster sperm.

Keywords

Full Text

مقدمه

 

یکی از مشکلات اساسی صنعت طیور کاهش باروری گله‌های مرغ مادر به دلیل انتخاب ژنتیکی انجام شده برای بهبود صفات تولیدی است که این صفات دارای رابطه منفی با باروری می‌باشند (1). انتخاب ژنتیکی لاین‌ها در راستای تولید جوجه‌هایی با رشد سریع و وزن زیاد کشتار است که این اهداف با صفات تولید مثلی از جمله نرخ باروری در تضاد می‌باشد (2). کاهش میزان باروری از 45 هفتگی با عوامل مختلفی مانند کاهش توده بیضه، میزان تولید اسپرم و سطح تستوسترون خروس‌های گله مرغ مادر ارتباط دارد (3). تلقیح مصنوعی به عنوان یکی از تکنیک‌های مطرح در گله‌های مرغ مادر و بوقلمون می‌تواند جایگزین مناسبی برای جفتگیری طبیعی (4) و کاهش هزینه‌های اسپاکینگ (spiking)(5) و همچنین انتخاب پرندگانی با صفات برتر ژنتیکی از گله‌هایی با سن بالا باشد (6)، بنابراین استفاده از تلقیح مصنوعی در عملیات مرغداری در حال گسترس است (7). توانایی باروری اسپرم منی پرندگان در شرایطی که رقیق نشده باشد پس از گذشت یک ساعت به شدت کاهش می‌یابد (8). لازم است که رقیق کننده‌های اسپرم شرایط متعادل و حفاظتی را برای سلول ایجاد نمایند (9). مواد معدنی در باروری و فعالیت سلول‌ اسپرم دارای نقش بسزایی هستند (10). کلسیم فعالیت حرکتی اسپرم را تحریک می‌کند و در واکنش آکروزومی اسپرم با غشاء سلول تخمک نقش پایه‌ای داشته و تا حدودی می‌توان جزو مهم‌ترین جزء شروع کننده لقاح دو سلول نر و ماده ‌باشد (11). نقش‌ کلسیم فقط به تحرک اسپرم محدود نشده و گزارش شده که کلسیم در ظرفیت پذیری اسپرم هم نقش دارد (12). این فرآیند شامل فعال سازی یک شبکه سیگنالینگ درون سلولی پیچیده است (13،14). اگزوسیتوز آکروزومی (AE) یک رویداد اگزوسیتوز وابسته به کلسیم است (15). ذکر این نکته ضروری است که باز شدن کانال‌های کلسیمی اسپرم باعث ایجاد ظرفیت و متعاقباً AE می‌شوند (16). دو کانال کلسیمی باروری نرها را تنظیم می‌کند: کانال Orail، که ورود کلسیم به مخازن را تنظیم می‌کند و کانال Catsper، که گسترده‌ترین کانال‌های کلسیمی در اسپرم است و غلظت این یون را در داخل سلولی کنترل می‌کند (17). کانال Catsper یک کانال اختصاصی کلسیمی در اسپرم قابل نفوذ، وابسته به pH و وابسته به ولتاژ پایین است که برای شروع فعالیت تاژک اسپرم، کموتاکسی به سمت تخمک، ظرفیت سازی و واکنش آکروزوم ضروری است، همه این رویدادهای فیزیولوژیکی نیاز به ورود کلسیم به داخل سلول‌های اسپرم می‌باشند. در بیشتر پستانداران، تحرک بیش فعال اسپرم بستگی به هجوم کلسیم به سیتوپلاسم اسپرم یا از فضای خارج سلولی یا آزاد شدن از اندامک‌های درون سلولی دارد بنابراین، کانال Catsper، حداقل، رفتار شنای اسپرم را کنترل می‌کند (18).

تحرک مژه‌ها و تاژک با تغییرات کلسیم داخل فلاژل تنظیم می‌شود. با این حال، مکانیسم مولکولی که توسط آن کلسیم حرکت را کنترل می‌کند ناشناخته است.کلسیم حرکت تاژک را با کنترل لغزش میکروتوبول مبتنی بر داینین تنظیم می‌کند و جفت میکروتوبول مرکزی و بازوهای شعاعی در این تنظیم نیز نقش دارند. کالمودولین و کیناز 2 وابسته به کالمودولین ممکن است واسطه سیگنال کلسیم باشند و این‌که دستگاه مرکزی و پره‌های شعاعی اجزای کلیدی مسیر سیگنال‌دهی کلسیم هستند (19). سرعت لغزش میکروتوبول مبتنی بر داینئین در سلول‌های جهش ‌یافته‌ که دارای دستگاه مرکزی معیوب، نقش کلسیم را در تعدیل فعالیت داینین تأیید کرد. مطالعات نشان داده است که بافرهایی با غلظت کلسیم بالا، فعالیت داینین را به سطوح تقریباً نرمال در آکسونم‌های جهش یافته که کاملاً فاقد دستگاه مرکزی هستند بازگرداندند. علاوه بر این، فعالیت داینین به صورت خطی با افزایش غلظت کلسیم افزایش می‌یابد زیرا تغییر تصویر موج نامتقارن به متقارن ناشی از کلسیم تا حدودی ناگهانی با افزایش کلسیم اتفاق می‌افتد (20). داینین‌های آکسونمال تاژک دارای زیر واحدهای Ca2+-binding هستند و احتمالاً مستقیماً توسط یون کلسیم تنظیم می‌شوند. یکی از اجزای بازوی بیرونی داینین نیز دارای محل‌های اتصال یون کلسیم است (21). پروتئین دیگری به نام کالاکسین نیز در بازوی بیرونی داینین وجود دارد که یک تنظیم کننده بالقوه کلسیم است (22).

