Document Type : Basic Sciences
Authors
Department of Biological Sciences, Faculty of Science, University of Kurdistan, Sanandaj, Kurdistan Province, Iran
Abstract
Keywords
اهمیت مواد معدنی در تغذیه حیوانات از حدود 2000 سال پیش مشخص شده است. در متون علمی وجود 21 عنصر معدنی در جیره ضروری تشخیص داده شده است. مواد معدنی حدود 4 درصد وزن بدن اکثر مهرهداران را تشکیل میدهند که کلسیم و فسفر بیش از نیمی از این مقدار را در بر میگیرند. در این میان کلسیم و فسفر به لحاظ مقدار نسبی حضور در جیره، هزینه تأمین و نیز عوارض سوء ناشی از عدم تأمین آن‌ها به مقدار کافی بیشترین توجه را به خود جلب نمودهاند (28). فسفر برای حیوانات یک عنصر ضروری میباشد که علاوه بر داشتن نقش حیاتی در توسعه و نگهداری بافت اسکلتی، در بسیاری از اعمال متابولیکی نیز اهمیت دارد. فیتک اسید یک فرم آلی فسفر است که برای جانوران تک معده‌ای از قبیل ماکیان، خوک‌ها، ماهیان، انسان و پرندگان قابل‌دسترس نیست؛ چون این جانوران سطح مناسبی از آنزیمهای هیدرولیز کننده فیتات در دستگاه معدی-رودهای خود ندارند (1،10).
فیتات (میو- اینوزیتول هگزا فسفات) فرم اصلی ذخیره‌ی فسفر در دانههای غلات، حبوبات، دانه‌ی گرده و دانههای روغنی است (7،20). این مولکول بسیار باردار است و 6 گروه فسفات از حلقه میواینوزیتول مرکزی آن امتداد یافتهاند. فیتیکاسید یک فاکتور ضد تغذیه‌ای برای انسان‌ها و دام‌ها به شمار می‌رود؛ زیرا شلاتور نیرومندی برای کاتیون‌هایی از قبیل Ca2+،Mg2+،Fe2+/3+،Zn2+،K+، Mn2+ و Cu2+است و از جذب آن‌ها در دستگاه گوارش جانوران جلوگیری می‌کند. همچنین به علت اتصال به مواد مغذی، آمینواسیدها و چربی‌ها، سبب عدم جذب آن‌ها شده و با اتصال به پروتئین‌ها، سبب جلوگیری از عملکرد صحیح آن‌ها در غذای حیوانات شده و درنتیجه میزان مؤثر این مواد را در رژیم غذایی کاهش می‌دهد (5،8،15،16). به دلیل نبود آنزیمهای مؤثر جهت هضم فیتات، مقدار زیادی از فسفر به همراه سایر مواد معدنی و غیره از بدن حیوانات تک معده‌ای دفع می‌گردد. فیتات تجزیه نشده، نه‌تنها سبب کاهش کیفیت مواد غذایی شده بلکه سبب آلودگی‌های زیست‌محیطی نیز می‌شوند (26).
آنزیم فیتاز (EC 3.1.3.8) یک افزودنی مهم تغذیه‌ای برای افزایش دسترسی به فسفر و دیگر مواد معدنی تغذیه‌ای است که در جیرهی حیوانات تک معده‌ای، جهت هیدرولیز اسید فیتیک موجود در جیره مورد استفاده قرار میگیرد(6،21،24). در صنایع بیوتکنولوژی از انواع فیتازها در زمینه‌های مختلف ازجمله در حمایت محیط‌زیست، آبزیپروری و کشاورزی استفاده می‌شود (4،13). از آنزیمهای فیتاز همچنین به‌عنوان مکمل غذایی جهت افزایش جذب آهن برای مصارف انسانی و همچنین به‌عنوان مکمل در تغذیه ماهیها کاربرد دارد. این آنزیمها، همچنین در صنعت نانوایی، صنایع غذایی و جداسازی پروتئین‌های گیاهی نیز کاربرد دارند (14).
