Design and Molecular Docking Study of Recombinant Chimera Protein HBHA-Omp28 for Developing an Efficient Vaccine Against Salmonella typhimurium

Document Type : Microbiology and Immunology

Authors

1 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine, Lorestan University, Khorramabad, Iran

2 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Lorestan University, Khorramabad, Iran

3 Department of Animal Sciences, Faculty of Agriculture, Lorestan University, Khorramabad, Iran

4 Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Lorestan University, Khorramabad, Iran

Abstract

BACKGROUND: Salmonellosis is a dangerous disease that can threaten the health of humans and animals. This disease can lead to economic losses annually; therefore, many studies have been conducted to prevent this disease.
OBJECTIVES: The current study aims to design a recombinant chimera protein HBHA-Omp28 as a vaccine against Salmonella typhimurium.
METHODS: The nucleotide and amino acid sequences of Omp28 and HBHA proteins were first extracted from the NCBI database. Then, the recombinant chimera of HBHA-Omp28 was bioinformatically assembled using a rigid linker. Epitope prediction of T and B cells, antigenicity, allergenicity, and physicochemical features assessments of HBHA-Omp28 were done using Immune Epitope Database (IEDB), ABCpred, VaxiJen, AllerTOP and ProtParam online servers, respectively. To assess the secondary and tertiary structures, the Self-Optimized Prediction Method with Alignment (SOPMA) and the Iterative Threading ASSEmbly Refinement (I-TASSER) server were used, respectively. Molecular docking between recombinant chimera and TLR4/MD2 receptor was assessed by ClusPro server. Finally, after codon optimization of nucleotide sequence of recombinant chimera to express in Escherichia Coli k-12 strain, the cloning of recombinant chimera in pET21-a (+) vector was examined.
RESULTS: The designed recombinant chimera was classified as an antigenic and non-allergenic protein with molecular weight of 34.19 kDa. According to the results of molecular docking study, the HBHA-Omp28 protein was able to bind to TLR4/MD2 receptor using 9 hydrogen bonds. The results of cloning study demonstrated that HBHA-Omp28 successfully cloned into pET21-a (+).
CONCLUSIONS: The designed recombinant chimera can be an appropriate vaccine against salmonella bacteria.

Keywords

Main Subjects

Full Text

مقدمه

امروزه نقش واکسیناسیون در جهت مقابله با انواع بیماری‏های عفونی ضرورتی انکارناپذیر است. واکسن‏ها سبب کاهش میزان مرگ و میر ناشی از بیماری‏های عفونی در جهان می‏شوند و نقش مهمی در کنترل و پیشگیری از بیماری‏های عفونی دارند (1، 2). واکسن‏هایی که عمدتاً مورد استفاده قرار می‏گیرند، شامل پاتوژن‏های زنده ضعیف شده، پاتوژن‏های کشته شده و واکسن‏های زیرواحدی مانند سموم باکتریایی غیرفعال شده می‌باشند. امروزه نسل‏های جدید از انواع واکسن مانند واکسن‏های نوترکیب به منظور ایجاد پاسخ‏های ایمنی قوی و پایدار مورد استفاده قرار می‏گیرند (3، 4). از مزیت‏های واکسن‏های زیرواحدی، کاهش اثرات و واکنش‏هایی است که می‏تواند در صورت استفاده از واکسن‏های زنده یا کشته شده در بدن ایجاد شود (5). واکسن‏های زیرواحدی، برخلاف واکسن‏های زنده ضعیف شده به منظور اثرگذاری بهتر، به ادجوانت نیاز دارند. از جمله مزایای ادجوانت‏ها می‏توان به تولید سریع و طولانی مدت آنتی‏بادی، افزایش تیتر آنتی‏بادی و کاهش دفعات تزریق واکسن اشاره کرد (6). مهم‌ترین عامل محدود کننده استفاده و توسعه واکسن‏های نوترکیب به موضوع ایمنی ادجوانت‏ها بر می‏گردد (7). باکتری سالمونلا جزء خانواده انتروباکتریاسه می‏باشد و به صورت باسیل‏های گرم منفی دیده می‏شود. این جنس باکتری به صورت هوازی یا بی‏هوازی اختیاری فعالیت دارد. سالمونلوزیس از جمله بیماری‏های زئونوز مهم عفونی می‌باشد، عامل آن باکتری سالمونلا است که از مهم‏ترین عوامل ایجاد آلودگی در مواد غذایی به شمار می‏آید (8). امروزه برای باکتری سالمونلا بیشتر از 2400 سروتایپ معرفی شده است که شامل دو گروه عمده سالمونلا انتریکا با شش زیر گروه و سالمونلا بونگوری است. سویه‏های بیماریزا انسانی به طور معمول در گروه انتریکا قرار دارند که به منظور بررسی ایمنی‏زایی سروتیپ‏های سالمونلا ابتدا آزمایش‏های بیوشیمیایی و سرولوژی صورت می‏گیرد (9، 10). یکی از انواع آنتی‏ژن‏های قابل بررسی باکتری سالمونلا جهت تولید واکسن، پروتئین‏های سطحی آن به خصوص پروتئین‏های غشا خارجی می‌باشد، مطالعات نشان داده است که پروتئین غشاء خارجی 28 (Omp28) دارای خاصیت آنتی‏ژنیک می‏باشد، لذا این پروتئین می‏تواند در ساخت واکسن استفاده شود (11). یکی از نکات مهمی که در طول طراحی و ساخت یک واکسن نوترکیب باید به آن توجه شود، اعمال یک ادجوانت مولکولی مناسب می‏باشد. طبق گزارشات انجام شده، یکی از پروتئین‏های سطحی باکتری‏های خانواده مایکوباکتریوم (عامل سل) به‏نام هماگلوتینین چسبنده به هپارین (HBHA) می‏تواند به عنوان ادجوانت مولکولی برای بهبود تأثیرگذاری واکسن در نظر گرفته شود (12). در مطالعه حاضر، یک کایمر نوترکیب بر پایه پروتئین آنتی‏ژنیک Omp28 از باکتری سالمونلا تیفی‏موریوم و ادجوانت مولکولی HBHA از باکتری مایکوباکتریوم بویس طراحی گردید و به عنوان کاندید واکسن علیه سالمونلوز با استفاده از روش‏های بیوانفورماتیکی مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش‏ کار

