A Preliminary Investigation of the Haemoproteus Infection in Domestic Pigeons of Torkaman County, Iran by Microscopic and Molecular Methods

Document Type : Parasitology & Parasitic Diseases

Authors

1 Young Researchers Club, Shabestar branch, Islamic Azad University, Shabestar, Iran

2 Department of Pathobiology, Malekan Branch, Islamic Azad University, Malekan, Iran

3 Department of Microbiology, Islamic Azad University, Shabestar Branch, Faculty of Veterinary Medicine, Shabestar, Iran

Abstract

BACKGROUND: The protozoan Haemoproteus belongs to the Phylum Apicomplexa, Class Sporozoa, and Order Haemosporina. Avian haemosporidian are protozoan parasites that use birds as hosts around the world. Many species of wild and domestic doves are natural hosts of different species of Haemoproteus. Blood-sucking arthropods are the main vectors of these blood parasites.
OBJECTIVES: The aim of this study was the microscopic and molecular investigation of the protozoan Haemoproteus columbae in the blood of infected pigeons in Torkaman County, Iran.
METHODS: Blood samples and tubes containing ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) anticoagulant were collected from 96 domestic pigeons randomly from 14 pigeon lofts and different parts of Torkaman County.
Pigeons were also inspected for infection with the host-vector Pseudolynchia canariensis. In the next step, blood smears were stained with Giemsa and examined microscopically. Also, blood tubes containing EDTA were tested by PCR method on the cytochrome b gene.
RESULTS: Microscopic and molecular examination of peripheral blood showed that 62 (64.58 %) and 73 (76.04 %) of the investigated pigeons were contaminated, respectively. Of the 62 infected pigeons infected with the Haemoproteus, 28 pigeons (66.66 %) were male, and 34 (62.96 %) were female. Also, the infestation with Pseudolynchia canariensis was observed in 4 (28.57 %) pigeon lofts.
CONCLUSIONS: The preliminary investigation shows the high rate of Haemoproteus infection in pigeons in Torkaman County. Further studies to determine the prevalence and accurate identification of the species infecting pigeons in this region require PCR testing and sequencing of infected blood samples.

Keywords

Main Subjects

Full Text

مقدمه

انگل هموپروتئوس متعلق به شاخه آپی کمپلکسا، رده اسپوروزوآ و راسته هموسپورینا می‌باشد. این تک یاخته در بین هموسپوریدیای پرندگان (لوکوسیتوزئون، پلاسمودیوم، هموپروتئوس و فالیسیا) بیشترین جنس را به خود اختصاص داده است (1).

بندپایان خونخوار ناقل عمده این انگل‌های خونی می‌باشند (2). مراحل غیر جنسی و جنسی هموسپوریدیای پرندگان به ترتیب در بدن میزبان پرنده و ناقل طی می‌شود (3). بسیاری از گونه‌های کبوترهای وحشی و اهلی و قمری میزبان طبیعی گونه‌های مختلف هموپروتئوس می‌باشند (4). گونه‌های هموپروتئوس از طریق گزش پشه‌های ریز کولیکوئیده، سراتوپوگونیده و مگس هیپوبوسیده منتقل می‌شوند (5). ناقل بندپای هموپروتئوس در کبوترهای ایران، مگس پسودولینشیا کانارنسیس Pseudolynchia canariensis تعیین شده است (6).

اسپوروزوآیت‌های انگل طی خون‌خواری پشه به پرنده منتقل می‌شود، سپس شیزونت‌های نسل اول و دوم در بدن میزبان ایجاد می‌شود. شیزونت‌های نسل دوم انگل هموپروتئوس در طحال، کبد و ریه تشکیل شده و گامتوسیت‌ها در داخل گلبول‌های قرمز به صورت ساختارهای دمبلی شکل ظاهر می‌شوند. این انگل بیشتر در کبوترهای جوان کشنده است و در پرندگان بالغ غیر بیماریز‌است (7، 8).

مطالعات مختلفی در زمینه بررسی هموپروتئوس در نقاط مختلف جهان و ایران انجام شده است. مطالعات قبلی بر اساس منطقه نمونه‌برداری و روش‌های تشخیص، میزان آلودگی به هموپروتئوس را بین 0 تا 100 درصد در گونه‌های پرندگان در سراسر جهان نشان داده است (9). میزان آلودگی به هموپروتئوس در ایران به میزان 8/6 تا 88 درصد گزارش شده است (10-12).

