اثر عصاره اتانولی آویشن شیرازی (Zataria multiflora) روی مرحله تومونت و ترونت ایکتیوفتیریوس مولتی فیلیس در ماهی زبرا (Danio rerio)

نوع مقاله : بهداشت و بیماری های آبزیان

نویسندگان

1 گروه بهداشت و بیماری‌های آبزیان، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

2 دانش آموخته دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

چکیده

زمینۀ مطالعه: گیاهان دارویی پیشینه طولانی در درمان بیماری‌ها دارند و معمولاً عاری از عوارض جانبی هستند. حذف و از بین بردن سریع ترونت‌ها و تومونت‌ها می‌تواند مانع از بیماریزایی انگل ایکتیوفتیریوس مولتی فیلیس در ماهیان گردد.
هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثر کشندگی و مهارکنندگی عصاره اتانولی آویشن شیرازی روی هر دو مرحله زندگی آزاد و انگلی ایک بود.
روشکار: سه شکل محلول از عصاره آویشن شیرازی (80 میلی‌لیتر در لیتر) آماده شد که شامل محلول تازه تهیه شده، محلول نگهداری شده در دمای اتاق به مدت یک ماه و محلول نگهداری شده در یخچال به مدت یک ماه بودند. سپس برای هریک از اشکال محلول‌ها، رقت‌های مختلف تهیه گردید و تومونت‌ها و ترونت‌‌ها در معرض رقت‌های مختلف عصاره قرار گرفتند.
نتایج: غلظت 20 میلی‌لیتر عصاره آویشن شیرازی بر لیتر در بازه‌ی زمانی 04/6 تا 37/6 دقیقه و غلظت 10 میلی‌لیتر عصاره بر لیتر در مدت زمان 2/31 تا 4/32 دقیقه می‌تواند تمامی ترونت‌های ایک را نابود کند اما با همین غلظت تنها 11/6-46/3 درصد تومونت‌ها پس از 4 ساعت در معرض‌گذاری از بین رفتند.
نتیجه­گیری نهایی: تومونت‌ها نسبت به ترونت‌ها مقاومت بیشتری در برابر ویژگی انگل‌کشی عصاره آویشن شیرازی داشتند. استفاده از این عصاره به طور معنی‌داری سبب کاهش تولید و تکثیر تومونت‌ها و کاهش شدت و شیوع عفونت‌زایی ایک شد. عصاره آویشن شیرازی قادر بود مانع از هجوم انگل ایک به ماهیان سالم شده و به طور مؤثری موجب درمان ماهیان مبتلا گردد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Effect of Ethanol Extract of Zataria Multiflora on Ichthyophthirius Multifiliis Tomonts and Theronts in Danio rerio

نویسندگان [English]

  • Hooman Rahmati-Holasoo 1
  • Mahsa Sadat Javadi Moosavi 2
  • Hosseinali Ebrahimzadeh Mousavi 1
  • Seyed Saeed Mirzargar 1
  • Ali Taheri Mirghaed 1
1 Department of Aquatic Animal Health, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran
2 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Medicinal plants have a long history in the treatment of parasitic diseases and are usually free of side effects. Removing and killing tomonts and theronts of this parasite can prevent the parasite pathogenicity in fish.
OBJECTIVES: The present study aimed to investigate the inhibitory effect of ethanolic extract of Zataria multiflora on both free and parasitic life stages.
METHODS: Three soluble forms of Zataria multiflora extract (80 ml/L) were prepared, which contained freshly prepared solution, stored solution at room temperature for one month and stored solution at refrigerator for one month. Afterwards, different dilutions were prepared for each of the solutions and the tomonts and Theronts were treated with different dilutions of the extract.
RESULTS: Zataria multiflora extract can kill all theronts at concentrations of 20 ml/L during 6.04 to 6.37 min and concentration of 10 ml/L during 31/2 to 32.4 min, respectively. However, at these concentrations, only 3.46-6.11 % of tomonts were killed herein after 4 hours.
CONCLUSIONS: Tomonts were found to be more resistant to the parasiticides than theronts. The use of Zataria multiflora extract significantly reduced tomont reproduction and decreased Ich infectivity prevalence and intensity. Zataria multiflora extract prevented Ich infestation in naive fish and effectively treated infected fish.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Zataria multiflora
  • Disease
  • Infectivity
  • killing
  • Inhibitory

مقدمه

 

امروزه به دلیل کارایی بالا و خطرات زیست محیطی کم، مطالعات در زمینه استفاده از ترکیبات و عصاره‌های گیاهان دارویی برای کنترل برخی انگل‌ها از جمله ایکتیوفتیریوس مولتی فیلیس جایگاه ویژه‌ای یافته است. گزارش شده است که عصارۀ آبی گیاه کاسپیکوس فروتسنس (12)، عصاره استونی موروس آلبا (8) و همچنین ترکیبات استخراج شده از عصاره‌های گیاهی از قبیل: پنتاگالوی‌لوکوز (30)، سیناتراتوزید-C (8)، دی هیدروزانگواینارین و دی هیدروکلریترین (28) دارای خواصی با ویژگی فعالیت‌های ضدانگلی در برابر انگل ایکتیوفتیریوس مولتی فیلیس است.