جمع‏آوری اطلاعات از پایگاه داده‏ها: به منظور انجام مطالعه حاضر، توالی نوکلئوتیدی و آمینو اسیدی مولکول HBHA از باکتری مایکوباکتریوم بوویس و آنتی‏ژن Omp28 از باکتری سالمونلا تیفی‏موریوم، از پایگاه داده NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.goV) استخراج شدند. شماره دسترسی پروتئین HBHA و Omp28 به ترتیب 3/000962NC_ و 104638CP بودند. علاوه بر این فایل pdb مربوط به گیرنده TLR4/MD2 با شماره دسترسی 64Z 2 از پایگاه داده‏های RCSB (https://www.rcsb.org/) استخراج شد.

طراحی کایمر نوترکیب: برای طراحی کایمر نوترکیب متشکل از توالی آمینو‏اسیدی پروتئین‏های Omp28 و HBHA از نرم‏افزار CLC Main WorkBench استفاده شد. بدین منظور ابتدا توالی پروتئین این دو مولکول توسط نرم‏افزار CLC Main WorkBench ورژن 5/5 به دست آمد سپس در کایمر نوترکیب، توالی آمینواسیدی پروتئین HBHA در بالادست (انتهای N) و توالی آمینو اسیدی آنتی‏ژن Omp28 در پایین‏دست (انتهای C) کایمر گنجانده شد. با هدف حفظ فاصله بین دو دومین پروتئینی از یکدیگر و به دنبال آن عملکرد صحیح آن­ها، از لینکر غیرمنعطف EAAAK استفاده شد.

بررسی آنتی‏ژنیسیتی و آلرژن‏زایی کایمر نوترکیب: برای سنجش میزان آنتی‏ژنسیتی و آلرژن‏زایی کایمر نوترکیب HBHA-Omp28، به ترتیب سرورهای VaxiJen (http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen) ورژن 2، وAllerTOP (https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/) ورژن 1 به کار گرفته شدند. برای استفاده از این سرورها توالی اسید‏آمینه‏ای پروتئین نوترکیب مذکور با فرمت FASTA به کار گرفته شد.

پیش بینی اپی توپ­های سلول­های T و B کایمر نوترکیب: با هدف تعیین اپی توپ­های اختصاصی سلول­های B و T موجود در کایمر نوترکیب طراحی شده در مطالعه حاضر، از سرورهای معتبر IEDB (http://tools.iedb.org/) و ABCpred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/index.html) به ترتیب برای پیش بینی اپی توپ­های سلول­های T (MHCI و MHCII) و سلول­های B استفاده شد. لازم به ذکر است که برای استفاده از سرورهای مذکور از توالی اسید آمینه­ای پروتئین کایمر نوترکیب طراحی شده با فرمت FASTA استفاده شد. در ادامه برای ارزیابی بیشتر آنتی ژنسیتی اپی توپ­های به دست آمده، سرور معتبر VaxiJen (dg-pharmfac.net/vaxijen/scripts/VaxiJen_scripts/) با حد آستانه 4/0 مورد استفاده قرار گرفت.

