نوع مقاله : علوم پایه (بیوشیمی، آناتومی، جنین، بافت شناسی و فیزیولوژی)
نویسندگان
1 گروه فیزیولوژی دام و طیور، دانشکده علوم دامی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران
2 گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده تولید گیاهی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران
3 گروه ایمنی‌شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی گلستان، گرگان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
BACKGROUND: Nowadays, researchers are converted silver to nanometer dimensions and using nanotechnology to achieve suitable performance and preserve the poultry health and they are used silver nanoparticles are used for poultry nutrition as a nutritional supplement. On the other hand, at the molecular level no complete reports in poultry breeding have been provided.
OBJECTIVES: This study was conducted to evaluate cytochrome P450 gene expression in broiler chickens fed with silver nanoparticles.
METHODS: This experiment a completely randomized design with 450 single-day Cobb 500 broiler chicks was divided into five treatments and six replications (15 birds in each replicate). Chickens were fed with (1) control (basal diet), (2) basal diet containing 1% zeolite, (3) basal diet containing 1% of zeolite-coated with 0.5% silver nanoparticles, (4) Basal diet containing with 0.15% organic acids and (5) Basal diet containing 1% of zeolite-coated with 0.5% of silver nanoparticles and 0.15% organic acids in with or without heat stress condition.
RESULTS: Results demonstrated the level of expression of cytochrome P450 in broilers fed zeolite (Z) in the 21st day of experiment, silver nanoparticles coated with zeolite in combination with organic acid (NSOA) in 42nd day without heat stress condition and silver nanoparticles coated with zeolite (NS) in day 42 with heat stress condition in intestine and liver had significant increase in expression in comparison with control (C) treatment (P<0.05).
CONCLUSIONS: In conclusion, result showed that zeolite and silver nanoparticles were identified as inorganic, chemical and exogenous substances in liver and intestine and up-regulated expression of pollution biomarkers genes. Whereas this effect is not identified in organic acid.
کلیدواژه‌ها [English]
فناوری نانو در سالهای آینده باعث تغییرات شگرفی در تمام جنبه‌های زندگی بشر خواهد شد و کاربردهایی را برای ما فراهم خواهند کرد. نانو مواد عبارتند از مواد طبیعی، تولید شده به صورت اتفاقی و یا ساخته شده بدست بشر که حاوی ذراتی به صورت آزاد، تجمع یافته و از نظر توزیع اندازه، 50 درصد ذرات آن حداقل در یک بُعد دارای اندازهای بین 1 تا 100 نانومتر باشند. همچنین یافتههای اخیر نشان داده است زمانی که ذرات یک ماده خاص در حد چند نانومتر کوچک شوند، این ذرات ویژگیهای متفاوتی با ذرات اولیه خواهند داشت که از جمله میتوان به فضای سطحی بزرگ (بالا رفتن فعالیتهای فیزیکی، شیمیایی و زیستی)، انحلال‌پذیری و سطح تحرک بالا اشاره کرد (10). خواص ضدمیکروبی نقره، سالهای زیادی شناخته شده است. اما اخیراً بهدلیل ساخته شدن آن بهصورت نانوذرات، سطح تماس آن افزایش یافته و خاصیت ضدمیکروبی آن تا بیش از 99 درصد افزایش پیدا کرده است (6). در میان نانومواد، نانوذرات نقره بهعنوان پر مصرفترین نانو ذره در صنعت نانو تکنولوژی دارای اثرات ضد باکتریایی، ضد قارچی و