مقدمه

برخی از گیاهان دارویی با داشتن ترکیباتی که خاصیت ضد اکسیدانی و ضد هیپوکسی دارند می‌توانند در خنثی سازی رادیکال‌های آزاد تولید شده در بدن نقش مهمی بازی کنند و از ایجاد آسیب بافتی و استرس ناشی از کاهش اکسیژن جلوگیری کنند. در عین حال در استفاده از این داروها حتما بابد جانب احتیاط رعایت شود و از عوارض احتمالی آن‌ها پیش از بکار گیری آگاهی حاصل شود. گیاه گلرنگ (C. tinctorius) گیاهی یکساله و گاهی دو ساله متعلق به خانواده Asteraceae از گیاهان دارویی سنتی با اثرات متعدد دارویی است (34). عصاره این گیاه غنی از فلاونوئیدها، آلکالوئیدها، پلی‌اتیلن‌ها، آلکان-دیول (Alkane-diol)، اسیدهای چرب، استروئید‌ها، لیگنان‌ها بوده (34) و همچنین اثرات متعدد درمانی از جمله اثرات بهبود سیستم ایمنی، ضد اکسیداسیونی قوی، اثرات ضد هیپوکسی، اثرات ضد افسردگی و ضد التهاب نیز برای آن گزارش شده است (39). در رابطه با اثرات عصاره خوراکی و تزریقی عصاره گلرنگ در موش آزمایشگاهی بررسی­های متعددی صورت گرفته است (2،21،23،36)، در رابطه با اثرات این گیاه در ماهیان بررسی­های بسیار محدودی صورت گرفته است که همگی این بررسی­ها بر روی اثرات خوراکی عصاره مذکور در برخی گونه­های بوده است (7،8،33).

برای استفاده از هر مکمل دارویی قبل از هر چیز باید از عوارض احتمالی آن آگاهی داشته باشیم، برای ارزیابی اثرات ترکیبات مختلف در ماهیان شاخص‌های فیزیولوژیکی متعددی وجود دارد، یکی از این شاخص‌ها بررسی‌های آسیب شناسی بافتی می‌باشد که به طور مستقیم ارزیابی کاملی از سلامت بافت فراهم می‌کند و منعکس کننده وضعیت سلامت موجود زنده است (27). تزریق به راحتی ماده مورد نظر را به خون وارد کرده و به سرعت به بافت‌های مختلف بدن انتقال می‌یابد، مواد وارد شده به خون در نهایت از راه کلیه دفع و یا در چرخه سم زدایی متابولولیت‌های آن خنثی شده و از راه سیستم صفراوی از بدن خارج می‌گردد، در غیر این صورت طی فرایند سم زدایی رادیکال‌های آزاد تولید شده موجب پراکسیداسیون لیپید‌های موجود در غشا سلول‌ها و همچنین اکسید کردن ماکرومولکول‌های مهم مانند پروتئین‌ها، کربوهیدرات‌ها و DNA سبب از بین روفتن سلول‌ها و در نهایت نکروز بافتی می‌شود که در بررسی­های بافت شناسی می­توان این عوارض را شناسایی نمود (35). اگرچه بافت­های کبد و کلیه از جمله بافت­های با اهمیتی هستند که در مراحل اولیه درگیری­های دارویی و سموم دچار عوارض می­شوند اما آگاهی کمتری نسبت به سمیت این بافت­ها در رابطه با داروهای گیاهی وجود دارد (31).

