A Study of the Effect of Organic Zinc Supplementation on Glucose Metabolism and Insulin Resistance Indices in Early Lactation Ewes

Document Type : Large Animal Health Management

Authors

1 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine, Urmia University, Urmia, Iran

2 Department of Internal Medicine and Clinical Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Urmia University, Urmia, Iran

3 Department of Animal Sciences, Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia, Iran

Abstract

BACKGROUND: The decreases in insulin sensitivity and extensive perinatal lipolysis are common causes of metabolic diseases related to energy metabolism in ewes.
OBJECTIVES: The present study was designed to study the effect of organic zinc on glucose metabolism and insulin resistance indices in early lactating ewes.
METHODS: 18 Ghezel ewes were divided into three groups based on organic zinc supplementation, including CTR: (basal diet without Zinc), LZn: (basal diet supplemented with 30 mg Zn/kgDM) and group 3, HZn: (basal diet supplemented with 300 mg Zn/kgDM).
RESULTS: The results of this study showed no significant differences between the experimental groups in glucose, NEFAs, BHB, cholesterol, triglyceride, and insulin concentrations. Furthermore, the effect of zinc on the insulin to glucose ratio was not significant among the experimental groups (p < /em>>0.05). Supplementation of zinc-methionine significantly increased serum zinc concentration in ewes (p < /em><0.001). The area under the curve (AUC60, AUC120) was the highest for the control group and LZn and the lowest for HZn group (p < /em><0.05). The rate of glucose clearance in zinc-methionine supplement recipients was higher compared to the control group. The time to reach half maximal glucose concentration in zinc treated ewes was significantly lower than that of the control group (p < /em><0.001), indicating an improvement in insulin sensitivity and glucose metabolism.
CONCLUSIONS: Our findings indicate that Zinc is effective in improving the NEB and preventing insulin resistance in early lactation. It is possible that in sheep, the tissue responsiveness to insulin is enhanced with dietary Zn supplementation, and present findings suggest that dietary Zn-Met may improve energy balance and insulin resistance in lactating ewes.

Keywords

Full Text

مقدمه


تولید شیر بلافاصله پس از زایمان یکی از فاکتورهای خطر بروز توازن منفی انرژی در نشخوارکنندگان محسوب می‌شود. این روند توازن منفی به همراه پایین بودن میزان خوراک مصرفی در اوایل شیرواری به دلیل وضعیت فیزیولوژیک خاص حیوان در این دوره و دریافت جیره‌های نامتعادل از نظر محتوای فیبر، انرژی و مواد معدنی خطر ابتلا به ناهنجاری‌های متابولیکی را افزایش می‌دهد. افزایش اسیدهای چرب غیراستریفیه یک معیار اندازه­گیری مقدار تجزیه چربی‌ها در بافت‌های چربی یا متابولیسم چربی بدن در شرایط توازن منفی انرژی می‌باشد. توالی رخدادها شامل کاهش گلوکز و انسولین، افزایش متابولیسم چربی و بالا­ رفتن اسیدهای چرب غیراستریفیه خون می‌باشد. فرکانس‌های سیری ایجاد شده توسط اکسیداسیون کبدی اسیدهای چرب غیراستریفیه که توسط عصب واگ به مراکز سیری هیپوتالاموس انتقال می‌یابد، می‌تواند به عنوان مکانیسم غالب کنترل کننده میزان خوراک مصرفی در دوره انتقال تبدیل شود (3). بنابراین می‌توان گفت کنترل سرعت لیپولیز، کارایی اکسیداسیون اسیدهای چرب در کبد و طول مدت قرارگیری حیوان در تعادل منفی انرژی و وضعیت لیپولیتیک، می‌تواند عاملی اساسی در کاهش بروز ناهنجاری‌های متابولیکی باشد (3،34).

وضعیت لیپولیتیک چند هفته قبل از زایش با کاهش همزمان غلظت انسولین پلاسما و کاهش حساسیت بافت چربی و عضله به انسولین شروع شده و تا چندین هفته پس از زایش ادامه دارد (15). کاهش حساسیت بافت‌ها به انسولین احتمالاً توسط افزایش تدریجی هورمون رشد، افزایش سیتوکین‌های پیش التهابی نظیر فاکتور نکروز توموری آلفا (TNF-α) حاصل از جفت و بافت چربی و افزایش غلظت اسیدهای چرب غیر­ استریفیه (NEFA) پلاسما ایجاد می‌شود. سیگنال‌های مربوط به آبستنی و یا شیرواری، لیپولیز را برای عرضه NEFA به عنوان یک سوخت برای کبد و بافت‌های خارج کبدی آغاز می‌کنند و از این طریق در مقدار گلوکز مورد نیاز برای تولد جنین و یا تولید شیر صرفه جویی می‌کنند (11).