ضد ویروسی میباشند (14). کاهش ابعاد مواد حجیم موجب تغییر ویژگیهای سطحی، افزایش فعالیتهای شیمیایی، افزایش یافتن بر هم کنش آن با مواد دیگر، منجر به ایجاد سمّیت خواهد شد. اندازه کوچک نانومواد، عبور از غشای سلولی در اندامکهایی همچون میتوکندری را ممکن می‌سازد و امکان فرار از تسویهی سلولی را نیز فراهم میکند (25). نانوذرات میتوانند وارد سلول شوند و با ساختارهای درونسلولی ارتباط یابند. جذب سلولی، موقعیتیابی ساختارهای درونسلولی و سمّیت این نانوذرات به اندازه، شکل و ترکیب شیمیایی آنها بستگی دارد (7). همچنین اندازه نانوذرات نقره باعث میشود که از غشای بیولوژیکی سلول عبور کند و از طریق مکانیسم پیامرسانی سلول در عملکرد میتوکندری و مواد ژنتیکی درون سلول اختلال ایجاد نماید (26). همچنین اندازه، مساحت سطح، انرژی سطحی و بارها در زمینهی اتصال به بیومولکولها بسیار مهماند و سرنوشت نانوذرات را در سلولها تعیین میکنند (24). نانو ذرات نقره احتمالاً با افزایش رادیکالهای آزاد و تغییرات فیزیکی غشای سلول، موجب آسیب DNA میشوند (9). همچنین تنش گرمایی در طیور موجب برهمزدن تعادل اُکسایشی شده و موجب افزایش رادیکالهای آزاد اُکسیژن میشوند. افزایش رادیکالهای آزاد در سلول موجب آسیب به مولکولهای بزرگ بیولوژیک مانند پروتئینها، لیپیدها و DNA میشود (20). با پیشرفت علم، شاخصهای جدیدی برای پی بردن به وضعیت فیزیولوژیکی جانوران در مواجهه با آلودگیهای نانوذرات معرفی گردیده است. زیستنشانگرها یا بیومارکرها شاخصهای بیوشیمیایی، خون شناسی، آنزیمی و بافتی هستند که به ردیابی اثرات ثانویه آلودگیها میپردازند. از آنجاییکه پاسخ بیولوژیک یک جانور به استرس از سطح مولکولی آغاز شده و با افزایش زمان مواجهه بهترتیب تغییرات در سطوح بیوشیمیایی، سلولی، بافت، دستگاه و موجود توسعه مییابد، بنابراین از این تغییرات میتوان بهعنوان نشانگرهای زیستی به منظور بررسی وجود آلودگیها استفاده نمود (13). در مطالعات مواجهه جانداران با غلظتهای متفاوت فلزهای سنگین آسیبهای بافتی، تغییرات آنزیمی، تغییرات پارامترهای خونشناسی، ژنتیکی، رفتاری، تولیدمثلی و حتی مرگ در گونه‌های مختلف گزارش شده است (2،11). تغییرات مولکولی بهعنوان اولین تغییرات قابل اندازهگیری در حیوانات مواجهه شده با تنش میباشد (23)، که از این تغییرات میتوان بهعنوان نشانگرهای زیستی بهمنظور بررسی وجود آلودگیها استفاده نمود (5،12). پروتئینهایی همچون HSP70، متالوتیونینها و آنزیم سیتوکروم P450 میتوانند بهعنوان نشانگرهای مولکولی آلودگی در سطح ژنوم یا پروتئین بررسی شوند (11،27). سیتوکروم P450 جزو اولین آنزیمهایی است که در فاز اول پاسخ به آلودگیها تولید میشوند (25) و جزء اولین محصولات متابولیتی آلودگیها میباشند و در معرض آلودگیهای مختلف از جمله فلزات سنگین، میزان بیان ژن سیتوکروم افزایش مییابد که این تغییرات بیان میتواند بهعنوان بیومارکر آلودگی محسوب گردد (15). در بین تمامی خانوادهی سیتوکروم P450، خانوادهی CYP2C دارای بالاترین میزان بیان و همچنین مهمترین و اولین گروه در مقابله با مواد زنوبیوتیک (ماده بیگانهزیست) (22) و مواد شیمیایی خارجی تهدید کنندهی سلولها میباشند (28). سوبسترای P450ها، شامل واسطه‌های متابولیک مانند لیپیدها و هورمون‌های استروئیدی و همچنین فلزات سنگین و مواد زنوبیوتیک مانند مواد مخدر و سایر مواد شیمیایی خارجی سمی هستند. همچنین با توجه به اینکه گزارشاتی مبنی بر افزایش بیان سیتوکروم P450 در کبد، کلیه، پوست، ریه، مغز و سیستم قلبی-عروقی در زمان مواجهه با نانوذرات نقره در پستان‌داران به اثبات رسیده است (17،18،19)، هدف از مطالعه حاضر بررسی بیان ژن سیتوکروم P450 بهعنوان زیستنشانگر فیزیولوژیک آلودگی در جوجههای گوشتی تغذیه شده با نانوذرات نقره میباشد.
