Role of Putative Phosphorylation Sites on Tie2 Receptor in the Interaction between Tumor-Associated Macrophages and Human Endothelial Cells

Document Type : Clinical & Anatomical Pathology

Authors

1 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran

2 Department of Clinical Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran

3 Department of Biothecnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Iran

4 Department of Biophysics, College of Biochemistry and Biophysics, University of Tehran, Tehran, Iran

Abstract

BACKGROUND: Recently, a subpopulation of monocytes expressing Tie2 receptors has been identified, playing an important role in tumor angiogenesis. Selective depletion of Tie2-expressing monocytes in tumor-bearing mice can inhibit tumor angiogenesis. Some of these macrophages have been shown to be located near the tumor blood vessels, forming vessels in these areas paracrinely during the angiogenesis process.
OBJECTIVES: This study aims to investigate the role of putative phosphorylation sites on Tie2 receptor in tumor- associated macrophages connected to human endothelial cells.
METHODS: In this study, we used a series of Tie2 mutants. After transfection of tumor-associated macrophages  with these mutants, they were evaluated for physical connection using the surface plasmon resonance technique and by non-contact co-culture of these macrophages with endothelial cells.
RESULTS: Mutation in the tyrosine residues 1106 and 1111 had an inhibitory effect on macrophage binding to endothelial cells, resulting in deterioration of the angiogenic activity of these cells.
CONCLUSIONS: Tie2 receptor and its downstream molecular pathways such as AKT/PI3 have a role in the interaction of tumor-associated macrophages with human endothelial cells, directly (via physical binding) and indirectly (through secretion of factors affecting angiogenesis). This emphasize the importance of the molecular mechanisms of Tie2 receptor activation in the interactions of endothelial cells with tumor-associated macrophages and as an anti-angiogenic therapy for cancer.

Keywords

Main Subjects

Full Text

مقدمه

پس از آن‌که Folkman در سال 1971 برای نخستین بار فرضیه وابسته بودن رشد تومورها به رگ‌زایی را مطرح نمود (1). روش‌های مختلف درمانی با هدف مهار رگ‌زایی تومور، در حال تحقیق و توسعه می‌باشند. نتایج مطالعات مختلف نشان داده که ماکروفاژهای مرتبط با تومور (TAM) هم رگ‌زایی و هم متاستاز تومور را افزایش می‌دهند. به نظر می‌رسد اعمال پیش توموری TAMs حداقل تا حدودی بستگی به تولید فاکتورهای رشد، فاکتورهای بازسازی بافتی و تعدیل‌کننده سیستم ایمنی دارد. علاوه بر این TAMs در شروع رگ‌زایی تومور که در مراحل اولیه تبدیل ضایعات هیپرپلاستیک به کارسینوم‌ها رخ می‌دهد، نقش دارند. یک زیر مجموعه منحصر به فرد از مونوسیت‌ها، که بیان­کننده پذیرنده تیروزین کیناز  (TEM) Tie2می‌باشند، توسط De Palma و همکاران در سال 2005 شناسایی شدند. نتایج این مطالعه نشان داد که فنوتیپ ماکروفاژهای M2 بیشترین فعالیت رگ‌زایی در بین سلول‌های مشتق از مغز استخوان را دارند و با حذف Tie2 در TEM از رگ‌زایی تومور به طور کامل جلوگیری می‌شود. پذیرنده تیروزین کیناز Tie2 در ابتدا به عنوان پذیرنده اختصاصی عروق که هم در سلول‌های اندوتلیال طبیعی و هم توموری وجود دارد، گزارش شده است. مطالعات جدید نشان می‌دهند بیان پذیرنده Tie2 محدود به عروق خونی نمی‌شود و در انواع مختلفی از سلول‌های ریز محیط تومور، از جمله سلول‌های اندوتلیال، مونوسیت‌های بیان‌کننده Tie2، ماکروفاژهای مرتبط با تومور و پیش‌سازهای سلول‌های مورال عروق که همگی آن‌ها به طور اختصاصی در رگ‌زایی نقش دارند و یا می‌توانند مستقیماً در عروق خونی در حال تشکیل جای بگیرند بیان می‌شود (2).

Tie2 به میزان کمی به وسیله بعضی از مونوسیت‌های خون محیطی بیان می‌شود و به محض لانه‌گزینی در تومورها، بیان آن به ‌طور قابل توجهی افزایش می‌یابد و به ماکروفاژهای اطراف عروقی تمایز می‌یابند. تخلیه تومورها از TEMs در موش سبب مهار آنژیوژنز تومور و رشد آن می‌شود، از آنجا که برخی از  TEMsدر مجاورت عروق خونی تومور در مناطق زنده تومور مستقر می‌شوند، می‌توان نتیجه گرفت که آن‌ها به ‌شکل پاراکراین از عروق در حال تشکیل در این مناطق، طی فرایند رگ‌زایی حمایت می‌کنند (2).

