بررسی بیان ژن سیتوکروم P450 به‌عنوان زیست‎نشانگر فیزیولوژیک آلودگی در جوجه‎های گوشتی تغذیه شده با نانوذرات نقره

نوع مقاله: علوم پایه (بیوشیمی، آناتومی، جنین، بافت شناسی و فیزیولوژی)

نویسندگان

1 گروه فیزیولوژی دام و طیور، دانشکده علوم دامی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران

2 گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده تولید گیاهی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران

3 گروه ایمنی‌شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی گلستان، گرگان، ایران

چکیده

زمینۀ مطالعه: امروزه محققان برای دستیابی به عملکرد مطلوب و حفظ سلامت طیور، نقره را با استفاده از فناوری‌ نانو، به ابعاد نانومتر تبدیل کرده و در تغذیه‌ی طیور به عنوان مکمل غذایی مورد استفاده قرار می‌دهند. از سویی در رابطه با نانوذرات نقره در سطح مولکولی در پرورش طیور، گزارشات کاملی ارائه نشده است.
هدف: این پژوهش به منظور بررسی بیان ژن سیتوکروم P450 در جوجه‌های گوشتی تغذیه شده با نانوذرات نقره انجام گردید.
روش‌کار: این بررسی با استفاده از 450 قطعه جوجه گوشتی تغذیه ‌شده با 1) گروه شاهد (جیره پایه)، 2) جیره پایه به همراه 1 درصد زئولیت، 3) جیره پایه به همراه 1 درصد زئولیت پوشش داده شده با 5/0 درصد نانو نقره، 4) جیره پایه به همراه 15/0 درصد اسید اُرگانیک و 5) جیره پایه به همراه 1 درصد زئولیت پوشش داده شده با 5/0 درصد نانو نقره مکمل ‌شده با 15/0 درصد اسید اُرگانیک انجام شد.
نتایج: نتایج نشان‌دهنده افزایش معنی‌دار سطح بیان ژن سیتوکروم P450 در هر دو بافت روده باریک و کبد در مقایسه با تیمار شاهد در جوجه‌های تغذیه شده با زئولیت (روز 21)، تیمار نانونقره پوشش داده شده بر زئولیت با مکمل اسیداُرگانیک (روز 42 بدون تنش گرمایی) و تیمار نانوذرات نقره پوشش داده شده بر زئولیت (روز 42 با تنش گرمایی) بوده است (05/0>P).
نتیجه‌گیری نهایی: بطور کلی زئولیت و نانوذرات نقره به‌عنوان ماده غیرآلی و شیمیایی با منشأ خارجی شناسایی شده و در بافت کبد و روده به‌عنوان ماده زنوبیوتیک افزایش‌دهنده‌ی بیان ژن‌های زیست‌نشانگر آلودگی بود در حالی که این اثر در تیمار اسیداُرگانیک، به‌عنوان یک اسید طبیعی دیده نشد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Evaluation of Cytochrome P450 Gene Expression as Physiological Pollution Biomarkers in Broiler Chickens Fed Silver Nanoparticles

نویسندگان [English]

  • Elnaz Arabiyan 1
  • Seyed Reza Hashemi 1
  • Ahad Yamchi 2
  • Homa Davoodi 3
  • Sharif Rostami 1
1 Department of Animal Physiology, Faculty of Animal Sciences, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran
2 Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Plant Production, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran
3 Department of Immunology, Golestan University of Medical Sciences, Gorgan, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Nowadays, researchers are converted silver to nanometer dimensions and using nanotechnology to achieve suitable performance and preserve the poultry health and they are used silver nanoparticles are used for poultry nutrition as a nutritional supplement. On the other hand, at the molecular level no complete reports in poultry breeding have been provided.
OBJECTIVES: This study was conducted to evaluate cytochrome P450 gene expression in broiler chickens fed with silver nanoparticles.
METHODS: This experiment a completely randomized design with 450 single-day Cobb 500 broiler chicks was divided into five treatments and six replications (15 birds in each replicate). Chickens were fed with (1) control (basal diet), (2) basal diet containing 1% zeolite, (3) basal diet containing 1% of zeolite-coated with 0.5% silver nanoparticles, (4) Basal diet containing with 0.15% organic acids and (5) Basal diet containing 1% of zeolite-coated with 0.5% of silver nanoparticles and 0.15% organic acids in with or without heat stress condition.
RESULTS: Results demonstrated the level of expression of cytochrome P450 in broilers fed zeolite (Z) in the 21st day of experiment, silver nanoparticles coated with zeolite in combination with organic acid (NSOA) in 42nd day without heat stress condition and silver nanoparticles coated with zeolite (NS) in day 42 with heat stress condition in intestine and liver had significant increase in expression in comparison with control (C) treatment (P<0.05).
CONCLUSIONS: In conclusion, result showed that zeolite and silver nanoparticles were identified as inorganic, chemical and exogenous substances in liver and intestine and up-regulated expression of pollution biomarkers genes. Whereas this effect is not identified in organic acid.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Silver nanoparticles
  • Xenobiotic
  • Biomarker
  • Cytochrome P450
  • Broiler Chickens

