TaqMan Real-Time PCR Method for the Authentication of Chicken Burgers

Document Type : Food Hygiene

Authors

1 Graduated from the School of Nutrition Sciences and Food Technology, Kermanshah University of Medical Sciences, Kermanshah, Iran

2 Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Kermanshah University of Medical Sciences, Kermanshah, Iran

3 Research Center of Oils and Fats, Health Technology Institute, Kermanshah University of Medical Sciences, Kermanshah, Iran; Department of Food Science and Technology, School of Nutrition Sciences and Food Technology, Kermanshah University of Medical Sciences, Kermanshah, Iran

4 MSc. in Genetic Science, Medical Genetics Laboratory, Kermanshah University of Medical Sciences, Kermanshah, Iran

Abstract

BACKGROUND: The authentication of chicken burgers is important due to the use of soybean meal instead of chicken in chicken burgers.
OBJECTIVES: This study aims to assess the effectiveness of TaqMan real-time polymerase chain reaction (PCR) method in authenticating the chicken burgers.
METHODS: The Cytochrome b (Cytb) and 18S rRNA genes were used for the chicken identification and endogenous control, respectively. The binary reference mixtures of chicken/soybean meal (containing 0.01, 0.1, 1, 10, and 100% chicken) were prepared for plotting the relative curves. The DNA serial dilutions extracted from the pure chicken sample were used to plot the absolute curves. The authentication was done after the acceptance of standard curves with satisfactory parameters using the model samples (the mixture chicken/soybean meal models of 60, 30, 10, and 5% and a chicken burger model of 75%).
RESULTS: The curves plotted for both relative and absolute models had acceptable parameters according to the criteria determined for quantitative PCR assays. The R2 values of 0.9986 and 0.9993, the slopes of -3.2647 and -3.5333, and amplification efficiency percentages of 102.44% and 91.88% were obtained for the relative and absolute models, respectively. In the validation phase, the results showed that all samples analyzed using both models had satisfactory relative standard deviation percentage or accuracy (<25%), but the bias percentage (precision) for the absolute model was not within the acceptable range (±25%).
CONCLUSIONS: The relative model of TaqMan PCR has acceptable accuracy and precision and a sensitivity of 0.1% to estimate chicken meat in chicken burgers and can be used to authenticate the chicken burgers or prevent their mislabeling in the market.

Keywords

Main Subjects

Full Text

مقدمه

یکی از مهم­ترین چالش­ها برای جمعیت رو‌به‌رشد جهان، تأمین غذای کافی، ایمن و عاری از هر‌گونه تقلب است (1). بعد از امنیت غذایی و ایمنی غذایی، اصالت‌سنجی مواد غذایی از‌نظر بررسی دقیق ­ترکیبات فرموله‌شده و ارزیابی نوع فرایند استفاده‌شده برای تهیه آن­ها به موضوع بسیار مهمی برای حمایت از حقوق مصرف‌کنندگان تبدیل شده است (2، 3). درواقع امروزه تقلب در صنعت غذا به‌عنوان یک مشکل بزرگ، اهمیت پیدا کرده است و انگیزه برای دستیابی به سود اقتصادی بیشتر از دلایل اصلی تقلب عمدی توسط تولید‌کنندگان است. تقلب به اشکال مختلف رقیق‌سازی (Dilution)، جایگزینی (Substitution)، پنهان‌کاری (Concealment)، بهبودهای تأیید‌نشده (Unapproved enhancement)، برچسب‌زنی اشتباه (Mislabeling) جعل کردن (Counterfeiting)، بازار خاکستری (Gray market diversion)، سرقت (Theft) و انحراف (Over run) انجام می­شود (4).

تقلب در فروش گوشت به‌صورت خام و یا به‌صورت فراوری‌شده، از عمده­ترین مسائلی است که به‌وفور در صنایع غذایی دیده می­شود (5، 6). یکی از تقلب رایج در محصولات گوشتی، جایگزینی گوشت­های ارزان­تر به‌جای گوشت­های با‌ارزش­تر است. این محصولات گوشتی فرموله‌شده با گونه­های گوشتی ارزان­تر و یا گونه­های گوشتی غیرمجاز با برچسب‌­های غیرواقعی (Mislabeling) به فروش می­رسند (7-12). به‌هر‌حال اطلاعات صحیح در‌مورد ترکیبات فرموله‌شده بر روی برچسب مواد غذایی می­تواند نگرانی­های مصرف‌کنندگان را علاوه‌بر مسائل اقتصادی درباره ایمنی (عدم مصرف غذا­های آلرژن‎زا و غذاهای تغییریافته ژنتیکی توسط برخی افراد)، محدودیت­های مذهبی (ممنوعیت خوردن گوشت خوک توسط مسلمانان و یهودیان)، مسائل اخلاقی (رفاه حیوانات و تولید سازگار با محیط‌زیست)، انتخاب نوع رژیم غذایی (عدم مصرف غذا­های با کالری بالا) و سبک زندگی­ (گیاه‌خواری و ارگانیک مصرف کردن) برطرف کند (13-16). بر‌این‌اساس، این امر موجب نیاز به آنالیزهایی شده ­است که نه‌تنها بتوانند گونه­های گوشتی موجود در غذاها را به‌طور قابل‌اعتماد شناسایی کنند، بلکه به اندازه کافی حساس و دقیق باشند تا برای ماتریکس­های غذایی پیچیده و فراوری‌شده مانند محصولات گوشتی استفاده شوند (17).