درک واکنش‌های پیچیده متقابل بین رده‌های سلولی مغز استخوان و رگ‌زایی تومور با توجه به توانایی انتقال برنامه‌های پروآنژیوژنیک توسط سلول‌های میلوئید نفوذ‌کننده به تومور که می‌توانند فعالیت داروهای ضد‌ رگ‌زایی را خنثی کنند از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. به‌ نظر می‌رسد ماکروفاژها و مونوسیت‌های بیان‌کننده Tie2 در میان سلول‌های میلوئید، در افزایش رگ‌زایی و رشد تومور نقش پررنگ‌تری داشته باشند. شناخت خصوصیات و اعمال این سلول‌ها در موش و انسان اهداف مولکولی جدیدی را در درمان‌های ضد سرطان پدید می‌آورد. علاوه بر این، از این سلول‌ها جهت انتقال داروهای ضد تومور به ویژه در ریزمحیط تومور می‌توان استفاده کرد. از سوی دیگر، مطالعات مختلف نشان دهنده­ اهمیت مسیر سیگنالینگ Tie2-Ang2 در رشد و رگ‌زایی تومور است، به طوری که مهار مسیر سیگنالینگ Ang2 سبب مهار آنژیوژنز و القای تحلیل عروقی در چندین مدل تومور از جمله تومورهایی که به درمان ضد VEGF مقاوم می‌باشند، شده است و در سلول‌های TEMs نیز مانع افزایش بیان Tie2 که باعث ایجاد ارتباط این سلول‌ها با عروق خونی تومور و فعالیت رگ‌زایی آن‌ها می‌شود، گردید. هر چند که نقش مهار این مسیر در مطالعات مختلف مورد مطالعه قرار گرفته است، اما فرایندهای مولکولی و اهمیت درمانی آن به عنوان یک هدف مولکولی هنوز مبهم مانده است. مهار فسفریلاسیون Tie2 با واسطه‌ آنژیوپویتین 1 در شرایط آزمایشگاهی باعث کاهش زنده مانی و مهار رگ‌زایی و رشد تومور در شرایط بدن شد. سیستم آنژیوپویتین-Tie2 نه تنها در فرایند رگ‌زایی و هموستاز عروقی ضروری است بلکه باعث ایجاد ارتباطات مهم بین مسیرهای آنژیوژنیک و مسیرهای التهابی می‌شود. در نتیجه این یافته‌ها اهمیت درک مکانیسم‌های مولکولی فعال‌سازی پذیرنده Tie2 در بر همکنش‌های سلول‌های اندوتلیال با ماکروفاژهای تومور و نیز درمان‌های ضد رگ‌زایی سرطان را ضروری می‌سازد (3، 4).

مواد و روش کار

در مطالعه حاضر جهت تهیه ماکروفاژهای مرتبط با تومور (TAM) سلول‌های لاین ماکروفاژ موش RAW 264.7 را در محیط رویی حاصل از سلول‌های سرطان 4T1 طی مراحل زیرکشت داده شد (5، 6).

کشت سلول 4T1 و تهیه محیط رویی: رده سلولی 4T1 که به عنوان سلول‌های سرطان پستان موش [American Type Culture Collection (ATCC) catalogue no. CRL-2539, 2004]. شناخته می‌شوند، این تومور یک مدل حیوانی برای مرحله چهار سرطان پستان انسان است و از نوع سلول‌های اپیتلیال چسبنده می‌باشد. سلول‌ها در محیط RPMI-1640 با 10 درصد سرم جنین گاو 100 واحد در میلی‌لیتر پنی‌سیلین، 100 میکروگرم در میلی‌لیتر استرپتومایسین کشت داده و در انکوباتور مرطوب 37 درجه سانتی‌گراد با 5 درصد CO2 نگهداری شدند. پس از آن‌که رشد سلول‌ها به 80 تا 90 درصد تراکم فلاسک رسید 3 مرتبه با بافر  PBS استریل شستشو داده و سپس محیط کشت RPMI-1640 بدون سرم اضافه شد و سلول‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. محیط رویی تومور پس از جمع‌آوری با فیلتر پلاستیکی 2/0میکرومتر فیلتر و جهت استفاده بعدی در فریزر20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد (5).

کشت سلول :RAW 264.7 لاین سلول نیمه چسبنده لوکمی مونوسیت/ماکروفاژ موش RAW 264.7 در محیط کشت RPMI -1640  با 10 درصد سرم جنین گاو 100 واحد در میلی‌لیتر پنی‌سیلین، 100 میکروگرم در میلی‌لیتر استرپتومایسین در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور 5 درصد CO2 کشت داده شدند. پس از آن که با مشاهده میکروسکوپی، تراکم سلول‌هایRAW 264.7  به 50 درصد ظرفیت فلاسک رسید محیط رویی دور ریخته شد، فلاسک‌ها 3 مرتبه با بافر سالین استریل شسته شده و محیط جدید RPMI 1640 به همراه 10 درصد سرم جنین گاو و 30 درصد از محیط رویی 4T1 اضافه و به مدت 48 ساعت انکوبه شد (5).

کشت سلول‌های ورید نافی انسان (HUVEC): جهت همکشتی سلول‌های اندوتلیال با سلول‌های ماکروفاژ و بررسی رفتار سلولی آن‌ها سلول‌های لاین اندوتلیال ورید ناف انسان HUVEC را در محیط کشتDMEM/F12  با 10 درصد سرم جنین گاوی، 100 واحد در میلی‌لیتر پنی‌سیلین، 100 میکروگرم در میلی‌لیتر استرپتومایسین در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور 5 درصد CO2 کشت داده شدند.

ترانسفورماسیون پلاسمید نوترکیب: جهت ترانسفورماسیون پلاسمید نوترکیب cDNA ژن Tie2 در داخل وکتور به همراه جهش در جایگاه مربوطه (Y1100F, Y1106F,Y1111F) استفاده گردید (7).

به ­منظور ترانسفکت سلول‌های RAW264.7 از کیت تجاری X-tremeGENETMHP DNA Transfection Reagent استفاده و تمام مراحل براساس پروتکل کیت انجام شد که به طور خلاصه شامل مراحل زیر است:

سلول‌ها از نظر تراکم و زنده بودن شمارش و ارزیابی گردید. تعداد 105×2 سلول در 1 میلی‌لیتر محیط رشد کامل در هر چاهک پلیت 6 خانه‌ای کشت داده شد. در روز ترانسفکشن تراکم سلولی باید 80-50 درصد باشد. سلول‌ها به مدت یک شب در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور 5 درصد CO2 انکوبه گردید.

