Cloning and Expression of Recombinant HBHA-OmpL Construct in a Prokaryotic System to Develop a Candidate Vaccine Against Salmonella Typhimurium

Document Type : Microbiology and Immunology

Authors

1 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine, Lorestan University, Khorramabad, Iran

2 Department of Microbiology and Food Hygiene, Faculty of Veterinary Medicine, Lorestan University, Khorramabad, Iran

3 Department of Animal Sciences, Faculty of Agriculture, Lorestan University, Khorramabad, Iran

4 Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Lorestan University, Khorramabad, Iran

Abstract

BACKGROUND: Salmonella Typhimurium, a Gram-negative bacterium, causes salmonellosis in humans and livestock. Beyond hygiene measures, vaccination with next-generation vaccines exhibiting minimal side effects represents a fundamental approach to combating this deadly disease.
OBJECTIVES: This study aimed to design and create a recombinant immunogenic chimera construct comprising the OmpL antigen from Salmonella Typhimurium and the HBHA adjuvant, and to evaluate its expression in a prokaryotic system.
METHODS: The DNA was first extracted from Salmonella Typhimurium bacteria and the B.C.G vaccine. Each of the OmpL and HBHA genes was amplified using linker primers and connected to each other using the SOE-PCR reaction. Next, to connect the recombinant HBHA-OmpL chimera to the pET22b(+) expression vector, both were first subjected to double-digestion treatment and then ligated together using T4 ligase enzyme. Finally, the recombinant construct was transferred into E. coli (DH5α) and E. coli BL21 (DE3) using a heat shock process. After gene expression induction, protein purification was performed using a nickel NTA chromatography resin column. Finally, the quality of recombinant protein expression was evaluated using a 12% SDS-PAGE gel.
RESULTS: The amplification of HBHA and OmpL genes, construction of the chimeric structure, and transformation of the expression vector into DH5α and BL21(DE3) cells were validated by PCR, SOE-PCR, and colony-PCR tests, respectively. Successful expression and purification of the 49.5 kDa recombinant HBHA-OmpL protein was confirmed by 12% SDS-PAGE gel.
CONCLUSIONS: The expression of recombinant HBHA-OmpL immunogenic construct in a prokaryotic system is feasible for developing a candidate vaccine against Salmonella Typhimurium.

Keywords

Main Subjects

Full Text

مقدمه

سالمونلوز یکی از مهم‌ترین بیماری‌های عفونی مشترک انسان و دام با گستردگی جهانی است کـه باعث مشکلات فراوانی در بهداشت و اقتصاد کشورها می‌شود (1، 2). عامل ایجادکننده این بیماری، یک باکتری تاژکدار گرم منفی و بی‌هوازی اختیاری از جنس سالمونلا و خانواده آنتروباکتریاسه است. این بیماری در انسان سالانه سبب ایجاد حدود 200000 مرگ در سطح جهان می‌شود (3) و در دام می‌تواند سبب ورم معده و روده همراه با اسهال استفراغ، ورم مفاصل، ورم و بزرگ شدن کبد، سقط ‌جنین، گاسترانتریت و غیره شود (4). عمده‌ترین راه انتقال آن، از‌طریق دستگاه گوارش است. مصرف آب ‌و‌ غذاهای آلوده، علوفه خشبی یا سایر غذاهایی که توسط مدفوع، ادرار و خون ناقلین آلوده‌ شده‌اند، از راه‌های انتقال این باکتری می‌باشند (5). سالمونلا تیفی‌موریوم سروواری از سالمونلا است که باعث بروز عفونت‌های روده­ای یا خارج روده‌ای با شیوع بالا، در انسان، دام و پرندگان می‌شود. در مطالعات متعدد، میزان شیوع آن از 74/2 درصد در آمریکا و 8/3 درصد در ایران گزارش ‌شده است (6، 7). امروزه استفاده از روش‌های مهندسی ژنتیک برای فراهم آوردن واکسن‌های جدید مؤثر به راهکارهای متداولی در مبارزه با بسیاری از عفونت‌های میکروبی تبدیل ‌شده‌اند. واکسن‌های حاوی پروتئین‌های نوترکیب کایمر‌شده با ادجوانت‌های مولکولی با استفاده از روش‌های مهندسی ژنتیک، علاوه‌بر اینکه می‌توانند باعث پاسخ بهتر سیستم ایمنی شوند، می‌توانند از عوارض ناخواسته واکسن‌های کشته‌شده که ناشی از اجزای مختلف پیکره باکتری است نیز پیشگیری کنند (8).

پروتئین‏های غشای خارجی (Omps) سالمونلا، از‌جمله آنتی‏ژن‏­های کاندید برای توسعه واکسن­های محافظ در‌زمینه کنترل سالمونلوز به شمار می‌روند (9). مطالعات در‌مورد باکتری­های گرم منفی نشان داده است پورین‌ها فراوان‌ترین دسته از OMPها می‌باشند که بسیار محافظ نیز می­باشند (10-12). پروتئین غشای خارجی پورین L (OmpL که YshA نیز نامیده می‌شود) پروتئینی است که به‌طور گسترده‌ای در بین سروتیپ‌های مختلف سالمونلا توزیع شده است. OmpL یک پروتئین بشکه‌ای β تراغشایی (Transmembrane β-barrel) است که شامل 12 رشته β تراغشایی و یک توالی سیگنال N ترمینال می­شود. زمانی که OmpL نوترکیب در اشریشیا کلی بیان می­شود به سمت غشای خارجی باکتری محلی می­شود (13).