Ghaemitalab و همکاران در سال 2021، مطالعه‌ای را بر روی 237 پرنده از مناطق مختلف جنوب و جنوب شرقی ایران با بررسی ملکولی بر روی ژن سیتوکروم b براساس پرایمرهای اختصاصی انجام دادند و نشان دادند که 1/51 درصد از این پرندگان آلوده به هموپروتئوس می‌باشند (13).

همچنین در بررسی انجام شده توسط  Nouraniو همکاران در سال 2021 در پرندگان ایران میزان آلودگی به هموپروتئوس در کبوترها با آنالیز مولکولی 36/22 درصد و با روش میکروسکوپی 76/17 درصد گزارش شده است (9).

Tabaripour و همکاران در سال 2017 طی مطالعه خود در استان مازندران، میزان آلودگی در کبوترهای خانگی را با روش میکروسکوپی 33/11 درصد تعیین کردند و بررسی مولکولی نشان داد همه نمونه‌های هموپروتئوس از گونه کولومبه بوده ‌است (14).

اطلاعات موجود نشان می‌دهد که استفاده از توالی‌های میتوکندریایی ابزار مناسبی برای تشخیص گونه‌های هموپروتئوس فراهم می‌کند (15).

در شهرستان ترکمن تاکنون هیچ‌گونه مطالعه‌ای درباره آلودگی هموپروتئوس در کبوترها صورت نگرفته است. بنابراین هدف از مطالعه حاضر تعیین میزان آلودگی کبوترهای شهرستان ترکمن با دو روش بررسی میکروسکوپی و بررسی مولکولی بود.

مواد وروش کار

جمع‌آوری نمونه: از تعداد ۹۶ قطعه کبوتر اهلی به صورت تصادفی طی ماه‌های مهر تا اسفند سال ۱۳۹8 از نقاط مختلف شهرستان ترکمن، پس از تعیین جنسیت آن‌ها، خونگیری به عمل آمد و همچنین قسمت‌های مختلف بدن آن‌ها از نظر آلودگی به پسودولینشیا کانارنسیس مورد ارزیابی قرار گرفت. برای خونگیری، 1 سی سی خون از ورید زیر بال کبوترها با استفاده از سرنگ انسولین اخذ شد. ابتدا یک قطره از خون گرفته شده به منظور تهیه گسترش خونی مورد استفاده قرار گرفت و مابقی آن بلافاصله به لوله حاوی ماده ضدانعقاد EDTA انتقال داده شد و پس از درج کد مربوطه، نمونه‌های خون در شرایط خنک به آزمایشگاه منتقل شد و تا زمان انجام آزمایشات مولکولی در فریزر ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. همچنین در مطالعه حاضر آلودگی کبوترخانه‌ها به مگس پسولینشیا مورد ارزیابی قرار گرفت.

بررسی‌های میکروسکوپی: گسترش‌های خونی تهیه شده با استفاده از متانول، به مدت 1 دقیقه تثبیت شدند، سپس به وسیله رنگ گیمسا (شرکت MERCK) رقت1:20 با محلول بافر فسفاته تهیه شده 8/6pH  و به مدت 30-25 دقیقه رنگ‌آمیزی گردیدند و پس از شستشو با آب و خشک شدن در جریان هوای آزمایشگاه به وسیله میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 100 مورد مشاهده و بررسی قرار گرفتند.

بررسی‌های مولکولی (استخراج DNA از نمونه‌های خون): به منظور استخراج DNA ژنومی از تمام نمونه‌های خون اخذ شده، از کیت استخراج DNA ژنومی (سیناکلون، ایران) استفاده گردید. روند استخراج بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده کیت انجام ‌گرفت.