بررسی خواص فیزیکوشیمایی و ساختار دوم کایمر نوترکیب: در مطالعه حاضر برای بررسی خواص فیزیکوشیمایی کایمر نوترکیب، از سرور ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) استفاده شد. شایان ذکر است این سرور توانایی آنالیز خواص فیزیکوشیمایی مهم از قبیل وزن مولکولی، نقطه ایزوالکتریک، شاخص آلفاتیک، شاخص ناپایداری و GRAVY را دارا می‏باشد. همچنین به منظور بررسی ساختار دوم و پیش‏بینی حالت‏های مختلف فضایی (آلفا هلیکس، پیچ‎های تصادفی، صفحات گسترده و پیچ‎های بتا) کایمر نوترکیب HBHA-Omp28 طراحی شده از سرور SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html) استفاده شد.

بررسی ساختار سوم کایمر نوترکیب: در مطالعه حاضر به منظور مدل کردن ساختار سوم کایمر نوترکیب طراحی شده از سرور I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) استفاده شد. سپس ساختار سوم مدل شده برای استفاده در مراحل بعد توسط سرور GalaxyRefine (https://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi/type=REFINE) ریفاین گردید و بهترین مدل ریفاین شده از طریق آنالیز پلات راماچاندران ارائه شده توسط سرور VADAR (http://vadar.wishartlab.com) انتخاب شد. در نهایت بهترین مدل ریفاین شده کایمر HBHA-Omp28 با استفاده از نرم‏افزار PyMol (https://pymol.org) ورژن 4/5/2 رویت‏سازی شد.

بررسی داکینگ مولکولی: بررسی برهمکنش پروتئین-پروتئین بین کایمر HBHA-Omp28 و گیرنده TLR4/MD2، توسط سرور ClusPro (https://cluspro.org/login.php/redir=/queue.php) ورژن 2 انجام شد. به این منظور از فرمت pdb پروتئین TLR4/MD2 به عنوان گیرنده و فایل pdb بهترین مدل ریفاین شده کایمر HBHA-Omp28 که از مراحل قبل به دست آمده‏ بود به عنوان لیگاند، استفاده شد. بهترین مدل داک شده بر اساس بزرگ‌ترین سایز کلاستر و کمترین انرژی انتخاب شد. رویت‏سازی و بررسی طول و تعداد پیوندهای هیدروژنی بین دو دمین مورد مطالعه توسط نرم‏افزار‏های PyMol ورژن 4/5/2 و +LigPlot ورژن 8/2/2 انجام شد.

بهینه سازی کدون‌های بیانی توالی نوکلئوتیدی کایمر نوترکیب: در مطالعه حاضر به منظور بهینه سازی کدون‌های بیانی توالی نوکلئوتیدی کایمر نوترکیب در سیسم بیانی پروکاریوتی E. Coli سویه K--12 از سرور JCat (http://www.jcat.de) استفاده گردید. برای این منظور توالی اولیه در سرور بار‌گزاری شد و علاوه بر بهینه‌سازی کدون‌ها، حدف جایگاه‌های برشی آنزیم‌های محدودالاثر اضافی و جایگاه‌های اتصال ریبوزم پروکاریوتی نیز در دستور کار قرار گرفت.

کلونینگ توالی نوکلئوتیدی کایمر نوترکیب: در مطالعه حاضر امکان کلون شدن توالی نوکلئوتیدی کایمر نوترکیب بین جایگاه برشی دو آنزیم محدودالاثر BamHI و HindII (به ترتیب در انتهای ´5 و ´3) در وکتور بیانی pET21-a(+) با نرم‏افزار Snap Gene ورژن 3/5/1 مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج

طراحی سازه ایمنوژنیک نوترکیب: همان‌طور که در تصویر 1 مشاهده می‏شود، در سازه کایمر نوترکیب از N انتهایی به سمت C انتهایی به ترتیب، توالی پروتئینی ادجوانت مولکولی HBHA از باکتری مایکوباکتریوم، لینکر سخت و غیرمنعطف EAAAK و توالی آمینو‏اسیدی آنتی‏ژن 28 کیلودالتونی غشاء خارجی باکتری سالمونلا تیفی‏موریوم (Omp28) قرار گرفته است. این سازه نوترکیب دارای 313 آمینواسید باقی مانده در ساختار اول خود بود (تصویر 1).