ایکتیوفتیریوس مولتی فیلیس یا ایک عامل بیماری ایکتیوفتیریازیس یا لکه سفید، تک یاخته‌ای مژه دار است که انگل ماهیان آب شیرین هم در محیط‌های آبی گرمسیری و هم مناطق معتدله در سراسر دنیا می‌باشد (13). این انگل سبب خسارت‌های مالی بسیار زیادی در صنعت آبزی پروری هم در ماهیان پرورشی خوراکی و هم در ماهیان زینتی می‌شود (25). سیکل زندگی این انگل شامل مراحل مختلفی است. فرم عفونت‌زای انگل فرم تومیت یا ترونت می‌باشد که با شنای آزاد در آب حرکت می‌کند و می‌تواند پوست ماهی سالم را در آب مورد حمله قرار دهد، بعد از ورود ترونت به پوست، رشد و از پوست تغذیه می‌کند و مرحله تروفونت تشکیل می‌گردد. تروفونت نقاط جدیدی روی پوست ایجاد می‌نماید. ترونت بعد از تکامل از پوست جدا می‌شود و در محیط آبی آزاد می‌گردد (تومونت). تومونت متحمل تقسیمات متعدد هسته‌ای می‌شود و به کیستی پر از نوزاد عفونت‌زای انگل تبدیل می‌شود، که با منهدم شدن آن ترونت عفونت‌زا به محیط وارد می‌گردد (15). تحقیقات علمی انجام شده نشان داد که ترونت‌ها در قیاس با دیگر مراحل انگل ایک حساسیت بیشتری نسبت به انگل‌کش‌های فعال گیاهی (6،12،29) و شیمیایی (5،21) دارند. بنابراین انجام تحقیقات و آزمون‌ها در شرایط آزمایشگاهی برای شناسایی و برگزیدن ترکیبات انگل کش‌های ضد ایک ضروری هستند. در بررسی‌های اخیر، مرگ و میر و تلفات ترونت (11،12،29) به عنوان شاخص‌هایی برای ارزیابی تأثیر و کارایی انگل‌کش در فواصل زمانی مختلف مورد استفاده قرار گرفته است. شاخص دیگری که برای ارزیابی پتانسیل و کارایی انگل‌کش مورد ارزیابی قرار می‌گیرد دوره و مدت زمان در معرض‌گذاری برای کشتن همه ترونت‌ها است (24) که در این تحقیق نیز برای تأثیر ضد ایک گیاه آویشن شیرازی (Zataria multiflora)  مورد استفاده قرار گرفت.

آویشن شیرازی، یک گیاه متعلق به نعناعیان است که تنها در ایران، پاکستان و افغانستان توزیع شده است (18). ترکیبات عمده تشکیل‌دهنده آویشن شیرازی، شامل کارواکرول (08/26 درصد)، پاراسیمن (34/20 درصد)، تیمول (23/17درصد) می‌باشند (16،23). آنتی‌اکسیدان‌هایی مانند فلاوونوئیدها، تانین‌ها، کومارین‌ها، کورکومانوئیدها، اگزانتون‌ها، فنولیک‌ها، لیگنان‌ها و ترپنوئیدها در تولیدات گیاهی مختلف (مانند میوه، برگ، دانه، عصاره) یافت می‌شوند (20). تیمول و کارواکرول اجزاء اصلی ترکیبات فنلی و پاراسیمن جزء اصلی ترکیبات غیرفنلی اسانس آویشن شیرازی می‌باشند (4) و ترکیبات طبیعی هستند که در صنایع غذایی به عنوان یک محرک برای بالا بردن سلامتی ایمنی غذا بکار برده می‌شوند (1). بنابراین استفاده از ترکیبات ضدانگلی استخراج شده از گیاهان می­تواند راهکار نوینی برای درمان بیماری ایک باشد.

این بیماری در نقاط مختلف و ماهی‌های مختلف در اثر گونه‌ی ایکتیوفتریوس مولتی فیلیس ایجاد می‌شود (15). بنابراین ماهی زبرا (Danio rerio) می‌تواند بیشـترین اطلاعـات سیسـتم شـبیه‌سـازی سلول را فراهم کند و در مقایسه با سایر موجودات آزمایشگاهی و سایر انواع گونه‌های ماهیان، ماهی زبرا دارای نوزادان زیاد است و هزینه‌های تولید و نگهـداری آن نسبتاً کم است. بـا توجـه بـه توصـیه‌هـای جامعـه علمـی، موسسه ملی سلامت این ماهی به عنوان مدل زیستی بـرای مطالعه و بیماری معرفی شده است (19).

مواد و روش کار

در این تحقیق از ماهی زبرا که تقریباً همگی نابالغ و هم سن بوده و تقریباً دو تا دو و نیم ماه سن داشتند، استفاده گردید. این ماهیان در دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران به مدت یک ماه و نیم در شرایط آزمایشی پرورش یافتند و در این دوره‏ی زمانی ماهی‏ها روزانه به میزان 5 درصد وزن بدن و در دو نوبت غذادهی ‏شدند.

در طول دوره آزمایش مقادیر مربوط به میانگین دما، pH، شوری و اکسیژن اندازه‏گیری شد (جدول 1). در طول مدت زمان انجام آزمایش تمامی شرایط محیطی، برای کلیه‌ تیمارها یکسان در نظر گرفته شد.

همچنین در این مطالعه از انگل ایکتیوفتیریوس مولتی فیلیس از ماهیان زبرای آلوده جداسازی شد، استفاده گردید. ماهیان آلوده در آکواریوم‌های 30 لیتری نگهداری و هوادهی از طریق پمپ هوای اکواریومی و سنگ هوا تأمین شد. در این مطالعه 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی فراهم شد. ماهیان با شدت آلودگی بیشتر جداشده و با پودر گل میخک بیهوش شدند. در این مطالعه برای دستیابی به تروفونت‌ها، پوست ماهیان مذکور به آرامی خراشیده شده و داخل ظروف پتری نگهداری می‌شد. تروفونت‌های جدا شده به دو گروه تقسیم شدند. گروه اول برای ارزیابی فعالیت کشندگی عصاره آویشن شیرازی، خریداری شده از شرکت سها جیسا، در برابر تومونت‌ها استفاده شد. گروه دوم تروفونت‌ها در ظروف پتری حاوی آب (فاقد کلر) به مدت 24 ساعت در دمای 23 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. پس از اینکه ترونت‌های گروه دوم از سیست‌های داخل ظرف پتری خارج شدند، 5 میکرولیتر سوسپانسیون ترونت با 5 تکرار با استفاده از سلول شمارش در زیر میکروسکوپ نوری شمارش شد. در این مطالعه در مراحل مختلف مطالعه قبل از مواجهه با عصاره، تراکم ترونت‌ها براساس تعداد ترونت در هر میلی‌لیتر محاسبه شد (30).