برداشت NEFA توسط کبد با غلظت آن‌ها درخون متناسب است. غلظت بیش از حد تری گلیسیرید کبدی نتیجه افزایش NEFA خون است که به اختلال در وظایف کبد و کاهش گلوکونئوژنز و بنابراین کاهش بهبود غلظت‌های گلوکز و انسولین خون به حالت طبیعی منجر می‌شود که وضیعت لیپولیتیک را بیشتر توسعه می‌دهد (1). به علت اینکه کبد نشخوارکنندگان ظرفیت محدودی برای خروج ‌تری گلیسرید به صورت لیپوپروتئین‌های با چگالی بسیار پایین دارد (9)؛ بنابراین محدود کردن لیپولیز هدف اصلی انتقال موفقیت­آمیز از دوره آبستنی به دوره شیردهی است. از این رو تنظیم دقیق متابولیسم گلوکز و چربی در بدن دام به منظور سازگاری متابولیک در این دوره ضروری است. مقاومت انسولینی یا عدم پاسخ بهینه بافت­های هدف به انسولین، یکی از سازگاری‌های مهم نشخوارکنندگان در دوره انتقال است. همان­طوری‌که در بالا اشاره شد ایجاد مقاومت انسولینی خفیف در دوره انتقال می‌تواند گلوکز، اسیدهای آمینه و اسیدهای چرب بیشتری را در اواخر آبستنی به جفت و در اوایل زایش به غدد پستانی سوق دهد؛ اما مقاومت انسولینی شدید می‌تواند با ایجاد اختلال در تنظیم فرایندهای طبیعی بافت چربی، منجر به بالا رفتن غیرطبیعی اسیدهای چرب غیر استریفیه در خون شود (12). استراتژی‌های تغذیه‌ای ممکن است بتواند با بهبود حساسیت انسولینی، فراخوانی چربی را از ذخایر بدنی محدود کرده و وقوع بیماری‌های متابولیکی مرتبط با متابولیسم انرژی دوره انتقال را کاهش دهد.

روی به عنوان یک عنصر ضروری برای عملکرد بسیاری از آنزیم‌های دخیل در تقسیم سلولی و سنتز DNA و پروتئین لازم است. کاهش سطح سرمی روی باعث اختلال‌های متعددی می‌شود که از بین عوارض درون ریز آن می‌توان به هیپوگنادیسم و اختلال تحمل گلوکز اشاره کرد. عنصر روی برای سنتز، ذخیره­سازی و ترشح انسولین ضروری است. با کاهش سطح روی سرم، کاهشی در ترشح انسولین و حساسیت بافت‌های محیطی به انسولین دیده می‌شود. مطالعات اخیر نقش روی را به عنوان یک پیامبر ثانویه داخل سلولی در کنترل سیگنالینگ انسولین و تنظیم گلوکز خون برجسته کرده است (26). استفاده از ترکیبات روی در علم پزشکی نوین به منظور درمان کمبود روی و نیز برای بهبود کاهش روی در بیماری دیابت نوع یک در سال‌های اخیر توجه بسیاری از متخصصین تغذیه را به خود جلب کرده است. نتایج به دست آمده از بررسی­های متعدد، دسترسی زیستی بالای منابع آلی روی را در مقایسه با ترکیبات غیر آلی آن و نیز ذخیره­سازی بهتر این منابع را در بدن نشان می­دهند (27،38،41). لذا تحقیق حاضر با هدف مطالعه اثر استفاده از روی آلی (Zn-Met) بر متابولیسم گلوکز و شاخصه‌های مقاومت به انسولین در میش‌های اوایل دوره شیرواری طراحی شده است.

مواد و روش‌کار

این پژوهش در گوسفندداری دانشکدة کشاورزی دانشگاه ارومیه انجام شد. همه میش­ها دو هفته پیش از قوچ­ اندازی به روش سیدرگذاری (CIDR; Eazi-Breed CIDR; Pharmacia and Upjohn Pty Limited, Rydalmere, Australia) و تزریق عضلانی 400 واحد هورمون (PMSG, Intervet Inc., Millsboro, DE) همزمان فحل و به صورت کنترل شده قوچ اندازی شدند.

در این تحقیق 18 رأس میش آبستن نژاد قزل با میانگین وزن 7±61 کیلوگرم، جهت عادت پذیری با شرایط آزمایش، محیط و جیره از 4 هفته مانده به تاریخ احتمالی زایمان بطور تصادفی در 3 گروه (هر گروه 6 راس) و در جایگاه­های انفرادی قرار گرفتند.

دوره اصلی آزمایش در این مطالعه بلافاصله پس از زایمان میش­ها شروع شده و به مدت 3 هفته ادامه داشت. میزان احتیاجات غذایی دوره آبستنی و شیرواری میش‌ها براساس جداول (2007) NRC, تنظیم و به صورت تغذیه آزاد (2 درصد باقیمانده خوراک)، روزانه در دو وعده صبح و عصر در اختیار میش­ها قرار ‌گرفت (جدول ‏1)، (29). جیره­های آزمایشی از نظر تمام مواد مغذی یکسان بوده و فقط مقادیر مختلف روی (Zn) از منبع آلی روی؛ زینک-متیونین (Zn-Met)، ZnM, Zinpro; Corporation, Eden Prairie, MN, USA)) از شرکت سنا دام پارس تهیه و به آن­ها افزوده شد. بر این اساس گروه‌های مورد آزمایش به صورت زیر تعریف شدند؛

گروه (1): جیره پایه (TMR) بدون افزودن روی (روی به میزان صفر میلی­گرم به ازای کیلوگرم ماده خشک) = (CTR)، گروه (2): جیره پایه به همراه مکمل روی به میزان احتیاجات (روی به میزان 30 میلی­گرم به ازای کیلوگرم ماده خشک خوراک) = (LZn) و گروه (3): جیره پایه به همراه مکمل روی با میزان بالا (روی به میزان 300 میلی­گرم به ازای کیلوگرم ماده خشک خوراک) = (HZn).