مقدمه


فناوری نانو در سال­های آینده باعث تغییرات شگرفی در تمام جنبه‌های زندگی بشر خواهد شد و کاربردهایی را برای ما فراهم خواهند کرد. نانو مواد عبارتند از مواد طبیعی، تولید شده به صورت اتفاقی و یا ساخته شده بدست بشر که حاوی ذراتی به صورت آزاد، تجمع یافته و از نظر توزیع اندازه، 50 درصد ذرات آن حداقل در یک بُعد دارای اندازه­ای بین 1 تا 100 نانومتر باشند. همچنین یافته­های اخیر نشان داده است زمانی که ذرات یک ماده خاص در حد چند نانومتر کوچک شوند، این ذرات ویژگی­های متفاوتی با ذرات اولیه خواهند داشت که از جمله می­توان به فضای سطحی بزرگ (بالا رفتن فعالیت­های فیزیکی، شیمیایی و زیستی)، انحلال‌پذیری و سطح تحرک بالا اشاره کرد (10). خواص ضدمیکروبی نقره، سال­های زیادی شناخته شده است. اما اخیراً به­دلیل ساخته شدن آن به­صورت نانوذرات، سطح تماس آن افزایش یافته و خاصیت ضدمیکروبی آن تا بیش از 99 درصد افزایش پیدا کرده است (6). در میان نانومواد، نانوذرات نقره به‌عنوان پر مصرف­ترین نانو ذره در صنعت نانو تکنولوژی دارای اثرات ضد باکتریایی، ضد قارچی و ضد ویروسی می­باشند (14). کاهش ابعاد مواد حجیم موجب تغییر ویژگی‌های سطحی، افزایش فعالیت­های شیمیایی، افزایش یافتن بر هم کنش آن با مواد دیگر، منجر به ایجاد سمّیت خواهد شد. اندازه کوچک نانومواد، عبور از غشای سلولی در اندامک­هایی همچون میتوکندری را ممکن می‌سازد و امکان فرار از تسویه­ی سلولی را نیز فراهم می­کند (25). نانوذرات می­توانند وارد سلول شوند و با ساختارهای درون­سلولی ارتباط یابند. جذب سلولی، موقعیت­یابی ساختارهای درون­سلولی و سمّیت این نانوذرات به اندازه، شکل و ترکیب شیمیایی آن­ها بستگی دارد (7). همچنین اندازه نانوذرات نقره باعث می­شود که از غشای بیولوژیکی سلول عبور کند و از طریق مکانیسم پیام­رسانی سلول در عملکرد میتوکندری و مواد ژنتیکی درون سلول اختلال ایجاد نماید (26). همچنین اندازه، مساحت سطح، انرژی سطحی و بارها در زمینه­ی اتصال به بیومولکول­ها بسیار مهم­اند و سرنوشت نانوذرات را در سلول­ها تعیین می­کنند (24). نانو ذرات ­نقره احتمالاً با افزایش رادیکال­های آزاد و تغییرات فیزیکی غشای سلول، موجب آسیب DNA می­شوند (9). همچنین تنش گرمایی در طیور موجب برهم­زدن تعادل اُکسایشی شده و موجب افزایش رادیکال­های آزاد اُکسیژن می­شوند. افزایش رادیکال‌های آزاد در سلول موجب آسیب به مولکول­های بزرگ بیولوژیک مانند پروتئین­­ها، لیپیدها و DNA می­شود (20). با پیشرفت علم، شاخص­های جدیدی برای پی بردن به وضعیت فیزیولوژیکی جانوران در مواجهه با آلودگی­های نانوذرات معرفی گردیده است. زیست­­نشانگرها یا بیومارکرها شاخص­های بیوشیمیایی، خون‌ شناسی، آنزیمی و بافتی هستند که به ردیابی اثرات ثانویه آلودگی‌ها می­پردازند. از آن­جایی­که پاسخ بیولوژیک یک جانور به استرس از سطح مولکولی آغاز شده و با افزایش زمان مواجهه به‌ترتیب تغییرات در سطوح بیوشیمیایی، سلولی، بافت، دستگاه و موجود توسعه می­یابد، بنابراین از این تغییرات می­توان به­عنوان نشانگرهای زیستی به ­منظور بررسی وجود آلودگی­ها استفاده نمود (13). در مطالعات مواجهه جانداران با غلظت­های متفاوت فلزهای سنگین آسیب­های بافتی، تغییرات آنزیمی، تغییرات پارامترهای خون­شناسی، ژنتیکی، رفتاری، تولیدمثلی و حتی مرگ در گونه‌های مختلف گزارش شده است (2،11). تغییرات مولکولی به‌عنوان اولین تغییرات قابل اندازه­­گیری در حیوانات مواجهه شده با تنش­ می­باشد (23)، که از این تغییرات می­توان به­عنوان نشانگرهای زیستی به­منظور بررسی وجود آلودگی­ها استفاده نمود (5،12). پروتئین­هایی هم‌چون HSP70، متالوتیونین­ها و آنزیم سیتوکروم P450 می­توانند به‌عنوان نشانگرهای مولکولی آلودگی در سطح ژنوم یا پروتئین بررسی شوند (11،27). سیتوکروم P450 جزو اولین آنزیم­هایی است که در فاز اول پاسخ به آلودگی­ها تولید می­شوند (25) و جزء اولین محصولات متابولیتی آلودگی­ها می‌باشند و در معرض آلودگی­های مختلف از جمله فلزات سنگین، میزان بیان ژن سیتوکروم افزایش می­یابد که این تغییرات بیان می­تواند به­عنوان بیومارکر آلودگی محسوب گردد (15). در بین تمامی خانواده­ی سیتوکروم P450، خانواده­ی CYP2C دارای بالاترین میزان بیان و همچنین مهم­ترین و اولین گروه در مقابله ­با مواد زنوبیوتیک (ماده بیگانه­زیست) (22) و مواد شیمیایی خارجی تهدید ­کننده­ی سلول­ها می­باشند (28). سوبسترای P450ها، شامل واسطه‌های متابولیک مانند لیپیدها و هورمون‌های استروئیدی و همچنین فلزات سنگین و مواد زنوبیوتیک مانند مواد مخدر و سایر مواد شیمیایی خارجی سمی هستند. همچنین با توجه به این­که گزارشاتی مبنی بر افزایش بیان سیتوکروم P450 در کبد، کلیه، پوست، ریه، مغز و سیستم قلبی-عروقی در زمان مواجهه با نانوذرات نقره در پستان‌داران به اثبات رسیده است (17،18،19)، هدف از مطالعه حاضر بررسی بیان ژن سیتوکروم P450 به­عنوان زیست­نشانگر فیزیولوژیک آلودگی در جوجه­های گوشتی تغذیه شده با نانوذرات نقره می­­باشد.