از دید آنزیمشناسی فیتازها گروه ویژه‌ای از فسفاتازها یا فسفریک مونواستر هیدرولازها به‌حساب می‌آیند که قادر به هیدرولیز فیتات می‌باشند (23). این آنزیمها از گسترش بالایی در طبیعت برخوردارند و فعالیت فیتازی در گیاهان، جانوران و ریزسازوارهها گزارش‌شده است که همگی قادر به رهاسازی فسفات از فیتات هستند که منبع اصلی فسفر در دانه گیاهان میباشد (12).بدون شک افزایش توجه عمومی به مسائل زیست محیطی، بهبود تغذیه دام و سلامت انسان باعث توجه به توسعه بیوتکنولوژی فیتازها و کاربرد آن‌ها در حیطه‌های مربوطه شده است (17).
گیاهان به علت تنوع زیستی و ساختمان اجزایشان، منابع منحصربه‌فرد و تجدید شدنی برای کشف داروهای جدید هستند. در کشورهای صنعتی حدود 50 درصد از داروهای تجویزشده از گیاهان مشتق شده است و طبق اعلام سازمان بهداشت جهانی، گیاهان برای حدود 4/3 میلیارد نفر به‌عنوان اولین منبع دارویی در کشورهای درحال‌توسعه محسوب می‌شود(3). از نظر تأثیر مواد مختلف بر روی فعالیت آنزیم یونهای مختلف مانند روی، مس، فلوراید و EDTA میتوانند اثر مهارکنندگی و فعالکنندگی داشته باشند (14،29). تاکنون گزارشی از اثر گیاهان و عصاره آن‌ها بر فعالیت فیتاز گزارش نشده است؛ در این پژوهش برای اولین بار تأثیر عصاره متانولی اندام‌های هوایی گیاهان مختلف بر روی فعالیت آنزیم فیتاز استخراج‌شده از سبوس گندم واریته سرداری که فعالیت فیتازی بالای آن قبلاً توسط نویسنده مورد بررسی قرار گرفته است (30)، مورد سنجش قرارگرفته است. هدف یافتن گیاهانی بود که احتمالاً توان فعالسازی یا مهار بالایی بر روی فعالیت فیتاز دارند. تا بتوان از آن‌ها به‌عنوان یک‌راهحل طبیعی و کم‌هزینه، بدون اثرات جانبی برای جلوگیری از مهار و یا افزایش فعالیت آنزیم فیتازی و به‌عنوان مکمل غذایی به جیرهی حیوانات تک معدی استفاده نمود.
نمونههای گیاهی: اندام‌های هوایی گیاهان، توسط کارشناسی ارشد سیستماتیک گیاهی از مناطق مختلف استان جمعآوری شدند. پس از شناسایی تاکسونومیک آن‌ها در هرباریوم مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان کردستان، بلافاصله به آزمایشگاه گروه علوم زیستی منتقل شدند. گیاهان جمع‌آوری‌شده در سایه و دمای 25 درجه سانتیگراد خشک شدند. قبل از تهیه پودر از نمونهها، آن‌ها ازلحاظ نظافت و عدم آلودگی به خاک و یا سایر گیاهان بررسی شدند. سپس بهوسیله قیچی باغبانی به قطعات کوچکی خردشده و بهوسیله آسیاب مکانیکی به‌صورت پودر نرم درآمدند. پودرهای به‌دست‌آمده پس از توزین در ظروف دربدار پلاستیکی تا زمان عصارهگیری، در دمای اتاق نگهداری شدند.