در عین حال بررسی­ برخی شاخص­های سرم خون نیز در ارزیابی عملکرد فیزیولوژیکی بدن می­تواند به کار گرفته شود به عبارت دیگر ارزیابی پلاسما و سرم خون به­دلیل ارتباط گسترده در سراسر بدن با بافت­های مختلف، می­تواند به عنوان یک شاخص مفید برای سنجش وضعیت تغذیه‌ای، سلامت و یا قرار گرفتن در معرض آلاینده‌ها به­کار گرفته شود (5،18). در ارزیابی اثرات ترکیبات مختلف خوراکی و تزریقی در ماهیان، با سنجش برخی متابولیت‌های سرمی و آنزیم‌ها می­توان اثرات مثبت یا منفی ماده مورد استفاده در ماهی مورد مطالعه را شناسایی نمود (22،25). به عنوان مثال افزایش مقادیر آنزیم‌هایی مانند آلانین آمینو ترانسفراز (ALAT)، آسپارتات آمینو ترانسفراز (ASAT) و فسفاتاز قلیایی (ALP) نیز در سرم یا پلاسما با آسیب­های هپاتوسیت­های کبدی، کیسه صفرا و مجرای صفراوی در ارتباط است (22،25). با توجه به اطلاعات محدود در رابطه با اثرات عصاره گلرنگ در ماهیان و عدم وجود هیچ منبعی برای اثرات این ترکیب در ماهی قزل آلای رنگین کمان، در بررسی حاضر عوارض تزریق داخل صفاقی این عصاره در ماهی قزل الای رنگین کمان مورد بررسی قرار گرفت. هدف از این بررسی امکان سنجی به­کار گیری عصاره این گیاه بصورت تزریقی و همچنین بررسی اثرات و عوارض بافتی در دوزهای 50 تا 200 (میلی­گرم/وزن ماهی) این دارو در ماهی قزل­آلای رنگین کمان بوده است.

مواد و روش‌کار

تهیه ماهی، اداپتاسیون و استخراج عصاره: ماهی‌های قزل‌آلای‌رنگین‌کمان (O. mykiss) با میانگین وزن 5 ± 100 گرم تهیه و در طی یک هفته آداپتاسیون با غذای تجاری GFT1 شرکت فرادانه تغذیه شدند. به منظور آماده سازی عصاره تزریقی، گل‌‌های خشک شده گیاه گلرنگ تهیه و از آن عصاره اتانولی طبق روش Harikrishnan و همکاران در سال 2009 تهیه شد (12). برای تهیه سوسپانسیون تزریقی مجدد با استفاده از سرم فیزیولوژی با دمای 45 درجه سانتی­گراد عصاره حاصله به صورت محلول در دوز‌های 50، 100 و 200 میلی‌گرم به ازای هر کیلو‌گرم وزن ماهی آماده (12) و پس محاسبه دقیق عصاره­های مذکور در 2/0 سی­سی سرم فیزیولوژی (حاوی 9/0 درصد NaCl) به صورت داخل صفاقی به ماهی تزریق شد. به این منظور پس از سازگاری ماهیان با شرایط آزمایش یک سه گروه تیمار، یک گروه کنترل منفی و یک گروه کنترل مثبت در نظر گرفته شد (هر گروه در 3 تکرار مورد بررسی قرار گرفتند). ماهیان گروه تیمار به ترتیب با دوزهای 50، 100 و 200 میلی‌گرم به ازای هر کیلو‌گرم وزن ماهی مورد تزریق قرار گرفتند. ماهیان گروه کنترل مثبت تنها با 2/0 سی­سی سرم فیزیولوژی به روش داخل صفاقی تزریق شدند. هیچ تزریقی در ماهیان گروه کنترل منفی صورت نگرفت.