میزان روی جیره پایه در حد 3 میلی­گرم به ازای ماده خشک خوراک توسط جیره تأمین و با استفاده از روش جذب اتمی تأیید شد. میزان احتیاجات میش براساس توصیه­های (2007) NRC تعیین شد (29). خونگیری از دام‌ها بصورت هفتگی و 3 ساعت پس از مصرف خوراک وعده صبح در روزهای صفر، 7، 14 و 21 پس از زایمان انجام گرفت. نمونه‌های خون بدون ماده ضد انعقاد پس از انتقال به آزمایشگاه، به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شده (با سرعت 3500 دور در دقیقه) و سرم آن­ها جدا گردید. نمونه­های سرم جهت ارزیابی روی (Zn)، گلوکز، اسیدهای چرب غیر استریفیه (NEFA)، بتا هیدروکسی بوتیرات (BHB)، تری‌گلیسیرید، کلسترول و انسولین تا زمان اندازه­گیری، در دمای 20 - درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. پس از 21 روز از شروع درمان، با تزریق سرم دکستروز 50 درصد بر اساس پروتوکل­های استاندارد (24) میزان شاخص­های مقاومت به انسولین شامل؛ مساحت سطح زیر منحنی (Area under the curve)، (AUC) تا دقیقه 60 و 120 (AUC60, AUC120)، نرخ پاکسازی گلوکز، زمان رسیدن به سطح پایه و زمان لازم برای رسیدن غلظت به نصف توسط آزمون تحمل گلوکز (IVGGT) انجام گرفت.

به طور خلاصه آزمایش تحمل گلوکز درون وریدی با تزریق گلوکز (25/0 گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن با استفاده از سرم دکستروز 50 درصد با سرعت 5-4 میلی­لیتر در دقیقه) انجام گرفت. متعاقب تزریق گلوکز نمونه‌های خون به صورت پیوسته از 15 دقیقه قبل از شروع تزریق تا 3 ساعت پس از آن جمع‌آوری شد. خونگیری متعاقب تزریق درون وریدی گلوکز در زمان‌های 15-، 0، 5، 10، 15، 20، 25، 30، 45، 60، 75، 90، 120، 150 و 180 نسبت به زمان تزریق انجام گرفت.

غلظت بتاهیدروکسی بوتیرات (BHB) و اسیدهای چرب غیراستریفیه (NEFA) سرم با استفاده از کیت‌های تجاری (Randox Laboratories Ltd, Ardmore, UK) اندازه­گیری شدند. در نمونه­های سرم ذخیره شده، گلوکز، تری گلیسرید، کلسترول و روی با استفاده ازکیت­های تجاری (شــرکت پارس آزمون، ایران) و با استفاده از آنالایزر بیوشیمی (Technicon, RA-1000, Tarry town, USA)، و انسولین با استفاده از کیت تجاری (Insulin AccuBind® ELISA; Monobind Inc. Lake Forest, USA) و به روش آنزیم ایمنواسی (ELISA, Biotek-Eon reader plate) مورد سنجش قرار گرفتند. میزان روی خوراک به روش طیف سنج جذب اتمی مجهز به سیستم کوره گرافیتی (Shimadzu AA6800, Tokyo, Japan) اندازه گیری شد.

آزمایش تحمل گلوکز وریدی (IVGTI) در روز 21 آزمایش انجام شد. پس از اندازه‌گیری گلوکز در خون داده‌های مربوط به آن در نرم افزار 1/9 SAS مورد بررسی قرار گرفت. از رویه NLIN برای پردازش منحنی‌های گلوکز در مدت ۶٠ دقیقه آزمایش تحمل گلوکز با استفاده از فرمول زیر استفاده شد (19).

F(t) = A × e (-k×t)

در این معادله F(t) غلظت متابولیت در زمان t می‌باشد. A بیشترین مقدار گلوکز می‌باشد. K هم ضریب تابعیت را تشکیل می­دهد. هر دو برآورد A و K محاسبه شد. نرخ پاکسازی که مشخص کننده سرعت پاک شدن از خون است به صورت زیر محاسبه شد (19):

Clearance rate (CR; ٪/min) ={(ln[ta] − ln[tb])/(tb − ta)} × ١٠٠

نیمه عمر یا زمان رسیدن به نصف حداکثر غلظت از فرمول زیر محاسبه می‌گردد (19):

(T1/2; min) = {[ln(2)]/CR} × 100)

در معادلات بالا [ta] غلظت متابولیت در زمان (ta) و  [tb] غلظت متابولیت­ها در زمان (tb) می‌باشد. مساحت زیر منحنی از گلوکز با (AUC) نشان داده می­شود. پس از رسم منحنی گلوکز این شاخص با استفاده از مساحت ذوزنقه و جمع مقادیر ۶٠ دقیقه اول و دوم (AUC60, AUC120) محاسبه شد. مقدار گلوکز پایه بر اساس مقادیر زمان‌های ١۵ –محاسبه شد. بیشترین مقدار گلوکز بر اساس مقادیر اولین خونگیری پس از تزریق در نظر گرفته شد.