مواد و روش کار

شرایط پرورش و گروه­های آزمایشی: تحقیق حاضر در ایستگاه تحقیقات طیور دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان واقع در مزرعه آموزشی-پژوهشی شماره 1 شهرستان گرگان، به­مدت 42 روز انجام شد. بدین منظور آزمایشی با 450 قطعه جوجه­ی گوشتی یک ­روزه سویه کاب 500 در پنج تیمار و شش تکرار و در هر واحد آزمایشی ۱۵ قطعه در نظر گرفته شد. تیمارهای آزمایشی شامل: ۱) گروه شاهد (جیره پایه فاقد زئولیت، اسیداُرگانیک و نانو ذرات نقره)، ۲) گروه شاهد مکمل شده با 1 درصد زئولیت، ۳) گروه شاهد مکمل شده با 1 درصد زئولیت پوشش داده شده با ۵/۰ درصد نانو ذرات نقره، ۴) گروه شاهد مکمل شده با 1۵/۰ درصد اسید اُرگانیک، ۵) گروه شاهد تیمار شده با 1 درصد زئولیت پوشش داده شده با ۵/۰ درصد نانو ذرات نقره مکمل شده با 1۵/۰ درصد اسید اُرگانیک در شرایط با و بدون تنش گرمایی انجام شد.

اعمال تنش گرمایی: دمای سالن در روز اول 1±32 درجه سانتی­گراد تنظیم شد. که این دما با افزایش رشد جوجه­ها کاهش یافت. در نهایت پس از گذشت ۲۱ روز دمای سالن در دمای 1±21 درجه سانتی­گراد ثابت گردید. در این مدت تمام گروه­ها تحت شرایط استاندارد نگهداری شدند. به­منظور اعمال تنش گرمایی، از روز ۳۵ دوره­ی پرورش، روزانه به مدت چهار ساعت دمای سالن به ۳۴ درجه سانتی­گراد رسانده شد. برنامه­ی واکسیناسیون توصیه شده در منطقه تا قبل از ۲۰ روزگی بر­اساس توصیه­ی اداره­ی دامپزشکی استان گلستان انجام شد. جیره­ها با توجه به احتیاجات سویه (Cobb) برای دوره­ی آغازین (۲۱-۱ روزگی) و رشد (۴۲-۲۲ روزگی) تهیه شدند.

نمونه­برداری: به­منظور بررسی بیان ژن سیتوکروم P450 به‌عنوان بیومارکر یا زیست­نشانگر حضور آلودگی، جوجه­های گوشتی تغذیه شده در 5 تیمار به ­نوبت در روز­های ۲1 بدون تنش گرمایی، ۴۲ بدون تنش گرمایی و روز 42 پس از اعمال تنش گرمایی در دوره پرورش، نمونه­برداری از بافت کبد و روده باریک انجام شد.