کشف تقلب‎های گوشتی با استفاده از مارکر­های مختلف انجام می­شود: 1. روش­های PCR بر پایه دی‌اکسی‌ریبونوکلئیک اسید (DNA)؛ 2. روش­های ایمونولوژیک بر پایه پروتئین­ها؛ 3. روش­های اسپکتروسکوپیک بر پایه متابولیت­های خاص. مولکول DNA اطلاعات ژنتیکی را در خود ذخیره کرده، سپس تکثیر و در‌نهایت به نسل بعد منتقل می­کند. با وجود اینکه برخی اطلاعات ژنتیکی در افراد یک گونه متفاوت است، اما میزانی از اطلاعات را که خاص همه افراد یک گونه است می­تواند برای شناسایی نوع گونه در محصولات گوشتی به کار برده شود. مولکول DNA پایداری بالاتری نسبت به پروتئین­ها (خصوصاً در فرایند­های حرارتی، فشار، فراوری شیمیایی و دهیدراسیون) دارد. بنابراین پایداری بالا و خاص بودن اطلاعات ژنتیکی برای هر گونه سبب می­شود تکنیک­های بر پایه DNA (روش­های ژنومیک) مثل PCR برای تشخیص نوع گونه در محصولات گوشتی فراوری‌شده به‌عنوان تکنیک­های معتبر بیش‌ترین کاربرد را نسبت به سایر تکنیک­ها داشته باشند (18-20). به‌هرحال، تکنیک‌های کیفی PCR نمی‌توانند یک تقلب عمدی را از یک آلودگی متقاطع (Cross contamination) در زنجیره تولید تشخیص دهند. بسیاری از مطالعات نشان داده­اند تکنیک قابل‌حل، حساس، دقیق و در‌عین‌حال دارای قابلیت تشخیص کمی، تکنیک (qPCR) Real-time PCR است (21). ضمناً روش Real-time PCR بر پایه پروب تک من به‌دلیل حساسیت بالاتر، قابلیت شناسایی چندین گونه در یک مخلوط واکنش PCR (Multiplexing) و تولید آمپلیکون‌های غیر‌اختصاصی کمتر بر روش Real-time PCR که بر پایه رنگ سایبرگرین است، برتری دارد (19-21).

گوشت مرغ محبوب­ترین منبع پروتئین گوشتی است. این امر به‌دلیل دسترسی بالا و ارزان‎تر بودن آن نسبت به گوشت قرمز و در‌عین‌حال عدم محدودیت فرهنگی یا مذهبی در مصرف آن است. همچنین عمده افزایش محبوبیت گوشت مرغ به‌دلیل آن است که می‌توان آن را به وعده­های غذایی آماده تبدیل کرد (22-24). یکی از تقلب­های گزارش‌شده در گوشت مرغ استفاده از پروتئین سویا به‌جای گوشت سفید در برگر­های مرغ به‌عنوان یک ماده جایگزین ارزان­تر در فراورده فرموله می‎باشد و در‌نهایت این جایگزینی غیرمجاز بر روی برچسب ماده غذایی اعلام نمی­شود. بنابراین علاوه‌بر اینکه این جایگزینی، ضرر­های اقتصادی را برای مصرف‌کنندگان به دنبال داشته است، پروتئین­های سویا به‌عنوان یک ماده آلرژن به واکنش­های آلرژیک در برخی افراد منجر شده است (2، 25).

با‌توجه‌به اینکه در ایران گزارش‌ها حاکی است که در برگر­های مرغ با ترکیبات و پروتئین­های گیاهی تقلب می‌شود، اصالت‌سنجی (Authenticity) برگر­های مرغ اهمیت بالایی دارد. ضمناً از این نظر که تکنیک TaqMan Real-time PCR یک روش آنالیزی با دقت و صحت بالا در تشخیص کمی گونه­های غیرمجاز است، در مطالعه حاضر به بررسی و تصدیق (Validation) 2 مدل Real-time PCR (مطلق و نسبی) بر پایه پروب تک من برای اصالت‌سنجی برگر­های مرغ پرداخته شده است.

 

مواد و روش کار

آماده‌سازی تیمارها: مخلوط­های مرجع حاوی 100، 10، 1، 1/0 و 01/0 درصد گوشت مرغ در ماتریکس کنجاله سویا (وزنی/وزنی) برای رسم منحنی استاندارد ساخته شد. مخلوط­های مدل شامل 60، 30، 10 و 5 درصد گوشت مرغ در ماتریکس کنجاله سویا (وزنی/وزنی) نیز برای مرحله اعتبارسنجی تهیه شد. یک نمونه برگر مرغ نیز حاوی 75 درصد (وزنی/وزنی) گوشت مرغ نیز برای مرحله اعتبارسنجی با اجزای گوشت مرغ (750 گرم)، پیاز (120 گرم)، آرد سوخاری (50 گرم)، گلوتن گندم (30 گرم)، نمک تصفیه‌شده (10 گرم)، ادویه (10 گرم)، فلفل دلمه (10 گرم) و آب (20 میلی‌لیتر) فرموله شد. همچنین تیمارهای 100 درصد گوشت مرغ و 100 درصد کنجاله سویا به‌ترتیب به‌عنوان تیمارهای کنترل مثبت و کنترل منفی به کار گرفته شدند.

استخراج و تعیین کمیت DNA: استخراج DNA از نمونه­ها با استفاده از کیت استخراج DNA از بافت FATGK (FavorPrepTM Tissue Genomic DNA Extraction Kit‌) مطابق با دستورالعمل شرکت سازنده (FAVORGEN Biotech Corp, Taiwan) با اندکی تغییرات انجام شد، به‌طوری‌که استخراج از 30 میلی‌گرم نمونه در مراحل لیز کردن (استفاده از بافر FATG1، محلول پروتئیناز K، بافر FATG2 و اتانول 98 درصد)، عبور لیزات مربوطه از ستون FATG، شست‌وشوی ستون با بافر شست‌وشو (2 بار باW1 buffer  و W2 buffer) و رهایش DNA از ستون با Elution buffer انجام شد. سپس کمیت و کیفیت DNA‌های استخراج‌شده با استفاده از اسپکتروفتومتر در طول موج 260 نانومتر (NanoDrop ND1000 UV-Vis Spectrophotometer) تأیید گردید. نهایتاً تمام DNA‌های استخراج‌شده برای جلوگیری از واکنش‌های آنزیمی نامطلوب تا انجام فرایند PCR در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

مجموعه­های پرایمر و پروب: یک جفت پرایمر و پروب اختصاصی برای شناسایی گونه مرغ (Gallus gallus) از منطقه ژن Cytb طراحی گردید. همچنین یک جفت پرایمر و پروب عمومی یوکاریوتی دیگر برای کنترل داخلی واکنش‌های qPCR و بررسی نتایج مثبت و منفی کاذب از ژن S rRNA18 انتخاب شد. توالی ژن‌ها از پایگاه داده‌های بیوتکنولوژی NCBI گرفته شد و برای طراحی پرایمرها از نرم‌افزار‌های Gene Runner و SnapGene استفاده شد (جدول 1).