محیط‌های قدیمی دور ریخته شده و محیط رشد کاملاً تازه جایگزین گردید. در ابتدا DNA پلاسمید و اجزای کیت را به دمای اتاق رسانده، 2/0 میکرولیتر (1/0 میکروگرم/میکرولیتر) DNA پلاسمید اضافه شد. با پیپت کردن آرام آرام مخلوط و سپس 4 میکرولیتر معرف کیت به مخلوط DNA رقیق شده اضافه گردید. کمپلکس‌های DNA در دمای اتاق به مدت 15 دقیقه انکوبه شد و کمپلکس‌ها با اضافه کردن به صورت قطره‌ای در بین سلول‌ها توزیع شدند. به آرامی ظرف کشت را به عقب و جلو و از یک طرف به طرف دیگر تکان داده شد تا به طور مساوی توزیع شود. پس از ترانسفکشن به مدت 72-24 ساعت، سلول‌ها انکوبه شدند. محیط ترانسفکت، 24 ساعت پس از ترانسفکت با محیط رشد کامل جایگزین گردید.

جداسازی سلول‌هایTie-2+  و Tie-2-  از TAMs با استفاده از آنتی بادی‌های متصل به بید: وجود جمعیت‌های مختلف در یک رده سلولی را می‌توان با این روش از هم جدا نمود که اساس آن اتصال آنتی بادی‌های اولیه کونژوگه با بید به آنتی ژن‌های سطحی سلول‌ها می‌باشد. سلول‌های RAW ترانسفکت شده جدا و حدود 20 میلیون سلول، برای جداسازی سلول‌های Tie-2+ و Tie-2- در نظر گرفته شد. سلول‌ها را در کنار یخ قرار داده و دو بار با بافر مکس شستشو داده شدند. سلول‌ها در 500 میکرولیتر بافر مکس و در ستون مکس قرار داده شدند. 5/0 میکروگرم از آنتی بادی اولیه کونژوگه به بیوتین را به مدت 30 دقیقه به سلول افزوده و در مرحله بعد، به مدت 20 دقیقه آنتی بادی ثانویه استرپتاویدین متصل به بید اضافه شد. در پایان جمعیت‌های Tie2- و Tie2+ جدا شدند. جمعیت منفی طبق پروتکل کشت سلول‌های RAW کشت داده شده و برای اهداف دیگر مورد استفاده قرار گرفتند.

تشکیل تیوب: به منظور بررسی اثر فاکتورهای ترشح شده توسط ماکروفاژها پس از ترانسفکت بر روی رفتار سلول‌های اندوتلیال، یک سیستم همکشتی غیر تماسی با استفاده از پلیت مخصوص با غشاء منفذدار طراحی شد.

برای بررسی تشکیل لوله، ابتدا ماتریژل را در دمای 4 درجه سانتی‌گراد ذوب و مقدار 50 لاندا از آن را در کف پلیت ریخته و به مدت نیم ساعت در انکوباتور قرار داده شد. 104×1 سلول HUVEC به همراه 100 میکرولیتر محیط کشت DMEM با 1 درصد سرم جنین گاوی به گودی­های حاوی ماتریژل اضافه و سپس بر روی سطح بالایی ماکروفاژهای ترانسفکت شده کشت گردید. پس از آن پلیت داخل انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد با رطوبت 96 و 5 درصد C02 قرار داده شد. برای هر آزمایش 3 چاهک در نظر گرفته شد. بعد از گذشت 24-18 ساعت از هر چاهک توسط میکروسکوپ معکوس متصل به دستگاه تصویر‌برداری دیجیتالی عکس‌برداری و آنالیز انجام شد. آنالیز کمی آنژیوژنز از طریق بررسی 25 کلونی در هر چاهک انجام گردید و امتیاز بین 0 تا 4 برای هر کلونی در نظر گرفته شد: 1- تجمع سلولی بدون جوانه زدن، 2- جوانه زدن بدون دو شاخه شدن، 3- با آناستوموز و 4- با تشکیل تیوب امتیاز نهایی هر چاهک با جمع زدن امتیاز 25 کلونی و با احتساب حداکثر 100 امتیاز محاسبه گردید. میانگین طول هر تیوب در 5 زمینه‌ میکروسکوپی با استفاده از نرم افزار image-analyzing software (Sight DS-L2; Nikon) بر حسب میکرو‌متر اندازه‌گیری شد.

اندازه‌گیری تعامل فیزیکی سلول‌های اندوتلیال انسان با ماکروفاژها با استفاده از تشدید پلاسمون سطحی :(SPR) از روش SPR برای ارزیابی نقش هر یک از جایگاه‌های پذیرنده Tie2 در اتصال فیزیکی بین ماکروفاژ و سلول اندوتلیال استفاده شد. برای ارزیابی اثر متقابل ماکروفاژها با گیرنده Tie2 جهش یافته با سلول‌های اندوتلیال، 500 میکرومولار DMEM / HG حاوی 105×5 سلول اندوتلیال وریدی ناف انسان (HUVECs)  به آرامی روی سنسور طلای SPR قرار گرفتند و به سلول‌ها برای اتصال به سطح شیشه‌ای 30 دقیقه زمان داده شد. شیشه‌ها درون پلیت کشت سلول قرار داده شدند و تا زمان رسیدن تراکم سلول‌هایHUVEC  به تک لایه سلولی، کشت داده شدند. به منظور تجزیه و تحلیل این که آیا اتصال HUVEC روی سطح طلا باعث تغییر در ضریب شکست می‌شود، هرگونه تغییر در منحنی SPR در بین شیشه‌های عاری از سلول و شیشه‌های دارای HUVEC با استفاده از دستگاه SPR چند پارامتری ثبت شد. سنسورهای طلای تازه در اسلایدهای نگه دارنده  SPR قرار داده شدند. سپس تغییر زاویه SPR سنسور طلای فاقد سلول و سنسوگرام‌های مربوط به آن هنگام تزریق ماکروفاژها از گروه‌های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. پس از آن ،105×2 کنترل و ماکروفاژهای اصلاح شده در 500 میکرولیتر PBS به حالت تعلیق در آمدند و به سطح طلای حاوی HUVECs در دمای 35 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه با سرعت جریان 15 میکرولیتر در دقیقه تزریق شدند.