مطالعات نشان داده‌اند پروتئین OmpL از باکتری سالمونلا تیفی­موریوم بسیار ایمنی­زا است، زیرا می‌تواند پاسخ‌های ایمنی هومورال و سلولی را برانگیزد و از موش‌های ایمن‌شده در زمان چالش با دُزهای بسیار بالای سالمونلا تیفی­موریوم به‌خوبی محافظت کند (14)؛ بنابراین OmpL یک کاندید بالقوه برای توسعه یک واکسن زیرواحدی محافظ در برابر عفونت سالمونلا است؛ بدین ترتیب با به‌کارگیری این آنتی­ژن ارزشمند، هدف مطالعه حاضر تهیه یک پروتئین ایمنوژن کایمر‌شده متشکل از آنتی‌ژن OmpL از باکتری سالمونلا تیفی‌موریوم و همچنین ادجوانت مولکولی HBHA (Heparin-Binding Haemagglutinin Adhesin) می‌باشد.

مواد و روش کار

در مطالعه Bazgir و همکاران در سال 2023 طراحی و مطالعات ایمونوانفورماتیکی سازه نوترکیب متشکل از یک دامنه ادجوانتی (HBHA) و یک دامنه آنتی­ژنی (OmpL) به‌طور مفصل بررسی شده است. به‌طور خلاصه، در مطالعه پیشین نشان داده شد این سازه با 434 اسید‌آمینه و وزن مولکولی 45/49 کیلودالتون، دارای ساختاری پایدار، آب‌دوست و کروی است. این سازه نوترکیب دارای 81/17 و 26/26 درصد ساختارهای صفحات گسترده و رندوم کویل می­باشد. آنتی­ژنیسیته محاسبه‌شده برای این سازه 6882/0 گزارش شد. علاوه‌بر‌این مطالعات بیوانفورماتیک نشان داد سازه نوترکیب طراحی‌شده به‌طور صحیحی قابلیت اتصال خود را از‌طریق دمین HBHA با گیرنده سطح سلول TLR4 حفظ کرده است (15).

سویه‌های باکتری و استخراج DNA: در مطالعه حاضر سروتیپ‌های باکتریایی سالمونلا سویه تیفی­موریوم، اشریشیا کلی سویه DH5α و اشریشیا کلی سویه BL21 تهیه شدند (دانشکده دامپزشکی، دانشگاه لرستان) و مورد استفاده قرار گرفتند. فرایند استخراج DNA بر‌اساس پروتکل ارائه‌شده توسط کیت اختصاصی استخراج DNA از باکتری (سیناکلون، ایران)، از باکتری سالمونلا تیفی‏موریوم برای تکثیر توالی ژن OmpL و از واکسن ب.ث.ژ برای تکثیر توالی ژنHBHA ، به‌عنوان ادجوانت مولکولی انجام شد. کیفیت استخراج DNA مورد‌نظر با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد بررسی شد.

تکثیر توالی  DNAآنتی‌ژن OmpL و مولکول HBHA: برای تکثیر توالی آنتی‏ژن OmpL و مولکول HBHA از پرایمرهای اختصاصی که در جدول 1 نشان داده شده است استفاده شد. لازم به ذکر است که پرایمر رفت در فرایند تکثیر HBHA در ناحیه '5 خود دارای جایگاه برش آنزیم Nco1 می‎باشد در حالیکه پرایمر برگشتی که برای تکثیر ژن OmpL استفاده شد در ناحیه ´3 خود دارای جایگاه برشی آنزیم EcoRI بود.

تکثیر ژن مورد‌نظر توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) با حجم نهایی 25 میکرولیتر انجام شد. مواد تشکیل‌دهنده‌ واکنش PCR برای تکثیر آنتی‌ژن OmpL و مولکول HBHA شامل 2 میکرولیتر Templat، 5/2 میکرولیتر بافر (X10)، 2 میکرولیتر dNTP (5/2 میلی‌مولار)، 5/1 میکرولیتر MgCl2 (‌50 میلی‌مولار)، 1 میکرولیتر (10 پیکومول) از هر‌یک از پرایمرهای لینکردار فوروارد و ریورس، 1 میکرو‌لیتر آنزیم تک پلیمراز (125/0 واحد بر میکرولیتر) بودند. سیکل­های دمایی به‌کار گرفته‌شده برای اجرای فرایند تکثیر به این صورت بود که در ابتدا مواد در دمای واسرشت اولیه 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 5 دقیقه قرار گرفتند. سپس در 35 سیکل متوالی دمای 95 درجه سانتی‌گراد واسرشت‌سازی را به‌مدت 30 ثانیه، دمای 60 درجه سانتی‎گراد برای اتصال پرایمرها را به‌مدت 35 ثانیه و دمای تکثیر 72 درجه سانتی‎گراد را برای 30 ثانیه متحمل شدند. در‌نهایت نیز تکثیر نهایی در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 10 دقیقه انجام شد. کیفیت‌سنجی محصولات تکثیر‌شده توسط سیستم الکتروفورز و ژل آگارز 1 درصد انجام شد.

