مقدمه

آنفلوانزای پرندگان بیماری ویروسی حاد تنفسی است که پرندگان اهلی، وحشی و بسیاری از سایرگونه­های جانوری را مبتلا می‌کند. عامل این بیماری ویروسی از خانواده ارتومیکسوویریده می‌باشد که در هفت جنس شامل آلفا، بتا، گاما، دلتا آنفلوانزا، توگاتوویروس، ایساویروس و کورانجاویروس رده بندی می‌شوند. ویروس‌های تیپ A در جنس آلفا آنفلوانزا بیش‌ترین بیماریزایی را برای پرندگان، پستانداران و انسان داشته و از عوامل مخاطره‌آمیز در بهداشت عمومی محسوب می‌گردند (1-3). تحت تیپ‌های ویروس‌های تیپ A براساس خاصیت آنتی‌ژنیسیته دو گلیکوپروتئین سطحی هماگلوتینین (HA) و نورآمینیداز (NA) تعیین می‌شوند. تاکنون 18 زیرواحد HA و 11 زیرواحد NA در ویروس‌های تیپ A شناسایی شده‌اند (4). انواع این ویروس توانایی جهش یا بازآرایی به اشکال عفونت‌های مرگ‌آور را دارا هستند و تنوع چشمگیری را در سرایت و مرگ‌ومیر در ماکیان نشان می‌دهند (1). ویروس‌های کم حدت H9N2 شایع‌ترین ویروس‌های آنفلوانزا در ماکیان محسوب می‌شوند و اندام‌های تولیدمثلی ماکیان را آلوده نموده و به دلیل کاهش تولید تخم‌مرغ تا 70 درصد، ضررهای اقتصادی فراوانی ایجاد می‌کنند. موارد مرگ‌ومیرهای ناشی از این ویروس می‌تواند به دلیل عفونت‌های ثانویه باکتریایی یا ویروسی باشد (5). ویروس‌های‌ H9N2 علاوه بر توانایی اتصال به گیرنده‌های اختصاصی طیور، گیرنده‌های NeuAcα2,6Gal شبیه سویه‌های انسانی را نیز کسب کرده‌اند. این یافته‌ها بدین معنی است که این ویروس پتانسیل تهدید بهداشت عمومی و سرایت به انسان را دارد (6، 7).

اولین شیوع H9N2 از ماکیان کشور چین در سال 1992 گزارش گردید و در طول بیست سال اخیر به‌عنوان رایج‌ترین تحت تیپ در گردش در کشورهای آسیایی اعلام شده است. شیوع سرمی بالای H9N2 در طیور روستایی در مطالعات مختلف نشان‌دهنده بومی‌شدن این ویروس در ایران و کشورهای خاورمیانه می‌باشد (5، 8، 9). به دلیل خسارت اقتصادی ناشی از ویروس آنزئوتیک H9N2 و تهدید سلامتی انسان و پرندگان، بسیاری از کشورها از جمله چین، کره جنوبی، مراکش، پاکستان، اندونزی، مصر، ایران و امارات متحده عربی، واکسیناسیون را در سطح محلی و ملی به‌عنوان یک رویکرد کلیدی برای جلوگیری از این بیماری در طیور اتخاذ کرده‌اند (9-14). با این‌حال در سال‌های اخیر عدم موفقیت واکسن‌های مصرفی در بسیاری از مناطق به دلیل پدیدار شدن انواع آنتی‌ژنیک، در نتیجه جهش‌هایی که در آنتی‌ژن اصلی ویروس یعنی پروتئین HA به وجود آمده‌اند گزارش شده است (10، 15-17).

ایمنی علیه ویروس آنفلوانزا به دنبال عفونت یا واکسیناسیون با تولید آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده علیه هماگلوتینین HA ایجاد می‌شود. افزون بر این به دلیل نقش محوری آن در بیماریزایی، تعیین تحت تیپ HA و واکنش‌پذیری آن برای پایش‌های کنترلی و بررسی‌های اپیدمیولوژیک بیماری بسیار مهم است. تنوع آنتی‌ژنی در ویروس‌های آنفلوانزا اغلب در نتیجه جایگزینی‌های اسیدآمینه در نزدیکی محل اتصال به گیرنده‌های گلیکوپروتئین HA رخ می‌دهند (16، 18). این جایگزینی‌ها با اثر مستقیم بر اتصال آنتی‌بادی، سبب ایجاد تغییر آنتی‌ژنی می‌شوند که متداول‌ترین مکانیسم فرار از سیستم ایمنی قلمداد می‌شود. به‌عبارت‌دیگر جهش‌های HA می‌توانند با افزایش توان اتصال ویروس به گیرنده سطح سلول، فعالیت آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده را کاهش دهند. به دلیل تغییرات پیش‌بینی ‌نشده‌ای که در پروتئین HA به‌عنوان آنتی‌ژن اصلی ویروس رخ می‌دهد، ممکن است اثربخشی واکسن‌ به شدت کاهش‌ یافته و یا آزمایش‌های سرولوژی نتایج قابل قبولی در برنداشته باشند (15، 19).