تهیهی عصاره متانولی: حدود 10 گرم پودر گیاهی در 100 میلیلیتر متانول خالص به مدت 24 ساعت (در ظروف تیره و به دور از نور) خیسانده در فواصل زمانی معینی همزده شد. سپس این مخلوط توسط کاغذ صافی واتمن شماره 42 صاف شد. مایع صاف‌شده با استفاده از دستگاه روتاریاواپریتور در دمای 65 درجه سانتیگراد تغلیظ شده و پس از تخلیه از مخزن دستگاه، جهت خشک شدن کامل، بر روی شیشه ساعت به قطر 15سانتیمتر، پخش‌شده و در زیر هود شیمیایی و در دمای محیط قرار گرفت. عصارههای خشک‌شده از روی سطح شیشه ساعت جمعآوری و در میکروتیوب تا زمان انجام مراحل بعدی در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
تخلیص عصاره آنزیم: برای استخراج آنزیم فیتاز از روش گیبسون و یولا با مختصر تغییراتی استفاده شد (11). حدود 100 گرم از دانه گندم رقم سرداری که از مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان کردستان تهیه شده بود آسیاب گردید. بعد از غربالکردن پودر حاصل توسط الک فلزی با قطر منافذ 5/0میلیمتر؛ 10 گرم از پودر غربالشده در 100 میلیلیتر محلول بافر غذا (با 5/5pH= حاوی: استات سدیم 22/0مولار، کلرید کلسیم 001/0 مولار، و محلولِ تویین-20، با غلظت 1/0 گرم در لیتر) حل شد. پس از هم زدن به مدت 60 دقیقه، بشر حاوی مواد فوق به مدت 15 دقیقه بر روی یخ قرار گرفت و بعد از این مدت مایع رویی این بشر از کاغذ صافی عبور داده شد و در بشر دوم جمعآوری گردید سپس محتویات آن توسط سرنگ از فیلتر PVDF به قطرمنافذ45/0 میکرومتر، عبور داده شده و در بشر سومی جمعآوری گردید و پس از توزیع در الیکوتهای یک میلیلیتری، در دمای 20- درجه سانتیگراد ، تا مراحل بعدی نگهداری شد. در مراحل بعدی برای رقیقسازی آنزیم از بافر رقیقسازی (با 5/5pH= حاوی: اسید استیک 01/0 مولار، استات سدیم 22/0 مولار، کلرید کلسیم 001/0 مولار، و محلول تویین-20، با غلظت 1/0 گرم در لیتر) استفاده شد.
سنجش اولیه فعالیت آنزیمی فیتاز و تعیین پارامترهای سنتیکی آنزیم: برای سنجش فعالیت آنزیم فیتاز با استفاده از روش Tran و همکاران در سال 2011 (27) با مختصر تغییراتی استفاده شده است. نحوه سنجش آنزیمی به روش نقطه پایان (End point) بود. زمانهای صفر و 30 دقیقه بعد از شروع واکنش مبنای سنجش جذب نوری مخلوط واکنش بودند. از غلظت‌های مختلف پارا-نیترو فنیل فسفات (p-NPP) به‌عنوان سوبسترا استفاده شد. سنجش در میکروپلیتهای 96 چاهکی و در حجم کل چاهک 150 میکرولیتر و با استفاده از میکروپلیتخوانِTecan مدل Sunrise به ترتیب زیر انجام شد. ترکیبات زیر به ترتیب وارد چاهک شدند، 120 میکرولیتر بافر استاتِ سدیم (5/5pH=، حاوی: استات سدیم 200 میلیمولار، کلرید کلسیم 1 میلیمولار) 10 میکرولیتر از آنزیم فیتاز و 20 میکرولیتر از سوبسترای پارا-نیترو فنیل فسفات (p-NPP) در غلظت‌های مختلف. بهمنظور مخلوط شدن کامل این اجزاء باهم میکروپلیت داخل دستگاه به مدت 5 ثانیه مخلوط شد؛ سپس جذب در طول موج 405 نانومتر قرائت شد. پس از 30 دقیقه گرمخانهای کردن در دمای 45درجه سانتیگراد برای توقف واکنش 50 میکرولیتر سود 1/0 مولار به مخلوط فوق اضافه گردید. آنگاه میکروپلیت درون دستگاه میکروپلیتخوان قرار گرفت و جذب آن در طول‌موج 405 نانومتر قرائت شد. سنجشها با سه بار تکرار انجام شد. چاهک بلانک حاوی اجزاء کامل چاهک تست غیر از آنزیم بود و به‌جای آنزیم 10 میکرولیتر به حجم بافر استات سدیم در این چاهک اضافه شد. بر این اساس شیب نواحی خطی نمودارهای تغییرات جذب در مقابل زمان در غلظت‌های مختلف سوبسترا، (که در واقع سرعت اولیه (Vo) برای آن غلظت از سوبسترا محسوب می‌شود) بدست آمد و در رسم نمودار ثانویه تغییرات سرعت اولیه واکنش در مقابل غلظت سوبسترا و سایر محاسبات بعدی ملاک مقایسه قرار گرفت.