اسپرم دارای چندین محل  برای اتصال یون کلسیم می‌باشد که می‌تواند زنجیره‌ای از رویدادها را برای تغییر ضربان تاژک آغاز کند. کالمودولین (CaM) یک گیرنده یون کلسیم است که در قسمت اصلی تاژک قرار گرفته است (23). دینامیک کلسیم نقش زیادی در شروع و حفظ تحرک بیش فعال دارد، که برای رسیدن و بارور کردن تخمک برای اسپرم پستانداران حیاتی است (24).

در اسپرم دو منبع اصلی برای یون کلسیم در اسپرم وجود دارد 1- برخی از آن‌ها در یک پمپ کلسیم واقع در سر اسپرم ذخیره می‌شوند که یک پوشش هسته‌ای اضافی در موقعیت گیرنده IP3 در ناحیه گردن که از نوع شبکه آندوپلاسمی (RNE) می‌باشد و 2- مابقی کلسیم در میتوکندری قسمت میانی قرار دارند (25). مجموعه RNE در طیف گسترده‌ای از پستانداران از جمله انسان (26)، همستر (13)، خفاش (27)، گاو نر (28) و موش (29) حفظ می‌شوند. به‌طور کلی می‌توان بیان کرد که در پستانداران این مجموعه RNE در قاعده تاژک همانند یک مکان ذخیره کلسیم عمل می‌کند که با تحریک شدن گیرنده آن باعث آزاد سازی کلسیم از این ذخایر می‌شود. مطالعات نشان داده است که آزاد سازی کلسیم در شروع حرکت اسپرم نقش دارد (16). این در حالی است که ذخایر کلسیمی شبکه آندوپلاسمی در پرندگان گزارش نشده است و میتوکندری‌ها مخزن اصلی کلسیم محسوب می‌گردند. نشان داده شده است که غلظت یون کلسیم در مایع منی در نرهای مبتلا به آستنوزواسپرمی به طور قابل توجهی کاهش یافته است. همبستگی قوی بین میزان کلسیم منی، کاهش تحرک و مورفولوژی غیر طبیعی آن‌ها وجود دارد (30). براساس توضیحات فوق در مطالعه حاضر این فرضیه پیشنهاد گردید که در ترکیبات رقیق کننده‌های منی پستانداران به دلیل وجود منابع کلسیمی داخل اسپرمی نیازی به اضافه کردن ترکیبات کلسیم نیست و پیروی محققین تلقیح مصنوعی پرندگان از اصول اصلی این فرمول‌ها سبب شده است که اضافه کردن ترکیبات کلسیم به رقیق کننده‌های منی در پرندگان مغفول بماند. همچنین این احتمال وجود دارد که کلسیم داخل مایع منی در پرندگان می‌تواند به‌عنوان مخزن و منبع کلسیم مورد نیاز برای تحرک توسط اسپرم لحاظ گردد. از آن جا که اجزای ترکیبات رقیق کننده‌های مختلف جهت نگهداری اسپرم پرندگان فاقد هرگونه ترکیبات کلسیمی می‌باشد. هدف از انجام مطالعه حاضر بررسی اثر افزودن ترکیبات مختلف کلسیمی به رقیق کننده لیک بر حفظ پارامترهای کیفی اسپرم خروس نگهداری شده پس از 72 ساعت ذخیره سازی در دمای 4 درجه سانتی‌گراد بود.

مواد و روش کار

در مطالعه حاضر از 5 خروس نژاد لاری هم سن استفاده شد که همه‌ آن‌ها تحت رژیم نوری 8 ساعت تاریکی و 16 ساعت روشنایی قرار گرفتند و در تمام طول دوره آزمایش دسترسی به آب آزاد و روزانه به ازای هر قطعه 95 گرم دان در اختیار پرنده‌ها قرار گرفت. خروس‌ها در یک دوره‌ سه هفته‌ای برای اسپرم‌گیری به صورت مالش ‌شکمی عادت دهی ‌شده و اسپرم‌گیری دو بار در هفته انجام ‌گرفت که هر خروس یک بار مورد مالش شکمی قرار گرفت. مایع جمع‌آوری شده در یک محفظه عایق حرارتی و در مدت کمتر از 15 دقیقه به آزمایشگاه انتقال داده شد و نمونه برای ارزیابی اولیه کیفیت اسپرم مورد‌ بررسی قرار گرفت.

در مطالعه حاضر جهت رقیق کردن نمونه منی از رقیق کننده لیک استفاده شد که ترکیبات آن در جدول 1 آمده است. اندازه‌گیری فشار اسمزی تمام محلول‌های آزمایشی با استفاده از دستگاه اسمومتر شرکت Gonatec مدل Osmomat 030 انجام گرفت. برای تهیه تیمارهای آزمایشی، منی جمع‌آوری شده به نسبت 1 به 10 با رقیق کننده ترکیب و حجم نهایی بین 10 لوله آزمایشی تقسیم و سپس تیمارها اضافه گردید. ترکیبات کلسیمی انتخاب شده جهت آزمایش شامل محلول تزریق کلسیمافور 40 (شرکت دارو‌سازی نصر فریمان ایران)، کلسیم گلوکونات (سینا دارو) و کلسیم کلراید (Merck) بود که در جدول 2 غلظت‌های آن نمایش داده شده است.