نمونه برداری و بررسی شاخص­های بافتی و سرمی: نمونه برداری از خون ماهی‌های از طریق ساقه دمی توسط سرنگ 2 ­سی سی و یر یوزن گیج 25 برای تمامی گروه­ها در روز‌های سوم، هفتم و دهم به صورت انجام گرفت و بعد از لخته شدن در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 40 دقیقه نمونه‌ها با دور 4000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ و سرم‌ها به میکروتیوب‌های جدید منتقل شدند و تا زمان انجام آزمایش در فریزر 80- قرار گرفتند. نمونه‌های بافت کبد و کلیه نیز در روز هفتم برداشته شد و به داخل محلول فرمالین 10درصد  منتقل شدند و مجدد بعد از 12 ساعت محلول فرمالین مربوط به هر ظرف نمونه تعویض گردید. مقاطع بافتی طبق روش استاندارد تهیه شد (27). در این راستا، پس از طی مراحل آبگیری، شفاف­سازی، پارافینه کردن و قالب­گیری مقاطع 5 میکرومتری از بافت­های کبد و کلیه تهیه و بر روی لام چسبانده شد. سپس رنگ­آمیزی به روش هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) صورت گرفت. مقدار پروتئین کل، آلانین آمینو ترانسفراز (ALAT)، آسپارتات آمینو ترانسفراز (ASAT) و فسفاتاز قلیایی (ALP) با استفاده از کیت (شرکت پارس آزمون) صورت گرفت و محاسبات طبق بروشور موجود در هر کیت صورت گرفت. در مطالعات بافت شناسی، آسیب­های احتمالی بافتی پس از رنگ­آمیزی به وسیله میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 100 تا 400 برابر (Nikon ECLIPSE E100) مورد مطالعه قرار گرفت.

آنالیز آماری: جهت بررسی آماری نتایج نهایی از نرم افزار SPSS نسخه 22 و جهت رسم نمودار‌ها از نرم افزار Microsoft Excel نسخه 2016 استفاده شد. نتایج بررسی شاخص­های مورد مطالعه به­صورت میانگین ± انحراف استاندارد برای تیمار‌های مختلف بیان گردید. جهت مقایسه­ی میانگین­ها از آنالیز واریانس یک طرفه (one way ANOVA) در سطح اطمینان 95 درصد استفاده استفاده گردید.

نتایج

مقدار پروتئین کل سرم خون: مقدار پروتئین کل سرم خون در هر دوره نمونه برداری نوسان‌هایی را نشان داد. در هر سه دوره نمونه برداری سطح پروتئین کل در تجویز دوز 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم کاهش معنی‌داری  داشت(05/0P <). به طوری که در سه دوره نمونه برداری کمترین سطح متعلق دوز 200 میلی‌گرم بر کیلو‌گرم بود. همچنین تزریق دوز 100 میلی‌گرم بر کیلوگرم در روز دهم نیز کاهش معنی‌داری (05/0P <) را نشان داد (جدول 1).

مقادیر آنزیم‌های ALAT، ASAT و ALP در سرم خون: سنجش مقدار فعالیت آنزیم‌هایی از قبیل ALAT، ASAT و ALP می‌تواند اطلاعات مفید درباره سلامت بافت و اندام‌ها در اختیار محققیق قرار دهد بر اساس بررسی حاضر. مقدار فعالیت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز در روزهای سوم، هفتم و دهم پس از تزریق در مقایسه با شاهد منفی و شاهد مثبت مقادیر بیشتری را نشان داد (05/0P <). به عبارت دیگر کمترین میزان فعالیت مربوط به گروه‌های شاهد منفی و مثبت در روز سوم، هفتم و دهم بود (جدول 2)در اندازه‌گیری کمی سطوح آنزیم فسفاتاز قلیایی در روزهای سوم، هفتم و دهم بعد از تجویز عصاره، افزایش معنی‌داری در فعالیت این آنزیم در مقایسه با نمونه‌های شاهد دیده شد (05/0P <) و کمترین سطح در شاهد منفی مربوط به هر دوره نمونه‌برداری مشاهده شد (جدول 3).

مقدار سطوح آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز موجود در داخل سرم خون نیز برای هر سه دوره نمونه برداری در دوز‌های 50، 100 و 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم در مقایسه با گروه‌های شاهد منفی و مثبت افزایش یافت (05/0P <) به طوری که بیشترین مقدار فعالیت این آنزیم در هر سه دوره نمونه برداری مربوط به دوز 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم ثبت شد (جدول 4).