الحاق توالی نوکلئوتیدی آنتی‌ژن OmpL به مولکول HBHA به کمک روش SOE-PCR: فرایند (Splicing-by-Overlap Extension PCR) SOE-PCR در دو مرحله اجرا می‌شود. در مرحله اول محصولات PCR به‌دست‌آمده از مرحله قبل (آنتی‌ژن OmpL و مولکول HBHA) به یکدیگر متصل شدند. بدین منظور محصولات به‌دست‌آمده از  PCR مرحله‌ قبل به‌عنوان الگو، در PCR مرحله 1 استفاده شدند. در واکنش SOE-PCR (I) از 1 میکرو‌لیتر از هر محصول PCR رقیق‌شدهOmpL  و‌HBHA ، 5/1 میکرولیتر آنزیم Taq پلیمراز، 2/1 میکرو‌لیتر MgCl2، 5/2 میکرو‌لیتر بافر، 2 میکرو‌لیتر dNTP و 8/16 میکرو‌لیتر آب‌مقطر در حجم نهایی 25 میکرو‌لیتر استفاده شد. برنامه دمایی مورد‌استفاده در این واکنش نیز همانند برنامه ذکر‌شده در مرحله قبل بود. با این تفاوت که تعداد سیکل­های تعیین‌شده، 15 عدد بود. سپس محصول واکنش اول  SOE-PCRبه‌عنوان الگو برای واکنش دوم SOE-PCR استفاده شد. بدین منظور از 5/1 میکرولیتر از DNA الگو، 5/0 میکرولیتر پرایمر رفت ژن  OmpL با غلظت 10 پیکو‌مول، 5/0 میکرولیتر پرایمر برگشت ژن HBHA با غلظت 10 پیکو‌مول، 5/0 میکرو‌لیتر آنزیم Taq پلیمراز، 5/1 میکرو‌لیتر MgCL2 با غلظت 50 میلی‌مولار، 5/2 میکرو‌لیتر بافر، 2 میکرو‌لیتر dNTP با غلظت 5/2 میلی‌مولار و 16 میکرو‌لیتر آب‌مقطر در حجم نهایی 25 میکرو‌لیتر استفاده شد. برنامه دمایی استفاده‌شده برای واکنش SOE-PCR(II) به این صورت بود که ابتدا دمای 95 درجه سانتی‎گراد به‌مدت 5 دقیقه به‌عنوان واسرشت‌سازی اولیه در نظر گرفته شد. سپس واکنش در 35 سیکل متوالی با دمای 95 درجه سانتی‎گراد برای واسرشت‌سازی به‌مدت 30 ثانیه، 69 درجه سانتی‎گراد برای اتصال پرایمرها به‌مدت 35 ثانیه و 72 درجه سانتی‎گراد به‌مدت 30 ثانیه برای تکثیر پیش رفت. در‌نهایت نیز به‌مدت 5 دقیقه دمای 72 درجه سانتی‎گراد برای تکثیر نهایی اعمال شد.

هضم آنزیمی وکتور pET22b(+) و کایمر نوترکیب HBHA-OmpL: هضم آنزیمی دوگانه روی وکتور بیانی pET22b (+) (Invitrogen, USA) و کایمر نوترکیب HBHA-OmpL انجام شد. برای انجام هضم دوگانه سازه نوترکیب HBHA-OmpL و وکتور pET22b(+) از دو آنزیم NcoI و EcoRI و بافر Tango به‌مدت 16 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد در انکوباتور بدون شیک استفاده شد. در‌نهایت هر دو محصول هضم‌شده روی ژل آگارز 1 درصد بارگذاری شدند. فرایند استخراج از ژل آگارز توسط کیت اختصاصی (Termo, USA) طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. بعد از استخراج از ژل، محصول استخراج‌شده توسط دستگاه نانودراپ کمیت‌سنجی شدند.

اتصال قطعه نوترکیب HBHA-OmpL به پلاسمید pET22b(+) و انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری بیانی BL21 (DE3): بعد از تعیین غلظت قطعات هضم‌شده HBHA-OmpL و وکتور بیانی، فرایند اتصال با استفاده از آنزیم DNA Ligase T4 در دمای 16 درجه سانتی‎گراد به‌صورت شبانه انجام شد. سپس فرایند انتقال پلاسمید نوترکیب به سلول‌های مستعد DH5α با استفاده از روش شوک حرارتی انجام شد. محصولات لایگیت‌شده روی یک پلیت LB آگار حاوی آنتی‏بیوتیک (1/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) کشت داده شدند و به‌مدت 16 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند. پس از ظاهر شدن کلنی‏های تک، جهت تأیید حضور قطعه کایمر‌شده درون کلنی‏های مشاهده‌شده روی محیط کشت، از واکنش PCR Colony و همچنین پرایمر جهانی T7 استفاده شد.

استخراج پلاسمید نوترکیب، تعیین توالی و زیرهمسانه‌سازی به وکتور بیانی: فرایند استخراج پلاسمید نوترکیب حاوی قطعه OmpL‌HBHA- از باکتری ‌DH5α، با استفاده از کیت تخصصی استخراج پلاسمید نوترکیب (USA Thermo,) طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد و برای تعیین توالی‏ با استفاده از پرایمرهای T7 به شرکت بایونیر کره ارسال شد. بعد از تأیید حضور قطعه‌ نوترکیب داخل پلاسمید  pET22b(+)مجدداً انتقال وکتور به درون باکتری مستعد بیانی BL21(DE3) به روش شوک حرارتی انجام شد و محصولات روی محیط کشت LB آگار حاوی آمپی‏سیلین (1/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) به‌مدت 16 ساعت و دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند. تأیید صحت اجرای مرحله انتقال نیز توسط فرایند PCR-Colony با به‌کارگیری پرایمر جهانی T7 بررسی شد.