آزمایش ممانعت از هماگلوتیناسیون HI استاندارد طلایی و پرکاربردترین روش غربالگری آنفلوانزا می‌باشد که اهمیت زیادی در ویروس‏شناسی تشخیصی دارد. در این آزمایش وجود آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن، با خاصیت بازدارندگی از تجمع و توده شدن گلبول قرمز مشخص می‏شود و اساس آن واکنش بین پروتئین HA ویروس آنفلوانزا و آنتی سرم است (20-22). در آزمایش HI اغلب از ویروس تکثیر یافته در تخم‌مرغ برای تهیه آنتی سرم اختصاصی استفاده می‌شود. وجود پروتئین‌های ناخواسته و نیز تغییرات آنتی‌ژنی پروتئین HA در نتیجه جهش‌های ژنومی، بر واکنش بین پروتئین HA ویروس و آنتی سرم اثر نامطلوب داشته و موجب کاهش حساسیت آزمایش می‌شوند (19، 23). هزینه تولید آنتی‌بادی‌های مونوکلونال مرجع در مقایسه با آنتی‌بادی‌های پلی کلونال برای استفاده در این آزمایش بالا می‌باشد (24)؛ بنابراین، برای انجام آزمایش HI معتبر، استفاده از قطعه حفاظت شده پروتئین HA راهکار مناسبی برای تولید آنتی‌بادی پلی‌کلونال با میل ترکیبی بالا در تعیین هویت جدایه‌های ویروس آنفلوانزا و عیارسنجی است. آنتی ‌سرم‌های تهیه شده از پروتئین نوترکیب HA تحت تیپ‌های مختلف ویروس آنفلوانزا در تعیین هویت تحت تیپ ویروس عامل و نیز ارزیابی میزان آنتی‌بادی در نمونه‌های سرمی کاربرد دارند (11، 25، 26). در مطالعه حاضر، آزمایش HI با استفاده از پپتید نوترکیب برای تشخیص آنتی‌بادی‌ اختصاصی علیه ویروس H9N2 طراحی شد. ابتدا با ابزارهای بیوانفورماتیک پپتید مناسب از پروتئین HA پیش‌بینی شد. سپس قطعه مورد نظر در سیستم یوکاریوتی بیان شده و آنتی سرم با تزریق به جوجه تهیه شد. ویژگی و حساسیت آنتی سرم حاصل در آزمایش HI متقاطع با ویروس‌های هومولوگ و هترولوگ ارزیابی شد.

مواد و روش کار

شناسایی توالی‌های حفاظت شده: توالی‌های HA ویروس آنفلوانزا H9N2 ایران با طول کامل از پایگاه ‌داده NCBI ((https://www.ncbi.nlm.nih.gov استخراج شده و درخت فیلوژنی با پردازش کم‌ترین میزان دگرگونی بر مبنای Maximum Composite Likelihood و یک‌ هزار بار تکرار با الگوریتم Neighbor-Joining در نرم‌افزار MEGA (https://www.megasoftware.net/) رسم شد. میزان واگرایی توالی‌ها در نتیجه فشار انتخابی با هدف بررسی جهش‌های خنثی که اثری بر دگرگونی ویروس ندارند، با آزمون بی‌طرفی Tajima ((Tajima's Neutrality در 001/0<P برآورد شد. در مجموع چهار توالی پپتیدی حفظ شده در تمام توالی‌ها در موقعیت‌های 100-72، 280-226، 381-340، و 482-414 (به ترتیب موتیف‌های 1 تا 4) تعیین شدند.

بررسی ویژگی‌های توالی‌های حفاظت شده: قابلیت اتصال به آنتی‌بادی با پیش‌بینی وجود اپی‌توپ‌های خطی سلول‌های B در توالی هر موتیف با BepiPred و پیش‌فرض 5/0 در پایگاه داده IEDB (http://tools.iedb.org/bcell) ارزیابی شد. پتانسیل آنتی‌ژنیک بودن هر یک از موتیف‌ها با الگوریتم Kolaskar و Tongaonker، سطح دسترس آنتی‌ژن با Emini، و میزان آب‌دوستی با Parker در IEDB با در نظر گرفتن حد آستانه 0/1 پیش‌بینی گردید. خصوصیات فیزیکوشیمیایی هر موتیف شامل ترکیب اسیدهای آمینه، نقطه ایزوالکتریک نظری pI، نیمه‌عمر در سلول‌های یوکاریوتیک، مخمر و E.coli، شاخص آلیفاتیک و میانگین کل هیدروپاتی GRAVY با استفاده از برنامه ProtParam (http://web.expasy.org/protparam) ارزیابی شد. برای بررسی برهم‌کنش آنتی‌بادی و سلول‌های B، ساختمان دوم پروتئین با PSIPred (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred) پیش‌بینی گردید.

توانایی اتصال هر موتیف به MHC کلاس II در پایگاه ‌داده IEDB بررسی شد. مبنای پیش‌بینی اتصال، روش SMM_align 1.1  می‌باشد که امکان شناسایی موتیف متصل شونده را از نظر ماتریس وزن مخصوص فراهم می‌کند. خروجی این روش مقادیر میل ترکیبی اتصال بر اساس IC50 (half maximal inhibitory concentration) است که رتبه صدک آن برای شناسایی پپتیدهای متصل ‌شونده به سلول‌های T برابر 500 نانو مولار در نظر گرفته شد. این آستانه بهترین مقدار توصیه شده برای تفکیک موتیف متصل شونده از غیر متصل شونده می‌باشد.