زنده‌مانی اسپرم: بدین منظور از رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین استفاده شد. برای تهیه محلول رنگی 735/1 گرم سدیم گلوتامات 128/0 گرم پتاسیم سیترات، 851/0 گرم سدیم استات 068/0 گرم منیزیم کلراید به همراه 5 گرم نگروزین و 1 گرم ائوزین در 100 میلی لیتر آب دو بار تقطیر حل گردید. 5 میکرولیتر از محلول اسپرم رقیق شده را با 10 میکرولیتر محلول رنگی روی یک لام ریخته و با هم مخلوط کرده سپس گسترشی از آن تهیه شده و اسلاید حاصل را در دمای اتاق و در یک جای عاری از گرد و خاک قرار داده تا کاملاً خشک شود. در گام بعدی توسط یک میکروسکوپ نوری (مدلOlympus.ch-2 ) در 10 نقطه از لام با بزرگ‌نمایی 1000، تعداد اسپرم‌های فاقد رنگ در هر صد سلول شمارش شدند (تصویر 1) (31).

جنبایی اسپرم: نمونه منی را به نسبت 1:10 رقیق کرده و 10 میکرولیتر از نمونه رقیق شده را روی یک لام که دمای آن به 37 درجه سانتی‌گراد رسیده بود قرار داده شد و یک لامل هم دما با آن را روی نمونه گذاشته و در 10 میدان جنبایی به صورت چشمی توسط تکنسین ماهر ثبت ‌شد. در تمام طول دوره آزمایش برای کاهش خطای فردی تمام مراحل توسط یک تکنیسین انجام داده شد و میانگین همه مشاهدات ثبت گردید (32).

سلامت غشاء اسپرم: این پارامتر توسط تست هایپو‌‌اسموتیک سنجیده شد. برای تهیه محلول هایپواسموتیک 45/0 گرم فروکتوز به همراه 245/0 گرم سیترات سدیم در 50 میلی لیتر آب دو بار تقطیر حل شد. 10 میکرولیتر از نمونه اسپرم هر گروه با 100 میکرولیتر از مخلوط هایپو اسمول در یک میکروتیوب مخلوط کرده و به مدت 50 تا 60 دقیقه در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد و سپس 10 میکرولیتر از محلول فوق بر روی یک لام قرار داده و درصد اسپرم با دم متورم و پیچ خورده در 100 عدد محاسبه شد (تصویر 2) (33).

سلامت آکروزوم: از محلول فرمالین سیترات برای تعیین درصد سلامت آکروزوم استفاده شد. محلول استوک سدیم سیترات 9/2 درصد تهیه شد و سپس 2 میلی لیتر از محلول استوک آماده شده با 48 میلی‌لیتر از محلول فرمالدئید (37 درصد) مخلوط شد. 5/0 میکرولیتر از محلول را روی یک لام ریخته و با لنز40 در 10 میدان دید اسپرم‌ها با آکروزوم سالم در100 عدد سلول شمارش شدند و میانگین اعداد بر اساس درصد بیان گردید (تصویر 3) (34).

واکنش اسپرم غشاء پری‌وتیلین: برای تهیه غشاء پری‌وتیلن از تخم نابارور و تازه استفاده گردید. ابتدا زرده تخم مرغ بدون نطفه به طور کامل از سفیده جدا شد. زرده جدا شده در پتری‌دیش به نحوی قرار گرفت که ناحیه بلاستودیسک آن رو به بالا باشد. سپس به‌وسیله یک پیپت و با سرم فیزیولوژی (9 درصد) به آرامی سفیده به جا مانده روی زرده شستشو داده شد تا آلبومین باقی مانده روی زرده پاک گردد. زرده به مدت یک ساعت در محلول کلراید هیدروژن 10 درصد در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد، بعد از اتمام وقت مقرر زرده داخل یک پتری ‌دیش قرار داده و با محلول نمکی 9 درصد چندین بار شستشو داده شد، بعد از تخلیه کامل محتویات کیسه زرده غشاء پری‌وتیلن برای انجام تست باروری مورد استفاده قرار گرفت.

میزان باروری با استفاده از واکنش بین اسپرم و غشاء پری‌وتیلن تخم مرغ برآورد شد. غشاء آماده شده به همراه 300 میلی‌لیتر از محلول حاوی اسپرم را به داخل یک میکروتیوب انتقال داده و به مدت50 دقیقه در حمام آب گرم 39 درجه سانتی‌گراد گذاشته شد، بعد از اتمام زمان انکوباتور غشاء با کمک سرم فیزیولوژی چندین بار شستشو داده شد تا اسپرم‌ها کامل شسته شوند، غشاء را با پنس به آرامی روی یک لام  پهن کرده سپس برای تثبیت بافت 10 میلی لیتر فرمالین 10 درصد روی آن ریخته شد و بعد از گذشت 1 دقیقه 15 میلی لیتر معرف شیف روی آن ریخته و پس از رنگ گرفتن غشاء با کمک آب مقطر چند مرتبه شستشو داده شد تا رنگ اضافی پاک شود. بعد از خشک شدن لام  با کمک لنز40 میکروسکوپ نوری تعداد سوراخ‌های ایجاد شده در چندین ناحیه شمارش و تعداد اسپرم‌های فعال بر اساس تعداد اسپرم در هر میلی‌لیتر محاسبه شد (تصویر 4) (35).