شرایط پرورش و گروههای آزمایشی: تحقیق حاضر در ایستگاه تحقیقات طیور دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان واقع در مزرعه آموزشی-پژوهشی شماره 1 شهرستان گرگان، بهمدت 42 روز انجام شد. بدین منظور آزمایشی با 450 قطعه جوجهی گوشتی یک روزه سویه کاب 500 در پنج تیمار و شش تکرار و در هر واحد آزمایشی ۱۵ قطعه در نظر گرفته شد. تیمارهای آزمایشی شامل: ۱) گروه شاهد (جیره پایه فاقد زئولیت، اسیداُرگانیک و نانو ذرات نقره)، ۲) گروه شاهد مکمل شده با 1 درصد زئولیت، ۳) گروه شاهد مکمل شده با 1 درصد زئولیت پوشش داده شده با ۵/۰ درصد نانو ذرات نقره، ۴) گروه شاهد مکمل شده با 1۵/۰ درصد اسید اُرگانیک، ۵) گروه شاهد تیمار شده با 1 درصد زئولیت پوشش داده شده با ۵/۰ درصد نانو ذرات نقره مکمل شده با 1۵/۰ درصد اسید اُرگانیک در شرایط با و بدون تنش گرمایی انجام شد.
اعمال تنش گرمایی: دمای سالن در روز اول 1±32 درجه سانتیگراد تنظیم شد. که این دما با افزایش رشد جوجهها کاهش یافت. در نهایت پس از گذشت ۲۱ روز دمای سالن در دمای 1±21 درجه سانتیگراد ثابت گردید. در این مدت تمام گروهها تحت شرایط استاندارد نگهداری شدند. بهمنظور اعمال تنش گرمایی، از روز ۳۵ دورهی پرورش، روزانه به مدت چهار ساعت دمای سالن به ۳۴ درجه سانتیگراد رسانده شد. برنامهی واکسیناسیون توصیه شده در منطقه تا قبل از ۲۰ روزگی براساس توصیهی ادارهی دامپزشکی استان گلستان انجام شد. جیرهها با توجه به احتیاجات سویه (Cobb) برای دورهی آغازین (۲۱-۱ روزگی) و رشد (۴۲-۲۲ روزگی) تهیه شدند.
نمونهبرداری: بهمنظور بررسی بیان ژن سیتوکروم P450 بهعنوان بیومارکر یا زیستنشانگر حضور آلودگی، جوجههای گوشتی تغذیه شده در 5 تیمار به نوبت در روزهای ۲1 بدون تنش گرمایی، ۴۲ بدون تنش گرمایی و روز 42 پس از اعمال تنش گرمایی در دوره پرورش، نمونهبرداری از بافت کبد و روده باریک انجام شد.