در طول مطالعه به صورت روزانه پارامترهای کیفی آب از قبیل دما، اکسیژن محلول، شوری و pH به‌صورت روزانه اندازه‏گیری و ثبت می‌شد.

اثر عصاره آویشن شیرازی روی ترونت­های ایک: سه شکل محلول از عصاره آویشن شیرازی (80 میلی‌لیتر در لیتر) آماده شد که شامل: 1) تازه تهیه شده، 2) تهیه شده و نگهداری شده در دمای اتاق (25-23 درجه سانتی‌گراد) برای مدت یک ماه و 3) تهیه شده و نگهداری شده در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در یخچال برای مدت یک ماه بودند. این سه محلول، به پلیت‌های میکروتیتر 96 چاهی اضافه شده و رقیق‌سازی‌های متوالی مضاعف (دوگانه) به‌ترتیب غلظت‌های 40، 20، 10، 5، 5/2 و 25/1 میلی‌لیتر عصاره آویشن شیرازی در لیتر را در هر چاه 50 میکرولیتری بوجود آورد. تقریباً 500 ترونت در 50 میکرولیتر آب در هر پلیت میکرولیتر 96 چاهی برای حصول غلظت نهایی 20، 10، 5، 5/2، 25/1 و 625/0 میلی‌لیتر عصاره آویشن شیرازی در لیتر در حجم نهایی 100 میکرولیتر در چاه‌ها توزیع شد. برای هر غلظت مورد مطالعه 5 چاه و 3 چاه نیز بدون عصاره آویشن شیرازی (تنها حاوی 50 میکرولیتر آب فاقد کلر) به‌عنوان شاهد مورد استفاده قرار گرفت. آب فاقد کلر (کلرزدایی شده) با استفاده از فیلترهای کربنی برای زدودن کلر از آب شهر  تهیه گردید. مطالعه 5 بار با استفاده از جمعیت‌های مختلف ترونت‌ها در زمان‌های مختلف تکرار شد. ترونت‌های زنده و مرده با میکروسکوپ اینورت در بازه‌های زمانی مختلف تا 4 ساعت پس از  در معرض‌گذاری با عصاره آویشن شیرازی شمارش شدند. طول مدت کشندگی (یعنی عدم حرکت و دفورمه شدن ترونت‌ها)  ضمن در معرض‌گذاری با عصاره آویشن شیرازی، برای ترونت‌ها در هر چاه ثبت شد (30). ترونت‌ها با استفاده از یک دوربین دیجیتالی نصب شده روی همان میکروسکوپ عکس‌برداری شدند.

اثر عصاره آویشن شیرازی روی تومونت‌های ایک: سه شکل محلول عصاره آویشن شیرازی (160 میلی لیتر در لیتر ) شامل: 1) تازه تهیه شده، 2) تهیه شده و نگهداری شده در دمای اتاق (25-23 درجه سانتی‌گراد) برای مدت یک ماه و 3) تهیه شده و نگهداری شده در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در یخچال برای مدت یک ماه آماده شد. مقدار 500 میکرولیتر از هر محلول به درون چاه‌ها (4 تا) در اولین ردیف 24 چاهی پلیت کشت بافت (Costar, Cambridge, MA, USA) ریخته شده و رقیق‌سازی‌های متوالی مضاعف (دوگانه) صورت گرفت. تقریباً 200 تومونت در 250 میکرولیتر آب درون هر چاه پلیت، برای حصول غلظت نهایی 80، 40، 20، 10 و صفر (شاهد) میلی‌لیتر در لیتر توزیع شدند. مطالعه 3 بار با جمعیت‌های مختلف از تومونت تکرار شد. پلیت‌ها در دمای 1 ± 23 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدتد. تومونت‌های زنده و مرده با میکروسکوپ معکوس (اینورت) 4 و 22 ساعت پس از مطالعه شمارش شدند. مرگ و تولید تومونت‌ها در هر چاه تعیین گردید. میانگین تعداد ترونت‌های آزاد شده از تومونت‌ها در هر چاه از طریق شمارش ترونت‌ها در 10 میکرولیتر از هر چاه (با 5 بار تکرار) با استفاده از سلول شمارشSadgewick-Rafter  تعیین شد (30).

نفوذپذیری غشای پلاسمای ایک با اکریدین اورنج (acridine orange) و پروپیدیوم یدید (propidium iodide): افزایش نفوذپذیری غشای پلاسمای ترونت‌ها و تومیت‌های تیمار شده با استفاده از روش Xu و همکاران در سال 2015 با مدت زمان رنگ‌آمیزی طولانی‌تر برای تومونت‌ها بررسی شد. ترونت‌های تیمار شده با 10 میلی‌لیتر در لیتر عصاره و تومونت‌های تیمار شده با 80 میلی‌لیتر در لیتر به 50 میکرولیتر تغلیظ شدند. ترونت‌ها و تومونت‌های تیمار نشده به‌عنوان شاهد منفی (کنترل منفی) استفاده شدند. ترونت‌های در تیوپ میکروسانتریوفوژ 2/0 میلی‌لیتری با 2 میکرولیتر اکریدین اورنج (Sigma) در غلظت 100 میکرولیتر در میلی‌لیتر  و 2 میکرولیتر پروپیدیوم یدید (Sigma) در غلظت 250 میکرولیتر در میلی‌لیتر برای مدت 5 دقیقه رنگ‌آمیزی شد. تومونت‌ها با همان غلظت‌های اکریدین اورنج و پروپیدیوم یدید برای مدت 40 دقیقه رنگ‌آمیزی شد. سپس زیر میکروسکوپ فلئورسنس رنگ‌آمیزی سوسپانسیون‌های سلولی روی اسلایدها توزیع (گسترش)، مشاهده و عکس‌برداری شد.

در نهایت داده‌های هر مطالعه با استفاده از نرم افزار SPSS (نسخه 0/17) تجزیه و تحلیل و به ‌صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شدند. آزمون Student–Newman–Keuls برای مقایسه‌ مورد استفاده قرار گرفت. احتمالات 05/0 و کمتر از نظر آماری معنی‌دار در نظر گرفته شدند.