سنجش اثر عصارهها بر روی فعالیت آنزیم فیتاز: در این مطالعه جهت سنجش اثر عصارههای گیاهی بر روی فعالیت آنزیم فیتاز نیز از روش اصلاح‌شده‌ی Tran و همکاران در سال 2011 استفاده گردید (27). همه عصارهها چهار غلظت001/0، 01/0، 1/0، و 1 گرم در لیتر آزمایش شدند. سنجشها در میکروپلیتهای 96 چاهکی و در حجم کل150 میکرولیتر و با استفاده از دستگاه میکروپلیتخوان به ترتیب زیر انجام شد. به هر چاهک 100 میکرولیتر بافر استات سدیم، 10میکرولیتر محلول فیتاز و 20 میکرولیتر از عصاره (محلول در آب مقطر) اضافه شد. جهت تأثیر ترکیبات موجود در عصاره بر آنزیم، به مدت 5 دقیقه گرمخانهای شدن انجام شد. برای شروع واکنش، 20 میکرولیتر از سوبسترای پارا-نیترو فنیل فسفات (p-NPP) 6 میلیمولار، به مخلوط واکنش اضافه گردید. پس از 30 دقیقه گرمخانهای کردن در دمای 45 درجه سانتیگراد برای توقف واکنش 50 میکرولیتر محلول سود 1/0 مولار به مخلوط فوق اضافه شد. آنگاه میکروپلیت درون دستگاه میکروپلیتخوان قرارگرفته، جذب آن در طول‌موج 405 نانومتر، قرائت گردید. تمام سنجشها با سه بار تکرار انجام شدند. همچنین برای سنجشهای هر میکروپلیت، از کنترل منفی استفاده گردید. در چاهک کنترل منفی بجای عصاره از بافر فسفات استفاده شد. پس از پایان سنجش، جذب پلیت خالی از جذب چاهکهای متناظر، کسر شد و سپس با تفریق جذب چاهک بلانک از جذب چاهک تست، جذب نهایی محاسبه گردید. سرعت واکنش بر اساس شیب نمودار جذب علیه زمان محاسبه شد. با استفاده از رابطۀ زیر درصد مهار فیتاز بهوسیله عصاره بدست آمد. در این معادله عدد منفی بدست آمده نشاندهنده فعالکنندگی و عدد مثبت نشاندهنده مهارکنندگی عصاره متانولی میباشد. تحلیل دادهها با استفاده از نرمافزار اکسل انجام شد.