پراکسیداسیون لیپید: در استرس‌های اکسیداتیو، پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع سبب تولید مالون ‌دی آلدئید می‌گردد. بنابراین با اندازه‌گیری میزان مالون دی آلدهید در نمونه‌های بیولوژیک مختلف می‌توان به میزان پراکسیداسیون چربی‌ها پی برد و از آن به عنوان یک نشانگر برای اندازه‌گیری سطح استرس اکسیداتیو در یک موجود زنده استفاده کرد. به‌طور خلاصه مالون دی آلدهید با تیو باربیتیوریک اسید (TBA) در دمای بالا، واکنش داده و محصول صورتی رنگی تولید می‌کند که با روش رنگ سنجی در طول موج 540-530 نانومتر اندازه‌گیری می‌شود. با توجه به اهمیت مالون دی‌ آلدهید به عنوان یک نشانگر پراکسیداسیون چربی‌ها و همچنین عملکرد منفی آن در برابر سلامت، نیاز به ارزیابی مالون دی آلدهید در مطالعات بیولوژی همچنان احساس می‌شود.

 در مرحله نخست نمونه‌ای را که برای این آزمایش گرفته شده بود، به مدت 5 دقیقه در 1500 دور سانتریفیوژ شد تا پلاسمای آن از اسپرم‌ها جدا شود سپس 1 میلی‌لیتر از پلاسمای بالای لوله با 1 میلی‌لیتر EDTA (72/3 گرم در 20 میلی‌لیتر آب)، 1 میلی‌لیتر BHT (2/0 گرم در 10میلی‌لیتر اتانول) و 2 میلی‌لیتر TCA (3 گرم در 30 میلی لیتر آب)، باهم مخلوط شد و به مدت 15 دقیقه در 1200 گرم سانتریفیوژ شد و بعد از اتمام مدت سانتریفیوژ 1 میلی لیتر از محلول بالای لوله (پلاسما) با 1 میلی لیتر TBA مخلوط شد و در دمای 90 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 دقیقه گرم شد و آن را 30 دقیقه در دمای اتاق گذاشته تا سرد شود بعد از آن محلول به‌دست آمده در دستگاه اسپکتروفتومتر قرار داده شد و به کمک آن میزان جذب در طول موج 532 نانومتر اندازه‌گیری شد. میزان مالون‌دی‌آلدهید از فرمول زیر به‌دست آمده است (36).

تجزیه وتحلیل‌های آماری: برای آنالیز داده‌های به دست آمده از طرح کاملاً تصادفی با 10 تکرار استفاده شد. تمام داده‌ها به صورت روزانه در نرم افزار EXCEL ثبت و سپس در نرم افزار SAS فراخوانی شد. برای آنالیز داده‌ها از روش GLM و مقایسه میانگین‌ها از آزمون دانکن و توکی استفاده شد.

Yi=µ+Ti +ei

Yi= پارامتر اندازه گیری شده

µ= میانگین جامعه

Ti= اثر تیمار

ei= اثر اشتباه آزمایشی

 

نتایج

درصد زنده‌مانی اسپرم: نتایج حاصل از ارزیابی زنده‌مانی در جدول 3 آمده است .درصد زنده‌مانی در تیمارهای 56/0، 056/0 و 0056/0 CMP، 56/0 CaCl2 و 56/0 CG میلی مولار بعد از 72 ساعت نگهداری در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نسبت به گروه شاهد دارای اختلاف معنی‌داری بودند (05/0P<). افزودن این ترکیبات، زنده‌مانی اسپرم‌های آزمایشی را افزایش داد که تیمار 56/0 CMP از بیشترین میزان زنده‌مانی (5/97 درصد) برخوردار بود (05/0P<).

جنبایی: در جدول 3 نتایج آنالیز میانگین تیمار‌های آزمایشی نشان داده شده است. بررسی‌ها بیانگر تأثیر تمام ترکیبات کلسیمی بر فراسنجه جنبایی بودند به گونه‌ای که بعد از 72 ساعت نگهداری، تحرک تیمارهای آزمایشی بجز 056/0 CG به‌طور معنی‌داری بیشتر از گروه کنترل بود (05/0P<).

تحرک پیش رونده: تأثیر سطوح و ترکیبات مختلف کلسیم بر پارامتر تحرک پیش رونده در جدول 3 آورده شده است. در فراسنجه تحرک پیش رونده به‌جز تیمارهای حاوی 56/0 CaCl2 و CMP سایر تیمارهای آزمایشی بعد از 72 ساعت نگهداری، در مقایسه با گروه شاهد دارای اختلاف معنی‌داری بودند و اضافه کردن این ترکیبات به رقیق کننده لیک سبب افزایش تحرک پیش رونده گردید (05/0P<).

سلامت غشاء: نتایج حاصل از ارزیابی سلامت غشاء در جدول 3 نشان داده شده است. افزودن 56/0 و 0056/0 میلی مولار CaCl2، تمام سطوح استفاده شده CMP و همچنین غلظت 56/0 CG به رقیق کننده لیک باعث بهبود معنی‌داری در پارامتر سلامت غشاء نسبت به تیمار شاهد بعد از 72 ساعت نگهداری در دمای 4 درجه سانتی‌گراد یخچال شد (05/0P<).

سلامت آکروزوم: مقایسه میانگین‌های فراسنجه‌ سلامت آکروزوم در جدول 3 آمده است. افزودن 56/0 CMP موجب بهبود سلامت آکروزوم بعد از 72 ساعت نگهداری در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نسبت به تیمار شاهد شد (05/0P<).