تکثیر بخشی از ژن سیتوکروم b به روش PCR: تکثیر بخشی از ژن سیتوکروم b به روش PCR و با استفاده از پرایمری که قبلاً توسط Bensch و همکاران در سال ۲۰۰۰ (16) طراحی شده بود، با کمی تغییر انجام‌ گرفت (جدول ۱). اندازه فرآورده‌ حاصل از تکثیر توسط مارکر bP plus ۱۰۰ (سیناژن، ایران) مشخص گردید. در این روش، نمونه‌های مثبت واجد باندی به میزان bp 617 می‌باشند. در مطالعه حاضر جهت کنترل مثبت، از مقایسه اندازه باندهای به دست آمده در مطالعه Bensch و همکاران در سال 2000 و یکسان بودن آن‌ها با اندازه نمونه‌های مثبت و برای کنترل منفی از آب مقطر به جای DNA استفاده گردید.

نتایج

طبق بررسی‌های انجام شده با روش میکروسکوپی، نتایج نشان داد که از ۹۶ نمونه خون جمع‌آوری شده از کبوترهای خانگی شهرستان ترکمن، تعداد ۶۲ (58/64 درصد) عدد از آن‌ها آلوده به تک‌یاخته هموپروتئوس بودند که از این تعداد 28 کبوتر (66/66 درصد) نر و تعداد 34 (96/62 درصد) ماده بودند (جدول 2). در گسترش خونی، گامتوسیت‌های هموپروتئوس در داخل گلبول‌های قرمز مشاهده شد (تصویر 1).

در مجموع ۹۶ نمونه خون مورد استخراج DNA ژنومی قرار گرفت و ژن سیتوکروم b با استفاده از روش واکنش رنجیره‌ای پلیمراز (PCR) تکثیر داده شد. تعداد ۷۳ نمونه واکنش مثبت در آزمایش PCR نشان دادند (تصویر 2)، تعداد ۱۱ نمونه مثبت در آزمایش PCR در آزمایش میکروسکوپی فاقد آلودگی گامت در گلبول‌های قرمز بودند. همچنین از 14 کبوترخانه مورد بررسی، تعداد 4 (57/28 درصد) کبوترخانه، آلوده به مگس پسودو لنشیا کانارانسیس بودند.

بحث

در مطالعه حاضر، هر دو بررسی میکروسکوپی و مولکولی جهت شناسایی دقیق تک‌یاخته هموپروتئوس انجام شد و نتایج به دست آمده از بررسی‌های میکروسکوپی و روش PCR نشان داد که به ترتیب ۵۸/۶۴ و ۰۴/۷۶ درصد از نمونه‌ها آلوده به تک‌یاخته هموپروتئوس بودند. مطالعه Nematollahi و همکاران در سال 2012 در اصفهان، نشان داد که از تعداد 100 کبوتر مورد آزمایش با روش میکروسکوپی، تعداد 62‌ (62 درصد) عدد آلوده به هموپروتئوس بودند (17).

در مطالعه Tavassoli و همکاران در سال 2018 در استان‌های شمال‌غرب و غرب کشور، میزان آلودگی کبوترها به هموپروتئوس با روش میکروسکوپی و مولکولی به ترتیب 97/13 درصد و 73/24 درصد گزارش گردیده است (18).

همچنین در بررسیBahrami  و همکاران در سال2020، 2/34 درصد کبوترها آلوده به هموپروتئوس، ماکرو و میکروگامتوسیت را در داخل گلبول‌های قرمز نشان دادند، در حالی‌که با روش Semi-nested PCR میزان آلودگی 8/63 درصد تعیین گردید (19). مطالعات Samani و همکاران در سال 2013، نشان داد از 100 کبوتر مورد آزمایش، 5/37 درصد کبوترهای نر و 5/37 درصد کبوترهای ‌ماده آلوده به هموپروتئوس بودند و ارتباط معنی‌داری بین جنسیت کبوتر و میزان آلودگی انگلی یافت نشد (20). همچنین مگس پسودولینشیا کانارنسیس از 57/28 درصد کبوترخانه‌ها و در مجموع از 36 درصد کبوترها جدا گردید. در مطالعات صورت گرفته در مناطق مختلف ایران، میزان آلودگی کبوترها به مگس پسودولینشیا کانارنسیس از 3/13 درصد تا 72/63 درصد گزارش گردیده است (11، 12، 20، 21).

