Document Type : Aquatic Animal Health Management
Authors
1 Department of Aquaculture, Faculty of Marine Sciences, University of Tarbiat Modares, Noor, Iran
2 National Cell Bank of Iran, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran
3 Iranian Biological and Genetically Resource Center, Tehran, Iran
Abstract
Keywords
رشد سریع صنعت نانوفناوری و افزایش تعداد محصولاتی که از ویژگیهای غیرمعمول نانوذرات مهندسیشده استفاده کردهاند، بیانگر اهمیت بسیار زیاد این فناوری در اقتصاد جهانی است. افزایش تولید و استفاده از محصولات نانویی بهناچار به افزایش سطح تخلیه نانومواد به محیط از طریق رهایش تعمدی و تصادفی یا از طریق نشت از محصولات حاوی این مواد انجامیده است. محیطهای آبی احتمالاً به این دلیلکه محلی برای تهنشینی این مواد هستند، بهطور ویژه حساس و آسیبپذیرند. شناخت کمی در زمینه سرنوشت نانوذرات در محیط آبی، برهمکنشهای آنها با اجزای زنده و غیرزنده و توانایی آنها برای ایجاد آسیب وجود دارد و این شناخت ناکافی موجب نگرانی از خطرهای احتمالی این مواد بر بومسازگان آبی و آبزیان شده است. در حال حاضر نانوذرات نقره بهویژه به دلیل خواص ضدمیکروبی، به طور وسیع در صنایع مختلف و حوزههای گوناگون زندگی روزانه استفاده میشوند. نانوذرات نقره در حوزه زیست پزشکی (بهعنوان عوامل ضدباکتریایی، پوشش ضدباکتریایی، گندزداها و ضدعفونی کنندههای ابزارآلات پزشکی)؛ در صنعت شیمیایی (رنگها، جلادهندهها، چسبها، پلیمرها)؛ در محصولات آرایشی و بهداشتی (صابون، خیمر دندان)؛ در بستهبندی مواد غذایی؛ در لوازم خانگی (یخچال، ماشین لباسشویی، تهویهکنندههای هوا با پوشش حاوی نانوذرات)؛ در لباس (جوراب) و وسایل مختلف دیگر استفاده میشوند (6،12،18). نانوفناوری این فرصت را در اختیار صنایع شیلاتی قرار داده که از ابزارهای جدید برای تشخیص سریع بیماری، افزایش توانایی ماهیان برای جذب داروهایی مانند هورمونها، واکسنها و مواد مغذی (25) و تصفیه آب بهره ببرند (10،13،16،27).
اگرچه خواص ضدمیکروبی نانوذرات نقره بهخوبی شناخته شده است (5)، ولی این نانوذرات در ردههای سلولی مهرهداران اثر سمی داشتهاند و مشخص شده که این سمیت ناشی از تولید گونههای فعال اکسیژن (26)، مرگ برنامهریزیشده سلول (آپوپتوز) (23)، افزایش پرواکسیداسیون (3) و کاهش عمکلرد میتوکندری (11) میباشد. مطالعات درونتنی (in vivo) در ماهیان نشان داده که نانوذرات نقره میتوانند اثرات پاتولوژیک بر بافتهای مختلف بدن ماهی داشته باشند که نوع و میزان آسیب به نوع گونه، مراحل مختلف زندگی ماهی، غلظت و مدت زمان مواجهه، شوری و غیره بستگی دارد. تکثیر و تزاید سلولی و التهاب در آبشش، نکروز و التهاب روده و پیگمنتیشن در کبد قزلآلای رنگینکمان (14)، هایپرپلازی، ادم (خیز) و جداشدگی اپیتلیوم آبشش و جوشخوردگی تیغههای آبششی و هموسیدروز، خونریزی، تورم هیدروپیک و هسته پیکنوتیک در کبد ماهی طلایی (1)، ساختار نامنظم و هسته پیکنوتیک اپیدرم، آپلازی و/ یا جوشخوردگی تیغه آبششی، تلانژکتازیس، نکروز و جداشدگی اپیتلیال آبشش و اتساع فضای سینوزوئید، رگهای پُرخون و هسته پیکنوتیک در کبد ماهی خاویاری سیبری (21) از آثار هیستوپاتولوژیکی نانوذرات نقره هستند که در معدود مطالعات انجام شده در این زمینه گزارش شدهاند.
با تـوجـه به افزایـش استفـاده از نانـوذرات نقــره در کاربردهای مصرفی و تجاری و نبود اطلاعات در زمینه اثر نانوذرات بر ماهی آزاد دریای خزر بهعنوان گونه ارزشمند و در معرض خطر، پژوهش حاضر با هدف بررسی اثرات هیستوپاتولوژیکی نانوذرات نقره بر آبشش این ماهی انجام شده است.