نتایج

همان طور که در جدول 2 مشاهده می‌شود، میانگین طول دوره‌ی زمانی (بر حسب دقیقه) برای از بین رفتن همه ترونت‌ها در خلال 4 ساعت مواجهه با غلظت‌های مختلف محلول تازه تهیه شده‌ عصاره آویشن‌شیرازی با افزایش غلظت عصاره آویشن‌شیرازی به طور معنی‌داری کاهش یافت. مشابه این روند در محلول عصاره  نگهداری‌شده برای یک ماه در دمای اتاق و یا دمای 4 درجه‌سانتی‌گراد نیز مشاهده شد. به طوری که با افزایش غلظت عصاره، طول دوره زمانی برای نابودی ترونت‌ها کاهش یافت. نتایج مربوط به اثر کشندگی عصاره آویشن شیرازی، در برابر ترونت‌های ایک نشان داد که مدت زمان لازم برای از بین بردن کامل ترونت‌ها در غلظت‌های بالای عصاره آویشن‌شیرازی به طور معنی‌داری (05/0>P) کوتاه‌تر از غلظت‌های پایین بود. با افزایش غلظت عصاره آویشن‌شیرازی، طول دوره زمانی نابودی کامل ترونت‌ها کوتاه‌تر شد. در تیمار 20 میلی‌لیتر عصاره بر لیتر کمترین زمان (کمتر از 7 دقیقه) و در تیمار 5/2 میلی­لیتر عصاره بر لیتر بیشترین زمان (297 تا 311 دقیق) برای نابودی کامل ترونت گزارش شد. همچنین در غلظت‌های 0 (تیمار شاهد)، غلظت 625/0 و 25/1 میلی‌لیتر عصاره بر لیتر، خاصیت کشندگی ترونت دیده نشد. به عبارت دیگر در غلظت 25/1 میلی‌لیتر عصاره بر لیتر و کمتر از آن، این ترکیب نتوانست موجب نابودی ترونت‌ها شود. مطالعه حاضر، تأثیر عصاره آویشن‌شیرازی در برابر ترونت‌ها همبستگی مثبت و رابطه مستقیمی با غلظت عصاره آویشن‌شیرازی داشت. نتایج همچنین نشان داد نگهداری محلول عصاره آویشن­شیرازی برای مدت یک ماه در دمای اتاق یا دمای 4 درجه سانتی‌گراد (یخچال) اثر معنی‌داری روی خاصیت ضد ترونت محلول عصاره آویشن شیرازی نداشت.

نتایج مربوط به اثر عصاره آویشن شیرازی روی تومونت‌های ایک در جدول 3 آمده است. نتایج نشان داد با افزایش غلظت عصاره آویشن شیرازی سبب افزایش اثر ضد تومونت شد (05/0>P). درصد تلفات تومونت‌ها طی 4 ساعت مواجهه با محلول تازه‌ی عصاره آویشن شیرازی در غلظت‌های 40 و 80 میلی‌لیتر عصاره بر لیتر به طور معنی‌داری (05/0>P) بیشتر از سایر غلظت‌ها بود. درصد تلفات تومونت در تیمار شاهد صفر درصد گزارش شد. در حالی که درصد تلفات در تیمار با غلظت 80 میلی‌لیتر عصاره بر لیتر هر سه حالت (محلول عصاره تازه، نگهداری شده به مدت یک ماه در دمای معمولی و 4 درجه سانتی‌گراد) 100 درصد بود که این اختلاف معنی­دار گزارش شد (05/0>P). طی4 ساعت مواجهه با عصاره آویشن شیرازی با غلظت 40 میلی‌لیتر در لیتر  به صورت محلول عصاره تازه، نگهداری شده به مدت یک ماه در دمای معمولی و 4 درجه سانتی‌گراد، به ترتیب 83، 80 و 79 درصد تلفات تومونت مشاهده گردید. اما پس از 22 ساعت در معرض‌گذاری، تعداد ترونت‌های آزاد شده از تومونت زنده در این غلظت (40 میلی‌لیتر در لیتر)، صفر بود. در غلظت 20 میلی‌لیتر بر لیتر، درصد تلفات تومونت طی4 ساعت مواجهه با محلول عصاره آویشن شیرازی، نسبت به غلظت‌های 80 و 40 میلی‌لیتر عصاره بر لیتر به شدت کاهش یافت و به 1/6 درصد در محلول تازه، 4/3 درصد در محلول نگهداری شده به مدت یک ماه در دمای اتاق و 2/5 درصد در محلول نگهداری شده به مدت یک ماه در دمای4 درجه سانتی‌گراد کاهش یافت. مشابه با این نتایج، در غلظت 10 میلی‌لیتر عصاره در لیتر نیز مشاهده شد به طوری که درصد تلفات تومونت طی 4 ساعت مواجهه با عصاره آویشن شیرازی، به 7/1 تا 2 درصد کاهش یافت. اما به موازات کاهش درصد تلقات تومونت در غلظت‌های 20 و 10 میلی‌لیتر عصاره بر لیتر، تعداد ترونت آزاد شده از هر تومونت زنده طی 22 ساعت مواجهه با محلول عصاره آویشن شیرازی، به طور معنی‌داری در مقایسه با غلظت‌های 40 و 80 میلی‌لیتر عصاره بر لیتر افزایش یافت (05/0 >P). اما با این وجود در تیمارهای با غلظت 10 و 20 میلی‌لیتر بر لیتر نیز تعداد ترونت‌های آزاد شده به ازای هر تومونت طی 22 ساعت مواجهه، نسبت به تیمار شاهد به طور معنی‌داری کاهش یافت (05/0<P). مطالعه حاضر غلظت 10 و 20 میلی‌لیتر در لیتر عصاره آویشن شیرازی، پس از 4 ساعت مواجهه موجب از بین رفتن کمتر از 7 درصد تومونت‌ها شد و تومونت‌های زنده مانده طی 22 ساعت در معرض‌گذاری، ترونت‌ها را تولید کردند. همچنین پس از 22 ساعت مواجهه، تعداد ترونت‌های آزاد شده از تومونت زنده از میزان 664-658 ترونت در تیمار شاهد به میزان صفر در غلظت‌های 40 و 80 میلی‌لیتر در لیتر کاهش یافت. به علاوه مطالعه حاضر، اگرچه محلول عصاره آویشن شیرازی در غلظت 40 میلی‌لیتر در لیتر قادر به از بین بردن همه تومونت‌ها نبود (طی 4 ساعت مواجهه، 83–79 درصد تلفات تومونت گزارش شد)، با این حال هیچ ترونتی تولید و آزاد نشد. مشابه مرحله قبل نگهداری محلول عصاره آویشن شیرازی برای مدت یک ماه در دمای اتاق (25-23 درجۀ سانتی­گراد) یا دمای 4 درجه سانتی‌گراد یخچال نتوانست اثر ضد تومونت این عصاره را تحت تأثیر قرار دهد. در مجموع در میان سه شکل محلول عصاره آویشن شیرازی، هیچ تفاوت معنی‌داری در تلفات تومونت‌ها و تولید ترونت‌ها مشاهده نشد.