نتایج

بررسی تشکیل تیوب بر روی ماتریژل به دنبال کشت سلول‌های Tie 2- القا شده با وکتور Tie 2 جهش یافته نشان داد که ساختار تیوب تحت القا با Tie 2 جهش یافته در جایگاه 1100 افزایش می‌یابد و از لحاظ آماری معنی‌دار بود (تصویر B1). این نتایج حاکی از نقش Tie 2 در القای رگ‌زایی در سلول‌های اندوتلیال به‌ شکل غیر‌مستقیم است. در واقع جهش در جایگاه‌های 1106 و 1111 Tie2 سلول‌های TAM را به سمت سلول‌های ضد آنژیوژنیک سوق می‌دهد. موتاسیون جایگاه‌های 1106 و 1111 در Tie 2 به صورت معنی‌داری باعث کاهش میزان تشکیل تیوب در سیستم هم‌کشتی سلول‌های TAM با سلول‌های اندوتلیال تحت القا با وکتور جهش یافته Tie 2 شد (نمودار 1).

عکس‌برداری با میکروسکوپ زمینه روشن از تراشه‌های طلای SPR نشان دادکه سلول‌های HUVEC در زمان کشت به طور یکنواخت روی سطح شیشه پخش می‌شوند (شکل سلول‌ها پس از سه روز به طور مناسب روی سطح هدف رشد و گسترش یافته و یک لایه منفرد سلولی را تشکیل دادند (تصویرA 2) .تغییر زاویه پایه از 70/69 به 30/71 درجه چسبندگی و بی‌حرکتی HUVECs روی سطح تراشه را تأیید کرد. با توجه به تشکیل تک لایه سلولی روی سطح طلا، سیگنال SPR تغییر در ضریب شکست در نزدیکی سطح پوشیده شده با سلول‌های HUVEC را نسبت به سطح فاقد سلول نشان داد. سنسورهای SPR نشان دادند، ماکروفاژهای گروه 1100 ظرفیت اتصال بیشتری به HUVECs نسبت به سایر گروه‌ها دارند. بر اساس داده‌ها، مقادیر واحد پاسخ (RU) به دست ‌آمده برای اتصال گروه 1100 نزدیک به RU×10-4 50 بود در حالی که مقدار RU مربوط به سایر گروه‌ها و گروه کنترل نزدیک RU×10-40 بود. هیچ تفاوتی در تعامل ماکروفاژ و HUVEC در گروه‌های کنترل، 1101، 1106 مشاهده نشد (تصویرB2). این نتایج نشان می‌دهد می‌توان با جهش در جایگاه خاصی از پذیرندهTie2  برهم کنش و تمایل ماکروفاژها با سلول‌های اندوتلیال عروقی را کنترل کرد که در ارتقاء و کنترل پاسخ‌های التهابی در بافت هدف، مؤثر است.

بحث

اکنون کاملاً پذیرفته شده است که رشد و گسترش تومورهای بدخیم نیاز به رگ‌زایی دارد، فرایندی که از طریق آن عروق خونی جدید از عروق موجود جوانه می‌زند. Shirakawa و همکاران در سال 2002 با استفاده از واکنش نیمه کمی PCR معکوس نشان دادند که فاکتورهای آنژیوژنیک و نه فاکتورهای لمفانژیوژنیک در سرطان پستان التهابی (IBC)،که نوعی از سرطان پستان است که علی‌رغم پیشرفت‌های اخیر در درمان پیش آگهی ضعیفی دارد، در مقایسه با تومورهای غیر التهابی افزایش پیدا کرده است. آنالیز ایمونوهیستوشیمی نمونه‌ها افزایش قابل توجه جمعیت سلول‌های اندوتلیال نفوذ کننده به تومور و سلول‌های پیش ساز اندوتلیال (EPC) در استرومای نمونه‌های IBC در مقایسه با نمونه‌های غیر IBC را نشان داد، تومورها صرفاً از سلول‌های سرطانی تشکیل نشده‌اند (8). ریز محیط تومور که تشکیل شده از سلول‌های استرومایی (بخش سلولی) و اجزای ماتریکس خارج سلولی (ECM)(بخش غیر سلولی) نقش مهمی در پیشرفت و تهاجم تومور بازی می‌کند (9). اخیراً مشخص شده مقاومت یا بازگشت تومور پس از درمان باعث القای خروج سلول‌های میلوئید از مغز استخوان می‌شود. زمانی که سلول‌های میلوئید وارد تومور می‌شوند با آزاد کردن فاکتورهای رگ‌زا و tissue-remodeling سبب پیشرفت رگ‌زایی و هم چنین باعث تحریک سلول‌های تومور برای ورود به درون عروق خونی، توزیع و متاستاز آن‌ها می‌شوند. سلول‌های مختلف ایمنی وارد ریز محیط تومور می‌شوند و اعمال ضد توموری آن‌ها تا حد زیادی در پاسخ به سیگنال‌های مشتق شده از تومور کاهش می‌یابد. سلول‌های ایمنی در ریز محیط تومور نه تنها توانایی انجام اعمال ضد توموری مؤثر ندارند، بلکه در تقویت رشد تومور همکاری می‌کنند. فرار تومور از سیستم ایمنی از طریق فعال‌سازی یک یا چند مکانیسم مولکولی که منجر به مهار عملکرد سلول‌های ایمنی یا آپوپتوز سلول‌های ضد تومور می‌شود انجام می‌گیرد (10).