ویژگیهای نانوذرات نقره: نانوذرات نقره کلوئیدی مورد استفاده در این پژوهش از شرکت نانو نصب پارس با نام تجاری نانوسید (Nanocid® L 2000) ثبتشده در اداره ثبت اختراعات و نشان ایالات متحده امریکا به شماره 20090013825 خریداری شد (13). براساس اطلاعات شرکت سازنده، نانوذرات نقره کلوئیدی غلظت 4000 میلیگرم در لیتر دارد و میانگین اندازه نانوذرات 6/16 نانومتر اعلام شده است. ویژگیهای این محصول کلوئیدی در مطالعة قبلی بررسی (16) و بهطور خلاصه در جدول 1 ارائه شده است.
گونه مورد مطالعه ماهی-ماهی: بچهماهیان آزاد دریای خزر (Salmo caspius) برای این آزمایش با میانگین وزنی 40/3±60/26 گرم از مرکز بازسازی ذخایر آزادماهیان شهید باهنر کلاردشت تهیه شدند.
بررسی اثر مزمن نانوذرات نقره بر بافت آبشش: بچه ماهیان به مدت یک هفته با شرایط آزمایشگاهی در مخازن آب شیرین (تانکهای 300 لیتر) سازگار و با غذای تجاری (بیومار) تغذیه شدند (1درصد وزن بدن). سپس، به منظور جلوگیری از جذب نانوذرات بهوسیله مدفوع، 24 ساعت قبل از شروع آزمایش، غذادهی به ماهیها قطع شد (14). در طول دورة سازگاری تلفاتی در بین ماهیان مشاهده نشد. بعد از این مدت ماهیها به صورت تصادفی به تانکهای آزمایش (100 لیتر) انتقال داده شدند. میزان تراکم ماهیها در هر تانک 100 لیتری حدود 7/2 گرم در لیتر بود (در هر تانک 7 ماهی). شاخصهای کیفی آب مانند pH، اکسیژن محلول، دما، سختی کل در طول آزمایش با استفاده از دستگاه دیجیتال (Lovibond water testing) اندازهگیری شد. میانگین دما (درجه سانتیگراد)، pH، سختی (میلیگرم در لیتر کربنات کلسیم) و اکسیژن محلول (درصد اشباع) به ترتیب 26/0±62/18، 08/0± 25/8، 34/6±246، 04/2±6/90 بودند. آزمایش تحت شرایط نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی انجام شد. برای آزمایش از آب شهری کلرزدایی و هوادهیشده استفاده شد.
غلظتهای 0، 01/0، 02/0 و 03/0 میلیگرم در لیتر براساس غلظت کُشنده میانی (LC50؛ دادههای منتشرنشده) انتخاب و برای هر تیمار سه تکرار در نظر گرفته شد. آزمایش به مدت 14 روز تحت شرایط ساکن با تعویض آب و تجدید غلظتها انجام شد و آب مخازن مورد آزمایش هر 24 ساعت یک بار تعویض و غلظتهای نانوذرات مورد مطالعه مجدداً در مخازن اضافه شد. در طول آزمایش برای جلوگیری از جذب نانوذرات به غذا و مدفوع ماهیها، غذادهی انجام نشد (14،15). ماهیهای شاهد تحت شرایط یکسان با گروههای آزمایشی قرار داشتند.
برای آزمایش هیستوپاتولوژی، در پایـان دوره (روز 14) از هـر تیـمـار 6 ماهی بهطور تصادفی برای نمونهبرداری از بافت آبشش انتخاب شدند. ماهیها در پودر گل میخک (100 میلیگرم در لیتر) بیهوش شدند. بهمنظور تثبیت نمونهها، بافتها که با دقت و بدون آسیب بافتی از بدن خارج شده بودند، بلافاصله به محلول بوئن انتقال داده شدند. برای انجام مطالعههای بافتشناسی ابتدا نمـونههای بافتی از محلول بوئن خارج و به الکل 70 درصد انتقال داده شدند. سپس نمونههای بافتی در دستگاه خودکار آمادهسازی بافت (Tissue processor, DID SABZ DS 2080/H) آبگیری، شفافسازی و پارافینه شدند. در ادامه نمونههای قالبگیریشده با دستگاه میکروتوم (Accu-Cut SRM 200 Rotary Microtome) با ضخامت 5 میکرومتر برش داده شدند. از هر نمونه 3 لام سریالی با کیفیت مناسب تهیه شد و رنگآمیزی لامهای حاصله به روش رایج هماتوکسیلین و ائوزین انجام گرفت (14). برشهای ایجادشده با چسب انتالان روی لام چسبانده شدند، سپس لامهای تهیهشده با میکروسکوپ نوری (OPTIKA) مجهز به دوربین در بزرگنماییهای مختلف مورد بررسی قرار گرفتند. برای مطالعه آسیبشناسی بافت آبشش در هر تیمار 500 تیغه ثانویه شمارش شد و تعداد تیغههای ثانویهای که دچار آسیب شده بودند نسبت به تعداد کل تیغه ثانویه سنجیده شدند. شدت تغییرات کمتر از 10 درصد، "بدون تغییر (-)"؛ شدت تغییرات بین 10-30 درصد "تغییر ملایم (+)"؛ شدت تغییرات بین 31-60 درصد "تغییر متوسط (++)" و شدت تغییرات بین 60-100 درصد "تغییر شدید (+++)" در نظر گرفته شدند (14،17،28).