 آزمایشات مولکولی: به منظور انجام آزمایشات مولکولی، پس از خرد کردن نمونه­ بافت­های روده باریک و کبد، استخراج Total RNA با استفاده از مقدار 1 میلی­لیتر بافر استخراج ترایزول (TRIzol) به ­ازای هر نمونه براساس دستورالعمل پیشنهادی شرکت سیگما انجام شد و سپس جهت اطمینان از استخراج درست RNA، چند نمونه به­طور تصادفی روی ژل آگارز با استفاده از دستگاه الکتروفورز بررسی شدند. سپس با استفاده از دستگاه آشکارساز، باند حاصل از RNA کل مشاهده شد و با استفاده از Gel Doc از ژل عکس گرفته شد و در نهایت باندهای ایجاد شده از نمونه­های موجود در ژل آگارز آنالیز شد. به­منظور حذف DNA احتمالی در نمونه­های RNA استخراج شده، از تیمار DNase I براساس روش پیشنهادی شرکت فرمنتاز استفاده شد و سپس ساخت رشته اول cDNA یا DNA مکمل با استفاده از 10 میکرو­لیتر RNA تیمار شده و 1 میکرو­لیتر آغازگر اُلیگودی­تی شرکت فرمنتاز و 5/2 میکرو­لیتر DEPC-treated water آغاز گردید. در این مرحله بعد از انکوباسیون نمونه­ها در دمای 65 درجه سانتی­گراد، به­ترتیب 4 میکرو­لیتر (5X)Buffer RT،  2 میکرو­لیتر dNTP، 5/0 میکرو‌لیتر RNase Inhibitor  Ribolock و 1 میکرو­لیتر آنزیم RT (Reverse Transcriptase) به میکروتیوپ­های حاوی نمونه اضافه گردید. سپس نمونه­ها به دستگاه PCR برای ساخت رشته دوم DNA مکمل در دمای 25 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه، 42 درجه سانتی­گراد به مدت 1 ساعت، 70 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه و 4 درجه سانتی­گراد به مدت 1 ساعت، منتقل شد. آغازگرهای مرجع و اختصاصی، با استفاده از نرم­افزار Oligo7 و AlleleID براساس توالی ژن­های موردنظر در سایت NCBI طراحی شدند. ساخت آغازگرها توسط شرکت پیشگامان انجام گرفت. به­منظور اطمینان از ساخت صحیح DNA مکمل، نمونه­های cDNA با استفاده از آغازگر مرجع مورد ارزیابی قرار گرفتند. در این تحقیق ژن β-actin به­عنوان کنترل داخلی (Internal control) انتخاب شد (جدول 1). برای اطمینان از اختصاصی بودن پرایمرها، محصول PCR با دماهای انیلینگ متفاوتی (نزدیک به TM ذکر شده برروی میکروتیوپ پرایمر سفارشی) در دستگاه PCR گرادیانت گذاشته شد. محصول نهایی روی ژل آگارز الکتروفورز گردید و شارپ­ترین و واضح­ترین باند­ها به­عنوان مناسب‌ترین دمای انییلینگ برای انجام Real Time-PCR  انتخاب شد. پس از تأیید ساخت صحیح DNA مکمل و اختصاصی بودن آغازگر بتا اکتین به­عنوان ژن مرجع، به­منظور بررسی کمّی بیان­ ژن­ها، بهینه­سازی دما و زمان مناسب تکثیر و اتصال و کارکرد درست آغازگر اختصاصی ژن­ سیتوکروم P450 با ایزوفرم CYP2C45، واکنش زنجیره­ای پلی­مراز در زمان واقعی، در دو بافت کبد و روده انجام شد. واکنش Real-time PCR در حجم نهایی 20 میکرو­لیتر با استفاده از تکنولوژی رنگ سایبرگرین (SYBR Green I) با استفاده از دستگاه  بایورَد (BioRad) و نرم­افزار iQ5 اپتیکال انجام شد. مخلوط واکنش شامل 1/0 میکرو­لیتر Primer Forward، 1/0 میکرو­لیتر Reverse Primer، 7/7 میکرو­لیتر  DEPC-treated water، 1 میکرو­لیتر DMSO،  9/9 میکرو­لیتر  SYBR Green و 2/0 میکرو­لیتر آنزیمTaq DNA Polymerase  تهیه شد. نمونه­ها در مرحله اول در دمای 95 درجه سانتی­گراد به مدت 3 دقیقه با تعداد 1 چرخه به منظور واسرشت ابتدایی در دستگاه ترمال سایکلر انکوبه شدند. سپس مرحله دوم با 40 چرخه شامل واسرشت­سازی (Denaturation) (95 درجه سانتی­گراد، 10 ثانیه)، اتصال (Annealing) (60 درجه سانتی­گراد، 20 ثانیه) و تکثیر (Extension) (72 درجه سانتی­گراد، 20 ثانیه) انجام شد. در مرحله سوم تکثیر نهایی با 1 چرخه در دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد و در انتها، مرحله ذوب با 81 چرخه در دمای 95 درجه سانتی­گراد به مدت 10 ثانیه انجام گردید. با بررسی منحنی­های ذوب در پایان هر واکنش، از اختصاصی عمل نمودن آغازگرها و فقدان پرایمر دایمرها اطمینان حاصل شد.

تجزیه و تحلیل آماری: داده­های حاصل از واکنش زنجیره‌ای پلی­مراز در زمان واقعی، (Ctها) در Excel ذخیره گردید و بیان نسبی ژن­های مورد نظر نسبت به ژن مرجع در فضای نرم‌افزار Excel با استفاده از فرمول لیواک انجام شد. فرمول لیواک معادل -∆∆Ct2می­باشدکه در این فرمول Ct∆∆ برابر است با: Ct∆ ژن هدف - Ct∆ کالیبراتور (18). تجزیه و تحلیل داده­ها در طرح کاملاً تصادفی و مشخص کردن سطوح معنی‌داری داده‌ها و مقایسه­ی میانگین­ها توسط آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح احتمال 05/0 انجام گردید.

نتایج

کیفیت RNA، با قراردادن نمونه­های استخراج شده برروی ژل آگارز 1 درصد تأیید شد. باندهای rRNA28s و rRNA18s به­وضوح مشاهده ­شدند و تمام نمونه­ها دارای الگوی نواری مناسبی برروی ژل آگارز بودند که نشان ­دهنده­ی خلوص و کیفیت بالای RNA تخلیص شده و عدم ایجاد شکستگی و آسیب در ساختار RNA است (تصویر 1). به‌منظور تأیید درستی ساخت cDNA از RNAهای استخراج شده، با استفاده از آغازگر ژن خانه­دار (بتا اکتین) و نمونه­های cDNA، واکنش زنجیره­ای پلی­مراز استاندارد انجام گرفت و در انتها محصول PCR برای آغازگر مرجع و آغازگر اختصاصی (تصویر 2) به­طور جداگانه، برروی ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز گردید. الگوی باندی مشاهده شده در این مرحله برای تمام نمونه­ها تأیید ­کننده­ی ساخت صحیح DNA مکمل، اختصاصی بودن آغازگر، بهینه­سازی مناسب دما و زمان مناسب برای مراحل واکنش PCR بود. سپس با اطمینان از سنتز صحیح DNA مکمل، واکنش زنجیره­ای پلی­مراز در زمان واقعی صورت گرفت و با بررسی منحنی ذوب حاصل از Real-time PCR، صحت پیک مربوط ­به آغازگرهای مورد مطالعه و فقدان پرایمر دایمرها تأیید گردید.