بررسی و تشخیص نفوذپذیری غشای پلاسمای ایک با اکریدین اورنج و پروپیدیوم یدید: اکریدین‌اورنج و پروپیدیوم‌یدید هر دو (خاصیت درون‌گذاری/ نفوذ به درون) intercalating  وnucleic acid-specific fluorochromes  را دارا هستند که هنگام اتصال با DNA ایک تحت نور UV، فلئورسانس سبز و یا نارنجی را ساطع می‌کنند. اکریدین اورنج قادر است از غشای پلاسمای سلول‌های زنده عبور کرده و درون DNA قرار گرفته و به رنگ سبز ظاهر شود (تصویر 1: A). پروپیدیوم یدید تنها وارد سلول‌هایی می‌شود که نفوذپذیری غشای پلاسمایی افزایش یافته است و رنگ صورتی یا قرمز را نشان می‌دهد (تصویر 1: B).

بحث

انگل ایکتیوفیتریوس مولتی‌فیلیس که با نام انگل ایک شناخته می‌شود بیماریزاترین انگل تک‌یاخته‌ای ماهیان به شمار می‌آید که ضررهای اقتصادی سنگینی را در آبزی‌پروری موجب می‌شود. سیکل زندگی این انگل شامل مراحل مختلفی است. ترونت مرحله عفونت‌زای چرخه زندگی انگل ایکتیوفتیریوس مولتی‌فیلیس است. بنابراین از بین بردن ترونت‌ها به منظور کنترل انگل تک‌یاخته ایک امری ضروری است.

Zhang  و همکاران در سال 2013 در مطالعه‌ای بر روی کنترل انگل ایک گزارش کردند که در معرض‌گذاری با غلظت 20 میلی‌گرم در لیتر ترکیب پنتاگالول‌گلوکز (استخراج شده از گیاه Galla chinesis) برای مدت 8/6-6/5 دقیقه و غلظت 10 میلی‌گرم در لیتر برای مدت 1/13-6/11 دقیقه قادر است کلیه ترونت‌ها را از بین ببرد (30) . Yi و همکاران در سال 2012 نیز نشان دادند که غلظت‌های 10 میلی‌گرم عصاره‌های دو گیاهMagnolia officinalis  وSophora alopecuroides  می‌تواند مدت در بازه‌ زمانی 3 تا 4 ساعت در معرض‌گذاری کلیه ترونت‌های انگل ایک را نابود کند (29).  همچنینBuchmann  و همکاران در سال 2003 گزارش کردند غلظت 5/62 میلی‌گرم عصاره سیر در لیتر می‌تواند کلیه ترونت‌های ایک را در طول 15 ساعت نابود کند (5).Ling   و همکاران در سال 2010 نشان دادند که در معرض‌گذاری ترونت ایک با غلظت 24 میلی‌گرم در لیتر فرات پتاسیم به مدت 30 دقیقه منجر به نابودی کامل ترونت‌ها می‌شود (11). در مطالعاتی که اخیراً انجام شد یک رابطه معنی‌دار و مستقیم بین غلظت اسید تانیک و زمان مواجهه به منظور افزایش نرخ کشندگی ترونت‌های ایکتیو فتیریوس مولتی فیلیس وجود داشت. میزان کشندگی با افزایش غلظت و زمان مواجهه اسید تانیک به طور معنی‌داری تشدید شد. تانن مورد استفاده منجر به کاهش معنی‌داری در شمار ترونت‌های انگل ایکتیوفتیریوس مولتی فیلیس بیش از ٨٠ درصد در طی یک ساعت شد (2،3). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که غلظت 20 میلی‌لیتر عصاره آویشن شیرازی بر لیتر در بازه‌ زمانی 04/6 تا 37/6 دقیقه و غلظت 10 میلی‌لیتر عصاره بر لیتر در مدت زمان 2/31 تا 4/32 دقیقه می‌تواند تمامی ترونت‌های ایک را نابود کند (جدول2). بنابراین عصاره آویشن شیرازی قادر است در مقایسه با ترکیبات فوق به طور مؤثری ترونت‌های ایک را نابود کند.

Sahandi و همکاران در سال 2012 تأثیر دو گیاه سیر (A. sativum) و بابونه (M. chamomilla) در افزایش مقاومت ماهی زینتی مولی باله بلند (P. latipinna) علیه تک یاخته ایک را بررسی کردند. نتایج نشان داد ماهیان باقی‌مانده پس از 5 روز درمان شدند. این محققان گزارش کردند عصاره‌های گیاهی می‌توانند به عنوان عوامل طبیعی مؤثر و ایمن برای درمان انگل‌های خارجی ماهیان به کار روند و نسبت به مواد شیمیایی نظیر فرمالین که برای مصرف‌کنندگان و محیط زیست بسیار مضرند ارجحیت دارند (22). نتایج این تحقیقات با مطالعات Sahandi و همکاران در سال 2012 مبنی بر اینکه عصاره گیاه آویشن شیرازی می‌تواند به عنوان عامل طبیعی مؤثر و ایمن برای درمان انگل‌های خارجی ماهیان به‌کار رود و نسبت به سایر مواد شیمیایی ارجحیت دارد مطابقت داشت.