شرایط تکثیر TaqMan-qPCR: قبل از آنالیز با qPCR، غلظت تمام عصاره­های استخراجی تا 5 نانوگرم/میکرولیتر تعدیل شد. مخلوط‌های واکنش استریپ‌های  PCR به حجم 20 میکرولیتر حاوی مستر میکس (10 میکرولیتر)، 2 جفت پرایمر (از هر پرایمر 8/0 میکرولیتر)، 2 پروب (از هرکدام 4/0 میکرولیتر)، DNA‌های استخراجی (2 میکرولیتر) و آب (4 میکرولیتر) تهیه شدند.

فرایند تکثیر به‌وسیله دستگاه Real-time PCR StepOneTM Real-time PCR System (Applied Biosystem) دارای 48 خانه تحت شرایط مرحله آغاز (Initialization step) فقط 1 بار در 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 3 دقیقه و برای 40 چرخه به‌ترتیب 2 مرحله دناتوراسیون (95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 5 ثانیه) و اتصال/طویل شدن (57 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 20 ثانیه) انجام شد.

مدل‌سازی مطلق TaqMan-qPCR: در مدل مطلق، غلظت DNA استخراجی حاصل از عضله مرغ تا 5 نانوگرم/میکرولیتر تعدیل شد و از آن رقت‌های سریالی 5/0، 05/0، 005/0 و 0005/0 نانوگرم/میکرولیتر ساخته شد. سپس 2 میکرولیتر از DNA‌های رقیق‌شده به 18 میکرولیتر از مخلوط‌های واکنش در استریپ‌های  PCR اضافه شد که معادل 10، 1، 1/0، 01/0 و 001/0 نانوگرم DNA مرغ است. یک منحنی مطلق از لگاریتم مقادیر DNA (X) و میانگین Ct‌‌های به‌دست‌آمده از هر رقت (Y) ترسیم شد و معادله خط آن به دست آمد که شیب و عرض از مبدأ از این معادله خط مشخص گردید. بنابراین برای یک نمونه مجهول پس از تعدیل DNA استخراجی آن تا 5 نانوگرم بر میکرولیتر، مقدار Ct به‌دست‌آمده از آن در فرمول [(Ct−b)/a] 10 قرار گرفت تا مقدار DNA مرغ (نانوگرم) محاسبه شود (پارامتر a شیب و پارامتر b عرض از مبدأ منحنی استاندارد است). سپس تخمین گوشت مرغ به‌صورت فرمول شماره 1 تعیین شد:

  1. درصد گوشت مرغ = محتوای DNA مرغ (نانوگرم) /محتوای DNA اولیه مرغ (10 نانوگرم) × 100

مدل‌سازی نسبی TaqMan-qPCR: در مدل نسبی، DNA‌های استخراجی حاصل از مخلوط­های مرجع (100-01/0 درصد (وزنی/وزنی)) تا 5 نانوگرم/میکرولیتر رقیق شدند. سپس 2 میکرولیتر از هر محلول DNA به 18 میکرولیتر از مخلوط‌های واکنش در استریپ‌های  PCR اضافه گردید. یک منحنی نسبی از لگاریتم درصد گوشت مرغ مخلوط‌های گوشتی مرجع (X) و میانگین Ct‌های به‌دست‌آمده برای مخلوط‌های واکنش آن‌ها (Y) رسم شد. بنابراین مقدار گوشت مرغ نمونه­های مجهول ازطریق درون‌یابی و  فرمول شماره 2 تخمین زده شد:

  1. درصد گوشت مرغ = [(Ct−b)/a] 10

بررسی پارامتر‌های منحنی‌های استاندارد: منحنی­های استاندارد در سنجش­های Real-time PCR به‌عنوان شاخصی برای ارزیابی عملکرد در نظر گرفته می­شوند. معیار­های پذیرش مربوط به منحنی­های کالیبراسیون سنجش­های qPCR به شرح زیر بیان شده است:

محدوده دینامیکی خطی به‌طور ایده­آل باید بیش از 4 مرتبه بزرگی (log10) باشد. درصد کارایی تکثیر که از‌طریق فرمول شماره 3 محاسبه گردیده است، می‌بایست بین 90 تا 110 درصد ­باشد که با شیب رگرسیون بین 1/3- و 6/3- مطابقت دارد. ضمناً مقدار ضریب تعیین (R2) بالا > 98/0 قابل‌پذیرش می‌باشد (26).

  1. (درصد کارایی تکثیر= ]((شیب/1-)10) - 1[ ×100 )

بررسی حساسیت تکنیک: مقادیر Ct مخلوط‌های مرجع 1 و 01/0 درصد (وزنی/وزنی) در 20 تکرار قرائت شد. LOD (Limit of detection) کم‌ترین غلظتی بود که 95 درصد تکرار‌های آزمون تا سیکل 40 (آخرین سیکل تعیین‌شده در مطالعه حاضر) به‌طور صحیح تعیین مقدار شدند و LOQ (Limit of quantification) کم‌ترین غلظتی بود که علاوه بر تعیین مقدار، واجد پارامتر‌های درصد RSD (%Relative Standard Deviation) و درصد Bias قابل‌قبولی (به ترتیب >25 درصد و محدوده 25 درصد±) نیز باشد (19، 26).