بحث

با توجه به گزارشاتی که توسط محققین مبنی ­بر افزایش سطح بیان ژن سیتوکروم P450 به­عنوان بیومارکر حضور آلودگی در بدن بیان شده است، مطالعه تغییرات سطوح بیان این ژن و اثبات حضور آلودگی در سطح مولکولی با مکمل نانوذرات نقره و اطمینان از سلامت نانوذرات نقره در طیور ضروری به­نظر می­رسد. در سطح مولکولی تغییرات ژنتیکی (تغییر در بیان، عملکرد و تنظیم ژنی) و تغییرات سطوح پروتئینی در موجودات را می­­توان شاخص مواجهه با آلودگی در نظر گرفت به­ویژه اگر مولکول مورد بررسی قسمتی از مکانیسم دفاعی، ترمیمی و یا سم­زدایی سلول باشد که از آن جمله می­توان به متالوتیونین­ها (8)، گلوتاتیون-S ترنسفراز (1)، سوپراُکسید دیسموتاز (SOD) (20)، پروتئین­های شوک حرارتی (HSP70) (3) و سیتوکروم P450 (21) اشاره نمود. همچنین گزارشات بیانگر این است که روده آبزیانی که در معرض فلزات سنگین قرار گرفتند، افزایش قابل­توجهی در میزان بیان ژن سیتوکروم P450، در مقایسه با تیمار شاهد داشته­اند (30). جوجه­هایی که در معرض سموم قرار داشتند افزایش بیان ژن سیتوکروم­ P450 را نشان دادند و این افزایش بیان، به عنوان نشانگری برای افزایش یافتن متابولیسم دارویی در بافت کبد و روده جوجه­ها درنظر گرفته شده است (4).

افزایش بیان ژن سیتوکروم P450 در کبد ماهیانی که در­ معرض فلزات سنگین بودند به اثبات رسیده است (11). همچنین گزارشاتی مبنی بر افزایش بیان ژن سیتوکروم P450 به­عنوان زیست­نشانگری در طی متابویسم مواد زنوبیوتیک و متابولیسم مواد دارویی در سطح سلول­های کبدی جوجه­های گوشتی گزارش شده است و افزایش بیان قابل توجهی از سطح ایزوفرم CYP2C45 در جوجه­های قرار گرفته در معرض فنوباربیتال، گزارش شده است (28). از این رو آغازگر ژن هدف سیتوکروم P450 با ایزوفرم CYP2C45 با استفاده از آغازگر بتا اکتین به عنوان کنترل داخلی، نرمال گردید و در دو بافت کبد و روده باریک مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفت. نتایج پژوهش حاضر بیان­گر این است که سطح بیان ژن CYP2C45 در روز 21 دوره پرورش در سلول­های کبد و روده جوجه­های تغذیه­شده با تیمار زئولیت (Z) در بیش­ترین میزان بیان بوده و دارای تفاوت معنی‌داری با تیمار شاهد بوده است (05/0>P). با این تفاوت که سطح بیان ژن CYP2C45 در سلول­های روده افزایش بسیار زیادی در مقایسه با تیمار شاهد داشته است در حالی که بیان این ژن در سلول­های کبدی سطح افزایش کمتری در مقایسه با سلول­های روده را نشان داده است. بدین ترتیب این احتمال وجود دارد که تیمار زئولیت (Z) در روز 21 دوره پرورش در سطح سلول­­های کبد و روده، سطح بیان ژن سیتوکروم P450 را به­عنوان زیست­نشانگر آلودگی افزایش داده و به­عنوان شاخصی برای حضور آلودگی احتمالی در سلول­های کبد و روده تلقی گردد. با این تفاوت که سلول­های روده بیش­تر از سلول­های کبد تحت­تأثیر تیمار زئولیت قرار گرفته­اند و سطح آلودگی وسیع­تری را در سطح مولکولی با توجه به افزایش بیان این ژن نشان داده­اند. تصویر 3 نشان­دهنده افزایش سطح بیان این ژن در جوجه­های گوشتی تغذیه ­شده با تیمار زئولیت در بافت کبد است که دارای تفاوت معنی­داری با تیمار شاهد بوده است (05/0>P). از سویی میزان بیان ژن CYP2C45 در تیمار اسید­اُرگانیک (OA) و نانوذرات نقره پوشش داده شده بر زئولیت (NS) در کبد در مقایسه با تیمار شاهد دارای کاهش بیان معنی­داری بوده است (05/0>P) در حالی که تفاوت معنی­داری در میزان بیان این ژن در تیمار نانوذرات نقره پوشش­داده شده بر زئولیت با مکمل اسید‌اُرگانیک (NSOA) در مقایسه با تیمار شاهد مشاهده نشده است (05/0<P). تصویر 4 نشان­دهنده­ افزایش چشمگیری در سطح بیان ژن مذکور در جوجه­های گوشتی تغذیه­شده با تیمار زئولیت در بافت روده باریک است که دارای تفاوت معنی­داری با تیمار شاهد بوده است (05/0>P). همچنین میزان بیان ژن CYP2C45 در تیمارهای اسید­اُرگانیک (OA)، نانوذرات نقره پوشش داده شده بر زئولیت (NS) و تیمار نانوذرات نقره پوشش داده شده بر زئولیت با مکمل اسید­اُرگانیک (NSOA) در روده باریک، تفاوت معنی­داری در مقایسه با تیمار شاهد نداشته است (05/0<P).