ارزیابی آنتی‏ژنسیتی، آلرژن‏زایی و خواص فیزیکوشیمیایی کایمر نوترکیب: در مطالعه حاضر، نتایج حاصل از سرور معتبر ProtParam نشان داد، وزن مولکولی، نقطه ایزوالکتریک، شاخص آلفاتیک، شاخص ناپایداری و GRAVY سازه نوترکیب طراحی شده HBHA-Omp28 به ترتیب 19/34، 01/6، 13/83، 12/41 و 453/0- بودند. علاوه بر این مشخص شد که نیمه عمر واکسن طراحی شده در پستانداران، مخمر‏ها و باکتری اشریشیاکلی به ترتیب، 30 ساعت، بیشتر از 20 ساعت و بیشتر از 10 ساعت می‏باشد. اطلاعات به دست آمده از سرورهای VaxiJen و AllerTOP ‏نشان داد که سازه مهندسی شده مورد مطالعه (با توجه به امتیاز آنتی‏ژنی63/0و سطح آستانه 4/0) می‏تواند به عنوان یک آنتی‏ژن سبب تحریک سیستم ایمنی شود ولی در عین حال هیچ‌گونه واکنش آلرژنی در بدن ایجاد نمی‏کند.

نتایج پیش بینی اپی توپ­های سلول­های B و T: محتمل‌ترین و قوی‌ترین اپی توپ­های سلول­های گروه T و B که بالاترین امتیاز ارائه شده را به ترتیب توسط سرورهای آنلاین IEDB و ABCpred داشتند انتخاب شدند. در ادامه آنتی ژنسیتی هر یک از اپی توپ‌های انتخاب شده از مرحله قبل مجدد توسط سرور VaxiJen با موفقیت ارزیابی شد و در نهایت از هر گروه دو اپی توپ برتر معرفی گردید (جدول 1).

پیش‏ بینی ساختار دوم و سوم سازه کایمر نوترکیب طراحی شده: همان‌طور که در تصویر 2 نشان داده شده ‏است، نتایج به دست آمده از بررسی پیش‏بینی ساختار دوم به کمک سرور SOPMA مشخص کرد که میزان حضور هر یک از ساختارهای آلفا هلیکس، پیچه‏های تصادفی، صفحات گسترده و پیچ‏های بتا به ترتیب 73/67، 73/21، 99/7 و 56/2 درصد در سازه نهایی می‏باشد. با توجه به داده‏های تصویر 2، ساختار مارپیچ‏های آلفا بیشترین مقدار را در بین ساختارهای پروتئین نوترکیب به خود اختصاص دادند. در ادامه، ساختار سه بعدی سازه نوترکیب مورد مطالعه توسط سرور I-TASSER مدل شد و بهترین فایل pdb با ضریب اطمینان (C-Scor) 73/2- و شاخص RMSD: Aº2/4 ±8/12 انتخاب گردید. بر اساس آنالیزهای راماچاندران در این مدل، 82 درصد از اسیدهای آمینه‏ در ناحیه هسته، 13 درصد از آن‏ها در منطقه مجاز و 1 درصد در منطقه خارج قرار داشتند (تصویر 3). پس از ریفاین کردن این مدل توسط سرور GalaxyRefine و پس از ارزیابی توسط پلات و آنالیزهای راماچاندران، مشخص شد که در مدل سه‏بعدی ریفاین شده نهایی، 91 درصد اسیدهای آمینه‏ در ناحیه هسته، 6 درصد اسیدهای آمینه در منطقه مجاز و 0 درصد از آن‌ها در منطقه خارج قرار داشتند (تصویر 4). در نهایت بهترین مدل ریفاین شده سازه نوترکیب HBHA- Omp28، توسط نرم‏افزار PyMol رویت‏سازی شد (تصویر 5).

داکینگ مولکولی: برای بررسی اتصال مولکولی بین پروتئین نوترکیب و گیرنده اختصاصی TLR4/MD2، از سرور آنلاین ClusPro استفاده شد. نتایج داکینگ نشان داد که HBHA با کمترین انرژی به گیرنده خود متصل شد (تصویر 6). این برهمکنش با 60 عضو خوشه دارای امتیاز مرکز خوشه 8/683- بود. کمترین انرژی این اتصال 3/867- کیلوکالری بر مول محاسبه شد. نرم‏افزارهای +LigPlot و PyMol جهت ارزیابی بیشتر محصول داک شده و برآورد تعداد و طول پیوندهای هیدروژنی مورد استفاده قرار گرفت. طبق مشاهدات ارائه شده در تصویر 7، در طی برهمکنش مولکول HBHA با پروتئین گیرنده مولکولی TLR4/MD2، تعداد 9 پیوند هیدروژنی ایجاد شد. اسیدهای آمینه مؤثر در ایجاد پیوندهای هیدروژنی در جدول 2 ارائه شده است.