اعتبار‌سنجی مدل: جهت اعتبارسنجی 2 مدل طراحی شد (مطلق و نسبی) و میانگین مقادیر Ct مخلوط‌ها و برگر مدل (مخلوط‌های مدل حاوی 60، 30، 10 و 5 درصد مرغ (وزنی/وزنی) و برگر مدل حاوی 75 درصد گوشت مرغ بودند) با استفاده از معادله خط آن‌ها به دست آمد و 2 پارامتر دقت (درصد RSD) و صحت (درصد Bias) برای هر نمونه مدل مطابق فرمول‌‌های شماره  4 و 5 محاسبه شدند (17):

  1. Bias (درصد) = ](مقدار واقعی ـ مقدار تخمین زده‌شده) / مقدار واقعی[ × 100
  2. RSD (درصد) انحراف استاندارد نسبی= انحراف استاندارد / میانگین× 100

بدین‌صورت، نزدیکی نتایج آزمایش به مقدار واقعی Bias نامیده می‌شود، اما RSD (انحراف استاندارد نسبی) نزدیکی نتایج به‌دست‌آمده در شرایط تعریف شده است. ضمناً معیار‌های پذیرش این دو پارامتر در ارزیابی‌های  Real time PCR به‌ترتیب در محدوده 25 درصد± و <25 درصد تعیین شده است.

تجزیه‌و‌تحلیل آماری: برای بررسی تکثیر‌پذیری (Reproducibility) یا دقت بین آنالیزی، سنجش‎ها در 3 روز مختلف و جهت بررسی تکرار‌پذیری (Repeatability) یا دقت درون‌آنالیزی، سنجش‎ها در هر روز در 3 تکرار انجام شدند. تجزیه‌و‌تحلیل آماری در مرحله مدل‌سازی و اعتبارسنجی با استفاده از نرم‌افزار  Excel نسخه 2016 انجام شد.

نتایج

کمیت و کیفیت DNA استخراجی: غلظت DNA با استفاده از جذب UV در طول موج 260 نانومتر به‌وسیله نانودراپ تعیین شد. همچنین خلوص DNA استخراجی با استفاده از نسبت جذب در طول موج‌‌های (نانومتر) 280A/260A و 230A/260A بررسی شد. در مطالعه حاضر، غلظت DNA­‌های استخراجی در رنج 4/58– 9/276 نانوگرم/میکرولیتر و نسبت جذب 280A/260 A از 83/1 تا 02/2 بود.

بررسی ست پرایمر / پروب طراحی‌شده: متوسط مقادیر Ct‌ها با استفاده از پرایمر/پروب اختصاصی مرغ برای نمونه‌های کنترل مثبت (گوشت خالص مرغ)، کنترل منفی (کنجاله سویا) و نمونه شاهد یا بلانک (مخلوط واکنش بدون DNA الگو) به‌ترتیب 63/20، Undetermined (عدم تشخیص) و Undetermined (تا سیکل 40) حاصل شد. این مقادیر با استفاده از پرایمر/پروب عمومی S rRNA18 یوکاریوتی به‌ترتیب 27/21، Undetermined و Undetermined به دست آمد. همچنین ارزیابی‌های بیشتر برای اطمینان از اختصاصیت پرایمر/پروب‌های طراحی‌شده با گوشت 12 گونه جانوری دیگر (اسب (Equus caballus)، الاغ (Equus asinus)، خوک (Sus scrofa)، گوسفند (Ovis aries)، بز (Capra hircus)، شتر (Camelus dromedaries)، بوقلمون (Meleagris gallopavo)، اردک (Anas platyrhynchos)، غاز (Anser anser)، قرقاول (Phasianus colchicu)، بلدرچین (Coturnix coturnix) و شترمرغ (Struthio camelus)) انجام شد و تا سیکل 40 در مخلوط‌‌های واکنش PCR حاوی پرایمر/پروب اختصاصی گونه مرغ سیگنالی مشاهده نشد.

مدل‌سازی مطلق TaqMan-qPCR: در این مدل، منحنی استاندارد با استفاده از لگاریتم 5 سری رقت سریالی DNA استخراجی مرغ از 10 نانوگرم تا 001/0 نانوگرم (محور X) در مقابل میانگین Ct‌های حاصل از این مقادیر DNA در مخلوط‌های واکنش qPCR (محور Y) ترسیم شد. جدول 2 مقادیر Ct به‌دست‌آمده برای رقت‌های سریالی DNA را در 3 روز مختلف نشان می‌دهد (در هر روز، میانگین 3 تکرار نوشته شده است). یک معادله خط 003/25 + X 5333/3- = Y برای منحنی مطلق به دست آمد. همان‌طور که در تصویر 1A مشاهده می‌شود، مشخصه‌های تکثیر این منحنی استاندارد ترسیم‌شده برای R2، شیب، عرض از مبدأ و درصد کارایی تکثیر به‌ترتیب برابر با 9993/0، 5333/3-، 003/25 و 88/91 تعیین شد.

مدل‌سازی نسبی TaqMan-qPCR: در مدل نسبی از مخلوط‌های حاوی 100، 10، 1، 1/0 و 01/0 درصد گوشت مرغ در ماتریکس کنجاله سویا (وزنی/وزنی) استفاده شد. منحنی استاندارد نسبی با استفاده از لگاریتم درصد مرغ در این نمونه‌های مرجع (محور X) در مقابل میانگین Ct‌های حاصل از عصاره DNA آن‌ها در مخلوط‌های واکنش PCR (محور Y) ترسیم شد (تصویر1B ). جدول 3 مقادیر Ct به‌دست‌آمده برای نمونه‌های مرجع را در 3 روز مختلف نشان می‌دهد (در هر روز، میانگین 3 تکرار نوشته شده است). در این روش، ژن S rRNA18 نیز به‌عنوان کنترل داخلی و بررسی نتایج مثبت و منفی کاذب مورد هدف قرار گرفت. بنابراین در مخلوط‌های واکنش qPCR از 2 ست پرایمر/پروب استفاده شد و یکDuplex TaqMan-qPCR  اجرا شد. همان‌طور که در تصویر 1B  مشاهده می‌شود، معادله خط این منحنی 348/27+X 2647/3-= Y تعیین شد که تحت آن برای شیب، عرض از مبدأ، R2 و درصد کارایی تکثیر به‌ترتیب مقادیر 2647/3-، 348/27، 9986/0 و 44/102 به دست آمد.