طرح آماری مورد استفاده: داده­ها با طرح تصادفی با اســتفاده از مدل خطی عمومی (MIXED) نرم افزار SAS نسخه 1/9 تجزیه و تحلیل شد. اندازه‌گیری‌های مکرر از Mixed برای داده‌ها (گلوکز و انسولین پلاسما در طول IVGTT) که در رابطه با زمان ســاخته شده بودند (رویه داده­های تکرار شونده در زمان) استفاده شد. حداقل مربعات محاســبه شــد و برای تفاوت­ها آزمون LSM مــورد آزمایش قرار گرفت. تفاوت­های معنی‌دار بین تیمارها در سطح (05/0>P) در نظرگرفته شد.

نتایج

میانگین و خطای استاندارد متابولیت­های خون در سه گروه از میش­های شیروار در 3 هفته ابتدای شیرواری در جدول ‏2 نشان داده شده است.

در مطالعه حاضر استفاده از روی آلی (Zn-Met) تأثیری بر میزان شاخص­های مرتبط با انرژی شامل؛ مقادیر گلوکز، اسیدهای چرب غیر استریفیه، بتاهیدروکسی بوتیرات، کلسترول و تری‎گلیسرید و نیز عیار انسولین و مقادیر روی سرم خون میش­های مورد مطالعه نداشت (05/0P>). با این‎حال تمایل عددی به کاهش غلظت NEFA و BHB در گروه­های تحت درمان با Zn-Met دیده می­شود (جدول ‏2). همچنین در این جدول کاهش معنی­دار مقادیر NEFA و BHB در تمام گروه­ها با افزایش تعداد روزهای شیرواری مشهود است (001/0>P).

مقادیر گلوکز پلاسما با درمان، زمان و اثرات متقابل زمان و درمان تحت تأثیر قرار نگرفت. همچنین اثر روی بر نسبت انسولین به گلوکز در بین گروه­های آزمایشی غیر معنی­دار بود (05/0<P).

غلظت انسولین خون نیز با درمان، زمان و اثرات متقابل زمان و درمان تحت تأثیر قرار نگرفت (05/0<P). تجویز Zn-Met به صورت خوراکی و روزانه، افزایش معنی­داری (001/0>P) را در غلظت روی سرم خون میش­های دریافت کننده مکمل ایجاد نمود، که در گروه HZn بیشتر از گروه LZn بود (جدول ‏2).

متعاقب انفوزیون وریدی گلوکز (IVGGT) مقادیر پایه گلوکز (زمان 15- دقیقه) در گروه کنترل از 45/17±69 به 45/5±17/76 در دقیقه 150 پس از تزریق رسید. مقادیر گلوکز به لحاظ عددی در گروه­های تحت درمان با روی نسبت به گروه کنترل کمتر بود. مساحت سطح زیر منحنی (AUC60, AUC120) برای گروه کنترل و LZn بیشترین و برای گروه HZn کمترین مقادیر را نشان داد (05/0>P) (جدول ‏3).

نرخ پاکسازی گلوکز در میش­های دریافت کننده مکمل Zn-Met نسبت به گروه کنترل از مقادیر بیشتری حمایت می­کرد (001/0>P) (جدول ‏3). زمان لازم برای رسیدن غلظت به نصف در میش­های دریافت کننده مکمل روی به­طور معنی­داری کمتر از گروه کنترل بود (001/0>P) (جدول ‏3).

همان­طور که در نمودار ‏1 مشاهده می­شود به استثنای گروه LZn، غلظت گلوکز تا دقیقه 150 پس از تزریق گلوکز به حد پایه نرسیده است. این شاخص در گروه LZn در دقیقه 90 پس از تزریق درون وریدی گلوکز بدست آمده است (نمودار ‏1).

به عبارت بهتر نتایج حاصل از تجزیه آماری نشان داد که غلظت گلوکز پایه قبل از IVGTT در تیمار­هایی که روی دریافت می­کردند نسبت به گروه کنترل تفاوت معنی­داری نداشت (05/0<P)، (نمودار ‏1). نرخ پاکسازی گلوکز توسط مکمل روی، بهبود یافته و منجر به نرخ پاکسازی بالاتر و منجر به زمان کوتاه­تر برای رسیدن به نصف حداکثر غلظت گلوکز و زمان برای رسیدن به سطح پایه گردید (جدول ‏3) (نمودار ‏1).