در روز 42 دوره پرورش بدون اعمال تنش گرمایی، جوجه­های گوشتی تغذیه­شده با تیمار نانوذرات نقره مکمل شده با اسیداُرگانیک (NSOA)، بیش­ترین سطح بیان ژن سیتوکروم P450 را به ترتیب در بافت کبد و روده باریک در مقایسه با تیمار شاهد نشان داده است (05/0>P) (تصویر 5،6). بر اساس نتایج حاصل از پژوهش حاضر، تیمارهای آزمایشی OA، Z و NS تفاوت معنی­داری را در میزان بیان ژن CYP2C45 در بافت کبد و روده باریک جوجه­های گوشتی در مقایسه با تیمار شاهد نشان نداده­اند (05/0<P).

همچنین روز 42 دوره پرورش با اعمال تنش گرمایی افزایش چشمگیری در میزان بیان ژن سیتوکروم P450 با ایزوفرم CYP2C45 در بافت کبد و روده­ی جوجه­های گوشتی تغذیه­شده با تیمار نانوذرات نقره (NS) در مقایسه با تیمار ایجاد شد (05/0>P). با این تفاوت که سلول­های کبدی بیش­تر تحت ­تأثیر تیمار NS قرار گرفته و افزایش بیان بسیار بالاتری نسبت به تیمار شاهد در مقایسه با بافت روده باریک را داشتند (تصویر 7).  

به­طور کلی نتایج این مطالعه گویای آن است که افزایش سطح بیان ژن CYP2C45 در هر دو بافت کبد و روده در تمام زمان­های نمونه‌برداری در یک تیمار مشخص رخ داده است که نشان­دهنده درستی و یکسان بودن شرایط آزمایش بوده و تیمارهای Z (در روز 21)، NSOA (در روز 42 بدون تنش گرمایی) و NS (روز 42 با اعمال تنش گرمایی) افزایش­دهنده­ی احتمالی سطح آلودگی در هر دو بافت کبد و روده باریک بوده است. با توجه ­به این که آنزیم سیتوکروم P450 جزء آنزیم­هایی است که در فاز اول متابولیسم آلودگی در سطح سلولی تولید می­گردد و اولین واکنش سلول­ها به شرایط تنش­زا و استرسی تولید آنزیم­ سیتوکروم P450 می­باشد (29)، از این رو نتایج تحقیق حاضر نشان داد که تغییرات سطح بیان این آنزیم با تیمارهای Z، NSOA و NS می­تواند به­عنوان نشانگر آلودگی در نظر گرفته شود و مکمل­های زئولیت (Z) و نانوذرات نقره (NS) را می­توان به­عنوان ماده غیرآلی و شیمیایی و ماده­ی شناخته شده با منشأ خارجی در بافت کبد و روده باریک جوجه­های گوشتی مدنظر قرار داد. این در حالی است که تیمار اسیداُرگانیک به عنوان اسید طبیعی موجب افزایش سطح بیان ژن سیتوکروم P450 در هیچ‌کدام از زمان­های دوره پرورش در بافت‌های کبد و روده باریک جوجه­های گوشتی نشده است.

سپاسگزاری

در پایان از همکاری اساتید و مسئولان آزمایشگاه­های دانشکده علوم دامی و تولید گیاهی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان تشکر به عمل می­آید.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

 

جدول 1. اسامی ژن­ها و توالی پرایمرهای مورد استفاده در واکنش qRT-PCR.

نام آغازگر

توالی آغازگر

طول محصول (bp)

Access number

CYP2C45

F: 5'- AAGACAATCCCAAATCACACT-3'

R: 5'-GAAGCAGAAGCCCGTATC-3'         

114 

NM_001001752

β-actin

F: 5'- AAGTTACTCGCCTCTGTGAA- 3'     

R: 5'- CACATCTATCACTGGGGAAC-3'       

198 

NM_205518

تصویر 1. بررسی RNA استخراج شده در دو بافت کبد و روده با تیمارهای مختلف.

تصویر 2. بررسی cDNA سنتز شده با آغازگر مرجع و اختصاصی در دو بافت کبد و روده با تیمارهای مختلف.

تصویر 3. میزان بیان ژن سیتوکروم P450 با ایزوفرم CYP2C45 در روز 21 دوره پرورش در بافت کبد جوجه­های گوشتی.

تصویر 4. میزان بیان ژن سیتوکروم P450 با ایزوفرم CYP2C45 در روز 21 دوره پرورش در بافت روده باریک جوجه­های گوشتی.

تصویر 5. میزان بیان ژن سیتوکروم­ P450 با ایزوفرم CYP2C45 در روز 42 دوره پرورش بدون اعمال تنش گرمایی در بافت کبد جوجه­های گوشتی.

تصویر 6. میزان بیان ژن سیتوکروم P450 با ایزوفرم CYP2C45 در روز 42 دوره پرورش بدون اعمال تنش گرمایی در بافت روده باریک جوجه­های گوشتی.

تصویر 7. میزان بیان ژن سیتوکروم­ P450 با ایزوفرم CYP2C45 در روز 42 دوره پرورش با اعمال تنش گرمایی در بافت کبد جوجه­های گوشتی.