 این تفاوت‌ در میزان آلودگی عامل و ناقل بیماری احتمالاً ناشی از عوامل مختلفی مانند زیستگاه جغرافیایی، شرایط آب و هوایی، سن، تغذیه، درمان و یا عدم درمان ضد انگلی و جمعیت ناقلین این انگل می‌باشد (22). Gomes و همکاران در سال 2020، نشان دادند که میزان آلودگی به هموپروتئوس در مناطق با رطوبت بالا بسیار بیشتر از مناطق با رطوبت پایین می‌باشد (23).

نتیجه‌گیری نهایی: بر اساس نتایج به دست آمده از مطالعه حاضر، می‌توان نتیجه گرفت که گونه‌های تک‌یاخته هموپروتئوس در میان کبوترها در شهرستان ترکمن شایع می‌باشد. رعایت اصول بهداشتی در نگهداری کبوترها و نیز درمان ضد انگل‌های خارجی و خونی کبوترها در کاهش میزان شیوع انگل‌های خونی مؤثر خواهد بود. مطالعات بیش‌تر جهت تعیین دقیق گونه‌های آلوده‌کننده کبوترها در این منطقه و میزان توزیع آن‌ها در میان میزبانان و ناقلین آن‌ها به روش مولکولی در شهرستان ترکمن لازم و ضروری است.

 

 

سپاسگزاری

بدین‌وسیله از همکاری و مساعدت‌های باشگاه پژوهشگران جوان و کارشناسان آزمایشگاه انگل‌شناسی دانشگاه آزاد واحد شبستر که در انجام مطالعه حاضر ما را یاری دادند کمال تشکر و سپاسگزاری را داریم.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