بحث

 در بررسی حاضر بـا تـوجه به اینکه میش­ها در شرایط نسبتاً خوبی نگهداری مـی­شـدند و جیـرة آن­هـا شامل علوفه با کیفیت مناسب (یونجه خشـک) و کنسانتره مرغوب بود، علائمی از مسمومیت آبستنی در میش­های مـورد آزمـایش دیـده نشـد، میـزان گلوکـز خـون بین سه گروه تفاوت معنی‌داری نداشت، بنابراین میش­ها در تمامی گروه­های مورد مطالعه توانسته بودند گلوکز که سوخت اصلی جنین مـی­باشـد را تأمــین کنــند. در بررسی­های دیگر نیز میش­هایی که در شـرایط نامناسب غـذایی قرار داشتند، توانسـته بودند با صـرفه جویی گلوکز و تکیه بیشتر به پیش ماده­های گلوکزساز از منابعی غیر از جیره (به طور عمده امینواسیدهای داخلی) گلوکز خون را ثابت نگه داشته و مقادیر مورد نیاز برای جنین یا تولید شیر را تأمین کنند (31).

در مطالعه حاضر با افزایش تعداد روزهای شیرواری سطح NEFA و BHB خون روند کاهشی دارد. پیشتر به اثرات مهاری اسیدهای چرب آزاد روی مصرف گلوکز اشاره شده است. اسیدهای چرب آزاد می‌توانند غلظت گلوکز پلاسما را با تحریک گلوکونئوژنز از طریق مکانیسم­های مختلفی افزایش دهند که شامل، افزایش بروز ژن آنزیم­های گلوکونئوژنیک، افزایش اکسیداسیون کبدی FFAs  که منجر به افزایش تولیدNADH ، استیل­کوآ و ATP می­شود و نیز القای مقاومت به انسولین می­باشد (40). هرچند که مقادیر بالای اسیدهای چرب غیراستریفیه در ابتدای زایمان تأثیری بر میزان گلوکز و یا انسولین میش­های مورد مطالعه نداشت. با این حال با کاهش مقادیر NEFA، افزایش عددی مقادیر انسولین سرم خون دیده می­شود. در این رابطه در مطالعه­ای روی گاوهای شیری حوالی زایمان، Kerestes و همکاران در سال 2009 نشان دادند که غلظت اسیدهای چرب غیر استریفیه به طور معنی­داری با ترشح کمتر انسولین در ارتباط است (25). مطالعات دیگر نیز کاهش ظرفیت ترشحی انسولین از پانکراس با افزایش سطح NEFA در گاوهای شیری را نشان دادند (6). بنابراین، این احتمال وجود دارد که در مطالعه حاضر کاهش غلظت FFAs در دوره پس از زایمان منجر به افزایش ترشح انسولین از پانکراس شده باشد.

مطالعات متعددی نشان داده­اند که عنصر روی نقش مهمی در سنتز، ذخیره‌سازی، ترشح و بهبود عملکرد انسولین دارد و کمبود آن با مقاومت به انسولین مرتبط است (28). γ PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) یکی از گیرنده­های داخل هسته­ای می‌باشد که عمدتاً در بافت چربی بیان می‌شود و فعالیت آن با تحریک ناقل گلوکز وابسته به انسولین (GLUT4)، افزایش بیان آدیپونکتین و افزایش حساسیت به انسولین همراه است (18). نقش مهم روی در ساختار پروتئین­های دارای انگشت روی (zinc-finger proteins)، در تنظیم فعالیت و عملکرد PPARγ به اثبات رسیده است (35). در بافت چربی و عضله، انسولین با فراهم کردن سوبسترای اسید چرب از طریق تحریک فعالیت لیپوپروتئین لیپاز (LPL) سبب تشویق سنتز تری‌گلیسرید می‌گردد. همچنین انسولین از طریق کاهش سطح cAMP و ممانعت از فعالیت پروتئین کیناز A و لیپاز حساس به هورمون باعث کاهش لیپولیز می­گردد (5).با این‌حال در مطالعه حاضر علی‌رغم افزایش سطح روی در میش­های تحت درمان با Zn-Met و افزایش عددی میزان انسولین، تغییرات معنی­داری در عیار انسولین خون دیده نمی­شود. توجه به این نکته ضروری است که کاهش غلظت اسیدهای چرب غیر استریفیه در واقع انعکاسی از وضعیت روبه بهبود انرژی در میش­های مورد مطالعه با افزایش تعداد روزهای شیرواری است که به دلیل کاهش تولید شیر و افزایش مصرف خوراک می­باشد و نیز نکته حائز اهمیت در این مساله توجه به نقش روی در بهبود وضعیت انرژی حیوان می­باشد. مطالعات نشان داده­اند که در کمبود روی سلول، بیان PPARγ هم در سطح mRNA و هم در سطح پروتئین به­طور معنی­داری کاهش و با مکمل روی افزایش می­یابد (42) و همچنین فعال شدن PPARγ با افزایش بیان آدیپونکتین همراه است (18،36). بنابراین شاید مکمل Zn-Met در مطالعه حاضر باعث فعال شدن PPARγ در بافت چربی شده و در نتیجه ترشح آدیپونکتین و سطح سرمی آن را افزایش داده است و این نیز با تحریک سوخت گلوکز و اکسیداسیون اسیدهای چرب از طریق فسفوریلاسیون و فعال کردن AMP کیناز در عضلات و کبد باعث افزایش برداشت گلوکز شده است که پیشتر توسط Okamoto و همکاران در سال 2006 توضیح داده شده است (30). به همین دلیل شاهد بهبود وضعیت انرژی در میش­های تحت درمان با Zn-Met خواهیم بود که این موضوع با کاهش بیشتر مقادیر BHB در این گروه­ها در مقایسه با گروه کنترل تأیید می‌شود.