ماکروفاژها معمولاً فراوان‌ترین جمعیت ایمنی موجود در ریز محیط تومور می‌باشند (11). این احتمال که ماکروفاژها قادر به تعدیل رگ‌زایی باشند، برای اولین بار توسط Sunderkotter و همکاران در سال 1991 ارائه شد. از آن زمان تاکنون برای ارائه تصویری دقیق از مکانیسم­های احتمالی مورد استفاده ماکروفاژها برای تنظیم آنژیوژنز در تومورها، توضیحات زیادی ارائه شده است. De Palma و همکاران در سال 2005 در تومورهای پستانی N202 زیر جلدی موش بیان Tie 2 را در سه نوع سلول مجزا :ECs، سلول‌های پروآنژیوژنیک با منشأ هماتوپویتیک و پیش‌سازهای پری سیت با منشأ مزانشیمال را شناسایی کردند. آن‌ها نشان دادند که مونوسیت‌های بیان کننده Tie2 (TEMs) یک رده هماتوپویتیک مجزا از سلول‌های ضد آنژیوژنیک می‌باشند که به طور انتخابی وارد تومورهای خود به خودی و orthotopic می‌شوند و رگ‌زایی را به شکل پاراکراین افزایش می‌دهند و بیشترین فعالیت رگ‌زایی را در میان سلول‌های میلوئید تومور دارند. knockout TEM  کاملاً از نوعروق‌زایی در تومور گلیوما انسان در مغز موش جلوگیری کرد و متعاقباً باعث تحلیل تومور شد (12). Liu و همکاران در سال 2010 با استفاده از RNA کوچک مداخله کننده اختصاصی (siRNA) بیان Tie2 را knockdown کردند که باعث مهار توانایی چسبیدن سلول‌های گلیوما به سلول‌های اندوتلیال شد. فعال شدن Tie2 سبب القای افزایش بیان اینتگرینβ1 و N- کادهرین گردید و آنتی بادی‌های خنثی‌کننده علیه این مولکول‌ها باعث مهار چسبیدن سلول‌های Tie2 مثبت به سلول‌های اندوتلیال شد. در کشت‌های 2 بعدی و 3 بعدی فعال‌سازی محور Ang1/Tie 2 با افزایش تهاجم سلول‌های گلیوما مرتبط بود که این فرایند با استفاده از Tie2 siRNA مهار شد. کاشت همزمان سلول‌های گلیوما Tie2 مثبت همراه با سلول‌های اندوتلیال در موش‌های مدل آزمایشگاهی منجر به ایجاد تومورهای با تهاجم منتشر همراه با کلاسترهای سلولی که عروق شبه گلومرولوئید را احاطه کرده بودند؛ شد که توزیع نیش تومور را تقلید می‌کردند. نتایج این مطالعه نشان دهنده نقش مسیر سیگنالینگ Tie2 در کنش متقابل سلول‌های گلیوما با ریز محیط تومور است (13).

ماکروفاژها مقادیر فراوانی از اگزوزوم‌ها و سایر میکرووزیکول‌ها را در شرایط آزمایشگاهی آزاد می‌کنند (14، 15). در برخی از مطالعات مشخص شد، میکرووزیکول‌های مشتق از ماکروفاژ حاوی میکرو RNA‌ها (miRNA) می‌باشند که ممکن است به سلول‌های پذیرنده منتقل شوند به عنوان مثال، Zhang و همکاران در سال 2010 نشان دادند مونوسیت‌های THP1 لوسمیک انسان، اگزوزوم‌های غنی از miR-150 را ترشح می‌کنند. جالب این که، اگزوزوم‌های مشتق شده از THP1 با ECهای لاین HMEC1 انسان جوش می‌خورند و سطح miR-150 اندوژن آن‌ها را چندین برابر افزایش می‌دهند. اگرچه نحوه دقیق انتقال miRNA فعال از مونوسیت‌ها به EC‌ها به مطالعات بیشتری نیاز دارد، اما Zhang و همکاران در سال 2010 شواهدی اساسی مبنی بر وجود اگزوزوم‌های مشتق شده از ماکروفاژها برای تأثیر بر رفتار EC در شرایط in vitro را نشان دادند. در حقیقت، اگزوزوم‌های تخلیص شده از مونوسیت‌های THP1 می‌توانند مهاجرت سلول‌های HMEC1 را در روش transwell assay افزایش دهند (14).

این یافته‌ها نشان می‌دهد، ماکروفاژهای اطراف عروقی ممکن است اگزوزوم‌های غنی از پروتئین‌های خاص یا RNA ترشح کنند، که به نوبه خود می‌توانند بیان ژن و عملکرد EC‌های مربوط به آنژیوژنز را تنظیم کنند.

 نکته قابل توجه، رگ‌زایی عروق خونی و توموری به طور خاص، با عروق در حالت سکون فرق می­کند. سلول‌های مورال در لایه‌های اطراف اندوتلیالی عروق (پری‌سیت‌ها و سلول‌های عضلات صاف) و یکپارچگی غشاءهای پایه اندوتلیال اغلب در طی رگ‌زایی از هم گسیخته می‌شوند تا EC بتواند مهاجرت و رشد کند (15، 16). بر اساس این تغییرات میکروآناتومیک می‌توان تصور کرد، ماکروفاژهای اطراف عروقی در طی رگ‌زایی می‌توانند از طریق ترشح میکرووزیکول‌ها و انتقال آن به ECها، بر بیولوژی و الگوی عروقی تأثیر بگذارند. در حال حاضر برای درک اهمیت این پدیده در رگ‌زایی در داخل بدن مطالعات بیشتری مورد نیاز است.