کلونینگ و بیان موتیف حفظ شده: پس از تعیین بهترین موتیف در ارزیابی بیوانفورماتیک، ویروس آنفلوانزا با شناسه A/chicken/Iran/SS7/2011(H9N2) برای انجام مطالعه حاضر انتخاب شد. توالی ژن HA این ویروس با شماره رهگیری JX456181.1 ثبت شده در GenBank تهیه شده و پرایمرهای رفت‌ و برگشت اختصاصی برای تکثیر و کلونینگ آن در وکتور بیانی pET-28a (+) با استفاده از نرم‌افزار oligo طراحی گردید. جایگاه برش آنزیم‌های BamHI و HindIII در دو انتهای '5 توالی پرایمرها در نظر گرفته شد. RNA ویروس با استفاده از کیت Ribospin™ ((GeneAll, Korea استخراج شد. قطعه ژنی طی واکنش یک‌مرحله‌ای RT-PCR (Next generation of premix; iNtRON, Korea) با پرایمر رفت 5′-GGATCCGGCTGACTCAAAAGAACGGG-3′ و پرایمر برگشت 5′-AAGCTTTCAGAATTCTCCCGTGGCT-3′ تکثیر شد. پس از تأیید درستی قطعه مورد نظر، وکتور و محصول PCR با آنزیم‌های محدود اثر برش داده شده و عمل اتصال با آنزیم DNA لیگاز T4 در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد به مدت یک شب انجام شد. پلاسمید نوترکیب حاصل درون سلول‌های پذیرای باکتری E.coli سویه BL21 ترانسفورم شد. باکتری ترانسفورم شده در محیط کشت LB حاوی کانامایسین کشت داده شد. برای افزایش بازده بیان، IPTG با غلظت 1 میلی‌مولار به ‌ازای هر میلی‌لیتر محیط اضافه شده و تا 16 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. در زمان‌های صفر، 1، 2، 4 و 16 ساعت پس از القا نمونه گرفته شده و نتیجه القا با الکتروفورز در ژل پلی‌اکریل‌آمید سدیم دودسیل سولفات (SDS-PAGE) 12 درصد در کنار مارکر پروتئین (Thermo Fisher) با طیف 4/3 تا 100 کیلودالتون ارزیابی شد. پروتئین بیان شده با استفاده از ستون نیکل کیت تجاری Protino Ni-TED  (Macherey-Nagel™) خالص شد. مقدار پروتئین خالص شده با روش برادفورد اندازه‌گیری شد (27).

تهیه آنتی‌ژن ویروس آنفلوانزا H9N2: مقدار 1/0 میلی‌لیتر از سوسپانسیون حاوی ویروس آنفلوانزا H9N2 A/chicken/Iran/SS7/2011(H9N2) به همراه محلول آنتی‌بیوتیک شامل پنی‌سیلین G و استرپتومایسین به حفره آلانتوئیک تخم‌مرغ جنین‌دار 10 روزه تزریق گردید و محل تلقیح با پارافین مسدود شد. پس از تزریق تخم‌مرغ‎ها در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت یک هفته نگه‌داری شدند. تخم‌مرغ‌ها روزانه بررسی شده و آن‌هایی که جنین‌شان در 24 ساعت اول مرده بودند، حذف شدند. در پایان مدت نگهداری، تخم‌مرغ‌ها 4 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند تا رگ‌های خونی جنین بسته شود. سپس در زیر هود بیولوژیک کلاس II مایع آلانتوئیک تخم‌مرغ‎ها برداشت شده و در ظرف استریل جمع‌آوری گردید. بقایای جامد با سانتریفیوژ در 4000 دور به مدت 20 دقیقه برداشته شد. عیار ویروس برابر با EID₅₀/ml ^83/9 10 محاسبه شده و با افزودن بتاپروپیولاکتون (Sigma Aldrich) در غلظت نهایی 1/0 درصد در PBS در دمای 37 درجه سانتی‌گراد غیرفعال گردید. برای اطمینان از فرایند غیرفعال ‌شدن ویروس، آنتی‌ژن همانند روش ذکر شده به 5 عدد تخم‌مرغ تزریق شد و در پایان دوره یک‌هفته‌ای، عدم وجود ویروس زنده در مایع آلانتوئیک با انجام آزمایش آگلوتیناسیون سریع  بررسی شد (28).