آزمایشات مولکولی: به منظور انجام آزمایشات مولکولی، پس از خرد کردن نمونه بافتهای روده باریک و کبد، استخراج Total RNA با استفاده از مقدار 1 میلیلیتر بافر استخراج ترایزول (TRIzol) به ازای هر نمونه براساس دستورالعمل پیشنهادی شرکت سیگما انجام شد و سپس جهت اطمینان از استخراج درست RNA، چند نمونه بهطور تصادفی روی ژل آگارز با استفاده از دستگاه الکتروفورز بررسی شدند. سپس با استفاده از دستگاه آشکارساز، باند حاصل از RNA کل مشاهده شد و با استفاده از Gel Doc از ژل عکس گرفته شد و در نهایت باندهای ایجاد شده از نمونههای موجود در ژل آگارز آنالیز شد. بهمنظور حذف DNA احتمالی در نمونههای RNA استخراج شده، از تیمار DNase I براساس روش پیشنهادی شرکت فرمنتاز استفاده شد و سپس ساخت رشته اول cDNA یا DNA مکمل با استفاده از 10 میکرولیتر RNA تیمار شده و 1 میکرولیتر آغازگر اُلیگودیتی شرکت فرمنتاز و 5/2 میکرولیتر DEPC-treated water آغاز گردید. در این مرحله بعد از انکوباسیون نمونهها در دمای 65 درجه سانتیگراد، بهترتیب 4 میکرولیتر (5X)Buffer RT، 2 میکرولیتر dNTP، 5/0 میکرولیتر RNase Inhibitor Ribolock و 1 میکرولیتر آنزیم RT (Reverse Transcriptase) به میکروتیوپهای حاوی نمونه اضافه گردید. سپس نمونهها به دستگاه PCR برای ساخت رشته دوم DNA مکمل در دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، 42 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت، 70 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه و 4 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت، منتقل شد. آغازگرهای مرجع و اختصاصی، با استفاده از نرمافزار Oligo7 و AlleleID براساس توالی ژنهای موردنظر در سایت NCBI طراحی شدند. ساخت آغازگرها توسط شرکت پیشگامان انجام گرفت. بهمنظور اطمینان از ساخت صحیح DNA مکمل، نمونههای cDNA با استفاده از آغازگر مرجع مورد ارزیابی قرار گرفتند. در این تحقیق ژن β-actin بهعنوان کنترل داخلی (Internal control) انتخاب شد (جدول 1). برای اطمینان از اختصاصی بودن پرایمرها، محصول PCR با دماهای انیلینگ متفاوتی (نزدیک به TM ذکر شده برروی میکروتیوپ پرایمر سفارشی) در دستگاه PCR گرادیانت گذاشته شد. محصول نهایی روی ژل آگارز الکتروفورز گردید و شارپترین و واضحترین باندها بهعنوان مناسب‌ترین دمای انییلینگ برای انجام Real Time-PCR انتخاب شد. پس از تأیید ساخت صحیح DNA مکمل و اختصاصی بودن آغازگر بتا اکتین بهعنوان ژن مرجع، بهمنظور بررسی کمّی بیان ژنها، بهینهسازی دما و زمان مناسب تکثیر و اتصال و کارکرد درست آغازگر اختصاصی ژن سیتوکروم P450 با ایزوفرم CYP2C45، واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی، در دو بافت کبد و روده انجام شد. واکنش Real-time PCR در حجم نهایی 20 میکرولیتر با استفاده از تکنولوژی رنگ سایبرگرین (SYBR Green I) با استفاده از دستگاه بایورَد (BioRad) و نرمافزار iQ5 اپتیکال انجام شد. مخلوط واکنش شامل 1/0 میکرولیتر Primer Forward، 1/0 میکرولیتر Reverse Primer، 7/7 میکرولیتر DEPC-treated water، 1 میکرولیتر DMSO، 9/9 میکرولیتر SYBR Green و 2/0 میکرولیتر آنزیمTaq DNA Polymerase تهیه شد. نمونهها در مرحله اول در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه با تعداد 1 چرخه به منظور واسرشت ابتدایی در دستگاه ترمال سایکلر انکوبه شدند. سپس مرحله دوم با 40 چرخه شامل واسرشتسازی (Denaturation) (95 درجه سانتیگراد، 10 ثانیه)، اتصال (Annealing) (60 درجه سانتیگراد، 20 ثانیه) و تکثیر (Extension) (72 درجه سانتیگراد، 20 ثانیه) انجام شد. در مرحله سوم تکثیر نهایی با 1 چرخه در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه انجام شد و در انتها، مرحله ذوب با 81 چرخه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 10 ثانیه انجام گردید. با بررسی منحنیهای ذوب در پایان هر واکنش، از اختصاصی عمل نمودن آغازگرها و فقدان پرایمر دایمرها اطمینان حاصل شد.
تجزیه و تحلیل آماری: دادههای حاصل از واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی، (Ctها) در Excel ذخیره گردید و بیان نسبی ژنهای مورد نظر نسبت به ژن مرجع در فضای نرمافزار Excel با استفاده از فرمول لیواک انجام شد. فرمول لیواک معادل -∆∆Ct2میباشدکه در این فرمول Ct∆∆ برابر است با: Ct∆ ژن هدف - Ct∆ کالیبراتور (18). تجزیه و تحلیل دادهها در طرح کاملاً تصادفی و مشخص کردن سطوح معنیداری دادهها و مقایسهی میانگینها توسط آزمون چند دامنهای دانکن در سطح احتمال 05/0 انجام گردید.