تصویر 8. میزان بیان ژن سیتوکروم­ P450 با ایزوفرم CYP2C45 در روز 42 دوره پرورش با اعمال تنش گرمایی در بافت روده باریک جوجه­های گوشتی.

  1. Ahmad, I., Pacheco, M., Santos, M.A. (2004). Enzymatic and nonenzymatic antioxidants as an adaptation to Phagocyte-induced damage in Anguilla anguilla L. Following in situ harbor water exposure. Ecotoxicol Environ Saf, 57, 290-302. https://doi.org/10.1016/S0147-6513(03)00080-0 PMID: 1504 1252
  2. Akhtar, M.S., Pal, A.K., Sahu, N.P., Alexander, C., Gupta, S.K. (2012). Effect of dietary Pyridoxine on growth and biochemical responses of Labeo rohita fingerlings exposed to endosulfan. Pestic Biochem Physiol, 103, 23-30. https://doi. org/10.1016/j.pestbp.2012.02.004
  3. Archana, P.R., Aleena, J., Pragna, P., Vidya, M.K., Abdul Niyas, P.A., Bagath, M., Krishnan, G., Manimaran, A., Beena, V., Kurien, E.K., Sejian, V., Bhatta, R. (2017). Role of heat shock proteins in livestock adaptation to heat stress. J Dairy Vet Anim Res, 5, 13-19. https://doi.org/10.15406/jdvar.2017. 05.00127
  4. Bauer, M., Greenwod, S.J., Clark, K.F., Jackman, P., Fairchild, W. (2013). Analysis of gene expression in Homarus americanus larvae exposed to sublethal concentration of endosulfan during metamorphosis. Comp Biochem Physiol, 8, 300-308. https://doi.org/10.1016/j.cbd.2013.07.002
  5. Benhamed, S., Guardiola, F.A., Martinez, S., Sanchez, M.J.M., Sirvent, C.P., Mars, M., Esteban, M.A. (2016). Exposure of the gilthead seabream (Sparus aurata) to sediments contaminated with heavy metals down-regulates the gene expression of stress biomarkers. Toxicol Rep, 3, 364-372. https://doi.org/10.1016/j.toxrep.2016.02.006 PMID: 2895955 8
  6. Bondarenko, O., Ivask, A., Kakinen, A., Kurvet, I., Kahru, A. (2013). Particle-cell contact enhances antibacterial activity of silver nanoparticles. PloS One, 8, e64060. https://doi.org/10. 1371/journal.pone.0064060 PMID: 23737965
  7. Buzea, C., Blandino, I.I.P., Robbie, K. (2007). Nanomaterials and nanoparticles: Sources and toxicity. Biointerphases, 2, 17-71. https://doi.org/10.1116/1.2815690 PMID: 20419892
  8. Chan, K.M. (1995). Methalothionin: Potential biomarker for monitoring heavy metal Pollution in fish around Hong Kong. Mar Pollut Bull, 31, 411-415. https://doi.org/10.1016/0025-326X(95)00125-7
  9. Colombo, A., Bonfanti, P., Orsi, F., Camatini, M. (2003). Developmental effects of endocrine disturbing chemicals in wildlife and humans. Environ Health Perspect, 101, 378-384. https://doi.org/10.1289/ehp.93101378 PMID: 8080506
  10. David, B. (2008). How meaningful are results of nanotoxicity studies in the absence of adequate material characterization. Toxicol Sci, 101, 183-185. https://doi.org/10.1093/toxsci/kfm 279 PMID: 18300382
  11. Dong, M., Zhu, L., Shao, B., Zhu, Sh., Wang, J., Xie, H., Wang, J., Wang, F. (2013). The effects of endosulfan on cytochrome P450 enzymes and glutathione S-transferase in zebrafish (Danio rerio) livers. Ecotoxicol Environ Saf, 92, 1-9. https://doi.org/10.1111/jai.13072 
  12. Dorts, J., Silvestre, F., Tu, H.T., Tyberghein, A.E., Phuong, N.T., Kestemont, P. (2009). Oxidative stress, protein carbonylation and heat shock proteins in the black tiger shrimp, Penaeus monodon, following exposure to endosulfan and deltamethrin. Environ Toxicol Pharmacol, 28, 302-310. https://doi.org/10.1016/j.etap.2009.05.006 PMID: 21784020
  13. Frijhoff, J., Winyard, P.G., Zarkovic, N., Davies, S.S., Stocker, R., Cheng, D., Knight, R.A., Taylor, E.L., Oettrich, J., Ruskovska, T., Gasparovic, A.C., Cuadrado, A., Weber, D., Poulsen, H.E., Grune, T., Schmidt, H.H.W., Ghezzi, P. (2015). Clinical relevance of biomarkers of oxidative stress. Antioxid Redox Signal, 23, 1144-1170. https://doi.org/10.1089/ars. 2015.6317 PMID: 26415143
  14. Govindasamy, R., Ruhuman, A.A. (2012). Histopathological studies and oxidative stress of synthesized particles in Mozambique tilapia (Oreocgromis mossambicus). Environ Sci, 24, 1091-1098. https://doi.org/10.1016/S1001-0742(11) 60845-0 PMID: 23505877
  15. Guo, Y.U., Liu, Y.S., Liu, W.R., Jiang, Y.X., Su, H.C., Zhang, Q.Q., Chen, X.W., Yang, Y.Y., Chen, J., Liu, S.S., Pan, C.G., Huang, G.Y., Ying, G.G. (2015). Tissue-specific bioac-cumulation of human and veterinary antibiotics in bile, plasma, liver and muscle tissues of wild fish from a highly urbanized region. Environ Pollut, 198, 14-24. https://doi. org/10.1016/j.ecoenv.2014.04.012 PMID: 24793519