تهیه آنتی‌ سرم اختصاصی: محلول آنتی‌ژن غیرفعال و مقدار 100 میکروگرم از پروتئین نوترکیب محلول در PBS جداگانه با ادجوان روغنی مخلوط شدند. برای ایمن‌سازی، تعداد 30 جوجه در سن سه هفتگی به طور تصادفی در سه گروه مساوی دریافت‌کننده ویروس غیرفعال، دریافت‌کننده پروتئین نوترکیب و دریافت‌کننده PBS به‌عنوان شاهد منفی تقسیم شدند. موارد اخلاقی نگه‌داری جوجه‌ها در دوره آزمایش شامل دریافت کافی و مناسب آب و غذا، عدم ایجاد تنش به هنگام خون‌گیری و واکسیناسیون به‌ طور کامل طبق مجوز صادره از دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران به شماره IR.UT.VETMED.REC.1401.011 رعایت شد. جوجه‌های هر گروه نمونه مربوطه را به میزان  2/0 میلی‌لیتر با تزریق درون عضله سینه دریافت کردند. برای همه گروه‌ها، یک تزریق یادآور با فاصله دو هفته‌ای تجویز شد. نمونه‌های خون هر هفته تا پایان هفته هفتم نگهداری گرفته شده و سرم‌های آن‌ها جمع‌آوری ‌شد. سرم‌ها به مدت نیم ساعت در دمای 56 درجه سانتی‌گراد غیرفعال شده و تا زمان انجام آزمایش در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

برآورد ویژگی آنتی‌ سرم‌های تولید شده در آزمایش HI: برای ارزیابی ویژگی آنتی ‌سرم‌ تولید شده در شناسایی اختصاصی تحت تیپ H9، آزمایش HI متقاطع با ویروس‌های H9N2 تعیین هویت شده شامل جدایه سال 2011 (JX456181.1) به‌عنوان ویروس هومولوگ و جدایه‌های سال 2009 (JX456179.1) و سال 1998 (FJ794817.1) به‌عنوان ویروس‌های هترولوگ انجام شد. برای هر یک از آنتی‌ سرم‌های تهیه شده ردیف جداگانه در میکروپلیت در نظر گرفته شده و آزمایش به طور یکسان بر اساس دستورالعمل انجام شد (28).

ارزیابی آماری: پردازش آماری با استفاده از آزمون آنووا یک‌طرفه نرم‌افزار SPSS، نسخه 22 صورت گرفت. بیشینه خطای مورد پذیرش، با درنظرگرفتن ضریب اطمینان 95 درصد، برابر 05/0 در نظر گرفته شد.

نتایج

ویروس‌های آنفلوانزا H9N2 ایران بر اساس همسانی 97 درصد گلیکوپروتئین HA، به دو کلاد اصلی I و II منشأ گرفته از دو نیای متفاوت سال‌های 1998 و 2003 تقسیم شدند. ویروس‌هایی که برای اولین ‌بار در ایران شناسایی شدند، همچنین ویروس‌های جدا شده تا سال 2004 و برخی جدایه‌های 2008 تا 2009 در دو گروه در کلاد I قرار می‌گیرند. ویروس‌های جدا شده از سال 2003 تا 2008 و جدایه‌های 2009 تاکنون در دو گروه در کلاد II قرار می‌گیرند (تصویر 1). نتایج آزمون بی‌طرفی Tajima نشان داد که در 64 توالی گلیکوپروتئین HA ویروس‌های آنفلوانزا H9N2 ایران، 225 محل جهش با تنوع نوکلئوتیدی یعنی میانگین تعداد تفاوت‌های نوکلئوتیدی در هر مکان بین دو توالی برابر با 058934/0 شناسایی شد؛ یعنی تنوع نوکلئوتیدی با تناوب کم بین این توالی‌ها زیاد است. مقادیر آزمون تاجیما برابر با 107764/1- بوده و این مقدار منفی به طور قابل‌توجهی از صفر (001/0<P) منحرف شده است. این نتیجه نشان داد که میزان واگرایی در این ویروس‌ها کم بوده و احتمالاً ناشی از فشار انتخابی واکسیناسیون می‌باشد. 

بر اساس آنالیز BepiPred، تعداد 21 اپیتوپ سلول B در توالی پروتئین HA ویروس آنفلوانزا H9N2 شناسایی شد (جدول 1). در موتیف 1 توالی SCDLLLGGR، در موتیف 2 دو توالی GPRPLVNGQIG و SHGRILKTD، در موتیف 3 توالی WPGLVAGWYGFQHSNDQGVGMAADRDSTQK و در موتیف 4 سه توالی IDDQ، KTLDEHDANVNN و ME به‌عنوان اپی توپ‌های ایمنوژنیک سلول B تعیین شدند. نتایج پیش‌بینی آنتی‌ژنیسیتی، آب‌دوستی و سطح در دسترس موتیف‌ها در جدول 2 آورده شده است. بجز موتیف 3، میزان آنتی‌ژنیسیتی سایر موتیف‌ها تقریباً مشابه بود. بر اساس الگوریتم Parker اسیدآمینه‌های قطبی بیشتر در سطح موتیف‌های 2 و 4 قرار گرفته‌اند و از پراکندگی بهتری برخوردارند، این ویژگی اهمیت زیادی در میان‌کنش آنتی‌ژن - آنتی‌بادی دارد. به‌عنوان شاخص کلیدی برای تعیین تاخوردگی و پایداری پروتئین‌ها و همچنین چگونگی برهم‌کنش آنتی‌ژن - آنتی‌بادی و تشکیل کمپلکس بین این دو مولکول، پیک‌های سطح در دسترس در موتیف 2 نسبت به موتیف‌های دیگر از پراکندگی و توزیع بهتری برخوردارند.