اعتبارسنجی مدل­ها: برای اعتبارسنجی 2 مدل طراحی‌شده، پارامتر‌های RSD (درصد) و‌ Bias (درصد) برای مخلوط‌های مدل (60، 30، 10 و 5 درصد (وزنی/وزنی)) و برگر مدل (75 درصد) محاسبه شد (جدول 4). همان‌طور در جدول 4 که مشاهده می‌شود، مقادیر RSD (درصد) نمونه‌‌های مدل از 10/3 تا 86/14 درصد محاسبه شد.

همچنین مقادیر Bias (درصد) در مدل مطلق، برای مخلوط‌های مدل به‌ترتیب 90/24، 65/29، 71/40 و 05/50 و برای برگر مدل 13/27 محاسبه شد، اما در مدل نسبی، مقادیر Bias (درصد) از رنج 20- تا 34/24- به دست آمدند.

تعیین حساسیت تکنیک: به‌منظور تعیین مقدار حساسیت تکنیک، غلظت  DNAاستخراج‌شده از 2 مخلوط مرجع 01/0 و 1/0 درصد گوشت مرغ تا 5 نانوگرم/میکرولیتر تعدیل شد و مخلوط‌های واکنش PCR آن‌ها با تکنیک تعریف شده TaqMan-qPCR در مطالعه حاضر در 20 تکرار مورد ارزیابی قرار گرفت. همان‌طور که در جدول 5 مشاهده می‌شود، این مقادیر Ct به‌دست‌آمده در معادله خط نسبی 348/27+X 2647/3-= Y به‌منظور تخمین درصد مرغ قرار گرفت. همان‌طور که در جدول 5 مشاهده می‌شود، مقادیر RSD (درصد) برای تکرار‌های Ct مخلوط‌های مدل 1/0 و 01/0 درصد گوشت مرغ به‌ترتیب 96/11 و 77/45 محاسبه شدند و مقادیر Bias (درصد) تحت این شرایط برای این دو مخلوط مدل به‌ترتیب 098/0- و 66/50 به دست آمدند.

بحث

بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراجی: غلظت عصاره‌های DNA استخراجی، مطابق با پروتکل ارزیابی‌های qPCR تعیین مقدار شد، به‌طوری‌که یک واحد جذب معادل با تقریباً 50 نانوگرم/ میکرولیتر dsDNA بود. همچنین بر‌اساس پروتکل، DNAهای استخراجی با کیفیت خوب باید نسبت 280A/260A در محدوده 8/1-0/2 داشته باشند (26). بنابراین در مطالعه حاضر، محدوده 2/02-1/83 برای نسبت جذب 280A /260A نشان‌دهنده این بود که عصاره‌های DNA استخراجی تقریباً واجد کیفیت مطلوب بودند.

بررسی پرایمر/پروب طراحی‌شده: همان‌طور که گفته شد به‌وسیله پرایمر/پروب شناسایی گونه مرغ، متوسط مقادیر Ct برای نمونه کنترل مثبت و کنترل منفی تحت شرایط 40 سیکل، 63/20 و عدم تشخیص به دست آمد و سیگنال معنی‌داری نیز در بررسی روی 12 گونه مورد‌مطالعه مشاهده نشد. بنابراین این نتایج همگی نشان‌دهنده این بود که ست پرایمر/پروب طراحی‌شده، کاملاً اختصاصی برای شناسایی گونه هدف است. ضمناً مقادیر Ct به‌وسیله پرایمر/پروب عمومی یوکاریوتی در مخلوط‌های واکنش تقریباً مشابه آنچه بود که به‌وسیله پرایمر/پروب اختصاصی مرغ به دست آمد (داده‌ها در جدول ذکر نشده است) که نشان‌دهنده تخریب کامل DNA‌های سویا در فرایندی بود که قبلاً لوبیای سویا را به کنجاله تبدیل کرده است.

جهت شناسایی مرغ از ژن Cytb از ژنوم میتوکندریایی استفاده شد. ژنوم میتوکندریایی به‌دلیل نوع آرایش خاص، توارث صرفاً مادری و تکامل سریع‌تر در مقایسه با ژنوم هسته‎ای در شناسایی تفاوت‌های بین‌گونه‎ای (حتی گونه‌های نزدیک به هم) و درون‌گونه‎ای کاراتر است. ضمناً کروی بودن و اندازه کوچک آن، تعدد بیشتر آن در سلول و کوتاه بودن توالی‌های ژنی، موفقیت آن را در شناسایی محصولات غذایی فراوری‌شده بالا برده است. همچنین برخی از مطالعات توصیه کرده‎اند که به‌دلیل احتمال تخریب DNA در طی فراوری مواد غذایی بهتر است آمپلیکون‌های تکثیر‌شده طولی کمتر از 150 جفت‌باز داشته باشند (27). بنابراین در مطالعه حاضر ست پرایمر/پروب اختصاصی مرغ طوری طراحی شد که آمپلیکون‌های 106 جفت‌باز تولید کردند.

مدل‌سازی مطلق TaqMan-qPCR: منحنی استاندارد مطلق که از‌طریق رقت سریالی DNA استخراجی مرغ در مقابل میانگین Ct‌های حاصل از آن‌ها رسم شد، یک معادله خط 003/25+X 5333/3-= Y با ضریب تعیین 9993/0 را به دست آورد. مقدار درصد کارایی تکثیر 88/91 درصد تعیین شد که با جای‌گذاری شیب منحنی مطلق (5333/3-) در فرمول شماره 3 محاسبه شد.

بنابراین تمام مشخصه‎های تکثیر (R2، شیب و درصد کارایی تکثیر) این منحنی استاندارد ترسیم‌شده، همان‌طور که در قسمت روش کار شرح داده شد، در محدوده معیارهای قابل‌پذیرش قرار داشتند. همچنین عرض از مبدأ (b) این منحنی با مقدار 003/25، مقدار Ct بود که برای 1 نانوگرم DNA مرغ در مخلوط‎های واکنش در استریپ‎های  PCR به دست آمد.