بهینه‌سازی کدون‌های بیانی توالی نوکلئوتیدی کایمر نوترکیب: نتایج بهینه‌سازی کدون‌های بیانی توالی نوکلئوتیدی کایمر نوترکیب در سیسم بیانی پروکاریوتی نشان داد درصد GC که توالی اولیه 8/58 درصد بود به 5/50 درصد در توالی بهینه شده تغییر یافت. همچنین شاخص بهینه‌سازی کدون‌ها (CAI) از 31/0 در توالی اولیه به 94/0 در توالی بهینه شده ارتقاء یافت.

کلونینگ توالی نوکلئوتیدی کایمر نوترکیب: نتایج کلونینگ توالی نوکلئوتیدی کایمر نوترکیب نشان داد این توالی می‏تواند در pET21-a(+) به عنوان یک وکتور بیانی در سیستم پروکاریوتی کلون شود (تصویر 8). همان‌طور که در تصویر 8 نمایش داده شده است به جز انتهای ´5 و ´3، هیچ‌گونه جایگاه برشی برای دو آنزیم BamHI و HindIII در طول توالی کلون شده وجود ندارد.

بحث

سالمونلا انتریتیدیس و تیفی‏موریوم شایع‏ترین سروتیپ‏های سالمونلا می‌باشند که باعث بیماری در انسان و حیوانات می‏شوند. شواهد اپیدمیولوژی و باکتریولوژی نشان داد که پرندگان وحشی ممکن است عفونت را به انسان و مرغ انتقال دهند (13). در مناطق شرقی آسیا میزان شیوع گونه‏های سالمونلا در لاشه مرغ معادل 3/8 درصد بیان شد (12). در سال‏های اخیر با توجه به محدودیت‏ واکسن‏های غیرفعال، ایده استفاده از واکسن‏های نسل جدید جهت کنترل بیماری‏های عفونی قوت بیشتری گرفته است. اما نقطه چالش بر‏انگیز واکسن‏های نوترکیب، تولید اندک آنتی‏ژن نوترکیب در میزبان پروکاریوتی می‏باشد. استفاده از ادجوانت‏ مناسب با هدف تحریک 