گزارش‌هایی مبنی بر اثر بهبود سلامت آکروزوم پس از استفاده ‌آنتی‌اکسیدان وجود دارد (37). اما به دلیل این که تا به‌حال مطالعه‌ای در مورد اثر بهبود دهندگی ترکیبات یونی بر سلامت آکروزوم منتشر نشده است اظهار نظر در مورد دلیل بهبود این فرآسنجه بعد از استفاده از این ترکیبات بسیار دشوار است اما از آن‌جایی که غشاء اکروزوم هم از جنس غشایی سلول اسپرم است می‌توان ‌بیان نمود که نقش کلسیم در فعالیت‌های متابولیسمی دلیل حفظ یک پارچگی غشاء‌های سلولی می‌شود (38).

باروری برون تنی: استفاده از سطوح 0056/0 CG و 56/0 و 0056/0 CaCl2 در رقیق کننده لیک سبب افزایش باروری برون تنی نسبت به گروه شاهد بعد از 72 ساعت نگهداری شد (05/0P<).

مالون‌دی‌آلدهید: نتایج حاصل از میزان مالون‌دی‌آلدهید تولید شده در گروه‌های آزمایشی بعد از 72 ساعت نگهداری در دمای 4 درجه سانتی‌گراد یخچال در تصویر 5 نشان داده شده است. مقایسه میانگین‌ها نشان داد که تیمارهای آزمایشی باعث تغییر معنی‌دار میزان پراکسیداسیون لیپید غشاءهای اسپرم نسبت به تیمار شاهد نشدند.

بحث

اختلاف آماری در بین گروه‌های آزمایشی در پارامترهای زنده‌مانی، جنبایی و تحرک پیش رونده نشان داد که بعد از 72 ساعت اکثر پارامترهای اسپرمی در گروه شاهد دارای روند کاهشی هستند به طوری که جنبایی اسپرم به 9/46 درصد و تحرک پیش رونده به 4/39 درصد رسید و بررسی تیمارهای آزمایشی به وضوح نشان داد که اضافه کردن هر نوع ترکیب کلسیمی (کلسیم گلوکونات، کلسیمافور و کلسیم کلراید) به نحوی سبب افزایش پارامترهای فوق گردید که این افزایش شاخص‌های کیفی می‌تواند به دلیل نقش کلیدی کلسیم در فعالیت متابولیسمی سلول‌های اسپرم باشد. گزارش‌های متعددی مبنی بر  نقش کلسیم در تحرک تاژک وجود دارد (38). تعدیل کانال‌های کلسیمی سبب کاهش حرکت تاژک یا دم اسپرم می‌گردد (39). لازمه حرکت تاژک افزایش انتقال کلسیم به داخل سلول و اثر بخشی آن بر انقباض رشته‌های اکتین و میوزین است (38). کلسیم نقش گسترده‌ای در تولید مثل نرها و رشد اسپرم دارد. کلسیم برای فیزیولوژی اسپرم از جمله تحرک، متابولیسم، واکنش آکروزوم و لقاح مهم است. نشان داده شده است که اسپرم‌ها در پاسخ به تغییر غلظت کلسیم داخل سلولی حرکت خود را تعدیل می‌کنند. تحرک همچنین به غلظت کلسیم بیرون سلول و درون سلول در قسمت اصلی تاژک بستگی دارد (40). در شرایطی که زنده‌مانی تیمار شاهد بعد از 72 ساعت نگهداری در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به 7/59‌ درصد رسید، تیمارهایی که به آن‌ها 56/0 و 056/0 میلی مولار کلسیما فور اضافه شده بود توانستند زنده مانی خود را در سطح‌های 5/79 و 5/77 حفظ کنند که دارای اختلاف معنی‌داری با گروه شاهد بود. رقیق‌کننده لیک بدون در نظر گرفتن نژاد مرغ مناسب‌ترین محلول جهت نگهداری اسپرم بود زیرا در مقایسه با سایر رقیق‌کننده‌های مورد مطالعه پس از نگهداری دارای تعداد اسپرم‌های زنده‌ بیشتری داشت (41). بالا رفتن میزان کلسیم داخل سلولی باعث افزایش موقت سیکل آدنوزین مونو فسفات و نیز سبب تحریک آنزیم آدنیلات سیکلاز داخل سلولی می‌شود که این امر موجب تحریک آنزیم پروتئین کیناز A ‌شده که در نتیجه فعالیت آن پروتئین آکسونم فسفریله می‌شود و دم اسپرم شروع به حرکت می‌کند، نوسانات کلسیم حرکت تاژک اسپرم را تغییر می‌دهد (42). با توجه به داده‌های به‌دست آمده باروری گروه شاهد بعد از 72 ساعت به 4/49 رسید که با اختلاف معنی‌داری پایین‌تر از سطح 0056/0 استفاده شده کلسیم گلوکونات و غلظت 56/0 و همچنین 0056/0 میلی مولار کلراید کلسیم بوده است. به دلیل نقش تاژک در فرآیند تحرک و باروری می‌توان گفت که تغییرات غلظت کلسیم نقش مهمی در جنبایی و باروری اسپرم دارد ‌‌(43). اصلاح محلول‌های فعال‌سازی اسپرم با کمک هر یک از یون‌های دو ظرفیتی کلسیم و منیزیم و میزان اسیدیته می‌تواند راندمان تولیدمثلی را افزایش دهد (41). علاوه بر این، کلسیم ظاهراً بیش فعالی را تغییر می‌دهد، یک الگوی شنا با ضرب و شتم تاژک نامتقارن و ایجاد امواج تاژک با دامنه بالا که برای لقاح ضروری است کلسیم هم در واکنش آکروزوم و هم در کموتاکسی اسپرم نقش اصلی را بازی می‌کند (42). در حالی که اسپرم در صورت عدم وجود کلسیم خارج سلولی قادر به انجام هیچ یک از این عملکردهای مهم نیست، کموتاکسی اسپرم نسبت به تخمک‌ها یک پدیده گسترده است که در بیشتر اشکال زندگی از گیاهان پایین‌تر تا پستانداران رخ می‌دهد و نقش مهمی در اطمینان از لقاح بازی می‌کند (41). هجوم کلسیم از طریق کانال‌های کلسیم غشاء پلاسمایی اسپرم برای واکنش آکروزوم در مجاورت تخمک و نقش اساسی در واسطه بودن باروری اسپرم دارد. رابطه کمی بین سطح کلسیم داخل سلول اسپرم و تحرک اسپرم هنوز بحث برانگیز است (44). بر اساس مشاهدات مندرج در تصویر 5 میزان مالون‌دی‌آلدهید تیمارهای آزمایشی در مقایسه با تیمار شاهد از نظر عددی بیشتر است که این هم با توجه به افزایش تحرک امری دور از انتظار نبود ولی از لحاظ آماری تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد که این امر خود نگرانی ناشی از بالا رفتن میزان رادیکال‌های آزاد را به دلیل افزایش فعالیت بر طرف می‌کند.