مطالعه حاضر با مطالعه Kesmen و همکاران در سال 2012 که مدل مطلق TaqMan-Real time PCR را برای تخمین درصد مرغ در مخلوط‌های گوشتی خام و حرارت‌دیده به‌طور موفقی به کار بردند، مقایسه شد. این مطالعه، منطقه ژنی NADH دهیدروژناز زیر واحد 2 (ژن ND2 میتوکندری) برای طراحی پرایمر/پروب هدف‌گذاری و آمپلیکون‎هایی با 86 جفت‌باز تولید شد. پروب طراحی‌شده با ریپورتر FAM و خاموش‌کننده TAMRA لیبل‌گذاری شد. برای رسم منحنی استاندارد، رقت‎های سریالی DNA استخراجی از 100 نانوگرم تا 001/0 نانوگرم تهیه شدند. نهایتاً، منحنی استاندارد مطلق دارای معادله خط 461/24+X 1264/3-= Y و شاخصه‎های  R2 و درصد کارایی تکثیر به‌ترتیب 9965/0 و 92/108 به دست آمد و عرض از مبدأ منحنی (461/24) نیز مقدار Ct برای 1 نانوگرم DNA بود (28).

مدل‌سازی نسبی TaqMan-qPCR: در مدل نسبی از کالیبراتورهای مشابه نمونه‎های آنالیز‌شده استفاده شد. منحنی استاندارد نسبی با استفاده از مخلوط‌های مرجع و میانگین مقادیر Ct‌های حاصل از آن‌ها ترسیم شد. همچنین در این مدل یک Duplex TaqMan-qPCR اجرا شد. بدین صورت که مجموعه پرایمر/پروب انتخاب‌شده از منطقه ژنی S rRNA18 نیز به‌عنوان کنترل داخلی در استریپ‎های  PCR استفاده شد. مقادیر Ct با استفاده از این مجموعه پرایمر/پروب عمومی یوکاریوتی S rRNA18، تقریباً مشابه با نتایج حاصل از پرایمر/پروب اختصاصی مرغ حاصل شد. معادله خط این منحنی 348/27+X 2647/3-= Y با ضریب تعیین 9986/0 و درصد کارایی تکثیر 44/102 نشان‌دهنده مقادیر قابل‌قبول مشخصه‎های تکثیر بود. ضمناً عرض از مبدأ منحنی استاندارد نسبی (348/27) مربوط به متوسط Ct برای مخلوط مرجع با غلظت 1 درصد بود. این مدل پیش‎تر در مطالعه Kang و Tanaka در سال 2018 برای تعیین مقدار جایگزینی گوشت خوک در محصولات گوشتی ادعا‌شده از گوشت گاو و در مطالعه Fajardo و همکاران در سال 2008 برای اصالت‌سنجی گوشت گونه‎های گوزن با به‌کارگیری تکنیک SYBR Green-qPCR استفاده شد (17، 29).

اعتبارسنجی مدل­ها: محدوده 10/3-86/14 مقادیر RSD (درصد) نمونه‎های مدل در هر دو روش مدل‌سازی نشان می‌دهد همه مقادیر در محدوده قابل‌پذیرش ارزیابی‌های Real time PCR می‌باشند (<25 درصد). به‌عبارت‌دیگر، این مقادیر نشان‌دهنده نزدیکی بین اندازه‌گیری‎های تکرار‌شده در شرایط یکسان آزمایش است. بنابراین می‌توان نتیجه گرفت هر دو مدل، دقت (پارامتر Precision) بالایی در تعیین درصد مرغ در مخلوط‌ها و برگرهای مرغ دارند.

همان‌طور که در قسمت روش کار شرح داده شد، مقادیر درصد Bias (پارامتر Trueness) طبق معیار‌های قابل‌پذیرش (25 درصد±<) تعیین شده است. بنابراین همان‌طور که در جدول 4 مشاهده می‌شود، در مدل مطلق، مقادیر Bias (درصد) برای همه نمونه‌های مدل به‌جز مخلوط 60 درصد در رنج قابل‌قبول قرار نداشتند. این در حالی است که در مدل نسبی، همه مقادیر در محدوده قابل‌پذیرش ارزیابی‌های Real time PCR قرار داشتند. Bias (درصد) همان صحت یا درستی است که نزدیکی مقادیر اندازه‌گیری‌‎های آزمایش با مقدار واقعی را نشان می‌دهد. بنابراین نتیجه‌گیری می‌شود مدل نسبی علاوه بر دقت، صحت لازم را نیز در تعیین درصد مرغ دارد.

تعدادی از مطالعات، هدف‌گیری مناطق میتوکندریایی را نسبت به مناطق هسته‌ای در تشخیص نوع گونه موفق‌تر دانسته‌اند، زیرا کپی مارکر‌های میتوکندریایی در هر سلول بسیار بیشتر از مارکر‌های هسته‌ای است (8، 30). به‌هر‌حال تعداد کپی‌های ژن‌های میتوکندریایی در افراد مختلف یک گونه و بافت‌های مختلف آن‌ها متفاوت است (27). بنابراین تعدادی مطالعات، رسم منحنی استاندارد با استفاده از کالیبراتور‌های مشابه با ماتریکس نمونه واقعی را موفق‌تر از رسم با رقیق‌سازی DNA استخراجی گزارش کرده‌اند (8، 19، 26). در مطالعه‌ای که Kang و Tanaka در سال 2018 انجام داده‌اند، از روش SYBR Green qPCR برای تعیین میزان گوشت خوک در محصولات گوشتی فراوری‌شده از گوشت گاو استفاده کردند. این مطالعه نشان داد مدل نسبی در مقایسه با مدل مطلق، مقادیر درصد Bias بهتری را ارائه می‌دهد (17)، باوجوداین Kim و Kim در سال 2019 گزارش کرده‌اند که مدل مطلق و ارزیابی‌های TaqMan-qPCR دقت و صحت کافی را در تخمین میزان گوشت مرغ در محصولات گوشتی دارد (13).