گسترده سیستم ایمنی می‏تواند این مشکل را برطرف کند (14، 15). مطالعات مختلفی در طی سال‏های گذشته برای تولید واکسن‏های نوین مانند انواع واکسن‏های تحت واحدی، نوترکیب، DNA واکسن‏ها و یا استفاده از ادجوانت‏های مختلف در ساختار واکسن انجام شد (16-18). امروزه طراحی و ساخت واکسن‏های نوترکیب که در تهیه آن‏ها فقط از اجزای ایمن آنتی‏ژنی استفاده می‏شود، بسیار توسعه یافته است. این دستاورد مهم توسط علم بیوانفورماتیک و مهندسی ژنتیک امکان‏پذیر شده است (11، 19، 20). دسترسی به این فناوری از یک سو اجازه تولید واکسن‏های نوترکیب تشکیل شده از آنتی‏ژن‏های پروتئینی را به جای واکسن‏های باکتریایی و ویروسی ضعیف شده و یا غیر فعال را می‏دهد و از سوی دیگر تولید پروتئین نوترکیب را در مقیاس عظیم با کمترین هزینه مقدور ساخته است (21). امروزه مطالعات بیوانفورماتیکی فراوانی در زمینه طراحی و ساخت واکسن‏های نوترکیب صورت گرفته است. اخیراً Shams و همکاران در سال 2019، با استفاده از سه پروتئین ایمنی‏زا یک واکسن چند اپی‏توپی علیه عفونت سالمونلایی طراحی کردند (22). همچنین Forouharmehr و همکاران در سال 2022، با استفاده از علم بیوانفورماتیک، واکسن نوترکیب مبتنی بر اپی‏توپ به همراه ادجوانت مولکولی طراحی کردند که می‏تواند کاندید مناسبی برای جلوگیری از عفونت بابزیوز گاوی محسوب شود (23). بر اساس مطالعه Pandey و همکاران در سال 2018، پروتئین‏های غشاء خارجی 28 باکتری سالمونلا تیفی‏موریوم (Omp28) پتانسیل امیدوارکننده‏ای را به عنوان کاندیدای واکسن ارائه کرده است. این پروتئین با داشتن 108 اسید امینه و همچنین دارا بودن خاصیت اسیدی، قادر به تحریک هر دو نوع ایمنی همورال و سلولی با شاخص آنتی‏ژنی بالا می‏باشد. در نتیجه پروتئین Omp28 یک پروتئین آنتی‏ژنیک محسوب می‏شود (24). طبق گزارشات موجود دامنه آنتی‏ژنیسیتی باید بین 55/0 تا 92/0 باشد تا بتواند سیستم ایمنی را تحریک کند (25، 26). بر اساس نتایج سرور VaxiJen، مشخص شد که سازه مهندسی شده در مطالعه حاضر با امتیاز آنتی‏ژنی 67/0 خاصیت ایمنی‏زایی دارد و سبب تحریک سیستم ایمنی می‏شود. علاوه بر ‏این، بر اساس پارامتر GRAVY می‏توان آبدوست یا آبگریز بودن یک پروتئین را تعیین کرد. به طور کلی یک پروتئین با GRAVY منفی، به عنوان یک پروتئین آبدوست شناخته می‏شود (27). بنابراین پروتئین نوترکیب طراحی شده در این مطالعه با GRAVY، 453/0- آبدوست می‏باشد. از جمله مشاهدات مطالعه حاضر که می‏تواند به عنوان یک دستاورد مهم قلمداد شود، وزن مولکولی سازه طراحی شده است. به طور کلی چنانچه وزن مولکولی پروتئینی کمتر از KDa10 باشد، به دلیل دفع سریع از مجاری کلیوی، ماندگاری کمتری در بدن میزبان موجود زنده دارد. این موضوع می‏تواند به عنوان نقطه ضعف در طراحی سازه‏های مناسب برای ساخت واکسن در نظر گرفته شود (28). نتایج بیوانفورماتیک در مطالعه حاضر نشان داد که وزن مولکولی سازه طراحی شده 19/34KDa بود، لذا می‏توان نتیجه‏گیری کرد که چنین سازه‏ای با وزن مولکولی مذکور در بدن موجود زنده پایداری بیشتری دارد. سرورهای I-TASSER و VADAR جهت مدل‏سازی و ریفاین ساختار سوم سازه استفاده شدند. نتایج حاصل از ریفاین ساختار سوم نشان داد که بخش عمده اسیدهای آمینه (91 درصد) در منطقه هسته قرار گرفته‏اند. لذا می‏توان بیان کرد که واکسن مهندسی شده به خوبی مدل شده است. با توجه به گزارشات موجود، کارکرد واکسن‏های نوترکیب و چند اپی‏توپی با استفاده از لینکر‏های مناسب تضمین می‏شود. همچنین گزارش شده است که لینکر‏ها نقش مهمی در حفظ فضای مناسب بین اجزاء تشکیل‏دهنده یک واکسن را ایفا می‏کنند و نه تنها به ارائه صحیح واکسن به سیستم ایمنی کمک می‏کنند، بلکه از تشکیل ناخواسته ساختار‏های حساسیت‏زا و آلرژیک علیه واکسن جلوگیری می‏کنند (29). طبق نتایج حاصل از نرم‎افزارCLC Main WorkBench ، توالی پروتئینی آنتی‏ژن 28 کیلو دالتونی غشاء خارجی باکتری سالمونلا تیفی‏موریوم (Omp28) در انتهای C و همچنین توالی پروتئینی ادجوانت مولکولی HBHA از باکتری مایکوباکتریوم در انتهای N، از طریق لینکر سخت و غیرمنعطف EAAAK به یکدیگر متصل شدند. همان طور که در قسمت نتایج نشان داده شد شاخص بهینه سازی کدون‌ها (CAI) سازه طراحی شده از 31/0 در توالی اولیه به 94/0 در توالی بهینه شده ارتقاء یافت که نزدیک شدن این شاخص به عدد 1 نشان دهنده این مهم است که اکثر کدون‌های این سازه نوترکیب برای بیان در سیستم پروکاریوتی بهینه شده‌اند. سیستم بیانی پروکاریوتی، سیستمی ارزان قیمت، ایمن و کاربرپسند می‌باشد که به طور گسترده­ای برای تولید پروتئین­های نوترکیب ساده که نیاز به تغییرات پس از ترجمه ندارند استفاده می‌شود (30) نتایج کلونینگ نشان داد، توالی نوکلئوتیدی کایمر نوترکیب در وکتور بیانی pET21-a(+) که مربوط به سیستم بیانی پروکاریوتی است قابل کلون و در نتیجه تحت پروموتر T7 وکتور ذکر شده قابل بیان است.