بیان و خالص‌سازی پروتئین نوترکیب تولیدشده HBHA-OmpL: به‌‌منظور القای بیان پروتئین HBHA-OmpL، باکتری BL21(DE3) (حاوی pET22b(+) نوترکیب)، در 5 تا 6 میلی‌لیتر محیط کشت مایع LB حاوی آمپی‌سیلین (1/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) به‌مدت 16 تا 20 ساعت، در دمای 37 درجه کشت داده شد. پس از جوان‌سازی مجدد باکتری­ها در 50 میلی‌لیتر محیط کشت مایع LB حاوی آمپی‌سیلین (1/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر)، القای بیان ژن مورد‌نظر توسط IPTG (5/0 میلی‌مولار) انجام شد. برای بررسی فرایند بیان پروتئین هر‌ 1 ساعت 1 بار نمونه‌برداری شد. در‌نهایت نیز ارزیابی کیفی القای بیان ژن توسط ژل SDS-PAGE با غلظت 12 درصد بررسی شد.

خالص‌سازی و جمع‌آوری پروتئین نوترکیب تولید‌شده، با روش‌ His-Taq purification و به‌کارگیری ستون رزین کروماتوگرافی نیکل NTA انجام ‌شد. در این روش، جمع‌آوری نهایی پروتئین­ها توسط محلول ایمیدازول 250 میلی‌مولار و ارزیابی کیفی پروتئین­های جمع‌آوری‌شده توسط ژل SDS-PAGE با غلظت 12 درصد انجام شد.

نتایج

استخراج DNA و تکثیر ژن‌های اختصاصی: به‌منظور تکثیر ژن­های HBHA به‌عنوان ادجوانت مولکولی و OmpL به‌عنوان آنتی‏ژن، استخراج DNA به‌ترتیب از واکسن ب.ث.ژ و باکتری سالمونلا تیفی‏موریوم با موفقیت انجام شد (تصویر 1). سپس هریک ژن‌های HBHA و OmpL که به‌ترتیب دارای طول 600 و 667 جفت باز می‌باشند، توسط پرایمرهای اختصاصی و واکنش PCR بدون هیچ آلودگی و باند غیر اختصاصی با موفقیت تکثیر شد (تصویر 2).

اجرای واکنش SOE-PCR برای اتصال قطعه آنتی‌ژن (667جفت باز) OmpL و قطعه مولکولی (600 جفت باز)HBHA: بعد از تکثیر، از محصولات PCR شده هریک از ژن­های HBHA و OmpL به‌عنوان نمونه الگو برای ساخت کایمر نوترکیب HBHA-OmpL استفاده شد. در این مرحله با استفاده از روش Splicing-by-Overlap Extension توالی آنتی‌ژن OmpL و مولکول HBHA با استفاده از پرایمرهای لینکردار به یکدیگر متصل شدند و قطعه کایمر نوترکیب HBHA-OmpL جدید دارای 1267جفت باز حاصل شد که نتایج الکتروفورز تکثیر صحیح این قطعه را تأیید می‌کند (تصویر 3).

فرایند هضم دو آنزیمی، واکنش اتصال و انتقال پلاسمید نوترکیب به درون باکتری‌های مستعد: کایمر نوترکیب HBHA-OmpL ساخته‌شده و همچنین وکتور بیانی pET22b(+) تحت تیمار هضم دو آنزیمی توسط آنزیم­های محدودکننده NcoI و  EcoRI قرار گرفتند و پس از استخراج از ژل هر‌یک از محصولات ذکر‌شده، فرایند اتصال با استفاده از آنزیم  T4لیگاز نیز با موفقیت انجام شد. سپس محصول به‌دست‌آمده به درون باکتری مستعد  DH5𝛼انتقال داده شد. نتایج الکتروفورز، محصولات حاصل از فرایند Colony-PCR موفقیت اجرای فرایندهای اتصال قطعه نوترکیب به وکتور بیانی pET22b(+) و انتقال وکتور نوترکیب به باکتری  DH5𝛼 را تأیید کرد (تصویر 4). در فرایند Colony-PCR، پرایمرT7 ، 325 جفت باز را به توالی کایمر نوترکیب HBHA-OmpL اضافه می‌کند و یک قطعه 1592 جفت بازی را تولید می­کند.

نتایج توالی‌یابی پلاسمید نوترکیب pET22b(+) حاوی پروتئین نوترکیب HBHA-OmpL: نتایج توالی‌یابی از روی پلاسمید حاوی قطعه‌ کایمر‌شده OmpL‌-HBHA، با استفاده از پرایمرهای T7 نشان داد توالی مدنظر هیچ جهشی ندارد و فریم خوانش صحیح می‌باشد. پس از تأیید نتایج توالی‏یابی، پلاسمید نوترکیب pET22b(+) طی فرایند شوک حرارتی به درون باکتری بیانی BL21 (DE3) با موفقیت انتقال یافت.