نتایج بررسی خواص فیزیکوشیمیایی (جدول 3) نشان داد که تعداد اسیدآمینه‌های با بار مثبت (Arg و Lys) در مقایسه با آن‌هایی که دارای بار منفی (Asp و Glu) می‎باشند در موتیف‌های 2 و 4 بسیار بیشتر از موتیف‌های دیگر بود. مقدار pI موتیف‌ها از 41/4 تا 52/10 برآورد شد و موتیف 2 با بیشترین مقدار pI و شاخص ناپایداری برابر با 51/17 (کمتر از حد آستانه 40)، نسبت به موتیف‌های دیگر پایداری بیشتری نشان داد. شاخص آلیفاتیک که بیانگر افزایش پایداری حرارتی پروتئین‌ها است، برای موتیف 3 بسیار کمتر از موتیف‌های دیگر برآورد شد. مقادیر منفی GRAVY نیز موید واکنشگری بیشتر موتیف‌های 2 و 4 است. در ساختمان دوم موتیف 2، صفحات بتا و ساختار کویل پیش‌بینی شد؛ در حالی ‌که بیشتر این ساختمان در موتیف 4 را مارپیچ آلفا تشکیل می‌دهد (تصویر 2). صفحات بتا نسبت به مارپیچ آلفا انعطاف‌پذیرتر می‌باشند و از آن‌جایی‌ که دومین‌های آنتی‌ژن و آنتی‌بادی اغلب در مناطقی با انعطاف‌پذیری بالا به یکدیگر متصل شده و کمپلکس تشکیل می‌دهند، موتیف 2 گزینه مناسب‌تری در برهم‌کنش با آنتی‌بادی به نظر می‌رسد. پیش‌گویی برای موتیف‌های 1 و 3 به دلیل کوتاه بودن طول توالی، امکان‌پذیر نبود.

نتایج توانایی اتصال موتیف‌ها به MHC کلاس II بر اساس کمینه مقدار IC50 در جدول 4 آورده شده است. صرف‌نظر از طول یکسان و با تجمیع توالی‌های مرکزی (core)، تعداد یک توالی در موتیف 1، چهار توالی در موتیف 2، دو توالی در موتیف 3 و چهار توالی در موتیف 4 قابلیت اتصال به MHC کلاس II را مقادیر تا 500 نانو مولار دارند. به طور نسبی این مقدار برای موتیف‌های 4 و 2 بسیار کمتر از موتیف‌های دیگر برآورد گردید.

مقادیر کمتر از 500 به معنای امکان اتصال قوی‌تر و بهتر آللی است. بر اساس داده‌های بیوانفورماتیک، موتیف‌های 2 و 4 گزینه‌های بهتری برای تهیه آنتی سرم اختصاصی می‌باشند؛ اما به دلیل قرار گرفتن موتیف 4 در زیر واحد HA2 پروتئین HA و همسانی زیاد آن با دیگر تحت تیپ‌های ویروس آنفلوانزا، موتیف 2 برای ادامه مطالعه انتخاب شد. محصول RT-PCR حاصل از تکثیر ژن‌ رمزگذار موتیف 2 به طول 361 جفت باز در وکتور pET-28a(+) بیان شد (تصویر 3). وزن مولکولی پروتئین بر اساس برآورد ProtParam حدود 6 کیلودالتون بود. ارزیابی نمونه‌های پروتئین بارگذاری شده روی ژل SDS-PAGE بیانگر این است که میزان بیان پس از 16 ساعت به بیشترین مقدار رسیده است. مقدار پروتئین خالص شده برابر با 38/5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر برآورد گردید.

عیار آنتی‌بادی HI در نمونه‌های سرم به ‌دست‌ آمده از ایمن‌سازی جوجه‌ها با ویروس H9N2 غیرفعال و موتیف ‌‌2 نوترکیب به ترتیب 064/7 و 959/4 برآورد شد (تصویر 4). ویژگی آنتی‌ سرم‌های تولید شده در شناسایی اختصاصی این تحت تیپ با آزمایش HI متقاطع ارزیابی شد (تصویر 4). در واکنش با آنتی سرم حاصل از ویروس غیرفعال هومولوگ 2011، عیار آنتی‌بادی HI برابر با 064/7 به دست آمد. این عیار برای ویروس‌ هترولوگ 2009 برابر با 608/4 و برای ویروس هترولوگ 1998 برابر با 895/2 برآورد شد. این تفاوت به لحاظ آماری معنی‌دار بود (05/0<P). در آزمایش با آنتی سرم موتیف ‌‌2 نوترکیب، نتیجه مشابه با هر سه ویروس H9N2 هومولوگ و هترولوگ مشاهده شد و عیار HI تقریباً یکسان در محدوده کمتر از 5 به دست آمد. بدین ترتیب برخلاف آنتی ‌سرم حاصل از ویروس کامل، آنتی سرم نوترکیب توان شناسایی ویروس‌های H9N2 جدا شده در سال‌های مختلف را دارد.