برهمکنش ادجوانت مولکولی کایمر شده با گیرنده آن می‏تواند تأثیر منفی بر روی واکسن داشته باشد. در نتیجه تعامل بین ادجوانت واکسن و گیرنده آن باید به صورت دقیق ارزیابی شود (17، 27). نتایج داکینگ مولکولی انجام شده با استفاده از سرور ClusPro بیان می‏کند که پروتئین HBHA- Omp28 توانایی اتصال به گیرنده TLR4/MD2 را با حداقل اتلاف انرژی دارد. لذا بر اساس نتایج حاصل، HBHA می‏تواند به عنوان یک ادجوانت مولکولی مناسب در تهیه واکسن‏های نوترکیب استفاده شود.

نتیجه‏گیری نهایی: به ‏طور کلی می‏توان نتیجه‏گیری کرد که پروتئین نوترکیب طراحی شده HBHA- Omp28 با وزن مولکولی 19/34KDa و برهمکنش مناسب با گیرنده اختصاصی خود، کاندید مناسبی به عنوان یک واکسن کارآمد، مؤثر و محرک سیستم ایمنی علیه بیماری سالمونلوز می‏باشد.

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله از حمایت‎های معاونت پژوهشی دانشگاه لرستان برای انجام مطالعه حاضر تشکر و قدرانی می‎نمایند.  