در آزمایش 14 روزه برای تعیین سمیت مزمن با افزایش غلظت نانوذرات نقره درصد زندهمانی ماهیان مورد مطالعه کاهش یافت. تلفات ماهیها در غلظت 03/0 میلیگرم در لیتر از روز هفتم شروع شد و این تلفات تا روز یازدهم ادامه داشت (تلفات تجمعی 47 درصد). در غلظت 02/0 میلیگرم در لیتر تلفات از روز هفتم (تلفات تجمعی 22 درصد) و در غلظت 01/0 میلیگرم در لیتر تلفات از روز هشتم (تلفات تجمعی 3 درصد) آغاز شد. در گروه شاهد در طول آزمایش تلفاتی مشـاهده نشد و رفـتار ماهیها طبیعی بود. از علائم رفتاری ماهیهای مورد آزمایش در سمیت مزمن که مرگ و میر در آنها مشاهده شد، کف گزینی، افزایش حرکت سرپوش آبششی، برهم خوردن تعادل و بیاشتهایی (در زمان تغذیه مختصر قبل از تعویض آب) بود.
آبشش ماهیان مورد آزمایش در گروه شاهد از نظر بافتشناسی طبیعی بود (تصویر a1). در غلظت 01/0 میلیگرم در لیتر هایپرپلازی، هایپرتروفی و راس چماقی و کوتاهی تیغه ثانویه ملایم مهمترین تغییرات هیستوپاتولوژیکی مشاهده شده بود (تصویر b1). با افزایش غلظت نانوذرات نقره در آب میزان آسیب بافت آبشش افزایش یافت. هایپرپلازی، هایپرتروفی، جداشدگی اپیتلیالی متوسط در غلظت 02/0 میلیگرم در لیتر دیده شد که نشان داد با افزایش غلظت بر شدت اثر این نانوذرات افزوده شد. شدیدترین تغییرات هیستوپاتولوژیکی بافت آبشش در غلظت 03/0 میلیگرم در لیتر شامل هایپرپلازی، هایپرتروفی، کوتاهی تیغه ثانویه و جداشدگی اپیتلیالی شدید بود (تصویرc,d1؛ جدول 2).
جدول 1. ویژگی های اندازه گیری شده نانوذرات نقره کلوئیدی مورد استفاده (16).
ویژگی |
روش اندازهگیری |
فراسنجه |
توضیحات |
غلظت (میلی گرم/لیتر) |
ICP-AES |
3980 |
با غلظت اعلامشده از شرکت تولیدی اختلاف ناچیزی دارد. |
قطر بیشینه (نانومتر) |
TEM |
129 |
14/65 درصد از ذرات قطری بین 13-1 نانومتر دارند. قطر اعلام شده از شرکت تولیدی 6/16 نانومتر است. |
شکل |
TEM |
کروی |
- |
قطر هیدرودینامیکی (نانومتر) |
Zetasizer |
9/3 تا 5/163 |
1/54 درصد از ذرات قطر دینامیکی کمتر از 100 نانومتر دارند. |
میانگین قطر هیدرودینامیکی (نانومتر) |
Zetasizer |
8/54 |
- |
خلوص |
EDX |
- |
در کلوئید نانوذرات نقره تنها عنصر نقره وجود دارد. |
جدول 2. یافته های هیستوپاتولوژیکی آبشش ماهی آزاد دریای خزر بعد از مواجهه مزمن (14 روزه) با غلظتهای تحت کُشنده نانوذرات نقره و گروه شاهد.
ضایعات بافتی* |
|||||||
غلظت (میلی گرم/لیتر) |
خمیدگی |
هایپرپلازی |
هایپرتروفی |
راس چماقی |
کوتاهی تیغه ثانویه |
جداشدگی اپیتلیالی |
آنوریسم |
0 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
01/0 |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
02/0 |
- |
++ |
++ |
+ |
+ |
++ |
- |
03/0 |
++ |
+++ |
+++ |
++ |
+++ |
+++ |
+ |
* بدون تغییر (-)، تغییر ملایم (+)، تغییر متوسط (++) و تغییر شدید (+++).