بحث

تشخیص سریع بهترین گزینه برای جلوگیری از شیوع عفونت‌های بیشتر و کاهش خسارات ناشی از عفونت ویروس‌های آنفلوانزا H9N2 می‌باشد. اگرچه در سال‌های اخیر روش‌های مولکولی برای تعیین تحت تیپ‌های ویروس آنفلوانزا مطرح شده‌اند، اما هنوز از روش‌های سرولوژی مانند HI و الایزا به طور گسترده استفاده می‌شود (29، 30). مبنای آزمایش HI جلوگیری از اتصال ویروس به گلبول‌های قرمز توسط آنتی‌بادی‌های اختصاصی می‌باشد. آنتی سرم‌های مرجع برای بسیاری از تحت تیپ‌های ویروس آنفلوانزا، در بز یا گوسفند تهیه شده است. این آنتی سرم‌ها با HA یک جدایه تهیه شده و تک اختصاصی (monospecific) در نظر گرفته می‌شوند (31). در مواردی که آنتی سرم تک اختصاصی در دسترس نباشد، آنتی سرم‌های پلی‌کلونال پیشنهاد می‌شوند. آنتی سرم‌ مرجع معرفی شده از طرف WHO برای ویروس‌های H9N2، از سویه A/turkey/WI/66 تهیه می‌شود (21). مطالعات فیلوژنی بیانگر همسانی بسیار کمی بین HA ویروس‌های H9N2 جدا شده از آسیا که به دودمان اروپایی - آسیایی تعلق دارند، با این ویروس که از دودمان آمریکای شمالی است وجود دارد (11، 32)؛ بنابراین آنتی سرم مرجع پیشنهادی در ارزیابی ارتباط آنتی‌ژنیک سویه‌های مختلف به‌ویژه سویه واکسن و ویروس‌های در گردش و همچنین ارزیابی پتانسیل ایمنی بخشی واکسن کارایی نخواهد داشت. یک راهکار استفاده از آنتی سرم پلی‌کلونال اختصاصی آنتی‌ژن در سنجش HI است. با این حال به دلیل رانش (دریفت) متعدد آنتی‌ژنی ویروس آنفلوانزای پرندگان و پیامد برنامه طولانی مدت واکسیناسیون و فشارهای منفی ایمنی، ممکن است آنتی‌سرم‌های معمول در تشخیص و یا تعیین تحت تیپ جدایه‌های جدید که احتمالاً از نظر آنتی‌ژنی با ویروس‌های پیشین متفاوت می‌باشند، غیراختصاصی عمل کنند (28، 33، 34). آنتی ‌سرم اختصاصی که در آزمایش HI استفاده می‌شود، از تزریق ویروس زنده یا غیرفعال شده به جوجه می‌آید. در این روش چون از کل پیکره ویروس استفاده می‌شود، ممکن است وجود پروتئین‌های ناخواسته ویروس و نیز تخم‌مرغ در آنتی سرم مورد استفاده در آزمایش HI، در واکنش اصلی بین پروتئین HA ویروس آنفلوانزا و آنتی سرم اثر نامطلوب داشته و موجب کاهش حساسیت آزمایش شوند (30، 35).