Xu و همکاران در سال 2011 به مقایسه مقاومت گربه ماهی کانالی (Ictalurus punctatus)، گربه ماهی آبی (Ictalurus furcatus) و گربه ماهی هیبریدی (ماده گربه ماهی کانالی و نر گربه ماهی آبی) در سطوح متفاوت انگل و مرگ و میر آن‌ها پرداختند (27). نتایج این مطالعه با مطالعات Xu و همکاران در سال 2009 مبنی بر اینکه با افزایش تعداد ترونت به ازای هر ماهی، ماهیان دچار عفونت سنگین‌تری می‌شدند و مرگ و میر تجمعی افزایش می‌یافت مطابقت داشت.

Gleason  در سال 1999 در مطالعه‌ای بر روی دوزیستان آن‌ها را با 200 عدد ترونت مقابله داد و مشاهده کرد که هیچ‌کدام از آن‌ها دچار ایک نشدند و بیان کرد که غلظت‌های پایین این تک‌یاخته اثری بر روی آبزیان ندارد (9) که با نتایج حاضر مطابقت دارد. همچنین در این مطالعه، وقتی دوزیستان را در معرض 2000 عدد ترونت مقابله داد، شاهد ابتلای  100 درصد آن‌ها به ایک بودکه با نتایج حاضر مبنی بر اینکه با با افزایش تعداد ترونت، شیوع این بیماری افزایش می‌یابد مطابقت داشت.

تومونت‌ها مرحله دیگری از زندگی آزاد چرخه زندگی انگل ایک هستند و هر تومونت قادر است صدها و هزاران ترونت عفونت‌زا ایجاد کند (7،13). هر چند تومونت‌ها مستقیماً ماهیان را مورد حمله قرار نمی‌دهند با این حال خاتمه دادن و توقف تکثیر و تولید تومونت‌ها برای جلوگیری از ابتلا به انگل ایک امری حائز اهمیت است. قابلیت تکثیر و تولید تومونت‌ها می‌تواند از طریق شمارش تعداد ترونت‌های موجود در تومونت مورد ارزیابی قرار گیرد. به علاوه تلفات و مرگ و میر تومونت‌ها در مراحل اولیه می‌تواند برای تعیین کارایی و بازده ضد انگلی ترکیبات انگل‌کش مورد استفاده قرار گیرد.

بنابراین در مطالعه حاضر مدت زمان 4 ساعت در معرض‌گذاری برای از بین بردن تومونت‌ها در نظر گرفته شد. همچنین تعداد ترونت‌های آزاد شده از هر تومونت زنده طی 22 ساعت پس از در معرض‌گذاری با عصاره آویشن شیرازی، برای ارزیابی و سنجش بازدهی و اثر ضد تومونت عصاره آویشن شیرازی به کار گرفته شد. عصاره آویشن شیرازی در غلظت 20 میلی‌لیتردر لیتر توانست در مدت زمان کوتاه (حدود 6 دقیقه) همه ترونت‌ها را نابود سازد اما با همین غلظت (غلظت 20 میلی‌لیتر عصاره بر لیتر)  تنها 11/6-46/3 درصد تومونت‌ها پس از 4 ساعت در معرض‌گذاری از بین رفتند (جدول 3). نتایج نشان داد که تومونت‌ها نسبت به ترونت‌ها مقاومت بیشتری در برابر ویژگی انگل‌کشی عصاره آویشن شیرازی داشتند. که این مسئله در مطالعات گوناگون به اثبات رسیده است (5،14،26،29).

Zhang و همکاران در سال 2013 در مطالعه‌ای که روی انگل ایک در گربه‌ماهی‌کانالی انجام دادند نشان دادند که یک ساعت در معرض‌گذاری با غلظت 5 و 5/2 میلی‌گرم در لیتر پنتاگالول‌گلوکز نتوانست سبب کشته شدن کلیه ترونت‌ها شود اما، توانایی عفونت‌زایی ترونت را به طور معنی‌داری کاهش داد و به میزان اندکی نیز موجب محافظت از ماهیان در برابر عفونت ناشی از ترونتها گردید (30). به طور مشابه Shinn و همکاران در سال 2012 نیز نشان دادند که استفاده از غلظت 1 میلی‌گرم در لیتر ترکیب شیمیایی برونوپول طی یک دوره 12 ساعته نتوانست کلیه ترونت‌ها را از بین ببرد اما به طور معنی‌داری موجب کاهش قدرت عفونت‌زایی ترونت‌ها در ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان شد (24). Zhang و همکاران در سال 2013 نشان دادند که غلظت‌های پایین ترکیب پنتاگالول‌گلوکز مانند 1 و 5/0 میلی‌گرم در لیتر نمی‌تواند از عفونت‌زایی ترونت‌ها ممانعت به عمل آورد به نحوی که درصد شیوع عفونت 100 درصد گزارش شد اما در مقایسه با گروه شاهد، به طور معنی‌داری شدت عفونت‌زایی کاهش یافت (30). همچنین گزارش شده است که مدت زمان و طول دوره طولانی در معرض‌گذاری با غلظت‌های پایین برونوپول نیز منجر به کاهش تراکم تروفونت در قزل‌آلای رنگین‌کمان شد (17). مشابه نتایج تحقیقات ذکر شده، در مطالعه حاضر عصاره آویشن شیرازی اثر مثبتی روی کنترل انگل ایک داشت.