نتیجه گیری نهایی: به‌نظر می‌رسد همانند آنچه در ابتدای انجام مطالعه حاضر انتظار می‌رفت یکی از دلایل کاهش تحرک اسپرم در شرایطی که سایر مواد مورد نیاز برای حفظ پایداری اسپرم فراهم باشد یون‌ها و ترکیبات دخیل در انجام حرکت و ادامه‌دار بودن آن است (10). که در این میان براساس مطالعات صورت گرفته بر روی مکانیسم عمل حرکت که در آن پروتئین‌های حرکتی لازم برای انجام حرکات انقباضی مشخص شد که یون کلسیم یکی از مهم‌ترین کاتیون‌های مورد نیاز می‌باشد و اهمیت وجود آن را می‌توان بر این اساس بیان کرد که در غشاء اسپرم کانال‌های مخصوص برای عبور کلسیم وجود دارد (18). آنچه از مطالعه حاضر استنباط می‌شود اثر بهبود دهندگی ترکیبات کلسیمی بر جنبایی است که تمام تیمارها به‌جز سطح 56/0 کلسیمافور باعث افزایش معنی‌دار این فراسنجه نسبت به تیمار شاهد شد. پس می‌توان گفت که بخشی از کاهش کیفیت اسپرم در رقیق کننده‌های مورد استفاده به دلیل کم شدن بعضی از یون‌های مورد نیاز برای فعالیت اسپرم ایجاد می‌شود.

سپاسگزاری

مطالعه حاضر نتیجه انجام پایان نامه کارشناسی ارشد گروه علوم دامی دانشکده کشاورزی دانشگاه کردستان می‌باشد که بودجه آن از محل اعتبارات پژوهشی دانشگاه کردستان تأمین شده است. نویسندگان این مقاله از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه کردستان، صمیمانه سپاسگزاری می‌نمایند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