آزمایش تحمل گلوکز داخل وریدی (IVGTT) برای ارزیابی سنتز و ترشح انسولین توسط پانکراس در نشخوارکنندگان انجام شده است (4،11،14). اساساً IVGTT عملکرد اولیه سلول­های بتا (beta cells) را برای تولید انسولین ارزیابی می­کند. الگوی پاسخ گلوکز سرم به تزریق درون وریدی گلوکز متعاقب IVGTT در مطالعه حاضر شبیه به الگوی گزارش شده در سایر مطالعات است (13،14،20). در تحقیق حاضر نرخ پاکسازی گلوکز متعاقب آزمایش IVGTT در دام­های تحت درمان با روی بیشتر بود. مقادیر بالای نرخ پاکسازی گلوکز در گروه­های تحت درمان با روی، احتمالاً مربوط به غلظت‌های پایین‎تر انسولین، یا توسعۀ مقاومت به انسولین یا به احتمال فراوان مربوط به هر دو عامل فوق در میش‌های گروه کنترل می­باشد (33). در آزمایش تحمل گلوکز، غلظت­های پایه و حداکثر، نرخ پاکسازی سرم، نیمه عمر، زمان رسیدن به غلظت پایه، سطح زیر منحنی برای گلوکز سرم و نسبت گلوکز سرم به انسولین سرم، فراسنجه­های لازم جهت ارزیابی تحمل گلوکز می­باشد (19). با این حال اطلاعات حاصل از آزمایش تحمل گلوکز به سادگی قابل تفسیر نمی­باشد، برای مثال در طول آزمایش تحمل گلوکز مشخص نیست که آیا افزایش نرخ پاکسازی گلوکز سرم در نتیجه افزایش مصرف گلوکز است یا کاهش تولید گلوکز. در این مورد نسبت مولار انسولین سرم به گلوکز یا نسبت نرخ پاکسازی آن­ها در مقایسه با نرخ پاکسازی گلوکز سرم شاخص بهتری برای مقاومت به انسولین می­باشد (39). بررسی حاضر نشان داد که جیره حاوی Zinc- Met با میزان بالا از نظر آماری سطح زیر منحنی گلوکز کمتری نسبت به گروه کنترل و گروه LZn دارد. سطح زیر منحنی (AUC) گلوکز بالاتر در گروه­های کنترل و LZn، نسبت به میش­های گروه HZn نشان­دهنده عدم کارایی انسولین برای پاک کردن میزان مشابه گلوکز در این گروه­ها بوده، لذا ممکن است نشان­دهنده درجه­ای از مقاومت به انسولین باشد.

پاکسازی گلوکز پس از IVGTT نتیجه مصرف گلوکز توسط بافت­های محیطی، جذب روده، تولید گلوکز در کبد و دفع آن از طریق کلیه است. همچنین مصرف گلوکز توسط غده شیری در اوایل شیردهی به طور قابل توجهی افزایش می­یابد (21)، و میزان مصرف گلوکز از گردش خون بستگی به میزان تولید شیر دارد. گرچه گلوکونئوژنز کبدی در گاو­های اوایل شیرواری افزایش می­یابد (22)، افزایش غلظت انسولین در نتیجه IVGTT باعث کاهش میزان گلوکونئوژنز در سلول­های کبدی می‌شود (8). در مطالعه حاضر تجزیه و تحلیل شاخص‌های مقاومت به انسولین نشان داد که مقادیر سطح زیر منحنی گلوکز در گروه کنترل به طور معنی‌داری بیشتر از تیمارهای تحت درمان با Zn-Met بود. این یافته یک حالت مقاومت به انسولین و کاهش پاکسازی گلوکز توسط بافت­ها را نشان می­دهد. بنابراین، به­نظر می­رسد که افزایش غلظت روی سرم خون با افزایش ترشح انسولین از پانکراس و یا با افزایش حساسیت بافتی به انسولین در بهبود وضعیت سطح انرژی میش­های شیروار مؤثر بوده باشد. همان‌طور که اشاره شد در این مطالعه، نرخ پاکسازی گلوکز متعاقب تزریق درون وریدی گلوکز معنی­دار است؛ افزایش میزان پاکسازی گلوکز از خون در نتیجه افزایش انسولین ناشی می­شود (17). لذا می‌توان چنین نتیجه‌گیری نمود که مصرف گلوکز خون توسط بافت­های محیطی در میش­های دریافت­کننده روی بیشتر از گروه کنترل تحت تأثیر واقع شده است.