100×{(شیب کنترل منفی)/(شیب عصاره-شیب کنترلمنفی)}=درصدمهار
جدول 1. تأثیرات فعالکنندگی یا مهارکنندگی فیتاز، توسط عصاره متانولی گیاهان مختلف.
|
ردیف |
نام علمی گیاه |
خانواده |
درصد فعالکنندگی و مهارکنندگی |
||||||||||
|
غلظت‌های عصاره متانولی هرگیاه (گرم/لیتر) |
|||||||||||||
|
001/0 |
01/0 |
1/0 |
1 |
||||||||||
|
1 |
Alcea kurdica (Flowers) |
Malvaceae |
32/17 |
23/27 |
19/3 |
00/0 |
|||||||
|
2 |
Alcea kurdica (Leaves) |
Malvaceae |
85/1 |
94/7 |
17/6 |
06/17 |
|||||||
|
3 |
Allium stipitatum Boiss. |
Alliaceae |
96/2 |
00/0 |
86/5 |
17/29 |
|||||||
|
4 |
Asperugo procumbens L. |
Boraginaceae |
15/16- |
00/15- |
04/8- |
93/3- |
|||||||
|
5 |
Astragalus caraganae Hohen. |
Papilionaceae |
78/33- |
17/55- |
81/45- |
22/0 |
|||||||
|
6 |
Astragalus caryolobus Bge |
Papilionaceae |
09/8 |
66/9 |
30/0 |
14/11 |
|||||||
|
7 |
Astragalus cyclophyllon G.Beck |
Papilionaceae |
07/9 |
52/9 |
62/1 |
44/18 |
|||||||
|
8 |
Astragalus glumaceus (Leaves) |
Fabaceae |
03/3- |
16/3 |
85/48 |
68/24 |
|||||||
|
9 |
Astragalus siliquosus Boiss.subsp.siliquosus |
Papilionaceae |
50/5 |
06/3 |
95/3 |
34/19 |
|||||||
|
10 |
Campanula involucrata Auch.ex DC. |
Campanulaceae |
27/15 |
00/0 |
60/15 |
41/45 |
|||||||
|
11 |
Centaurea Behen L. |
Asteraceae |
76/22- |
88/25- |
87/19- |
38/5 |
|||||||
|
12 |
Chaerophyllum macropodum Boiss. |
Apiaceae |
29/29- |
67/11- |
59/13- |
05/8 |
|||||||
|
13 |
Conium maculatum L. |
Apiaceae |
25/31- |
86/26- |
26/81- |
25/25- |
|||||||
|
14 |
Crambe orientalis L. |
Brassicaceae |
19/20- |
97/15- |
83/11- |
78/8- |
|||||||
|
15 |
Cruciata taurica (Pall.ex Willd) Ehrend |
Rubiaceae |
6/85- |
91/7- |
89/7 |
35/46 |
|||||||
|
16 |
Descurainia sophia (L.) Webb & Berth. |
Brassicaceae |
81/16- |
69/9- |
66/8- |
47/27 |
|||||||
|
17 |
Eremostachys macrophylla Montbr. & Auch |
Lamiaceae |
30/3- |
95/0 |
11/2- |
58/12 |
|||||||
|
18 |
Euphorbia denticulate Lam. |
Euphorbiaceae |
94/41- |
26/22- |
39/38- |
67/58- |
|||||||
|
19 |
Ferula haussknechtii Wolff ex Rech. |
Apiaceae |
70/1- |
43/18- |
72/16- |
83/35 |
|||||||
|
20 |
Fumaria vaillantii Loisel. |
Fumariaceae |
27/19 |
35/2 |
70/11 |
54/32 |
|||||||
|
21 |
Heptaptera anatolica (Boiss.) Tutin |
Apiaceae |
40/11 |
38/7 |
55/2 |
44/47 |
|
||||||
|
22 |
Hypericum scabrum L. |
Guttiferae |
85/58- |
87/40- |
76/42- |
52/23 |
|
||||||
|
23 |
Leontice leontopetalum L. |
Podophyllaceae |
70/5 |
50/11 |
02/4 |
92/28 |
|
||||||
|
24 |
Linum album Ky.ex Boiss. |
Linaceae |
51/51- |