کیفیت RNA، با قراردادن نمونههای استخراج شده برروی ژل آگارز 1 درصد تأیید شد. باندهای rRNA28s و rRNA18s بهوضوح مشاهده شدند و تمام نمونهها دارای الگوی نواری مناسبی برروی ژل آگارز بودند که نشان دهندهی خلوص و کیفیت بالای RNA تخلیص شده و عدم ایجاد شکستگی و آسیب در ساختار RNA است (تصویر 1). بهمنظور تأیید درستی ساخت cDNA از RNAهای استخراج شده، با استفاده از آغازگر ژن خانهدار (بتا اکتین) و نمونههای cDNA، واکنش زنجیرهای پلیمراز استاندارد انجام گرفت و در انتها محصول PCR برای آغازگر مرجع و آغازگر اختصاصی (تصویر 2) بهطور جداگانه، برروی ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز گردید. الگوی باندی مشاهده شده در این مرحله برای تمام نمونهها تأیید کنندهی ساخت صحیح DNA مکمل، اختصاصی بودن آغازگر، بهینهسازی مناسب دما و زمان مناسب برای مراحل واکنش PCR بود. سپس با اطمینان از سنتز صحیح DNA مکمل، واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی صورت گرفت و با بررسی منحنی ذوب حاصل از Real-time PCR، صحت پیک مربوط به آغازگرهای مورد مطالعه و فقدان پرایمر دایمرها تأیید گردید.
با توجه به گزارشاتی که توسط محققین مبنی بر افزایش سطح بیان ژن سیتوکروم P450 بهعنوان بیومارکر حضور آلودگی در بدن بیان شده است، مطالعه تغییرات سطوح بیان این ژن و اثبات حضور آلودگی در سطح مولکولی با مکمل نانوذرات نقره و اطمینان از سلامت نانوذرات نقره در طیور ضروری بهنظر میرسد. در سطح مولکولی تغییرات ژنتیکی (تغییر در بیان، عملکرد و تنظیم ژنی) و تغییرات سطوح پروتئینی در موجودات را میتوان شاخص مواجهه با آلودگی در نظر گرفت بهویژه اگر مولکول مورد بررسی قسمتی از مکانیسم دفاعی، ترمیمی و یا سمزدایی سلول باشد که از آن جمله میتوان به متالوتیونینها (8)، گلوتاتیون-S ترنسفراز (1)، سوپراُکسید دیسموتاز (SOD) (20)، پروتئینهای شوک حرارتی (HSP70) (3) و سیتوکروم P450 (21) اشاره نمود. همچنین گزارشات بیانگر این است که روده آبزیانی که در معرض فلزات سنگین قرار گرفتند، افزایش قابلتوجهی در میزان بیان ژن سیتوکروم P450، در مقایسه با تیمار شاهد داشتهاند (30). جوجههایی که در معرض سموم قرار داشتند افزایش بیان ژن سیتوکروم P450 را نشان دادند و این افزایش بیان، به عنوان نشانگری برای افزایش یافتن متابولیسم دارویی در بافت کبد و روده جوجهها درنظر گرفته شده است (4).