موارد بالا نشان می‌دهد، فعالیت پروآنژیوژنیک ماکروفاژها (یا زیرمجموعه‌های خاص از این سلول‌ها) هم شامل تولید فاکتورهای پروآنژیوژنیک کلاسیک می‌شود و هم ارتباط فیزیکی ماکروفاژها با رگ‌های خونی در حال جوانه زدن می‌شود. در حالت ارتباط فیزیکی نیاز به تعامل مستقیم ECها با ماکروفاژها M2 است، فرایندی که به نظر می‌رسد، حداقل در بخشی، توسط محورهای سیگنالینگ Ang2 / Tie2 و CXCL12 / CXCR4 تنظیم می‌شود (17، 18) مطالعات جدیدتر نشان می‌دهد، فعل و انفعالات ماکروفاژ-EC در واقع دو طرفه است، زیرا مطالعات هم‌کشتی آزمایشگاهی نشان داد، تک‌لایه‌های EC می‌تواند از تمایز این ماکروفاژهای شبه M2 از پیش‌سازهای میلوئیدی پشتیبانی کند زیرا این سلول‌ها (یا پیش سازهای آن‌ها) از رگ خارج شده و در دیواره رگ اقامت می‌کنند (19).

 در این مطالعه با هدف بررسی نقش هر یک از جایگاه‌های فسفریلاسیون پذیرنده Tie2 در اتصال فیزیکی ماکروفاژها به سلول‌های اندوتلیال و نیز در برهمکنش غیر مستقیم آن‌ها در رگ‌زایی از یکسری از وکتورهای با Tie2 جهش‌یافته استفاده شده که پس از ترانسفکت ماکروفاژهای مشتق از تومور با این وکتورهای جهش‌یافته با استفاده از روش SPR اتصال فیزیکی بررسی شده است.

ماکروفاژها علاوه بر تولید فاکتورهای رشد متعارف در رگ‌زایی، ممکن است رگ‌زایی را با ترشح MV، مانند اگزوزوم‌ها نیز تحریک کنند (20). بنابراین با طراحی یک مدل همکشتی غیر‌تماسی با استفاده از پلیت‌های اینزرت دارای غشاء منفذدار اثر این پذیرنده بر فاکتورهای مترشحه احتمالی از ماکروفاژها و تأثیر آن بر روی آنژیوژنز و رفتار سلول‌های اندوتلیال، ارزیابی شده است.

جهت تهیه TAM از محیط رویی تومور 4T1 استفاده شده است نتایج حاصل از فلوسیتومتری نشان‌دهنده افزایش MRC1 به عنوان شاخص فنوتیپ ماکروفاژهای M2 بود که این یافته با داده‌های حاصل از مطالعه Benner و همکاران در سال 2019 و نیز Houck و همکاران در سال 2019 مطابقت داشت که نشان دهنده اهمیت سیگنال‌های موجود در ریزمحیط تومور در تغییر فنوتیپ و رفتار سلول‌های التهابی به سمت حمایت از تومور است (6، 21).

تعداد زیادی از مطالعات تا کنون نشان می‌دهند، ماکروفاژهای اطراف عروق بیولوژی EC‌ها را در طی رگ‌زایی و بازسازی عروق تنظیم می‌کنند. نتایج به دست آمده از SPR نشان می‌دهد، تیروزین جایگاه 1100 بر اتصال ماکروفاژهای Tie2 به سلول‌های اندوتلیال بی اثر است و یا اثر ممانعتی دارد به ‌طوری که در گروه با جهش در این جایگاه اتصال فیزیکی بیشتر بود و نیز رگ‌زایی بهتر انجام گرفت و بنابراین نشان دهنده‌ اهمیت جایگاه‌های 1106 و 1111 در اتصال فیزیکی ماکروفاژها به سلول‌های اندوتلیال و القای آنژیوژنز است. همچنین این نتایج نشان‌دهنده اهمیت اتصالات فیزیکی ماکروفاژها در القای آنژیوژنز به صورت پاراکراین می‌باشد.

Siavashi و همکاران در سال 2019 با استفاده از موتاسیون‌های Tie2 در سلول‌های EPC و بررسی رفتار ایجاد تیوب و مهاجرت آن‌ها بر روی ماتریژل نشان دادند که موتاسیون در جایگاه 1106 پذیرنده Tie2 این سلول‌ها را به سمت فنوتیپ سلول‌های اندوتلیال بالغ می‌برد و تیروزین 1106 نقش مهمی در حفظ ویژگی‌های EPC به عنوان سلول‌های بنیادی دارد (22) که با نتایج مطالعه حاضر مغایرت داشت. از طرف دیگر، تا کنون مطالعات زیادی در مورد منشأ TAMها انجام شده و هر چند که معمولاً مونوسیت‌ها به عنوان پیش‌سازهای TAM توصیف می‌شوند، هنوز مشخص نیست که کدام یک از دو جمعیت اصلی مونوسیت‌های در گردش خون، مونوسیت‌های التهابی "Ly6C++ " یا رزیدنت Ly6C-"" منبع اصلی TAM در موش‌ها است (23، 24). محققینی چون Asahara و همکاران در سال 1997 منشأ مشترکی را با سلول‌های پیش ساز اندوتلیال (EPC) فرض می‌کنند زیرا EPCهای هماتوپویتیک و در گردش خون از مغز استخوان (BM) منشأ می‌گیرند و توانایی تمایز به سلول اندوتلیال و شرکت در رگ‌زایی خونی و لنفاوی را دارند (25). نقش EPC در عروق تومورهای موش برای اولین بار توسط Lyden و همکاران در سال 2001  اعلام شد، که گزارش دادند پیوند سلول‌های بنیادی نوع وحشی مغز استخوان به موش‌های دارای نقص رگ‌زایی توانست رشد تومور و آنژیوژنز را بازیابی کند (26). EPC‌‌های عروق خونی و لنفاوی در انسان از پروژنیتورهای CD34+ مغز استخوان منشأ می‌گیرند و دارای مارکرهای اختصاصی سلول‌های اندوتلیال بالغ مانند Tie-1، Tie-2 ، VEGFR-2 ، VEGFR-3 یا کادهرین اندوتلیال عروقی می‌باشند (27). اخیراً، گزارش شده EPC،CD34+ CD133+ توانایی تمایز به سلول‌های اندوتلیال لنفاوی میلوئیدی (LEC) بیان کنندهVEGF-A ، C و D را در شرایط آزمایشگاهی دارند که به طور مداوم فعالیت‌های همانژیوژنیک و لنفاژیوژنیک را نشان می‌دهد (28). سرانجام و از همه مهم‌تر، سلول‌های میلوئیدی LEC در شرایط آزمایشگاهی در حضور پلاسمای بیمار تمایز می‌یابند و هم فنوتیپ و هم اعمال آنژیوژنیک TEMهای تومورهای پستانی را نشان می‌دهند (28). در حالی که نتایج حاصل از مطالعه حاضر نشان دهنده نقش و عمل متفاوت پذیرنده Tie2 در این دو نوع سلول است از این رو، ارتباط نسبی EPC با مونوسیت‌های آنژیوژنیک یا TEM و همچنین میزان سهم آن‌ها در نئوواسکولاریزاسیون سرطان‌های انسانی نیاز به مطالعات بیشتری دارد. Jones و همکاران در سال 2003 نشان دادند، به طور کلی جایگاه تیروزین 1106 Tie2 به عنوان جایگاه فسفریلاسیون وابسته به Ang1 است و باعث فعال شدن پروتئین‌های وابسته به تیروزین کیناز (DOK-R) می‌شود. در حالی که جایگاه 1100 و 1111 در انتهای دم کربوکسیل پذیرنده قرار دارد و به ناحیه Src homology 2 (SH2) زیر واحد P58 از اینوزیتول تری‌کیناز (PI3K) متصل و فسفریله می‌شود و مسیرهای سیگنالینگ پایین دست از جمله AKT را فعال می‌کند و باعث مهاجرت سلول‌های اندوتلیال و بقای آن‌ها می‌شود. نتایج مطالعات نشان می‌دهد فعال شدن PI3K وAKT در بخش‌هایی از Tie2 در تکوین عروق جنین و رگ‌زایی پاتولوژیکی نقش دارد که با نقش Tie2 در بقای سلول‌های اندوتلیال سازگاری دارد (7).