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

References

  1. Anwar E, Goldberg E, Fraser A, Acosta CJ, Paul M, Leibovici L. Vaccines for preventing typhoid fever. Cochrane Database Syst Rev. 2014;(1):1-75. doi: 10.1002/14651858.CD001261.pub3 PMID: 24385413
  2. Plotkin S. History of vaccination. Proc Natl Acad Sci. 2014;111(34):12283-7. doi: 10.1073/pnas.1400472111 PMID: 25136134
  3. Roth JA. Veterinary vaccines and their importance to animal health and public health. Procedia Vaccinol. 2011;(5):127-36. doi: 10.1016/j.provac.2011.10.009 PMID: 32288915
  4. Singh M, T O'Hagan D. Recent advances in veterinary vaccine adjuvants. Int J Parasitol. 2003;33(5-6):469-78. doi: 10.1016/s0020-7519(03)00053-5 PMID: 12782048
  5. Gupta RK, Siber GR. Adjuvants for human vaccines—current status, problems and future prospects. Vaccine. 1995;13(14):1263-76. doi: 10.1016/0264-410x(95)00011-o PMID: 8585280
  6. Meeusen EN, Walker J, Peters A, Pastoret P-P, Jungersen G. Current status of veterinary vaccines. Clin Microbiol Rev. 2007;20(3):489-510. doi: 10.1128/CMR.00005-07 PMID: 17630337
  7. Dertzbaugh MT. Genetically engineered vaccines: an overview. Plasmid. 1998;39(2):100-13. doi: 10.1006/plas.1997.1329 PMID: 9514708
  8. Su L, Chiu C. Salmonella: clinical importance and evolution of nomenclature. Chang Gung Med J. 2007;30(3):210. doi: 10.1006/plas.1997.1329 PMID: 17760271
  9. Bender JB, Hedberg CW, Boxrud DJ, Besser JM, Wicklund JH, Smith KE, et al. Use of molecular subtyping in surveillance for Salmonella enterica serotype Typhimurium. N Engl J. 2001;344(3):189-95. doi: 10.1056/NEJM200101183440305 PMID: 11172141
  10. Zahraei Salehi T. Experimental evaluation of Salmonella Typhimurium killed vaccines. J Vet Res. 2001.56(2):87-89. (In Persian).
  11. Lin J, Ficht TA. Protein synthesis in Brucella abortus induced during macrophage infection. Infect Immun. 1995;63(4):1409-14. doi: 10.1128/iai.63.4.1409-1414.1995 PMID: 7890403
  12. Shanmugasamy M, Velayutham T, Rajeswar J. Inv A gene specific PCR for detection of Salmonella from broilers. Vet World. 2011;4(12):562-564. doi: 10.5455/vetworld.2011.562-564
  13. Kapperud G, Stenwig H, Lassen J. Epidemiology of Salmonella typhimurium O: 4–12 infection in Norway: evidence of transmission from an avian wildlife reservoir. Am J Epidemiol. 1998;147(8):774-82. doi: 10.1093/oxfordjournals.aje.a009522 PMID: 9554419
  14. Edelman R. Vaccine adjuvants. Rev Infect Dis. 1980;2(3):370-83. doi: 10.1093/clinids/2.3.370 PMID: 6997966
  15. Qadir M, Azimi S, Harzandi N. Cloning and expression of VP1 gene of foot-and-mouth disease virus and fic gene of Salmonella in Escherichia Coli. J Vet Microbiol. 2017;13(1):89-98. (In Persian).
  16. Nagarajan G, Kumar CA, Dechamma H, Reddy G, Ganesh K, Suryanarayana V. Cloning and expression of FMDV-VP1 immunoreactive peptide in trivalent form and its application as immunogen. Indian J Biotechnol. 2008;7(4):472-477.
  17. Rodriguez LL, Grubman MJ. Foot and mouth disease virus vaccines. Vaccine. 2009;27(1):D90-D94. doi: 10.1016/j.vaccine.2009.08.039 PMID: 19837296
  18. Ghorbanpour R, Nikbakht Gh, Jalali A H. Immuno-Bioinformatics Study of Autotransporter Protein, Antigen 43, in Enterotoxigenic Escherichia coli Isolated From Calves. J Vet Res. 2019.47(1):127-141. doi: 10.22059/jvr.2018.211721.2504 (In Persian)
  19. Rashidian E, Forouharmehr A, Nazifi N, Jaydari A, Shams N. Computer-aided design of a novel poly-epitope protein in fusion with an adjuvant as a vaccine candidate against leptospirosis. Curr Proteomics. 2021;18(2):113-23. doi: 10.2174/1570164617666200319144331
  20. Nikbakht Borojeni Gh, Abasabadi F, Abiri R. Designing B and T cell multi-epitope vaccine for cross protection against Haemophilus strains: An immunoinformatics approach. J Vet Res. 2021;76(1):133-145. doi: 10.22059/jvr.2019.271610.2882 (In Persian)
  21. Andersen DC, Krummen L. Recombinant protein expression for therapeutic applications. Curr Opin Biotechnol. 2002;13(2):117-23. doi: 10.1016/s0958-1669(02)00300-2 PMID: 11950561
  22. Shams N, Shakarami Gandabeh Z, Nazifi N, Forouharmehr A, Jaydari A, Rashidian E. Computational design of different epitope-based vaccines against Salmonella typhi. Int J Pept Res Ther. 2020;26(3):1527-39. doi: 10.1007/s10989-019-09959-4
  23. Forouharmehr A, Nazifi N, Mousavi SM, Jaydari A. Designing an efficient epitope-based vaccine conjugated with a molecular adjuvant against Bovine Babesiosis: A computational study. Process Biochem. 2022;121:170-7. doi: 10.1007/978-3-030-96376-7-1
  24. Pandey M, Saxena M. Cloning and immunopotential analysis of Omp 28 of Salmonella Typhimurium for the development of subunit vaccine for poultry salmonellosis. Indian J Poult Sci. 2015;50(2):138-42.
  25. Forouharmehr A. Engineering an efficient poly-epitope vaccine against Toxoplasma gondii infection: a computational vaccinology study. Microb Pathog. 2021;152:104646. doi: 10.1016/j.micpath.2020.104646 PMID: 33242641
  26. Vakili B, Eslami M, Hatam GR, Zare B, Erfani N, Nezafat N, et al. Immunoinformatics-aided design of a potential multi-epitope peptide vaccine against Leishmania infantum. Int J Biol Macromol. 2018;120:1127-39. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.08.125 PMID: 30172806
  27. Chang KY, Yang J-R. Analysis and prediction of highly effective antiviral peptides based on random forests. PloS one. 2013;8(8):e70166. doi: 10.1371/journal.pone.0070166 PMID: 23940542
  28. Jaydari A, Nazifi N, Forouharmehr A. Computational design of a novel multi-epitope vaccine against Coxiella burnetii. Hum Immunol. 2020;(81)10-11:596-605. doi: 10.1016/j.humimm.2020.05.010 PMID: 32718721
  29. Chen X, L. Zaro J, Shen WC. Fusion protein linkers: Property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 2013;65(10):1357-69. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.039 PMID: 23026637
  30. Pope B, Kent HM. High efficiency 5min transformation of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 1996;24(3):536-7. PMID: 8602370
Journal of Veterinary Research
Volume 78, Issue 3
September 2023
Pages 223-233

Files

Share

How to cite

Statistics