71/51- |
35/51- |
29/37- |
|
||||||
|
25 |
Linum glaucum Boiss.& Noe |
Linaceae |
98/34 |
85/1 |
42/3 |
10/13 |
|
||||||
|
26 |
Marrubium cuneatum Russell |
Lamiaceae |
90/4 |
47/4 |
16/12 |
28/22 |
|
||||||
|
27 |
Nonea hypoleia Bornm. |
Boraginaceae |
46/2 |
68/6- |
00/14- |
75/23 |
|
||||||
|
28 |
Pedicularis sibthorpii Boiss |
Scrophulariaceae |
00/0 |
91/2 |
19/13 |
35/56 |
|
||||||
|
29 |
Peganum harmala L.var. harmala |
Zygophyllaceae |
17/24 |
44/2 |
00/0 |
12/11 |
|
||||||
|
30 |
Phlomis persica Boiss. |
Lamiaceae |
89/1 |
49/8 |
75/12 |
10/57 |
|
||||||
|
31 |
Rindera lanata (Lam.) Bge. |
Boraginaceae |
83/44- |
91/66- |
18/29- |
98/20- |
|
||||||
|
32 |
Saccharum ravennae |
Poaceae |
60/21- |
33/16- |
22/8- |
34/45 |
|
||||||
|
33 |
Scorzonera calyculata Boiss. |
Asteraceae |
16/11- |
75/19- |
50/2 |
28/32 |
|
||||||
|
34 |
Silene commelinifolia Boiss. |
Caryophyllaceae |
30/44- |
21/27- |
11/38- |
14/47 |
|
||||||
|
35 |
Silene latifolia Poir. |
Caryophyllaceae |
14/13- |
77/8- |
78/6- |
13/9- |
|
||||||
|
36 |
Solenanthus circinatus Ledeb. |
Boraginaceae |
78/3 |
47/4- |
18/2 |
99/68 |
|
||||||
|
37 |
Stroganowia persica Busch |
Brassicaceae |
93/24- |
63/17 |
50/22- |
96/14 |
|
||||||
|
38 |
Stachys lavandulifolia Vahl |
Lamiaceae |
55/34 |
36/10 |
05/16 |
20/69 |
|
||||||
|
39 |
Valeriana sisymbriifolia Vahl |
Valerianaceae |
89/45- |
07/52- |
84/42- |
05/26- |
|
||||||
|
40 |
Veronica orientalis Miller |
Scrophulariaceae |
28/9- |
96/18- |
93/30- |
71/5 |
|
||||||
|
41 |
Vicia hyrcanica Fisch. & C. A. Mey. |
Papilionaceae |
99/2- |
28/17- |
34/19- |
96/5 |
|
||||||
نتایج سنجش اولیه فعالیت آنزیمی فیتاز و تعیین پارامترهای سنتیکی فیتاز: نمودار تغییرات سرعت اولیه واکنش فیتاز در مقابل تغییرات غلظت‌های مختلف سوبسترا تا غلظت 6 میلیمولار، دارای شکل سهمی راست‌گوشه بود که نشاندهنده پیروی رفتار فیتاز از مدل میکائیلیس– منتن است (تصویر 1). در غلظت‌های بالاتر از این مقدار سرعت اولیه واکنش شروع به کاهش مینمود که نشانگر نوعی مهار توسط سوبسترا میباشد. با استفاده از رویکردهای خطی مانند رویکرد لاینویوور– برک، مقدار Km برابر با 1/0 میلیمولار، و مقدار Vmaxبرابر با 9/0 میلیمولار در دقیقه تعیین شدند (تصویر 2). بر اساس نتایج این بخش از مطالعات غلظت 6 میلیمولار از سوبسترا برای سنجش اثرات فعالکنندگی یا مهارکنندگی عصارههای گیاهی برای فعالیت آنزیم فیتاز انتخاب شد.
تصویر 1. تغییرات سرعت واکنش فیتاز در مقابل سوبسترای پارانیترو فنیل فسفات.
تصویر 2. نمودار معکوس مضاعف (لاینویور-برک) برای واکنش فیتاز در مقابل سوبسترای پارانیترو فنیل فسفات.