Hines در سال 1973 اثر دو دوز تومیت را بر روی ماهی کپور به مدت 25-22 روز بررسی کردند. در این مطالعه ماهیان با 40 و 400 عدد تومیت بالغ به ازای هر ماهی مقابله داده شدند دمای آب بین 20-18 درجه‌سانتی‌گراد بود (10). نتایج این مطالعه با نتایج مطالعه Hines مبنی بر اینکه گیاه مرگ و میر در ماهیانی که با دوز پایین‌تر ترونت به ازای هر ماهی مقابله داده شده بودند گزارش نشد، این ماهیان بهبود یافتند و در این گروه ماهیان دستخوش یک عفونت سبک قرار گرفتند و در ماهیانی که با دوز بیشتر مقابله داده شده بودند میزان تلفات آن‌ها افزایش یافت و دوز بالاتر ایک باعث افزایش مرگ و میر در ماهی می‌شود، مطابقت داشت.

همچنین  Sahandiو همکاران در سال 2012 ماهی زینتی مولی بلند باله (P. latipinna) را در معرض ترونت ایک قرار دادند و سپس با دوزهای مشخصی از دو عصاره گیاهی سیر (A. sativum) و بابونه (M. chamomilla) حمام دادند. نتایج نشان داد ماهیان باقی‌مانده پس از  5 روز درمان شدند (22). پس این محققان گزارش کردند عصاره‌های گیاهی می‌توانند به عنوان عوامل طبیعی مؤثر و ایمن برای درمان انگل‌های خارجی ماهیان به کار روند.

به طور کلی نتایج این مطالعه نشان داد که عصاره آویشن شیرازی توانست به طور مؤثری موجب ریشه‌کن شدن ترونت‌ها و تومونت‌های انگل ایکتیوفتیریوس مولتی فیلیس در آب شود. در مجموع، استفاده از این عصاره توانست به طور معنی‌داری سبب کاهش تولید و تکثیر تومونت‌ها و کاهش شدت و شیوع عفونت‌زایی ایک شود. عصاره آویشن‌شیرازی قادر بود مانع از هجوم انگل ایک به ماهیان سالم شده و به طور مؤثری موجب درمان ماهیان مبتلا گردد. این ترکیب برای ماهی زبرا ایمن بود با این وجود تحقیقات بیشتری برای ارزیابی اثر این عصاره روی کنترل بیماری ایک در شرایط واقعی مزارع پرورش ماهیان مورد نیاز است.

سپاسگزاری

نویسندگان از معاونت محترم پژوهشی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، جهت همکاری در اجرای این پژوهش تقدیر و تشکر به عمل می‌آورند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

  1. References

     