در مطالعه حاضر با هدف ارائه روشی برای تولید آنتی سرم پلی‌کلونال که بتواند از محدودیت‌های آزمایش HI در تعیین تحت تیپ و تعیین ارتباط آنتی‌ژنیک‌های ویروس‌های هومولوگ و هترولوگ در گردش با سویه واکسن بکاهد، ابتدا پتانسیل القای آنتی‌بادی چهار موتیف محافظت شده HA ویروس‌های آنفلوانزا H9N2 ایران با ابزارهای بیوانفورماتیک بررسی شد. بر اساس نتایج پیش‌بینی اپی توپ‌های سلول‌های B، پتانسیل آنتی‌ژنیک بودن، سطح در دسترس، میزان آب‌دوست بودن، خصوصیات فیزیکوشیمیایی، ساختمان دوم و توالی‌های متصل‌شونده به MHC کلاس II، موتیف‌های 2 و 4 نسبت به دو موتیف دیگر پایدارتر بوده و از پتانسیل آنتی‌ژنیک بیشتری برخوردارند. در ایجاد کمپلکس آنتی‌ژن - آنتی‌بادی احتمال برقراری اتصال قوی‌تر و بهتر را دارند، اما از نظر ساختاری موتیف 2 انعطاف‌پذیرتر بوده و به نظر گزینه مناسب‌تری در برهم‌کنش با آنتی‌بادی است. بیش‌تر مکان‌های آنتی‌ژنی که علیه آن‌ها آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده تولید می‌شود، در سر کروی HA جای گرفته‌اند و پاسخ‌های HI بیشتر به سمت اپی توپ‌های اصلی آنتی‌بادی روی زیر واحد HA1 هدایت می‌شوند (36). اگرچه زیر واحد HA2 هم تعدادی مکان‌های آنتی‌ژنیک دارد، اما توالی‌های آن بین تحت تیپ‌های مختلف ویروس‌ آنفلوانزا محافظت شده‌اند؛ بنابراین کاندید مناسبی برای تولید واکسن جامع می‌باشند (36، 37). با بیان موتیف 2 نوترکیب، آنتی سرم اختصاصی علیه آن تولید شده و کارایی آن با آنتی سرم به دست ‌آمده از کل پیکره ویروس در آزمایش HI متقاطع ارزیابی شد. آنتی سرمی که از موتیف حفاظت شده تهیه شده بود، با حساسیت و ویژگی بیشتری ویروس‌های هترولوگ را در مقایسه با آنتی سرمی که از کل پیکره ویروس به‌ دست ‌آمده بود، شناسایی کرد. در مطالعات مشابه، Sączyńska و همکاران در سال 2017 پس از تزریق پروتئین نوترکیب HA ویروس آنفلوانزا H5N1 به جوجه‌های SPF، آنتی‌بادی خنثی‌کننده علیه این قطعه را به میزان بالا تولید کردند و ایمنی مناسبی علیه سویه‌های هومولوگ و هترولوگ به ترتیب به میزان 100 و 70 درصد ایجاد نمودند. اگرچه این مطالعه در ارتباط با تولید آنتی‌بادی محافظت‌کننده علیه H5N1 بود تا برای واکسیناسیون پرندگان مورد استفاده قرار گیرد، اما تولید HA نوترکیب و ایجاد پاسخ ایمنی مناسب حفاظتی علیه ویروس‌های همولوگ و هترولوگ، بیانگر کاربرد پروتئین نوترکیب برای ایجاد عیار بالای آنتی‌بادی‌های پلی‌کلونال حفاظتی علیه بیماری است (25، 26). پروتئین نوترکیب HA علاوه بر ارتقاء بلوغ سلول‌های دندریتیک، تحریک پاسخ‌های ایمنی سلولی و جلوگیری از گسترش ویروس، سطوح بالای آنتی‌بادی سرمی تولید نموده که آثار قوی ممانعت از هماگلوتیناسیون علیه سویه‌های هترولوگ تحت تیپ‌های H1 و H3 را نشان می‌دهد. افزون بر این آنتی‌بادی‌های خالص شده علیه این پروتئین نوترکیب، به HAهای مختلف با میل ترکیبی بالا متصل می‌شوند (23، 37). ویژگی و حساسیت آنتی سرم تولید شده علیه پروتئین نوترکیب HA و نیز HA1 بیان شده در سیستم باکولوویروس و مقایسه آن با ویروس غیرفعال H9N2 بیانگر حساسیت زیاد و ویژگی 100 درصد در ارزیابی پنج تحت تیپ مختلف ویروس‌های آنفلوانزا است (26، 35). در مطالعه روی ویروس نیوکاسل، پروتئین HN بیان شده در باکولوویروس به‌عنوان آنتی‌ژن، برای شناسایی و عیارسنجی آنتی‌بادی‌های اختصاصی در سرم جوجه و سرم بوقلمون با موفقیت در آزمون HI استفاده شده است (38).