نتایج سنجش اثر عصارهها بر روی فعالیت آنزیم فیتاز: در میان گیاهانی که بدین روش بررسی شدند، آن‌هایی که اثرِ مهارکنندگی و فعالکنندگی بالاتر از 50 درصد داشتهاند، به عنوان گیاهان دارای اثرِ مهارکنندگی و فعالکنندگی قوی طبقهبندی شدند. در این میان چهار گیاه Pedicularis sibthorpiiBoiss (در غلظت1 میلیگرمدرمیلیلیتر؛ 35/56 درصد)، PhlomispersicaBoiss (در غلظتِ1 میلیگرمدرمیلیلیتر؛ 10/57 درصد)، SolenanthuscircinatusLedeb (در غلظتِ1 میلیگرمدرمیلیلیتر؛ 99/68 درصد)، Stachys lavandulifoliaVahl (در غلظت1 میلیگرم در میلیلیتر؛ 20/69 درصد)، اثر مهارکنندگی بالای 50 درصد، از خود نشان دادند (جدول 1).
همچنین شش گیاه Astragalus caraganae Hohe(در غلظت 01/0 میلیگرمدرمیلیلیتر؛ 17/55- درصد)، Hypericum scabrum L (در غلظت 001/0 میلیگرمدرمیلیلیتر؛ 85/58- درصد)، Linum album Ky.ex Boiss (در غلظت‌های 1/0، 01/0 و 001/0 میلیگرمدرمیلیلیتر، به ترتیب 35/51- درصد 71/51- درصد و 51/51- درصد)، Valeriana sisymbriifolia Vahl (در غلظت 01/0 میلیگرمدرمیلیلیتر؛ 07/52- درصد)، Euphorbia denticulate Lam (در غلظت 1 میلیگرمدرمیلیلیتر؛ 67/58- درصد)، Rindera lanata (Lam.)Bge (در غلظت 01/0 میلیگرمدرمیلیلیتر؛ 91/66- درصد) ، اثر فعالکنندگی بالای 50 درصد از خود نشان دادند (جدول 1). نتایج مربوط به سایر گیاهان و سایر غلظت‌های کارشده به‌طور کامل در جدول (1) آمده است.
بحث
آنزیم فیتاز اغلب در بذر و دانه گرده گیاهان عالی از قبیل غلات، دانههای روغنی و مغزدارها یافت شده و به میزان کمتر در ریشه گیاهان وجود دارد (12). فعالیت فیتازی در موقع جوانه زدن بذر و دانه گرده به کار می‌آید. در بذر گیاهان به هنگام جوانه زدن فعالیت فیتازی افزایش سریعی نشان می‌دهد (9). بیشترین فعالیت فیتازی در غلاتی چون چاودار، جو و گندم از 100 تا 7000 واحد فعالیت در کیلوگرم، گزارش شده است (26).
جانوران تک معدی از قبیل خوک، طیور و ماهی به دلیل فقدان فیتاز در سیستم گوارشی خود قادر به استفاده از فیتات موجود در جیره غذایی خود نمی‌باشند؛ بنابراین برای تأمین فسفات معدنی موردنیاز، آنزیم فیتاز به جیره آن‌ها افزوده می‌شود. از طرفی افزودن فسفر به جیره، به‌صورت معدنی و قابل‌جذب دارای اثرات زیان‌بارتری بوده و گزینه مناسبی نیست (2،19). همچنین هزینه زیاد تخلیص فیتاز و افزودن آن به جیره غذایی خود یکی دیگر از مشکلات است (22). نکته قابل‌توجه آن است که زمان کم حضور فیتات در سیستم گوارشی پرندگان و محدودیت pH حاکم بر سیستم گوارشی آن‌ها، اجازه تجزیه کامل را به آن نخواهد داد و فیتازهای افزودنی تنها قادر به تجزیه 35 درصد فیتات جیره خواهند بود (25).