عموماً افزایش سطح انسولین خون، سبب کاهش فعالیت انسولین در سطح گیرنده و پس از گیرنده می‌گردد (5). در مقاومت به انسولین کبدی، افزایش سطح انسولین خون با عدم توانایی انسولین در کاهش تولید گلوکز در کبد مرتبط است. در مقاومت به انسولین بافت محیطی، افزایش سطح انسولین خون با نقص مصرف و اکسیداسیون گلوکز در عضله و سلول­های بافت چربی و عدم توانایی در کاهش آزاد شدن اسیدهای چرب از بافت چربی مرتبط می­باشد (37). بنابراین نتیجه حاصل از مطالعه حاضر بروز مقاومت به انسولین بافت محیطی را به ویژه در میش‌های گروه کنترل نشان می­دهد. مطالعات نشان می­دهند که در گاو­های شیروار، مقاومت به انسولین گاهی اوقات به معنی کاهش ترشح انسولین پانکراس است (21). با این حال در مطالعه حاضر مقادیر گلوکز نسبت به مقادیر اولیه میش­های گروه کنترل 5 و 10 تا 30 دقیقه پس از IVGTT به عنوان تأیید توانایی گلوکز برای تولید و انتشار انسولین از سلول­های اندوکرین بتای پانکراس در میش­های دریافت کننده Zn-Met می­باشد.

Bossaert و همکاران در سال ٢٠٠٩ گزارش کردندکه سطوح گلوکز خون در دقایق مختلف خونگیری آزمایش IVGTT متأثر از گلوکز تزریقی، گلوکز تولیدی از منشأ درونی، گلوکز جذب شده از روده، دفع گلوکز کلیوی و جذب گلوکز توسط بافت­های حساس به انسولین (بافت ماهیچه اسکلتی و آدیپوز) می­باشد (7). میزان اینفیوژن گلوکز بر مبنای مقالات مقدار 25٠ میلی­گرم گلوکز به ازای هر کیلوگرم وزن بدن با اعمال محرومیت ٢٠ ساعتی از خوراک استفاده شد (23،32). از آنجایی که حدوداً تا ٢ ساعت پس از ارائه گلوکز، سطح آن در خون بایستی به سطح اولیه رسیده باشد (32)، آزمایش تا دقیقه ١8٠ ادامه یافت. De koster و همکاران در سال 2013 گزارش کردند هرچه زمان بیشتری طول بکشد تا میزان گلوکز خون به حد طبیعی خود برگردد، بافت­های بدن حالتی مقاوم به انسولین دارند. در حالت مقاومت به انسولین انتظار می­رود نرخ پاکسازی پایین، سطح زیرمنحنی گلوکز زیاد و زمان رسیدن به نصف حداکثر غلظت گلوکز یا زمان رسیدن به غلظت پایه گلوکز بیشتر باشد (12). با درنظر گرفتن این شاخص­ها به نظر می‌رسد که حالت بهبود حساسیت به انسولین در میش‌هایی که زینک متیونین مصرف کرده بودند ایجاد شــده اســت. لذا به نظر می­رسد اســتفاده ازمکمل روی بتواند وضعیت متابولیسم گلوکز را در بدن بهبود دهد.

الگوی افزایش قابل توجهی از انسولین و قند خون پس از تزریق گلوکز در گاوهای شیری اوایل دوره شیردهی گزارش شده است (21،33). در آزمایش آن­ها، گلوکز در 4 ساعت به طور معنی‌داری در سطوح بالاتر از مقادیر خط پایه باقی مانده بود. این یافته­ها نشان می­دهد که مقاومت به انسولین در گاوهای اوایل شیردهی وجود دارد. بر اساس این یافته و بر اساس نتایج حاضر، به نظر می‌رسد که واکنش ترشح انسولین به گلوکز و همچنین حساسیت به انسولین در بافت­های محیطی ممکن است در طول اوایل شیرواری کاهش یابد. به عبارتی کاهش نرخ پاکسازی ترشح گلوکز پس از زایمان به علت افزایش مقاومت به انسولین است که با تشدید لیپولیز از آدیپوسیت­ها مشخص می­شود، این یافته در مطابقت با سایر مطالعات قبلی می­باشد (21،33).