  16. Huang, G.Y., Ying, G.G., Liang, Y.Q., Liu, S.S., Liu, U.S. (2014). Expression patternsof metallothionein, cytochrome P4501A and vitellogenin genesin western mosquitofish (Gambusia affinis) in response to heavy metals. Ecotoxicol Environ Saf, 105, 97-102. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv. 2014.04.012
  17. Kim, J.H., Raisuddin, J.S., Ki, S., Lee, J.S., Han, K.N. (2008). Molecular cloning and bnaphthoflavone- induced expression of a cytochrome P450 1A (CYP1A) gene from an anadromous river Pufferfish, Takifugu obscures. Mar Pollut Bull, 57, 433-440. https://doi.org/10.1016/j.marpolbul.2008.01.005 PMID: 18304588
  18. Livak, K.J., Schmittgen, T.D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-∆∆Ct. Method, 25, 402-408. https://doi.org/10.1006/meth.2001. 1262 PMID: 11846609
  19. Miranda, C.L., Chung, W.G., Wang-Buhler, J.L., Musafia-Jeknic, T., Baird, W.M., Buhler, D.R. (2006). Comparative in vitro metabolism of benzo[a]pyrene by recombinant zebrafish CYP1A and liver microsomes from beta-naphthoflavone-treated rainbow trout. Aquat Toxicol, 80, 101-108. https:// doi.org/10.1016/j.aquatox.2006.07.018 PMID: 16963132
  20. Mujahid, A., Sato, K., Akiba, Y., Toyomizu, M. (2006). Acute heat stress stimulates mitochondrial superoxide production inbroiler skeletal muscle, possibly via down-regulation of uncoupling protein content. Poultry Sci, 85, 1259-1265. https://doi.org/10.1093/ps/85.7.1259
  21. Nebert, D.W., Wikvall, K., Miller, W.L. (2013). Human cytochromes P450 in health and disease. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 368, 1612-1635. https://doi.org/10.1098/rstb. 2012.0431 PMID: 23297354
  22. Nelson, D., Schuler, A., Paquette, M., Reichhart, W., Bak, S. (2004). Comparative genomics of rice and Arabidopsis. Analysis of 727 cytochrome P450 genes and pseudogenes from a monocot and a dicot. Plant Physiol, 135, 756-772. https://doi.org/10.1104/pp.104.039826 PMID: 15208422
  23. Rose, W.L., Nisbet, R.M., Green, P.G., Norris, S., Fan, T., Smith, E.H., Cherr, G.N., Anderson, S.L. (2006). Using an integrated approach to link biomarker responses and Physiological stress to growth impairment of cadmium-exposed larval topsmelt. Aquat Toxicol, 80, 298-308. https://doi.org/10.1016/j.aquatox.2006.09.007 PMID: 170839 87
  24. Rothen-Rutishauser, B., Muhlfeld, C., Blank, F., Musso, C., Gehr, P. (2007). Translocation of particles and inflammatory responses after exposure to fine particles and nanoparticles in an epithelial airway model. Part Fibre Toxicol, 25, 4-9. https://doi.org/10.1186/1743-8977-4-9 PMID: 17894871
  25. Siroka, Z., Drastichova, J. (2004). Biochemical markers of aquatic environment contamination cytochrome P450 in fish. Acta Vet Brno, 73, 123-132. https://doi.org/10.2754/avb200 473010123
  26. Sung, J.H., Ji, J.H., Park, J.D., Yoon, J.U., Kim, D.S., Jeon, K.S., Song, M.Y., Jeong, J., Han, B.S., Han, J.H., Chung, Y.H., Chang, H.K., Lee, J.H., Cho, M.H., Kelman, B.J., Yu, I.J. (2009). Subchronic inhalation toxicity of silver nanoparticles. Toxicol Sci, 108, 452-461. https://doi.org/10. 1093/toxsci/kfn246 PMID: 19033393
  27. Tedeschi, J.N., Kennington, W.J., Berry, O., Whiting, S., Meekan, M., Mitchell, N.J. (2015). Increased expression of HSP70 and HSP90 mRNA as biomarkers of thermal stress loggerhead turtle embryos (Caretta caretta). J Therm Biol, 47, 42-50. https://doi.org/10.1016/j.jtherbio.2014.11.006 PMID: 25526653
  28. Watanabe, P.K., Kawai, K.Y., Ikenaka, Y., Kawata, M., Ikushiro, S., Sakaki, T., Ishizuka, M. (2013). Avian cytochrome P450 (CYP) 1-3 family genes: isoforms, evolutionary relationships, and mRNA expression in chicken liver. PloS one, 8, e75689. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0075689 PMID: 24098714
  29. Xu, L., Dan, M., Shao, A., Cheng, X., Zhang, C., Yokel, R., Takemura, T., Hanagata, N., Niwa, M., Watanabe, D. (2015). Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. Int J Nanomedicine, 10, 6105-6119. https://doi.org/10.2147/IJN.S85265 PMID: 26491287
  30. Zhang, X.D., Wu, H.Y., Wu, D., Wang, Y.Y., Chang, J.H., Zhai, Z.B., Fan, F.Y. (2010). Toxicologic effects of gold nanoparticles in vivo by different administration routes. Int J Nanomed, 5, 711-781. https://doi.org/10.2147/IJN.S8428 PMID: 21042423