از روشهای مختلفی برای سنجش فعالیت فیتاز استفاده شده است و مقادیر Km گزارش شده برای آن‌ها از 10 تا 650 میکرومولار متغییر است. فیتازهای گیاهی نیز از نظر سنتیک تفاوت قابل‌توجهی نشان میدهند. در این پژوهش از روش میکرو برای سنجش و تعیین پارامترهای سنتیکی استفاده شده است و مقدار Km تعیین‌شده (100 میکرومولار) در محدوده مقادیر گزارش شده برای فیتازهای گیاهی است که Km آن‌ها از 30 تا 300 میکرومولار متغیر میباشد (18).
هزینه زیاد تخلیص و تجاریسازی آنزیمها و از دست دادن فعالیت مناسب ویژه میتواند یکی از مشکلات افزودن آنزیم فیتاز به غذای جانوران باشد. از طرف دیگر استفاده از فیتاز با منشأ گیاهی در جیره غذایی جانوران تک معده‌ای از قبیل خوک، طیور، ماهی و همچنین شناسایی عوامل دارای اثر فعالکنندگی یا مهارکنندگی فعالیت آنزیم فیتاز که افزودن (برای فعالکننده) یا حذف (برای مهارکننده) منابع گیاهی آن‌ها از جیره غذایی میتواند باعث افزایش فعالیت فیتازی، جذب فسفر و کم کردن اثرات زیان‌بار آن و کاهش هزینه مربوط به افزودن آنزیم به جیره غذایی جانوران شود. در همین راستا و برای اولین بار با توجه به نتایج این پژوهش (جدول 1) در میان گیاهان غربالگری شده چهار گیاه دارای خاصیت مهارکنندگی و شش گیاه دارای خاصیت فعالکنندگی بالایی 50 درصد بر روی فعالیت فیتاز بودند. افزودن گیاهان دارای اثر فعالکنندگی یا عصاره آن‌ها به جیره غذایی میتواند یک‌راه تشدید فعالیت فیتاز موجود در منابع گیاهی جیره غذایی بوده و یک راه‌حل با منشاء طبیعی باشد. همچنین میتوان با حذف گیاهانی دارای خاصیت مهارکنندگی از جیره غذایی باعث افزایش فعالیت فیتاز طبیعی موجود در گیاهان و دانههای آن‌ها شد. موارد فوق طبعاً نیاز به تحقیقات بیشتر و پژوهشهای در همین راستا دارد. لازم به ذکر است که غربالگری عصاره متانولی گیاهان و اثر مهاری یا فعالکنندگی گونههای گیاهی ذکرشده در این مطالعه بر روی آنزیم فیتاز برای اولین بار بررسی‌شده و مطالعه مشابهی تاکنون صورت نگرفته است.
نتیجهگیری نهایی: نتایج این پژوهش نشان داد که چهار گیاه Pedicularis sibthorpii Boiss، Phlomis persicaBoiss، Solenanthus Circinatus Ledeb، Stachys lavandulifoliaVahl، فعالیت مهارکنندگی؛ و شش گیاه Astragalus caraganaeHohe، Hypericum scabrumL، Linum albumKy.ex Boiss، Valeriana sisymbriifolia Vahl، Euphorbia denticulate Lam، Rindera lanata(Lam.)Bge، فعالیت فعالکنندگی بالایی 50 درصد را بر روی آنزیم فیتاز داشتهاند. لذا جداسازی و خالصسازی عوامل بالقوه مؤثر در این گیاهان و تأثیر آن‌ها بر روی فیتاز میتواند موضوع مناسبی برای پژوهشهایی آینده باشد.
نویسندگان، بدینوسیله از آقای مهندس حسین معروفی عضو هیئت‌علمی مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان کردستان به دلیل کمکهای کارشناسی در جمعآوری و شناسایی علمی نمونههای گیاهی، صمیمانه تشکر و قدردانی می‌نمایند.
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
)