    1. Ahmadifar, E., Akrami, R., Pouralimotlagh, S., Ghelichi, A., Noori, S. (2011). Growth performance, body composition, survival and haematological changes in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, juveniles following dietary administration of NEXT Enhance150 (Thymol and Carvacrol). J Fish, Islamic Azad University, Azadshahr Branch, 4(4), 83-91.
    2. Alavinia, S.J., Mirzargar, S.S., Rahmati‐Holasoo, H., Ebrahimzadeh Mousavi, H. (2018). The in vitro and in vivo effect of tannic acid on Ichthyophthirius multifiliis in zebrafish (Danio rerio) to treat ichthyophthiriasis. J Fish Dis, 41(12), 1793-1802. https://doi.org/10.1111/jfd.12886
    3. Alavinia, S.J., Mirzargar, S.S., Rahmati-Holasoo, H., Ebrahimzadeh Mousavi, H. (2019). In vitro Investigation of Short-Term Antiparasitic Effect of Tannic Acid on Ichthyophthirius multifiliis J Vet Res, 74(2), 223-231.
    4. Behnam, B., Aliakbarlou, J. (2014). Antioxidant effects of Zataria multiflora and Mentha longifolia essential oils on chicken meat stored at 4 °C. J Food Res, 23(4), 534-543.
    5. Buchmann, K., Jensen, P.B., Kruse, K.D. (2003). Effects of sodium percarbonate and garlic extract on Ichthyophthirius multifiliis theronts and tomocysts: In vitro experiments. North Am J Aquac, 65(1), 21-24. https://doi.org/10.1577/1548-8454(2003)065<0021:EOSPAG>2.0.CO;2
    6. Chu, C., Zhang, Q.Z., Luo, F. (2010). Effect of twenty Chinese herbal medicines on killing trophonts, cysts and theronts of Ichthyophthirius multifiliis in vitro. Freshw Fish, 40(1), 55-60. (In Chinese with English abstract).
    7. Dickerson, H.W., Dawe, D.L. (2006). Ichthyophthirius multifiliis and Cryptocaryon irritans (phylum Ciliophora). In: Fish Diseases and Disorders. Dickerson H. W (ed.). Cabi, UK. p. 116-153.
    8. Fu, Y., QiZhong Z., De-Hai X., Huan X., XinXing C., Bin W. (2014). Parasiticidal effects of Morus alba root bark extracts against Ichthyophthirius multifiliis infecting grass carp. Dis Aquat Org, 108(2), 129-136. https://doi.org/10.3354/dao02708
    9. Gleeson, D.J. (1999). Experimental infection of striped marshfrog tadpoles (Limnodynastes peronii) by Ichthyophthirius multifiliis. J Parasitol, 85(3), 568-570. https://doi.org/2307/3285799 PMID: 10386457
    10. Hines, R.S., Spira, D.T. (1973). Ichthyophthirius multifilis (Fouquet) in the mirror carp, Cyprinus carpio L.: I. Course of infection. J Fish Biol, 5(3), 385-392. https://doi.org/10. 1111/j.1095-8649.1973.tb04466.x
    11. Ling, F., Wang, J.G., Liu, Q.F., Li, M., Ye. L.T., Gong, X.N. (2010). Prevention of Ichthyophthirius multifiliis infestation in goldfish (Carassius auratus) by potassium ferrate (VI) treatment. Vet Parasitol, 168(3-4), 212-216. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2009.11.009
    12. Ling, F., Wang, J.G., Lu, C., Wang, G.X., Lui, Y.H., Gong, X.N. (2012). Effects of aqueous extract of Capsicum frutescens (Solanaceae) against the fish ectoparasite Ichthyophthirius multifiliis. Parasitol Res, 111(2), 841-848. https://doi.org/10.1007/s00436-012-2907-9 PMID: 22526288
    13. Matthews, R.A. (2005). Ichthyophthirius multifiliis Fouquet and ichthyophthiriosis in freshwater teleosts. Adv Parasitol, 59, 159-241. https://doi.org/10.1016/S0065-308X(05)59003-1
    14. Meinelt, T., Matzke, S., Stüber, A., Pietrock, M., Wienke, A., Mitchell, AJ. (2009). Toxicity of peracetic acid (PAA) to tomonts of Ichthyophthirius multifiliis, Dis Aquat Org, 86, 51-56. https://doi.org/10.3354/dao02105
    15. Mikkelsen, H., Lindenstorm, T., Nielsen, M.E. (2006). Effects of temperature on production and specificity of antibodies in rainbow trout (Onchorynchus mykiss). J World Aquacult Soc, 37(4), 522-518. https://doi.org/10.1111/j. 1749-7345.2006.00065.x
    16. Omidbeygi, M., Barzegar, M., Hamidi, Z., Naghdibadi HA. (2007). Antifungal activity of thyme, summer sarvory and clove essential oils against Aspergillus flavus in liquid medium and tomato paste. Food Control, 18(12), 1518-23. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2006.12.003
    17. Picón-Camacho, S.M.., Taylor, N.G., Bron, J.E., Guo, F.C., Shinn, A.P. (2012). Effects of long duration, low dose bronopol exposure on the control of Ichthyophthirius multifiliis (Ciliophora), parasitising rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum). Vet Parasitol, 186, 237-244. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2011.11.022
    18. Ramezani, M., Hosseinzadeh, H., Samizadeh, SH. (2004). Antinociceptive effects of Zataria multifliora Boiss fractions in mice. J Ethnopharmacol, 91(1), 167-170. https://doi.org/ 1016/j.jep.2003.12.016
    19. Rasooly, R. S., Henken, D., Freeman, N., Tompkins, L., Badman, D., Briggs, J., Hewitt, A. T. (2003). Genetic and genomic tools for zebrafish research: the NIH zebrafish initiative. Dev Dynam: an official publication of the American Association of Anatomists, 228(3), 490-496. https://doi.org/10.1002/dvdy.10366
    20. Roby, M.H.H, Sarhan, M.H., Selim, K.A.H. (2013). Evaulation of antioxidant activity, total phenols and phenolic compounds in thyme (Thymus vulgaris L.), sage (Salvia officinalis L.), and marjoram (Origanum majorana L.) extracts. Ind Crop Prod, 43, 827-831. https://doi.org/10. 1016/j.indcrop.2012.08.029
    21. Rowland, S.J., Mifsud, C., Nixon, M., Read, P., Landos, M. (2009). Use of formalin and copper to control ichthyophthiriosis in the Australian freshwater fish silver perch (Bidyanus bidyanus Mitchell). Aqua Res, 40, 44-54. https://doi.org/10.1111/j.1365-2109.2008.02061.x
    22. Sahandi, J., Gholipour Kanani, H., Rahmani Asgarabad, F. (2012). Influence of garlic (Allium sativum) and mother worth (sic) (Matricaria chamomilla) extract effects on Ichthyophtirius mutilfilus (sic) parasite treatment in sail fin molly (Poecilia latipinna) ornamental fish. Glob Vet, 9(3). 362-366. https://doi.org/10.5829/idosi.gv.2012.9.3.6462
    23. Sharififar, F., Moshafi, M.H., Mansouri, S.H., Khodashenas, M., Khoshnoodi, M. (2007). In vitro evaluation of antibacterial and antioxidant activities of the essential oil and methaol extract of endemic Zataria multiflora. Boiss. Food Control, 18(7), 800-805. https://doi.org/10.1016/j.foodcont. 04.002
    24. Shinn, Picón-Camacho, A.P., Bron, S.M., Conway, J.E., Yoon, D., Guo, G.H.., Taylor, F.C. (2012). The anti-protozoal activity of bronopol on the key life-stages of Ichthyophthirius multifiliis Fouquet, 1876 (Ciliophora), Vet Parasitol, 186, 229-236. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2011.11.025
    25. Song, K., Ling, F., Huang, A., Dong, W., Liu, G., Jiang, C., Zhang, Q., Wang, G. (2015). In vitro and in vivo assessment of the effect of antiprotozoal compounds isolated from Psoralea corylifolia against Ichthyophthirius multifiliis in fish. Int J Parasitol Drugs Drug Resist, 5(2), 58-64. https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2015.04.001
    26. Straus, D.L., Meinelt, T. (2009). Acute toxicity of peracetic acid (PAA) formulations to Ichthyophthirius multifiliis Parasitol Res, 104, 1237-1241. https://doi.org/10.1007/s00436-009-1361-9 PMID: 19221794
    27. Xu, D.H., Klesius, P.H., Shoemaker, C.A. (2009). Effect of immunization of channel catfish with inactivated trophonts on serum and cutaneous antibody titers and survival against Ichthyophthirius multifiliis. Fish Shellfish Immun, 26(4), 614-618. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2008.09.015
    28. Yao, J., Zhi-ming Z., Xi-lian L., Wen-lin Y., Hong-shun R., Xiao-yi P. (2011). Antiparasitic efficacy of dihydrosanguinarine and dihydrochelerythrine from Macleaya microcarpa against Ichthyophthirius multifiliis in richadsin (Squaliobarbus curriculus). Vet Parasitol, 18(1-2), 8-13. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2011.07.021
    29. Yi, Y.L., Lu, C., Hu, X.G., Ling, F., Wang, G.X. (2012). Antiprotozoal activity of medicinal plants against Ichthyophthirius multifiliis in goldfish (Carassius auratus). Parasitol Res, 111, 1771–1778. https://doi.org/10.1007/s00436-012-3022-7 PMID: 22864919
    30. Zhang, Q., Xu, D.H., Klesius, P.H. (2013). Evaluation of an antiparasitic compound extracted from Galla chinensis against fish parasite Ichthyophthirius multifiliis, Vet Parasitol, 198(1-2), 45-53. https://doi.org/10.1016/j.vetpar. 08.019