تعیین حساسیت تکنیک: آنالیز مخلوط‌های مرجع 01/0 و 1/0 درصد (وزنی/وزنی) در 20 تکرار با تکنیک TaqMan-qPCR تعریف شده و سپس تخمین درصد مرغ با استفاده از معادله خط نسبی نشان داد سطح LOD در مطالعه حاضر 01/0 درصد گوشت مرغ در ماتریکس سویا است، زیرا مقادیر Ct در 20 تکرار آزمایش تا سیکل 40 برای آن به دست آمد اما این مقدار به‌عنوان سطح LOQ لحاظ نگردید، زیرا این مخلوط دارای درصد‌های RSD و Bias قابل‌پذیرش نبود. سطح LOQ تکنیک 1/0 درصد است، زیرا مقادیر 965/11 و 098/0- درصد برای RSD و Bias به دست آمد. بنابراین کم‌ترین غلظتی که درصدهای RSD و Bias آن در محدوده قابل‌قبول قرار دارند (به‌ترتیب 25 درصد> و 25 درصد±)، غلظت 1/0 درصد است که به‌عنوان LOQ تکنیک لحاظ گردید. Sarlak و همکاران در سال 2022 در مطالعه بررسی تقلبات گوشت مرغ و خمیر مرغ در همبرگرهای ادعا‌شده از گوشت گاو با تکنیک TaqMan-qPCR و با مدل نرمالیز‌شده (Ct∆)، سطح LOD و LOQ را 01/0 درصد گوشت مرغ در ماتریکس گوشت گاو تعیین کردند (19)، اما Kim و Kim در سال 2019 با حساسیت کمتری (5/0 درصد) مرغ را با تکنیک Multiplex TaqMan-qPCR شناسایی کردند (13).

نتیجه‌گیری نهایی: نتایج مطالعه حاضر نشان داد پرایمر/پروب طراحی‌شده از منطقه ژنی Cytb به‌درستی می‌تواند گونه مرغ را در مخلوط‎ها و برگر‎ها شناسایی کند. همچنین با آنکه هر دو منحنی ترسیم‌شده از مدل‌های مطلق و نسبی، شاخصه‌های قابل‌قبول منحنی‌های استاندارد مختص ارزیابی‌های  Real time PCR را داشتند، اما مدل نسبی نسبت به مدل مطلق به‌دلیل استفاده از کالیبراتورهای مشابه نمونه‌های آنالیز‌شده، درصد گوشت مرغ را با پارامترهای دقت و صحت قابل‌قبولی تخمین زد. بنابراین این مدل با حساسیت 1/0 درصد، می‌تواند به‌طور قابل‌اعتمادی برای اصالت‌سنجی برگر‌های مرغ در سطح عرضه به کار رود.

ملاحظات اخلاقی

 این طرح با کد اخلاق IR.KUMS.REC.1402.335 در تاریخ 13/08/1402 در دانشگاه علوم‌پزشکی کرمانشاه تصویب شده است.

سپاسگزاری

این مقاله از پایان‌نامه دانشجویی مقطع کارشناسی ارشد دانشگاه علوم‌پزشکی کرمانشاه با کد طرح 4020612 استخراج شده است. بدین وسیله از معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه به دلیل حمایت‎های مالی، صمیمانه قدردانی می‎شود.

تعارض منافع

هیچ گونه تعارض منافعی در ارتباط با این مطالعه وجود ندارد.