نتیجه‌گیری نهایی: سیستم آنژیوپویتین-Tie2 نه تنها در فرایند رگ‌زایی و هموستاز عروقی ضروری است بلکه باعث ایجاد ارتباطات مهم بین مسیرهای آنژیوژنیک و مسیرهای التهابی می‌شود (3، 4). نتایج مطالعه حاضر نشان دهنده نقش مسیر سیگنالینگ Tie2 در کنش متقابل سلول‌های ماکروفاژ با سلول‌های اندوتلیال هم به‌صورت مستقیم به شکل ارتباط فیزیکی و هم غیر‌مستقیم از طریق ترشح فاکتورهای مؤثر بر رگ‌زایی می‌باشد. به علاوه مطالعه حاضر نشان داد اعمال هر یک از جایگاه‌های فسفریلاسیون این پذیرنده و مسیرهای پایین دست آن در سلول‌های اندوتلیال و EPC در مقایسه با ماکروفاژهای مشتق شده از تومور متفاوت است که هنوز مشخص نیست این تغییر بسته به شرایط محیطی و وجود فاکتورهای مختلف تغییر می‌کند یا خیر؟ در نتیجه این یافته‌ها اهمیت درک مکانیسم‌های مولکولی فعال‌سازی پذیرنده Tie2 در بر همکنش‌های سلول‌های اندوتلیال با ماکروفاژهای تومور و نیز درمان‌های ضد رگ‌زایی سرطان را ضروری می‌سازد.

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله بر خود واجب می‌دانند از مسئولین آزمایشگاه دکتر رستگار، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران برای تأمین تجهیزات مورد نیاز مطالعه حاضر و همچنین از دکتر رضا رهبر قاضی و دکتر وحید سیاوشی به‌ پاس محبت و مساعدت‌های فراوانی که در انجام مراحل مختلف این مطالعه داشتند، تشکر و قدردانی کنند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