بررسی القای بیان و خالص‌سازی توالی پروتئین نوترکیب HBHA-OmpL: القای بیان پروتئین نوترکیب با استفاده از IPTG با غلظت 5/0 میلی‌مولار انجام شد. میزان بیان هر 1 ساعت پس از القا تا 5 ساعت متوالی در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، با استفاده از ژل SDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت (تصویر 5) و همان‌طور که ملاحظه می­شود با گذشت زمان غلظت پروتئین بیان‌شده افزایش یافته است. به‌منظور خالص‌سازی پروتئین تولید‌شده، از ستون رزین کروماتوگرافی نیکل استفاده شد. پس از اتمام فرایند تخلیص پروتئین  HBHA-OmpLبا استفاده از کروماتوگرافی تمایلی به روش طبیعی (توسط تغییر غلظت ایمیدازول)، پروتئین­های خالص‌شده روی ژلSDS-PAGE  12 درصد بارگزاری و ارزیابی شدند و درنهایت پروتئین مورد انتظار با وزن مولکولی تقریباً 45/49 کیلو دالتون، روی ژل SDS-PAGE مورد تأیید قرار گرفت (تصویر 6).

بحث

در حال حاضر میزان مرگ‌و‌میر و مشکلات بهداشت عمومی مرتبط با سالمونلا تیفی­موریوم به حدی افزایش‌ یافته است که آن را به موضوع مهمی برای جوامع بشری تبدیل کرده است. این باکتری در برابر درمان‌های آنتی‌بیوتیکی رایج به‌راحتی مقاوم می‌شود و این مسئله مشکلات زیادی را در درمان انسان‌ها و حیوانات در سراسر جهان به وجود آورده است (16)؛ بنابراین نیاز به دسترسی به یک واکسن کارآمد با قابلیت مناسب تحریک سیستم ایمنی و با کمترین عوارض جانبی به‌شدت احساس می‌شود. امروزه به‌کارگیری علم زیست‌فناوری در تولید پروتئین نوترکیب، اجازه جایگزینی آنتی‌ژن‌های پروتئینی را با باکتری­ها و ویروس­های زنده ضعیف‌شده یا غیرفعال در ساختار واکسن­های نسل جدید داده است. علاوه‌بر‌این تولید پروتئین‌های نوترکیب در مقیاس بزرگ با هزینه کمتر یکی از مزایای عمده این فرایند است (17). براساس مطالعات پیشین، پروتئین‌های غشای خارجی سالمونلا، آنتی­ژن­هایی فعال / محافظت‌کننده در برابر سالمونلا می‌باشند و این پتانسیل را دارند که به‌عنوان یک کاندید در طراحی واکسن­ها مورد استفاده قرار گیرند ‌(12، 18). در‌مورد اهمیت به‌کارگیری آنتی­ژن OmpL می­توان به این نکته اشاره کرد که این آنتی­ژن، به‌عنوان یک پروتئین غشایی، به‌دلیل موقعیت آن بر روی سطح باکتری و همچنین بیان فراوان آن در میان سرووارهای مختلف سالمونلا در مطالعه­های مربوط به طراحی واکسن علیه سالمونلوز مورد توجه است (14، 19). به‌عنوان مثال Yang و همکاران در سال 2013 در یک مطالعه به شناسایی و توصیف واکسنی متشکل از آنتی­ژن OmpL به‌عنوان یک واکسن بالقوه برای محافظت در برابر سالمونلوز در موش پرداختند و گزارش کردند در موش‌های واکسینه‌شده با rOmpL، تمام ایزوله‌های باکتری توسط سرم rOmpL کشته شدند، ولی سرم موش‌های بدون مایه­کوبی قادر به کشتن عامل بیماری در شرایط آزمایشگاهی برای همه سرووارهای آزمایش‌شده تا ۱۸۰ دقیقه نبود. آن­ها به این نتیجه رسیدند که پروتئین OmpL یک آنتی‌ژن امیدوارکننده و محافظ برای توسعه یک واکسن کاندید علیه عفونت سالمونلا ارائه می‌کند (14). بر همین اساس در مطالعه حاضر نیز از آنتی‌ژن OmpL همراه با ادجوانت HBHA با هدف توسعه یک واکسن کونژوگه استفاده شده است. در مطالعه حاضر امکان‌سنجی بیان سازه نوترکیب HBHA-OmpL در سیستم بیانی پروکاریوتی (باکتری بیانی BL21(DE3)) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان‌دهنده‌ بیان موفق این سازه‌ نوترکیب در سیستم بیانی پروکاریوتی بود. به‌کارگیری سیستم بیانی کاربرپسند و مقرون‌به‌صرفه پروکاریوتی بسیار مورد توجه و علاقه محققین است.

در راستای مطالعه حاضر، Jahandar و همکاران در سال 2015 ژن InvG از باکتری سالمونلا را با طراحی آغازگر اختصاصی و استفاده از روش‌PCR  تکثیر و بیان آن را در سیستم بیانی پروکاریوتی BL21(DE3) ارزیابی کردند. نتایج نشان داد تولید پروتئین نوترکیب InvG از باکتری سالمونلا با وزن 81 کیلو دالتون در میزبان بیانی پروکاریوتی (اشریشیا کلی) امکان‌پذیر است (20) که این نتایج در راستای اهمیت و توانمندی سیستم پروکاریوتی در تهیه پروتئین­های نوترکیب می­باشد. علاوه‌بر‌این مطالعات پیشین نشان داده­اند مطالعه­های بسیاری در‌زمینه بیان انواع پروتئین­های آنتی­ژنیک و معرفی به‌عنوان کاندید واکسن­های نوترکیب زیرواحدی، متشکل از آنتی­ژن­های قدرتمند علیه پاتوژن‌هایی نظیر بروسلا و کوکسیلا انجام شده است که از همین سیستم بیانی پروکاریوتی و همچنین پلاسمیدهای اختصاصی با موفقیت استفاده کرده­اند (21-23). سیستم بیانی وکتورpET نیز قوی­ترین سیستمی است که برای بیان پروتئین نوترکیب در میزبان­های پروکاریوتی به کار گرفته می‌شود (24). در مطالعه حاضر تولید پروتئین HBHA-OmpL در باکتری اشریشیا کلی به شکل نوترکیب با استفاده از ناقل پلاسمیدی سیستم (+)pET22b با موفقیت انجام گرفت. دلیل انتخاب پلاسمید (+)pET22b کارایی بالای آن در کلونینگ و تولید پروتئین نوترکیب است (20). سپس پروتئین نوترکیب در باکتری تجاری اشریشیا کلی BL21 (DE3) بیان و خالص‌سازی شد و درنهایت نیز توسط SDS-PAGE مورد تأیید قرار گرفت.