References

  1. Sharideh H, Zhandi M, Zenioaldini S, Zaghari M, Sadeghi M. The effect of coenzyme Q10 on rooster semen preservation in cooling condition. Theriogenology. 2019; 129: 103-9. doi: 1016/j.theriogenology.2019.02.028 PMID: 30831340
  2. Kranis A, Gheyas AA, Boschiero C, Turner F, Yu L, Smith S, Talbot R, Pirani A, Brew F, Kaiser P, Hocking PM. Development of a high density 600K SNP genotyping array for chicken. BMC genomics. 2013; 14: 1-3. doi: 1186/1471-2164-14-59 PMID: 23356797
  3. Vizcarra JA, Kirby JD, Kreider DL. Testis development and gonadotropin secretion in broiler breeder males. Poult Sci. 2010; 89: 328-34. doi: 3382/ps.2009-00286 PMID: 20075286
  4. Boz MA, Baş H, Sarica M, Erensoy K. The effects of natural mating and artificial insemination on reproductive traits of 1-and 2-year-old domestic Turkish geese. Vet Res Commun. 2021; 45: 211-21. doi: 1007/s11259-021-09802-6 PMID: 34089129
  5. Mphepya LC, van Rensburg WJ, Mpofu TJ, Mtileni BJ, Nephawe KA. Influence of male–male competition on reproductive performance and mortality of broiler breeders following intra-spiking. Poult Sci. 2019; 98: 4549-54. doi: 3382/ps/pez273 PMID: 31111931
  6. Akhtar MF, Shafiq M, Ali I. Improving gander reproductive efficacy in the context of globally sustainable goose production. Animals. 2021; 12: 44. doi: 3390/ani12010044 PMID: 35011150
  7. Vasicek J, Kuzelova L, Kulikova B, Chrenek P. Effect of diluent and storage time on sperm characteristics of rooster insemination doses. Avian Biol Res. 2015; 8: 41-6. doi: 3184/175815515X14232453836759
  8. Feyzi S, Sharafi M, Rahimi S. Stress preconditioning of rooster semen before cryopreservation improves fertility potential of thawed sperm. Poult Sci. 2018 1; 97(7): 2582-90. doi: 3382/ps/pey067 PMID: 29584912
  9. Sun L, He M, Wu C, Zhang S, Dai J, Zhang D. Beneficial influence of soybean lecithin nanoparticles on rooster frozen–thawed semen quality and fertility. Animals. 2021; 11(6): 1769. doi: 3390/ani11061769 PMID: 34199159
  10. Halliwell B. Dietary polyphenols: good, bad, or indifferent for your health? Cardiovasc Res. 2007; 73: 341-7. doi: 1016/j.cardiores.2006.10.004 PMID: 17141749
  11. Visconti PE, Krapf D, De La Vega-beltrán JL, Acevedo JJ, Darszon A. Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian J Androl. 2011; 13: 395. doi: 1038/aja.2010.69 PMID: 21540868
  12. Alonso CA, Osycka-Salut CE, Castellano L, Cesari A, Di Siervi N, Mutto A, Johannisson A, Morrell JM, Davio C, Perez-Martinez S. Extracellular cAMP activates molecular signalling pathways associated with sperm capacitation in bovines. MHR: Mol Hum Reprod. 2017; 23: 521-34. doi: 1093/molehr/gax030 PMID: 28521061
  13. Neild DN, Gadella BM, Agüero A, Stout TA, Colenbrander B. Capacitation, acrosome function and chromatin structure in stallion sperm. Anim Reprod Sci. 2005; 89: 47-56. doi: 1016/j.anireprosci.2005.06.017 PMID: 16054782
  14. Yanagimachi R. Mammalian sperm acrosome reaction: where does it begin before fertilization? Biol Reprod. 2011; 85: 4-5. doi: 1095/biolreprod.111.092601 PMID: 21490244
  15. Ruiz-Díaz S, Grande-Pérez S, Arce-López S, Tamargo C, Olegario Hidalgo C, Pérez-Cerezales S. Changes in the cellular distribution of tyrosine phosphorylation and its relationship with the acrosomal exocytosis and plasma membrane integrity during in vitro capacitation of frozen/thawed bull spermatozoa. Int J Mol Sci. 2020; 21: 2725. doi: 3390/ijms21082725 PMID: 32326382
  16. Sangani AK, Masoudi AA, Torshizi RV. Association of mitochondrial function and sperm progressivity in slow-and fast-growing roosters. Poult Sci. 2017; 96: 211-9. doi: 3382/ps/pew273 PMID: 27591282
  17. Lishko PV, Kirichok Y, Ren D, Navarro B, Chung JJ, Clapham DE. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annu Rev Physiol. 2012; 74: 453. doi: 1146/annurev-physiol-020911-153258 PMID: 22017176
  18. Quill TA, Wang D, Garbers DL. Insights into sperm cell motility signaling through sNHE and the CatSpers. Mol Cell Endocrinol. 2006; 250: 84-92. doi: 1016/j.mce.2005.12.031 PMID: 16413670
  19. Smith EF. Regulation of flagellar dynein by calcium and a role for an axonemal calmodulin and calmodulin-dependent kinase. Mol Biol Cell. 2002; 13: 3303-13. doi: 1091/mbc.e02-04-0185 PMID: 12221134
  20. Brokaw CJ, Luck DJ. Bending patterns of Chlamydomonas flagella: III. A radial spoke head deficient mutant and a central pair deficient mutant. Cell Motil. 1985; 5: 195-208. doi: 1002/cm.970050303 PMID: 4005942
  21. Yang P, Diener DR, Yang C, Kohno T, Pazour GJ, Dienes JM, Agrin NS, King SM, Sale WS, Kamiya R, Rosenbaum JL. Radial spoke proteins of Chlamydomonas flagella. J Cell Sci. 2006; 119: 1165-74. doi: 1242/jcs.02811 PMID: 16507594
  22. . Mizuno K, Padma P, Konno A, Satouh Y, Ogawa K, Inaba K. A novel neuronal calcium sensor family protein, calaxin, is a potential Ca2+‐dependent regulator for the outer arm dynein of metazoan cilia and flagella. Biol Cell. 2009; 101: 91-103. doi: 1042/BC20080032 PMID: 18620543
  23. Schlingmann K, Michaut MA, McElwee JL, Wolff CA, Travis AJ, Turner RM. Calmodulin and CaMKII in the sperm principal piece: Evidence for a motility‐related calcium/calmodulin pathway. J Androl. 2007; 28: 706-16. doi: 2164/jandrol.106.001669 PMID: 17460096