References

  1. Liu Y, Cao Y, Wang T, Dong Q, Li J, Niu C. Detection of 12 common food-borne bacterial pathogens by TaqMan real-time PCR using a single set of reaction conditions. Front Microbiol. 2019;10:222. doi: 10.3389/fmicb.2019.00222
  2. Safdar M, Abasıyanık M. Development of fast multiplex real-time PCR assays based on EvaGreen fluorescence dye for identification of beef and soybean origins in processed sausages. Food Res Int. 2013;54(2):1652-6. doi: 10.1016/j.foodres.2013.09.013
  3. Sarlak Z, Hosseini H, Garavand F, Mohammadi R, Rouhi M. The occurrence of lead in animal source foods in Iran in the 2010s decade: a systematic review. Biol Trace Elem Res. 2022:1-20. doi: 10.1007/s12011-021-02787-y
  4. Spink J, Vincent Hegarty P, Fortin ND, Elliott CT, Moyer DC. The application of public policy theory to the emerging food fraud risk: Next steps. Trends Food Sci Technol. 2019;85:116-28. doi: 10.1016/j.tifs.2019.01.002
  5. Hajimohammadi B, Fattahi K, Yekta ZK, Sadeghinezhad J, Morovvati H, Basti AA. Experimental study of the histological method for quantitative detection of meat in kabab and cooked sausage model. J Vet Res. 2020;75(3). doi: 10.22059/JVR.2022.350769.3308
  6. Ghaderi H, Pajohi-AlaMoti MR, Kalantari-Hesari A. Investigating the fraud of using unauthorized tissues in sausages produced in Hamadan province. J Vet Res. 2022;77(4). doi: 10.22059/jvr.2022.350769.3308
  7. Van Ruth SM, Huisman W, Luning PA. Food fraud vulnerability and its key factors. Trends Food Sci Technol. 2017;67:70-5. doi: 10.1016/j.tifs.2017.06.017
  8. Kang TS. Basic principles for developing real-time PCR methods used in food analysis: A review. Trends Food Sci Technol. 2019;91:574-85. doi: 10.1016/j.tifs.2019.07.037
  9. Kane DE, Hellberg RS. Identification of species in ground meat products sold on the US commercial market using DNA-based methods. Food Control. 2016;59:158-63. doi: 10.1016/j.foodcont.2015.05.020
  10. Amaral JS, Santos G, Oliveira MBP, Mafra I. Quantitative detection of pork meat by EvaGreen real-time PCR to assess the authenticity of processed meat products. Food Control. 2017;72:53-61. doi: 10.1016/j.foodcont.2016.07.029
  11. Meira L, Costa J, Villa C, Ramos F, Oliveira MBP, Mafra I. EvaGreen real-time PCR to determine horse meat adulteration in processed foods. LWT. 2017;75:408-16. doi: 10.1016/j.lwt.2016.08.061
  12. Hossain A, Hossain MS, Munshi MK, Huque R. Detection of species adulteration in meat products and Mozzarella-type cheeses using duplex PCR of mitochondrial cyt b gene: A food safety concern in Bangladesh. Food Chem. 2021;2:100017. doi: 10.1016/j.fochms.2021.100017
  13. Kim M-J, Kim H-Y. A fast multiplex real-time PCR assay for simultaneous detection of pork, chicken, and beef in commercial processed meat products. LWT. 2019;114:108390. doi: 10.1016/j.lwt.2019.108390
  14. Hellberg RS, Hernandez BC, Hernandez EL. Identification of meat and poultry species in food products using DNA barcoding. Food Control. 2017;80:23-8. doi: 10.1016/j.foodcont.2017.04.025
  15. Al Amin M, Mahfujur Rahman M, Razimi MSA, Chowdhury ZZ, Hussain MNM, Desa MNM. Screening of commercial meat products from supermarket chains for feline derivatives using SP-PCR-RLFP and lab-on-a-chip. J Food Compos Anal. 2020;92:103565. doi: 10.1016/j.jfca.2020.103565
  16. Salehi A, Shariatifar N, Pirhadi M, Zeinali T. An overview on different detection methods of saffron (Crocus sativus L.) adulterants. J Food Meas and Charact. 2022;16(6):4996-5006. doi: 10.1007/s11694-022-01586-w
  17. Kang TS, Tanaka T. Comparison of quantitative methods based on SYBR Green real-time qPCR to estimate pork meat adulteration in processed beef products. Food Chem. 2018;269:549-58. doi: 10.1016/j.foodchem.2018.06.141
  18. Druml B, Grandits S, Mayer W, Hochegger R, Cichna-Markl M. Authenticity control of game meat products – A single method to detect and quantify adulteration of fallow deer (Dama dama), red deer (Cervus elaphus) and sika deer (Cervus nippon) by real-time PCR. Food Chem. 2015;170:508-17. doi: 10.1016/j.foodchem.2014.08.048
  19. Sarlak Z, Shojaee-Aliabadi S, Rezvani N, Hosseini H, Rouhi M, Dastafkan Z. Development and validation of TaqMan real-time PCR assays for quantification of chicken adulteration in hamburgers. J Food Compos Anal. 2022;106:104302. doi: 10.1016/j.jfca.2021.104302
  20. Druml B, Mayer W, Cichna-Markl M, Hochegger R. Development and validation of a TaqMan real-time PCR assay for the identification and quantification of roe deer (Capreolus capreolus) in food to detect food adulteration. Food Chem. 2015;178:319-26. doi: 10.1016/j.foodchem.2015.01.003
  21. Kim M-R, Kwon K, Jung Y-K, Kang TS. A rapid real-time PCR method to differentiate between mottled skate (Beringraja pulchra) and other skate and ray species. Food Chem. 2018;255:112-9. doi: 10.1016/j.foodchem.2018.02.056
  22. Longato E, Lucas-González R, Peiretti PG, Meineri G, Pérez-Alvarez JA, Viuda-Martos M, et al. The effect of natural ingredients (amaranth and pumpkin seeds) on the quality properties of chicken burgers. Food Bioprocess Technol. 2017;10:2060-8. doi: 10.1007/s11947-017-1978-0
  23. Mikhail W, Sobhy H, Khallaf M, Ali HM, El-askalany SA, El-Din MME. Suggested treatments for processing high nutritive value chicken burger. Ann Agric Sci. 2014;59(1):41-5. doi: 10.1016/j.aoas.2014.06.006
  24. Hasan S, Khanjari A, Koohi MK, Nasrabadi HG, Shavisi N. Study on the effect of chitosan coating incorporated with Ziziphora Clinopodioides essential oil on the some microbial and sensory properties of chicken fillet at refrigerated temperature. J Vet Res. 2019;74(3):370-8. doi: 10.22059/JVR.2018.244342.2715
  25. Soares S, Mafra I, Amaral JS, Oliveira MBP. A PCR assay to detect trace amounts of soybean in meat sausages. Int J Food Sci Technol. 2010;45(12):2581-8. doi: 10.1111/j.1365-2621.2010.02421.x
  26. Sarlak Z, Rezvani N, Rouhi M, Shojaee-Aliabadi S, Hosseini H. A normalized model based on Taqman real-time PCR assay for quantitative comparison of chicken adulteration in raw and heat-treated hamburgers. J Food Meas and Charact. 2023;17(5):4991-9. doi: 10.1007/s11694-023-02005-4
  27. Alikord M, Momtaz H, Keramat J, Kadivar M, Rad AH. Species identification and animal authentication in meat products: a review. J Food Meas and Charact. 2018;12:145-55. doi: 10.1007/s11694-017-9625-z
  28. Kesmen Z, Yetiman AE, Şahin F, Yetim H. Detection of chicken and turkey meat in meat mixtures by using Real‐Time PCR Assays. J Food Sci. 2012;77(2):167-73. doi: 10.1111/j.1750-3841.2011.02536.x
  29. Fajardo V, González I, Martín I, Rojas M, Hernández PE, García T, et al. Real-time PCR for detection and quantification of red deer (Cervus elaphus), fallow deer (Dama dama), and roe deer (Capreolus capreolus) in meat mixtures. Meat Sci. 2008;79(2):289-98. doi: 10.1016/j.meatsci.2007.09.013
  30. Lopparelli RM, Cardazzo B, Balzan S, Giaccone V, Novelli E. Real-time TaqMan polymerase chain reaction detection and quantification of cow DNA in pure water buffalo mozzarella cheese: method validation and its application on commercial samples. J Agric Food Chem. 2007;55(9):3429-34. doi: 10.1021/jf0637271
Journal of Veterinary Research
Volume 80, Issue 3
September 2025
Pages 149-160

Files

Share

How to cite

Statistics