در راستای مطالعه حاضر، تاکنون مطالعات متعددی در‌زمینه‌ طراحی و یا ساخت سازه­های آنتی‌ژنیک نوترکیب با هدف توسعه واکسن­های زیرواحدی صورت گرفته است. در این خصوص Adeli و همکاران در سال 2016 با هدف توسعه یک واکسن زیر‌واحدی علیه بیماری سالمونلوز به بیان پروتئین نوترکیب fliC پرداختند. در آن مطالعه برای بیان حداکثری، ژن موردنظر با‌توجه‌به ترجیح کدونی باکتری E.coli سنتز و درون وکتور بیانیpET28a+ زیرهمسانه‌سازی شد و سپس به میزبان بیانی پروکاریوتی اشریشیا کلیBL21 (DE3)  منتقل شد. بیان و خلوص پروتئین ۵۱ کیلو دالتونی مذکور با استفاده از SDS-PAGE تأیید شد (25). Verma و همکاران در سال 2009، مطالعه‌ایی با هدف به‌کارگیری پروتئین‌های غشای خارجی OmpF و OmpC از سالمونلا آنتریکا سرووار تیفی (S. Typhi) در ساختار یک واکسن کاندید برای پیشگیری از تب تیفوئید انجام دادند. پروتئین‌های OmpF و OmpC از S. Typhi در وکتور pQE30UA همسانه‌سازی و سپس در باکتری بیانی اشریشیا کلی BL21 (DE3) بیان شدند. پروتئین‌های تولید‌شده با استفاده از روش‌های کروماتوگرافی (کروماتوگرافی تعویض یونی) خالص‌سازی و سپس به موش‌ها تزریق شدند تا پاسخ ایمنی آن‌ها بررسی شود. آزمایش‌های سرمی برای اندازه‌گیری تولید آنتی‌بادی‌ها نشان داد پروتئین‌ها می‌توانند پاسخ ایمنی مؤثری ایجاد کنند و به‌عنوان آنتی‌ژن‌های بالقوه برای واکسن‌های ضد S. Typhi در نظر گرفته شوند (26).

علاوه‌بر‌این Pandey و همکاران در سال 2018، طی مطالعه‌ایی به‌منظور توسعه واکسن زیر‌واحدی به بیان و خالص‌سازی آنتی­ژن Omp28 از سالمونلاآنتریکا سرووار تیفی موریوم برای توسعه واکسن زیر‌واحد پرداختند. در این مطالعه توالی آنتی­ژن Omp28 تکثیر و همسانه‌سازی و پروتئین آن نیز در سیستم بیانی پروکاریوتی بیان شد. آنتی­ژنیک بودن پروتئین خالص‌شده از‌طریق وسترن بلات با آنتی‌سرم تولید‌شده در خرگوش تأیید شد. آن‌ها گزارش کردند آنتی‌ژن Omp28 می‌تواند به‌عنوان یک کاندید مؤثر برای توسعه واکسن rDNA علیه سالمونلوز در نظر گرفته شود (27) که با هدفی مشابه با مطالعه حاضر با موفقیت پیش رفته است. در راستای به‌کارگیری آنتی­ژن­های برجسته در توسعه کاندید واکسن‌های زیرواحدی،Jha  و همکاران در سال 2012 با هدف توسعه یک واکسن نوترکیب علیه سالمونلا تیفی موریوم برای طیور، از آنتی­ژن Omp C باکتری سالمونلا تیفی موریوم استفاده کردند. این ژن یک پروتئین غشای خارجی اصلی است که هم در اسمولاریته پایین و هم در اسمولاریته بالا به میزان زیادی بیان می‌شود. بدین‌منظور توالی DNA آنتی­ژن مذکور تکثیر و سپس در باکتری اشریشیا کلی سویه DH5α کلون و سپس تعیین توالی شد تا امکان توسعه واکسن rDNA بررسی شود (28).

یک واکسن زیر‌واحدی، شامل آنتی­ژن OmpL می­تواند واکسنی محافظ در برابر عفونت‌های سالمونلایی باشد. این پروتئین می‌تواند پاسخ‌های ایمنی هومورال و سلولی را برای پاک‌سازی کامل عفونت باکتری سالمونلا تقویت کند و پتانسیل آن را برای استفاده در انواع واکسن‌ها افزایش دهد. در‌نتیجه واکسن مبتنی بر آنتی­ژن OmpL این قابلیت را دارد که یک واکسن بالقوه در برابر عفونت چندگانه سالمونلا تیفی­موریوم باشد. در مطالعه حاضر، تلاش شد یک پروتئین نوترکیب معرفی شود که حاوی پروتئین‌ آنتی‌ژن OmpL از باکتری سالمونلا تیفی­موریوم و ادجوانت مولکولی HBHA (HBHA-OmpL)، به‌عنوان یک جایگزین کارآمد برای واکسن‌های رایج موجود است.