  24. . Olson SD, Fauci LJ, Suarez SS. Mathematical modeling of calcium signaling during sperm hyperactivation. Mol Hum Reprod. 2011; 17: 500-10. doi: 1093/molehr/gar040 PMID: 21606121
  25. . Costello S, Michelangeli F, Nash K, Lefievre L, Morris J, Machado-Oliveira G, Barratt C, Kirkman-Brown J, Publicover S. Ca2+-stores in sperm: their identities and functions. Reproduction. 2009; 138: 425. doi: 1530/REP-09-0134 PMID: 19542252
  26. . Bajpai M, Doncel GF. Involvement of tyrosine kinase and cAMP-dependent kinase cross-talk in the regulation of human sperm motility. Reproduction. 2003 1; 126(2): 183-95. doi: 1530/rep.0.1260183 PMID: 12887275
  27. Naresh S, Atreja SK. The protein tyrosine phosphorylation during in vitro capacitation and cryopreservation of mammalian spermatozoa. Cryobiology. 2015; 70: 211-6. doi: 1016/j.cryobiol.2015.03.008 PMID: 25828199
  28. Colás C, Grasa P, Casao A, Gallego M, Abecia JA, Forcada F, Cebrián-Pérez JA, Muiño-Blanco T. Changes in calmodulin immunocytochemical localization associated with capacitation and acrosomal exocytosis of ram spermatozoa. Theriogenology. 2009; 71(5): 789-800. doi: 1016/j.theriogenology.2008.10.003 PMID: 19081128
  29. Peris-Frau P, Martín-Maestro A, Iniesta-Cuerda M, Sánchez-Ajofrín I, Cesari A, Garde JJ, Villar M, Soler AJ. Cryopreservation of ram sperm alters the dynamic changes associated with in vitro capacitation. Theriogenology. 2020 15; 145: 100-8. doi: 1016/j.theriogenology.2020.01.046 PMID: 32007635
  30. Meseguer M, Garrido N, Martínez-Conejero JA, Simón C, Pellicer A, Remohí J. Relationship between standard semen parameters, calcium, cholesterol contents, and mitochondrial activity in ejaculated spermatozoa from fertile and infertile males. J Assist Reprod Genet. 2004; 21(12): 445-51. doi: 1007/s10815-004-8761-7 PMID: 15704520
  31. Łukaszewicz E, Jerysz A, Partyka A, Siudzińska A. Efficacy of evaluation of rooster sperm morphology using different staining methods. Res Vet Sci. 2008; 85(3): 583-8. doi: 1016/j.rvsc.2008.03.010 PMID: 18486956
  32. Masoudi R, Sharafi M, Pourazadi L. Improvement of rooster semen quality using coenzyme Q10 during cooling storage in the Lake extender. Cryobiology. 2019 1; 88: 87-91. doi: 1016/j.cryobiol.2019.03.003 PMID: 30857955
  33. Ortatatli M, Ciftci MK, Tuzcu M, Kaya A. The effects of aflatoxin on the reproductive system of roosters. Res Vet Sci. 2002; 72(1): 29-36. doi: 1053/rvsc.2001.0516 PMID: 12002635
  34. Qazi IH, Angel C, Yang H, Zoidis E, Pan B, Wu Z, Ming Z, Zeng CJ, Meng Q, Han H, Zhou G. Role of selenium and selenoproteins in male reproductive function: a review of past and present evidences. Antioxidants. 2019; 8(8): 268. doi: 3390/antiox8080268 PMID: 31382427
  35. Croyle KE, Durrant BS, Jensen T. Detection of oocyte perivitelline membrane-bound sperm: a tool for avian collection management. Conserv Physiol. 2015; 3(1): cou060. doi:1093/conphys/cou060 PMID: 27293681
  36. Bramwell RK, Marks HL, Howarth B. Quantitative determination of spermatozoa penetration of the perivitelline layer of the hen’s ovum as assessed on oviposited eggs. Poult Sci. 1995; 74(11): 1875-83. doi: 3382/ps.0741875 PMID: 8614695
  37. Ammar O, Houas Z, Mehdi M. The association between iron, calcium, and oxidative stress in seminal plasma and sperm quality. Environ Sci Pollut Res Int. 2019; 26(14): 14097-105. doi: 1007/s11356-019-04575-7 PMID: 30852746
  38. Benko F, Ďuračka M, Kováč J, Lukáč N, Tvrdá E. Comparative analysis of the effects of curcumin and epicatechin on the vitality of rooster spermatozoa. Journal of microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 2021 1; 10(6): e3078-. doi: 15414/jmbfs.3078
  39. Asaduzzaman M, Saha A, Akter S, Biswas S, Alam MG, Bari FY. Quality changes in spermatozoa of exotic muzaffarnagari cross-breed ram semen during the stages of frozen production. Online J Anim Feed Res. 2021; 11(6): 206-12. doi: 51227/OJAFR.2021.30
  40. Jueraitetibaike K, Ding Z, Wang DD, Peng LP, Jing J, Chen L, Ge X, Qiu XH, Yao B. The effect of vitamin D on sperm motility and the underlying mechanism. Asian J Androl. 2019; 21(4): 400. doi: 4103/aja.aja_105_18. PMID: 30618415
  41. Nguyen TM, Duittoz A, Praud C, Combarnous Y, Blesbois E. Calcium channels in chicken sperm regulate motility and the acrosome reaction. FEBS J. 2016; 283(10): 1902-20. doi: 1111/febs.13710 PMID: 26990886
  42. Espinal-Enríquez J, Priego-Espinosa DA, Darszon A, Beltrán C, Martínez-Mekler G. Network model predicts that CatSper is the main Ca2+ channel in the regulation of sea urchin sperm motility. Sci Rep. 2017; 26; 7(1): 1-4. doi: 1038/s41598-017-03857-9 PMID: 28652586
  43. Siudzińska A, Łukaszewicz E. Effect of semen extenders and storage time on sperm morphology of four chicken breeds. J Appl Poult Res. 2008; 17(1): 101-8. doi: 3382/japr.2007-00048
  44. Puga Molina LC, Luque GM, Balestrini PA, Marín-Briggiler CI, Romarowski A, Buffone MG. Molecular basis of human sperm capacitation. Front Cell Dev Biol. 2018; 6: 72. doi: 3389/fcell.2018.00072 PMID: 30105226



Journal of Veterinary Research
Volume 77, Issue 4
December 2023
Pages 229-238

Files

Share

How to cite

Statistics