نتایج حاصل از مطالعات بافت شناسی:با توجه به بررسی مقاطع بافتی کلیه و کبد، به طور کلی می‌توان گفت تزریق داخل صفاقی عصاره گلرنگ باعث افزایش آسیب‌های بافتی کلیه و کبد گردید. در این مطالعه به موازات افزایش غلظت عصاره گلرنگ از 50 به 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم، روند آسیب‌های بافتی ثبت شده نیز افزایش یافت. عمده‌ترین علائم مشاهده شده در بررسی بافت کلیه ماهی‌های تزریق شده با عصاره گلرنگ شامل افزایش مراکز ملانوماکروفاژ و دژنره شدن توبول‌های کلیوی بوده است. در این بررسی شدت عوارض یاد شده در دوز‌های بالا بیشتر بود (تصاویر1).

عمده آسیب‌های مشاهده شده در بافت کبد شامل واکوئوله شدن هپاتوسیت‌ها بود که بر اساس بررسی‌های بافت شناسی با افزایش دوز تزریقی عصاره گلرنگ شدت واکوئوله شدن هپاتوسیت‌های کبدی افزایش معناداری داشت (تصاویر 2). در ماهی‌هایی که 200 میلی‌گرم بر گیلوگرم عصاره گلرنگ را از راه تزریق داخل صفاقی دریافت نمودند، واکوئوله شدن شدید و همچنین نکروز هپاتوسیت‌های کبدی نیز ثبت شد (تصاویر 2).

*حروف انگلیسی متفاوت در هر ستون نشان دهنده اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها می‌باشد (05/0P˂).

جدول 2. سطحوح آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (واحد/­لیتر) به تفکیک در روز سوم، هفتم و دهم بعد از تزریق غلظت‌های مختلف عصاره گلرنگ در ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان، میانگین ± انحراف استاندارد.

*حروف انگلیسی متفاوت در هر ستون نشان دهنده اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها می‌باشد (05/0P˂).

جدول 3. سطحوح آنزیم فسفاتاز قلیایی (واحد/­لیتر) به تفکیک در روز سوم، هفتم و دهم بعد از تزریق غلظت‌های مختلف عصاره گلرنگ در ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان، میانگین ± انحراف استاندارد.

*حروف انگلیسی متفاوت در هر ستون نشان دهنده اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها می‌باشد (05/0P˂).

جدول 4. سطحوح آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (واحد/­لیتر) به تفکیک در روز سوم، هفتم و دهم بعد از تزریق غلظت‌های مختلف عصاره گلرنگ در ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان، میانگین ± انحراف استاندارد.

*حروف انگلیسی متفاوت در هر ستون نشان دهنده اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها می‌باشد (05/0P˂).

تصاویر 1. آسیب‌های بافتی کلیوی ناشی از تزریق داخل صفاقی عصاره گیاه گلرنگ در ماهی قزل الای رنگین کمان رنگ­آمیزی هماتوکسیلین –ائوزین (H & E) بزرگ­نمایی 400 برابر. تصویر A): بافت کلیه ماهی‌های تزریق شده با غلظت 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم عصاره گلرنگ. توبول‌های کلیوی نرمال (a)، گلومرول کلیوی نرمال (b)، بافت بینابینی کلیوی نرمال (c)، توسعه مراکز پراکنده ملانوماکروفاژ (d). تصویر B): بافت کلیه ماهی‌های تزریق شده با غلظت 100 میلی‌گرم بر کیلوگرم عصاره گلرنگ، تجمع مایعات اکسودا در برخی توبول‌های کلیوی (a)، نفوذ گسترده مراکز ملانوماکروفاژ (b)، دژنره شدن مختصر سلولی در برخی از توبول‌های کلیوی (c). تصویر C): بافت کلیه ماهی‌های تزریق شده با غلظت 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم عصاره گلرنگ، دژنره شدن سلولی توبول‌های کلیوی (a)، تجمع مایعات در توبول‌های کلیوی (b)، نفوذ گسترده مراکز ملانوماکروفاژ (c)، تجمع مایعات اکسودا در توبول‌های کلیوی (d). تصویر D): بافت کلیه ماهی‌های تزریق شده با غلظت 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم عصاره گلرنگ، دژنره شدن توبول‌های کلیوی (a)، نفوذ گسترده مراکز ملانوماکروفاژ (b)، دژنره شدن بافت بینابینی کلیه (c).