References

  1. Valkiūas G. Avian Malaria Parasites and Other Haemosporidia. 1st ed. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA; 2005.
  2. Clark NJ, Drovetski SV, Voelker G. Robust geographical determinants of infection prevalence and a contrasting latitudinal diversity gradient for haemosporidian parasites in Western Palearctic birds. Mol Ecol. 2020;29(16):3131-43. doi: 10.1111/mec.15545
  3. Valkiūnas G, Palinauskas V, Križanauskienė A, Bernotienė R, Kazlauskienė R, Iezhova TA. Further observations on in vitro hybridization of hemosporidian parasites: patterns of ookinete development in Haemoproteus spp. J Parasitol. 2013;99(1):124-36. doi: 10.1645/GE-3226.1
  4. Nourani L, Djadid ND, Rabiee K, Mezerji MS, Shakiba M, Bakhshi H, et al. Detection of haemosporidian parasites in wild and domestic birds in northern and central provinces of Iran: Introduction of new lineages and hosts. Int J Parasitol Parasites Wildl. 2020;13:203-12. doi: 10.1016/j.ijppaw.2020.10.001 PMID: 33209581
  5. Bukauskaitė D, Žiegytė R, Palinauskas V, Iezhova TA, Dimitrov D, Ilgūnas M, et al. Biting midges (Culicoides, Diptera) transmit Haemoproteus parasites of owls: evidence from sporogony and molecular phylogeny. Parasit Vectors. 2015;8(1):1-11. doi: 10.1186/s13071-015-0910-6
  6. Pirali-Kheirabadi K, Dehghani-Samani A, Ahmadi-Baberi N, Najafzadeh V. A first report of infestation by Pseudolynchia canariensis in a herd of pigeons in Shahrekord (Southwest of Iran). J arthropod borne dis. 2016;10(3):424-8. PMID: 27308301
  7. Varshney JP, Deshmukh VV, Chaudhary PS. Pseudomalaria (Haemoproteus columbae) in pigeon shelter. Intas Polivet. 2014;15(1):176-7.
  8. Maharana BR, Kumar B. Pseudomalaria in a domestic pigeon: a case report. J Parasit Dis. 2017;41(1):295-7. doi: 10.1007/s12639-016-0764-7 PMID: 28316429
  9. Nourani L, Baghkheirati AA, Zargar M, Karimi V, Djadid, ND. Haemoproteosis and avian malaria in Columbidae and Corvidae from Iran. Vet Med Sci. 2021;7(5):2043-50. doi: 10.1002/vms3.549 PMID: 34240581
  10. Mirzaei F, Siyadatpanah A, Norouzi R, Pournasir S, Nissapatorn V, Pereira MDL. Blood parasites in domestic birds in central Iran. Vet Sci. 2020;7(3):126. doi: 10.3390/vetsci7030126 PMID: 32899724
  11. Sadeghi-Dehkordi Z, Azami S, Gharekhani J, Yousefi M, Gerami-Sadeghian A, Sadeghi D, et al. Ecto and endo-parasites of domestic pigeons (Columba livia) in Hamadan, west part of Iran. Mun Ent Zool. 2019;14(2):489-95.
  12. Chaechi-Nosrati M-R, Eslami A, Rahbari S, Houshmand E, Yousefi A. The survey of parasitic infections of wild pigeons (Columba livia) in Lahijan city, Guilan, Iran. Comp Clin Path. 2018;27:1405-8. doi: 10.1007/s00580-018-2779-1
  13. Ghaemitalab V, Mirshamsi O, Valkiūnas G, Aliabadian M. Prevalence and Genetic Diversity of Avian Haemosporidian Parasites in Southern Iran. Pathogens. 2021;10(6):645. doi: 10.3390/pathogens10060645 PMID: 34071073
  14. Tabaripour R, Youssefi MR, Rahbari S, Arghavan M. Molecular identification of Haemoproteus in domestic pigeons (Colombia livia domestica) in Mazandaran province. J Vet Res. 2017; 72(4):397-402. doi: 10.22059/JVR.2018.217312.2532 (In Persian)
  15. Santiago-Alarcon D, Outlaw DC, Ricklefs RE, Parker PG. Phylogenetic relationships of haemosporidian parasites in New World Columbiformes, with emphasis on the endemic Galapagos dove. Int J Parasitol. 2010;40(4):463-70. doi: 10.1016/j.ijpara.2009.10.003 PMID: 19854196
  16. Bensch S, Stjernman M, Hasselquist D, Hannson B, Westerdahl H, Pinheiro RT. Host specificity in avian blood parasites: a study of Plasmodium and Haemoproteus mitochondrial DNA amplified from birds. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 2000;267(1452):1583-9. doi: 10.1098/rspb.2000.1181 PMID: 11007335
  17. Nematollahi A, Ebrahimi M, Ahmadi A, Himan M. Prevalence of Haemoproteus columbae and Trichomonas gallinae in pigeons (Columba domestica) in Isfahan, Iran. J Parasit Dis. 2012;36(1):141-2. doi: 10.1007/s12639-011-0082-z PMID: 23542461
  18. Tavassoli M, Esmaeilnejad B, Malekifard F, Mardani K. PCR-RFLP detection of Haemoproteus spp. (Haemosporida: Haemoproteidae) in pigeon blood samples from Iran. Bulg J Vet Med. 2018;21:429-35. doi: 10.15547/bjvm.2014
  19. Bahrami S, Esmaeilzadeh S, Alborzi AR, Niknejad S. Prevalence and new histopathological aspects of Haemoproteus spp. in pigeons from Iran. J Hell Vet Med Soc. 2020;71(1):1925-34. doi: 10.12681/jhvms.22929
  20. Samani AD, Kheirabadi KP, Samani AD. Prevalence and rate of parasitemia of haemoproteus columbae in columba iiviadomesticain southwest of Iran. Iran J Parasitol. 2013;8(4):641-44. PMID: 25516748
  21. Fakhar M, Kalani H, Rahimi-Esboei B, Armat S. Hemoprotozoa in free-ranging birds from rural areas of Mazandaran Province, northern Iran. Comp Clin Path. 2013;22(3):509-12. doi: 10.1007/s00580-012-1441-6
  22. Tietz MS, Marinho DE, Cuadros R, Jardim DA, Silva C, Baldo M. Parasites of pigeons (Columba livia) in urban areas of lages, Southern Brazil. Parasitol latinoam. 2007;62(3-4):183-7. doi: 10.4067/S0717-77122007000200014
  23. Gomes RC, Teixeira BL, Gusmão CL, Fernandes AM. Humidity effects on avian blood parasites in the Caatinga of Brazil. Ornithol Res. 2020;28:98-104. doi: 10.1007/s43388-020-00009-y
Journal of Veterinary Research
Volume 78, Issue 2
June 2023
Pages 77-83

Files

Share

How to cite

Statistics