نتیجه‌گیری نهایی: مطالعه حاضر با هدف ساخت یک ساختار کایمر ایمونوژنیک، شامل دو دامنه اصلی متشکل از آنتی‌ژن OmpL از باکتری سالمونلا تیفی­موریوم و مولکول HBHA، به‌عنوان ادجوانت مولکولی از باکتری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس انجام شد. این ساختار در ابتدا طراحی و سپس امکان‌سنجی بیان پروتئین مربوط به آن در سیستم بیانی پروکاریوتی بررسی شد. همان‌طور که در نتایج مشخص گردید این پروتئین نوترکیب با موفقیت در سیستم ارزان‌قیمت و کاربرپسند پروکاریوتی بیان و خالص‌سازی می­گردد؛ بنابراین می‌توان در مطالعه­های بعدی خواص ایمنی‌زایی آن را به‌عنوان یک کاندید واکسن زیر‌واحدی در مدل‌های حیوانی مورد‌ مطالعه قرار داد.

ملاحظات اخلاقی

مطالعه حاضر یک مطالعه in vitro می‌باشد و هیچ مدل انسانی یا حیوانی در آن استفاده نشده است؛ بنابراین مشمول دریافت کد اخلاق نمی‌باشد.

سپاسگزاری

مطالعه حاضر در راستای حمایت­های همه‌جانبه دانشکده دامپزشکی دانشگاه لرستان در ایران می‌باشد؛ بنابراین از همکاری مسئولین ذی‌ربط در انجام این پروژه تشکر و قدردانی می‌شود.

تعارض منافع

هیچ گونه تعارض منافعی در ارتباط با این مطالعه وجود ندارد.