افزایش بیان ژن سیتوکروم P450 در کبد ماهیانی که در معرض فلزات سنگین بودند به اثبات رسیده است (11). همچنین گزارشاتی مبنی بر افزایش بیان ژن سیتوکروم P450 بهعنوان زیستنشانگری در طی متابویسم مواد زنوبیوتیک و متابولیسم مواد دارویی در سطح سلولهای کبدی جوجههای گوشتی گزارش شده است و افزایش بیان قابل توجهی از سطح ایزوفرم CYP2C45 در جوجههای قرار گرفته در معرض فنوباربیتال، گزارش شده است (28). از این رو آغازگر ژن هدف سیتوکروم P450 با ایزوفرم CYP2C45 با استفاده از آغازگر بتا اکتین به عنوان کنترل داخلی، نرمال گردید و در دو بافت کبد و روده باریک مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفت. نتایج پژوهش حاضر بیانگر این است که سطح بیان ژن CYP2C45 در روز 21 دوره پرورش در سلولهای کبد و روده جوجههای تغذیهشده با تیمار زئولیت (Z) در بیشترین میزان بیان بوده و دارای تفاوت معنیداری با تیمار شاهد بوده است (05/0>P). با این تفاوت که سطح بیان ژن CYP2C45 در سلولهای روده افزایش بسیار زیادی در مقایسه با تیمار شاهد داشته است در حالی که بیان این ژن در سلولهای کبدی سطح افزایش کمتری در مقایسه با سلولهای روده را نشان داده است. بدین ترتیب این احتمال وجود دارد که تیمار زئولیت (Z) در روز 21 دوره پرورش در سطح سلولهای کبد و روده، سطح بیان ژن سیتوکروم P450 را بهعنوان زیستنشانگر آلودگی افزایش داده و بهعنوان شاخصی برای حضور آلودگی احتمالی در سلولهای کبد و روده تلقی گردد. با این تفاوت که سلولهای روده بیشتر از سلولهای کبد تحتتأثیر تیمار زئولیت قرار گرفتهاند و سطح آلودگی وسیعتری را در سطح مولکولی با توجه به افزایش بیان این ژن نشان دادهاند. تصویر 3 نشاندهنده افزایش سطح بیان این ژن در جوجههای گوشتی تغذیه شده با تیمار زئولیت در بافت کبد است که دارای تفاوت معنیداری با تیمار شاهد بوده است (05/0>P). از سویی میزان بیان ژن CYP2C45 در تیمار اسیداُرگانیک (OA) و نانوذرات نقره پوشش داده شده بر زئولیت (NS) در کبد در مقایسه با تیمار شاهد دارای کاهش بیان معنیداری بوده است (05/0>P) در حالی که تفاوت معنیداری در میزان بیان این ژن در تیمار نانوذرات نقره پوششداده شده بر زئولیت با مکمل اسیداُرگانیک (NSOA) در مقایسه با تیمار شاهد مشاهده نشده است (05/0<P). تصویر 4 نشاندهنده افزایش چشمگیری در سطح بیان ژن مذکور در جوجههای گوشتی تغذیهشده با تیمار زئولیت در بافت روده باریک است که دارای تفاوت معنیداری با تیمار شاهد بوده است (05/0>P). همچنین میزان بیان ژن CYP2C45 در تیمارهای اسیداُرگانیک (OA)، نانوذرات نقره پوشش داده شده بر زئولیت (NS) و تیمار نانوذرات نقره پوشش داده شده بر زئولیت با مکمل اسیداُرگانیک (NSOA) در روده باریک، تفاوت معنیداری در مقایسه با تیمار شاهد نداشته است (05/0<P).
در روز 42 دوره پرورش بدون اعمال تنش گرمایی، جوجههای گوشتی تغذیهشده با تیمار نانوذرات نقره مکمل شده با اسیداُرگانیک (NSOA)، بیشترین سطح بیان ژن سیتوکروم P450 را به ترتیب در بافت کبد و روده باریک در مقایسه با تیمار شاهد نشان داده است (05/0>P) (تصویر 5،6). بر اساس نتایج حاصل از پژوهش حاضر، تیمارهای آزمایشی OA، Z و NS تفاوت معنیداری را در میزان بیان ژن CYP2C45 در بافت کبد و روده باریک جوجههای گوشتی در مقایسه با تیمار شاهد نشان ندادهاند (05/0<P).
همچنین روز 42 دوره پرورش با اعمال تنش گرمایی افزایش چشمگیری در میزان بیان ژن سیتوکروم P450 با ایزوفرم CYP2C45 در بافت کبد و رودهی جوجههای گوشتی تغذیهشده با تیمار نانوذرات نقره (NS) در مقایسه با تیمار ایجاد شد (05/0>P). با این تفاوت که سلولهای کبدی بیشتر تحت تأثیر تیمار NS قرار گرفته و افزایش بیان بسیار بالاتری نسبت به تیمار شاهد در مقایسه با بافت روده باریک را داشتند (تصویر 7).