References

  1. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat Med. 1995;1(1):27-31. doi: 10.1038/nm0195-27 PMID: 7584949
  2. De Palma M, Venneri MA, Galli R, Sergi LS, Politi LS, Sampaolesi M, et al. Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proAngiogenic monocytes required for tumor vessel formation and a mesenchymal population of pericyte progenitors. Cancer Cell. 2005;8(3):211-226. doi: 10.1016/j.ccr.2005.08.002 PMID: 16169466
  3. Daly C, Eichten A, Castanaro C, Pasnikowski E, Adler A, Lalani AS, et al. Angiopoietin-2 functions as a Tie2 agonist in tumor models, where it limits the effects of VEGF inhibition, Cancer Res. 2013;73(1):108-18. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-12-2064 PMID: 23149917
  4. Hayes AJ, Li LY, Lippman ME. Anti-vascular therapy: a new approach to cancer treatment. West J Med. 2000;172(1):39-42. doi: 10.1136/ewjm.172.1.39 PMID: 18751215
  5. Deng R, Wang SM, Yin T, Ye TH, Shen GB, Li L, et al. Dimethyl sulfoxide suppresses mouse 4T1 breast cancer growth by modulating tumor-associated macrophage differentiation. J Breast Cancer. 2014;17(1):25-32. doi: 10.4048/jbc.2014.17.1.25 PMID: 24744794
  6. Benner B, Scarberry L, Suarez-Kelly LP, Duggan MC, Campbell AR, Smith E, et al. Carson WE 3rd. Generation of monocyte-derived tumor-associated macrophages using tumor-conditioned media provides a novel method to study tumor-associated macrophages in vitro. J Immunother Cancer. 2019;7(1):140. doi: 10.1186/s40425-019-0622-0 PMID: 31138333
  7. Jones N, Chen SH, Sturk C, Master Z, Tran J, Kerbel RS, et al. A unique autophosphorylation site on Tie2/Tek mediates Dok-R phosphotyrosine binding domain binding and function. Mol Cell Biol. 2003;23(8):2658-2668. doi: 10.1128/MCB.23.8.2658-2668.2003 PMID: 12665569
  8. Shirakawa K, Shibuya M, Heike Y, Takashima S, Watanabe I, Konishi F, et al. Tumor-infiltrating endothelial cells and endothelial precursor cells in inflammatory breast cancer. Int J Cancer. 2002;99:344-351. doi: 10.1002/ijc.10336 PMID: 11992402
  9. Whiteside TL. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 2008;27(45):5904-12. doi: 10.1038/onc.2008.271 PMID: 18836471
  10. Baghban R, Roshangar L, Jahanban-Esfahlan R, Seidi K, Ebrahimi-Kalan A, Jaymand M, et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Commun Signal. 2020;18:1-19. . doi: 10.1186/s12964-020-0530-4 PMID: 32264958
  11. Allavena P, Sica A, Solinas G, Porta C, Mantovani A. The inflammatory micro-environment in tumor progression: The role of tumor-associated macrophages. Crit Rev Oncol Hematol. 2008;66(1):1-9. doi: 10.1016/j.critrevonc.2007.07.004 PMID: 17913510
  12. Sunderkotter C, Goebeler M, Schulze-Osthoff K. Macrophage-derived angiogenesis factors. Pharmacol Ther. 1991;51(2):195-216. doi: 10.1016/0163-7258(91)90077-y PMID: 1784630
  13. Liu D, Martin V, Fueyo J, Lee OH, Xu J, Cortes-Santiago N, et al. Tie2/TEK modulates the interaction of glioma and brain tumor stem cells with endothelial cells and promotes an invasive phenotype. Oncotarget. 2010;1(8):700. doi: 10.18632/oncotarget.101204 PMID: 21321379
  14. Zhang Y, Liu D, Chen X, Li J, Li L, Bian Z, et al. Secreted monocytic miR-150 enhances targeted endothelial cell migration. Mol Cell. 2010;39(1):133-44. doi: 10.1016/j.molcel. 2010.06.010 PMID: 20603081
  15. Potente M, Gerhardt H, Carmeliet P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 2011;146(6):873-87. doi: 10.1016/j.cell.2011.08.039 PMID: 21925313
  16. Weis SM, Cheresh DA. Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets. Nat Med. 2011;17(11):1359-1370. doi: 10.1038/nm.2537 PMID: 22064426
  17. Grunewald M, Avraham I, Dor Y, Bachar-Lustig E, Itin A, Yung S, et al. VEGF-induced adult neovascularization: recruitment, retention, and role of accessory cells. Cell. 2006;124(1):175-89. doi: 10.1016/j.cell.2005.10.036 PMID: 16413490
  18. Mazzieri R, Pucci F, Moi D, Zonari E, Ranghetti A, Berti A, et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 2011;19(4):512-26. doi: 10.1016/j.ccr. 2011.02.005 PMID: 21481792
  19. He H, Xu J, Warren CM, Duan D, Li X, Wu L, Iruela-Arispe ML. Endothelial cells provide an instructive niche for the differentiation and functional polarization of M2-like macrophages. Blood. 2012;120(15):3152-62. doi: 10.1182/blood-2012-04-422758 PMID: 22919031
  20. Théry C, Zitvogel L, Amigorena S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2002;2(8):569-79. doi: 10.1038/nri855 PMID: 12154376
  21. Houck KA, Leung DW, Rowland AM, Winer J, Ferrara NJ. Dual regulation of vascular endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisms. J Biol Chem. 1992;267(36):26031-26037. . PMID: 1464614
  22. Siavashi V, Nassiri SM, Rahbarghazi R, Mohseni Z, Sharifi AM. Distinct Tie2 tyrosine phosphorylation sites dictate phenotypic switching in endothelial progenitor cells. J Cell Physiol. 2019;234(5):6209-6219. doi: 10.1002/jcp.27349 PMID: 30246247
  23. Movahedi K, Laoui D, Gysemans C, Baeten M, Stangé G, Van den Bossche J, et al. Different tumor microenvironments contain functionally distinct subsets of macrophages derived from Ly6C (high) monocytes origin and functions of tumor macrophage subsets. Cancer Res. 2010;70(14):5728-5739. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-09-4672 PMID: 20570887
  24. MacDonald KP, Palmer JS, Cronau S, Seppanen E, Olver S, Raffelt NC, et al. An antibody against the colony-stimulating factor 1 receptor depletes the resident subset of monocytes and tissue-and tumor-associated macrophages but does not inhibit inflammation. Blood. 2010;116(19):3955-3963. doi: 10.1182/blood-2010-02-266296 PMID: 20682855
  25. Asahara T, Murohara T, Sullivan A, Silver M, van der Zee R, Li T, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 1997;275(5302):964-966. doi: 10.1126/science.275.5302.964 PMID: 9020076
  26. Lyden D, Hattori K, Dias S, Costa C, Blaikie P, Butros L, et al. Impaired recruitment of bone-marrow–derived endothelial and hematopoietic precursor cells blocks tumor angiogenesis and growth. Nature Medicine. 2001;7(11):1194-201. doi: 10.1038/nm1101-1194 PMID: 11689883
  27. Resch T, Pircher A, Kähler CM, Pratschke J, Hilbe W. Endothelial progenitor cells: current issues on characterization and challenging clinical applications. Stem Cell Reviews and Reports. 2012;8:926-939. doi: 10.1007/s12015-011-9332-9 PMID: 22095429
  28. Bron S, Henry L, Faes-Van't Hull E, Turrini R, Vanhecke D, Guex N, et al. TIE-2-expressing monocytes are lymphangiogenic and associate specifically with lymphatics of human breast cancer. Oncoimmunology. 2016;5(2):e1073882. doi: 10.1080/2162402X.2015.1073882 PMID: 27057438
Journal of Veterinary Research
Volume 78, Issue 4
December 2023
Pages 235-246

Files

Share

How to cite

Statistics