از زمان تشخیص ویروس‌های H9N2 در ایران، واکسن غیرفعال به طور گسترده در مزارع پرورشی مورد استفاده قرار گرفته است. واکسیناسیون، فشار انتخاب مثبت برای ظهور انواع آنتی‌ژنی وارد می‌کند و تطابق آنتی‌ژنی کمتر با سویه‌های پیشین اغلب ناشی از فشار انتخابی واکسیناسیون می‌باشد (18، 34). توالی HA بیشتر این ویروس‌ها دارای جهش‌های نقطه‌ای است که به تغییر در ناحیه سر کروی HA1، مکان‌های آنتی‌ژنیک H9-A و H9-B، و همچنین از دست ‌دادن اپیتوپ آنتی‌بادی در محل اسیدآمینه‌های 192 تا 218 منجر می‌شود (7، 11، 15). با استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال اختصاصی HA، جهش‌های فرار آنتی‌بادی ویروس‌های H9N2 که حاوی حذف اسیدهای آمینه در حلقه 220 در مکان‌های اتصال گیرنده HA بودند، شناسایی شدند. نشان داده شد که این ویروس‌های جهش یافته قادر به فرار از اتصال آنتی سرم پلی‌کلونال می‌باشند (16، 34، 39). در مطالعات مشابه اعلام شده است آنتی‌بادی‌های اختصاصی H9 ناشی از واکسن‌های H9N2 تولید شده با ویروس‌های جدا شده در دهه 1990 در چین، اثر محافظتی ضعیفی در برابر سویه‌های در گردش کنونی ارائه می‌کنند (6، 13، 40). در دو مطالعه توالی و اطلاعات ساختاری سه‌بعدی گلیکوپروتئین‌های HA همراه با داده‌های مربوط به آزمایش HI برای جدایه‌های ویروس H1N1 انسانی (1997-2009) و ویروس‌ مرجع (H1N1 09) ارزیابی شد. داده‌ها بیانگر این است که جایگزینی یک تا دو اسیدآمینه (N125D و/یا N156K) در مکان‌های اصلی آنتی‌ژنی HA ویروس H1N1 09 به طور چشمگیری بر توانایی آنتی‌بادی‌ها در تشخیص ویروس‌های H1N1 در آزمایش HI اثر می‌گذارد (39، 41). ازآنجایی‌که برخی جهش‌های HA در ویروس‌های H9N2 مانند S145N، Q164L، A168T، A198V، M224K و Q234L می‌توانند بر خاصیت آنتی‌ژنیک ویروس‌های آنفلوانزا با تغییر تمایل اتصال گیرنده و تغییر پاسخ‌های آنتی‌بادی اثر بگذارند و سبب ایجاد عیارهای متفاوت HI شوند (15، 18)، در این مطالعه از بخشی از پروتئین HA ویروس H9N2 استفاده شد که فاقد این مکان‌های در معرض فشار انتخاب مثبت باشد تا محدوده حساسیت بالاتری در سنجش سرولوژی با آنتی‌بادی پلی‌کلونال تولید شده علیه پپتید حفظ شده ایجاد شود. پلی‌کلونال بودن یک آنتی‌بادی امکان اتصال چندین عامل آنتی‌ژنیک را فراهم می‌کند تا این آنتی‌بادی در سنجش علیه انواع پروتئین‌های هدف حساس‌تر باشد. این ویژگی اتصال چند اپی توپی امکان تشخیص آنتی‌ژن را در انواع واریانت‌های آنتی‌ژنی و حتی اگر برخی از این اپی توپ‌ها تحت تأثیر تغییر ساختار سوم یا سطح دسترسی قرار گیرند، را فراهم می‌کند (2، 31). به دلیل ماهیت ناهمگون، آنتی‌بادی پلی‌کلونال ممکن است به اعتبارسنجی دقیق‌تری نسبت به آنتی‌بادی مونوکلونال نیاز داشته باشند. بسیاری از آنتی‌بادی پلی‌کلونال در برابر پروتئین‌های طبیعی یا قطعات بزرگ پروتئینی ایجاد شده و اپی توپ‌های متعدد را تشخیص می‌دهند؛ بنابراین احتمال برهم‌کنش با دیگر پروتئین‌ها بسیار زیاد است که یک پاسخ ایمنی ناخواسته ایجاد می‌کند. پپتیدها می‌توانند همانند پروتئین‌ها در تولید آنتی‌بادی‌های پلی‌کلونال و آنتی‌بادی‌های مونوکلونال به طور مؤثر استفاده شوند؛ بی آن که واکنش‌های ناخواسته ایجاد کنند. تولید مناسب و با کیفیت بالای آنتی‌بادی علیه پپتید به انتخاب توالی پپتید، موفقیت در سنتز و بیان پپتید، پاسخ ایمنی هومورال در حیوان میزبان، ادجوان مورد استفاده، دوز پپتید تجویز شده، روش تزریق و خالص‌سازی بستگی دارد (31).

نتیجه‌گیری نهایی: با توجه‌ به اهمیت بیماری آنفلوانزا، بومی بودن ویروس H9N2 در ایران و واکسیناسیون گسترده، مطالعات گوناگونی روی این ویروس انجام می‌شود. این امر اهمیت استفاده از آنتی‌بادی‌های پلی‌کلونال علیه ویروس را دوچندان می‌کند. انتخاب توالی پپتیدی حیاتی‌ترین مرحله در تولید آنتی‌بادی است. روش‌های محاسباتی پیش‌بینی اپیتوپ سلول B می‌توانند در بیشتر شدن احتمال تولید آنتی‌بادی‌های مؤثرتر کمک کنند. در مطالعه حاضر قابلیت اتصال به آنتی‌بادی با پیش‌بینی وجود اپیتوپ‌های خطی سلول B، پتانسیل آنتی‌ژنیک بودن، سطح دسترس، میزان آب‌دوستی و خواص فیزیکوشیمیایی قطعه حفاظت شده زیر واحد HA1 پروتئین HA ویروس H9N2 با الگوریتم‌های بیوانفورماتیک پیش‌بینی شد. افزون بر این توانایی و میل ترکیبی اتصال به MHC کلاس II برای آنالیز میان‌کنش‌های آنتی‌بادی با آنتی‌ژن نیز بررسی شد تا بهترین توالی پپتیدی برای تزریق به حیوان و تولید آنتی سرم پلی‌کلونال انتخاب شود. سپس واکنش آنتی سرم پلی‌کلونال به دست‌ آمده با ویروس‌های همولوگ و هترولوگ با آزمایش HI بررسی شد. با ارزیابی‌های انجام شده این آنتی سرم دارای کارایی مناسب در شناسایی جدایه‌های متفاوت ویروس H9N2 است و در مقایسه با آنتی سرم معمول بادقت بیشتری اختلاف آنتی‌ژنی یک تحت تیپ را مشخص می‌کند. آنتی سرم پلی‌کلونال حاصل فاقد بازدارنده‏های غیراختصاصی می‌باشد که ممکن است تفسیر یافته‏های سرولوژی را با مشکلاتی مواجه نماید؛ هرچند معتبرسازی آن مستلزم انجام آزمایش با تعداد بیشتر ویروس است.

سپاسگزاری

مطالعه حاضر حاصل پایان نامه دکترای تخصصی بیماری‌های طیور مصوب دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران می‌باشد. نویسندگان بر خود لازم می‌دانند از حمایت‌های مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی قدردانی نمایند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.