References

  1. Brenner F, Villar R, Angulo F, Tauxe R, Swaminathan B. Salmonella nomenclature. J Clin Microbiolo. 2000;38(7):2465-7. doi: 10.1128/jcm.38.7.2465-2467.2000 PMID: 10878026
  2. Ramarathinam L, Niesel DW, Klimpel GR. Salmonella typhimurium induces IFN-gamma production in murine splenocytes. Role of natural killer cells and macrophages. J Immunol (Baltimore, Md: 1950). 1993;150(9):3973-81. doi: 10.4049/jimmunol.150.9.3973 PMID: 8473744
  3. Ngan GJY, Ng LM, Lin RT, Teo JW. Development of a novel multiplex PCR for the detection and differentiation of Salmonella enterica serovars Typhi and Paratyphi A. Res Microbiol. 2010;161(4):243-8 doi: 10.1016/j.resmic.2010.03.005 PMID: 20381608
  4. Holschbach CL, Peek SF. Salmonella in dairy cattle. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 2017;34(1):133. doi: 10.1016/j.cvfa.2017.10.005 PMID: 29224803
  5. Singh Y, Saxena A, Kumar R, Bhatt P, Saxena M. Immunogenic outer membrane proteins (Omps) of Salmonella: potential candidate for sub-unit vaccine. Virol & Immunol J. 2017; 1(2):1-6. doi: 10.23880/vij-16000109
  6. Jamshidi AE, Basami M, Afshari NS. Identification of Salmonella spp. and Salmonella typhimurium by a multiplex PCR-based assay from poultry carcasses in Mashhad-Iran. Iran J Vet Med. 2009; 3(1):43-48. doi: 10.22059/ijvm.2009.19608
  7. Pethe K, Alonso S, Biet F, Delogu G, Brennan MJ, Locht C, et al. The heparin-binding haemagglutinin of M. tuberculosis is required for extrapulmonary dissemination. Nature. 2001;412(6843):190-4. doi: 10.1038/35084083 PMID: 11449276
  8. Arockiasamy A, Krishnaswamy S. Crystallization of the immunodominant outer membrane protein OmpC; the first protein crystals from Salmonella typhi, a human pathogen. FEBS Lett. 1999;453(3):380-2. doi: 10.1016/S0014-5793(99)00746-2 PMID: 10405180
  9. Isibasi A, Ortiz V, Vargas M, Paniagua J, Gonzalez C, Moreno J, et al. Protection against Salmonella typhi infection in mice after immunization with outer membrane proteins isolated from Salmonella typhi 9, 12, d, Vi. Infec immun. 1988;56(11):2953-9. doi: 10.1128/iai.56.11.2953-2959.1988 PMID: 2844676
  10. Thomson DU, Loneragan GH, Thornton AB, Lechtenberg KF, Emery DA, Burkhardt DT, et al. Use of a siderophore receptor and porin proteins-based vaccine to control the burden of Escherichia coli O157: H7 in feedlot cattle. Foodborne Pathog Dis. 2009;6(7):871-7. doi: 10.1089/fpd.2009.0290 PMID: 19737063
  11. Singh SP, Singh SR, Williams YU, Jones L, Abdullah T. Antigenic determinants of the OmpC porin from Salmonella typhimurium. Infec Immun. 1995;63(12):4600-5. doi: 10.1128/iai.63.12.4600-4605.1995 PMID: 7591112
  12. Gil-Cruz C, Bobat S, Marshall JL, Kingsley RA, Ross EA, Henderson IR, et al. The porin OmpD from nontyphoidal Salmonella is a key target for a protective B1b cell antibody response. P Natl A Sci. 2009;106(24):9803-8. doi: 10.1073/pnas.0812431106 PMID: 19487686
  13. Freeman Jr TC, Landry SJ, Wimley WC. The prediction and characterization of YshA, an unknown outer-membrane protein from Salmonella typhimurium. Biochim Biophys Acta Biomembr. 2011;1808(1):287-97. doi: 10.1016/j.bbamem.2010.09.008 PMID: 20863811
  14. Yang Y, Wan C, Xu H, Wei H. Identification and characterization of OmpL as a potential vaccine candidate for immune-protection against salmonellosis in mice. Vaccine. 2013;31(28):2930-6. doi: 10.1016/j.vaccine.2013.04.044 PMID: 23643894
  15. Bazgir M, Shams N, Forouharmehr A, Jaydari A, Nazifi N. Engineering a recombinant chimeric protein consisting of OmpL antigen conjugated to HBHA molecular adjuvant (HBHA-OmpL) with the aim of developing a vaccine against Salmonella Typhimurium. Vet Res Biol Produc. 2023;36(2):100-11. doi: 10.22092/vj.2022.359453.1995
  16. Solhan S, Chan PP, Kurupatham L, Foong BH, Ooi PL, James L, et al. An outbreak of gastroenteritis caused by Salmonella enterica serotype Enteritidis traced to cream cakes. Western Pac surveill response j WPSAR. 2011;2(1):23. doi: 10.5365/WPSAR.2010.1.1.001 PMID: 23908880
  17. Andersen DC, Krummen L. Recombinant protein expression for therapeutic applications. Curr Opin Biotechnol. 2002;13(2):117-23. doi: 10.1016/S0958-1669(02)00300-2 PMID: 11950561
  18. Hamid N, Jain S. Characterization of an outer membrane protein of Salmonella enterica serovar Typhimurium that confers protection against typhoid. Clin. Vaccine Immunol. 2008;15(9):1461-71. doi: 10.1128/CVI.00093-08 PMID: 18650399
  19. Chai T-j, Foulds J. Purification of protein A, an outer membrane component missing in Escherichia coli K-12 ompA mutants. Biochim Biophys Acta. 1977;493(1):210-5. doi: 10.1016/0005-2795(77)90274-4 PMID: 328056
  20. Jahandar MH, Nasiri MR, Aslami Nezhad AA, Tahmoures Pour M. Cloning of InvG gene from Salmonella Enterica in the expression vector pET32a and evaluation of its expression in hosts BL21-DE3. Agric Biotechnol J. 2015;22;7(3):75-88. doi: 10.22103/jab.2015.1133
  21. Nazifi N, Tahmoorespur M, Sekhavati MH, Haghparast A, Behroozikhah MA. Engineering, cloning and expression of DNA sequence coding of OMP31 epitope of Brucella melitensis linked to IL-2 in Escherichia coli. Inte J Infect. 2018;5(3):e68974. doi: 10.5812/iji.68974
  22. Bakhteyari H, Jahangiri R, Nazifi N, Kakanezhadifard A, Soleimani Z, Forouharmehr A, et al. Cloning and expression of Com1 and OmpH genes of Coxiella burnetii in periplasmic compartment of Escherichia coli with the aim of recombinant subunit vaccine production. Arch Razi Inst. 2019;74(4):341-7. doi: 10.22092/ari.2018.122911.1233 PMID: 31939250
  23. Naghavi M, Sekhavati MH, Tahmoorespur M, Nassiri M. Design and production of a novel recombinant chimeric IL2-Omp31 antigen against Brucella infection. Arch Razi Inst. 2018;73(3):199-206. doi: 10.22092/ari.2017.110504.1131 PMID: 30280839
  24. Mierendorf RC, Morris BB, Hammer B, Novy RE. Expression and purification of recombinant proteins using the pET system. Methods Mol Med. 1998;13:257-92. doi: 10.1385/0-89603-485-2:257 PMID: 21390849
  25. Adeli Z, Farahani N, Mosavi SA, Mogarmoon M. Coloning and expression of flic as a vaccine candidate against typhoid. Studies Medical Science. 2016;27(8):683-91. URL: http://umj.umsu.ac.ir/article-1-3346-en.html.
  26. Verma SK, Gautam V, Balakrishna K, Kumar S. Overexpression, purification, and immunogenicity of recombinant porin proteins of Salmonella enterica Serovar Typhi (S. Typhi). J microbiol biotechnol. 2009;19(9):1034-40. doi: 10.4014/jmb.0812.675 PMID: 19809263
  27. Pandey M, Saxena MK, Saxena A, Jha R, Rastogi SK, Kumar R. Cloning, expression and purification of the outer membrane protein28 of Salmonella enterica serovar Typhimurium for subunit vaccine development-a short communication. Vet arh. 2018;88(4):559-68. doi: 10.24099/vet.arhiv.170526
  28. Jha R, Kumar A, Saxena A, Tamuly S, Saxena MK. Cloning, sequencing and in silico analysis of Omp C of
Journal of Veterinary Research
Volume 81, Issue 2
June 2026
Pages 137-147

Files

Share

How to cite

Statistics