بهطور کلی نتایج این مطالعه گویای آن است که افزایش سطح بیان ژن CYP2C45 در هر دو بافت کبد و روده در تمام زمانهای نمونهبرداری در یک تیمار مشخص رخ داده است که نشاندهنده درستی و یکسان بودن شرایط آزمایش بوده و تیمارهای Z (در روز 21)، NSOA (در روز 42 بدون تنش گرمایی) و NS (روز 42 با اعمال تنش گرمایی) افزایشدهندهی احتمالی سطح آلودگی در هر دو بافت کبد و روده باریک بوده است. با توجه به این که آنزیم سیتوکروم P450 جزء آنزیمهایی است که در فاز اول متابولیسم آلودگی در سطح سلولی تولید میگردد و اولین واکنش سلولها به شرایط تنشزا و استرسی تولید آنزیم سیتوکروم P450 میباشد (29)، از این رو نتایج تحقیق حاضر نشان داد که تغییرات سطح بیان این آنزیم با تیمارهای Z، NSOA و NS میتواند بهعنوان نشانگر آلودگی در نظر گرفته شود و مکملهای زئولیت (Z) و نانوذرات نقره (NS) را میتوان بهعنوان ماده غیرآلی و شیمیایی و مادهی شناخته شده با منشأ خارجی در بافت کبد و روده باریک جوجههای گوشتی مدنظر قرار داد. این در حالی است که تیمار اسیداُرگانیک به عنوان اسید طبیعی موجب افزایش سطح بیان ژن سیتوکروم P450 در هیچ‌کدام از زمانهای دوره پرورش در بافتهای کبد و روده باریک جوجههای گوشتی نشده است.
در پایان از همکاری اساتید و مسئولان آزمایشگاههای دانشکده علوم دامی و تولید گیاهی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان تشکر به عمل میآید.
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
جدول 1. اسامی ژنها و توالی پرایمرهای مورد استفاده در واکنش qRT-PCR.
|
نام آغازگر |
توالی آغازگر |
طول محصول (bp) |
Access number |
|
CYP2C45 |
F: 5'- AAGACAATCCCAAATCACACT-3' R: 5'-GAAGCAGAAGCCCGTATC-3' |
114 |
NM_001001752 |
|
β-actin |
F: 5'- AAGTTACTCGCCTCTGTGAA- 3' R: 5'- CACATCTATCACTGGGGAAC-3' |
198 |
NM_205518 |
تصویر 1. بررسی RNA استخراج شده در دو بافت کبد و روده با تیمارهای مختلف.
تصویر 2. بررسی cDNA سنتز شده با آغازگر مرجع و اختصاصی در دو بافت کبد و روده با تیمارهای مختلف.
تصویر 3. میزان بیان ژن سیتوکروم P450 با ایزوفرم CYP2C45 در روز 21 دوره پرورش در بافت کبد جوجههای گوشتی.
تصویر 4. میزان بیان ژن سیتوکروم P450 با ایزوفرم CYP2C45 در روز 21 دوره پرورش در بافت روده باریک جوجههای گوشتی.
تصویر 5. میزان بیان ژن سیتوکروم P450 با ایزوفرم CYP2C45 در روز 42 دوره پرورش بدون اعمال تنش گرمایی در بافت کبد جوجههای گوشتی.
تصویر 6. میزان بیان ژن سیتوکروم P450 با ایزوفرم CYP2C45 در روز 42 دوره پرورش بدون اعمال تنش گرمایی در بافت روده باریک جوجههای گوشتی.
تصویر 7. میزان بیان ژن سیتوکروم P450 با ایزوفرم CYP2C45 در روز 42 دوره پرورش با اعمال تنش گرمایی در بافت کبد جوجههای گوشتی.
تصویر 8. میزان بیان ژن سیتوکروم P450 با ایزوفرم CYP2C45 در روز 42 دوره پرورش با اعمال تنش گرمایی در بافت روده باریک جوجههای گوشتی.
', './data/jvr/coversheet/cover_fa.jpg'))