متابولیت­های انسولین و لیپید نسبتاً رابطه­ی معکوسی با هم دارند (6). انسولین با مهار لیپولیز، تحریک لیپوژنز و با افزایش استفاده از کتون بادی­ها در بافت­های محیطی اثر آنتی­کتوژنیک دارد (8). علاوه بر این، انسولین فعالیت آنزیمی کبدی را برای استریفیه کردن مجدد NEFA به تری اسیل گلیسرول افزایش می­دهد (16). همچنین انسولین اکسیداسیون NEFA در سلول‌های میتوکندری کبدی را به واسطه کاهش فعالیت پالمیتوئیل ترانسفراز-1 (CPT-1) و درنتیجه کاهش جذب میتوکندریایی NEFA کاهش می­دهد (43). NEFA و BHB به طور کلی پاسخ انسولین و گلوکز را به خطر می­اندازند. NEFA نه تنها منجر به بروز اختلال در چندین مسیر انسولین می­شود، بلکه می­تواند منجر به اختلال در تولید انسولین پانکراس نیز گردد. نشان داده شده است که NEFA رابطه منفی با AUC انسولین و سطوح پیک، بدون تأثیر روی پارامترهای گلوکز در گاوهای پس از زایمان دارد (6). افزایش تری­گلیسیرید و بویژه سطح NEFA عامل تشدید کننده مقاومت به انسولین است و می­تواند توسط تزریق نیکوتینیک اسید کاهش یابد (32). همچنین در مطالعه­ای نشان داده شده است که هیپرلیپیدمی تجربی با استفاده از غلظت بالای NEFA سبب مقاومت به انسولین در گوسفندان می­شود (2). Hayirli در سال 2006 گزارش داد که غلظت بالای NEFA سبب کاهش استفاده از گلوکز در بافت­ها، کاهش تعداد گیرنده GLUT4 و اختلال در مسیرهای سیگنالینگ انسولین داخل سلولی در بافت‌های کبد و محیطی می­شود (20). کاهش در غلظت گلوکز اولیه، انتشار گلوکز و انسولین و میزان پاکسازی گلوکز در عین حال افزایش آزادسازی چربی و کتوژنز، نشانه­هایی از مقاومت به انسولین در نشخوارکنندگان به دلیل مواجهه با سوء تغذیه و کتوزیس ناشی از آن است. یافته­های حاضر کاهش مقادیر NEFA و BHB را به لحاظ عددی در گروه­های تحت درمان با Zn-Met به ویژه در گروه دریافت کننده میزان بالا نشان می­دهد که احتمالاً دلیلی بر بهبود پاسخ به انسولین در گروه­های تحت درمان با روی می­باشد.

نتیجه گیری: یافته­های تحقیق حاضر نشان می­دهند که مکمل غذایی زینک-متیونین به ویژه با میزان بالا (300 میلی­گرم به ازای ماده خشک خوراک)، در بهبود بالانس منفی انرژی و جلوگیری از مقاومت به انسولین در میش­های شیروار پس از زایش مؤثر بوده و این احتمال وجود دارد که پاسخ به انسولین در میش­ها در کنار استفاده از مکمل­های حاوی روی بهبود پیدا کند.

سپاسگزاری

 بدین­وسیله نویسندگان از دانشکده­ی دامپزشکی دانشگاه ارومیه، جهت تأمین منابع مالی این تحقیق، کمال تشکر را دارند. همچنین نویسندگان مراتب تشکر و قدردانی خود را از شرکت سنا دام پارس از بابت حمایت در تأمین مکمل زینک-متیونین اعلام می­دارد.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

References

  1. References

     

    1. Adewuyi, A., Gruys, E., Van Eerdenburg, F. (2005). Non esterified fatty acids (NEFA) in dairy cattle. A review. Vet Q, 27, 117-126. https://doi.org/10.1080/ 01652176.2005.9695192
    2. Akbari, H., Dalir-Naghadeh, B., Asri-Rezaei, S., Hadian, M., Boston, R. (2015). Experimental hyperlipidemia induces insulin resistance in sheep. Domest Anim Endocrinol, 53, 95-102. https://doi.org/ 10.1016/j.domaniend.2015.06.002
    3. Allen, M., Bradford, B., Oba, M. (2009). Board-invited review: The hepatic oxidation theory of the control of feed intake and its application to ruminants. J Anim Sci, 87, 3317-3334. https://doi.org/10.2527/jas.2009-1779
    4. Attaee-Nazari, S., Ganjkhanlou, M., Zali, A., Amini, M. (2016). Effects of omega-3 fat supplementation and feeding frequency on glucose metabolism and insulin in on Mahabad kid. J Vet Res, 71, 415-422. (In Persian)
    5. Berne, R.M., Levy, M.N. (2005). Principles of Physiology. (4st ed.) St Louis, Elsevier, Mosby. p. 509-517.
    6. Bossaert, P., Leroy, J., De Vliegher, S., Opsomer, G. (2008). Interrelations between glucose-induced insulin response, metabolic indicators, and time of first ovulation in high-yielding dairy cows. J Dairy Sci, 91, 3363-3371. https://doi.org/10.3168/jds.2008-0994
    7. Bossaert, P., Leroy, J., De Campeneere, S., De Vliegher, S., Opsomer, G. (2009). Differences in the glucose-induced insulin response and the peripheral insulin responsiveness between neonatal calves of the Belgian Blue, Holstein-Friesian, and East Flemish breeds. J Dairy Sci, 91, 92, 4404-4411. https://doi.org/10.3168/jds.2009-2218
    8. Brockman, R.P., Laarveld, B. (1986). Effect of insulin on gluconeogenesis and the metabolism of lactate in sheep. Can J Physiol Pharmacol, 64, 1055-1059. https://doi.org/10.1139/y86-181
    9. Constable, P.D., Hinchcliff, K.W., Done, S.H, Grünberg, W. (2016). Veterinary Medicine-e-Book: A Textbook of the Diseases of Cattle, Horses, Sheep, Pigs and Goats (11st ed.) Elsevier Health Sciences. St. Louis, Missouri. p. 1722-1726.
    10. Contreras, G.A., Strieder-Barboza, C., Raphael, W. (2017). Adipose tissue lipolysis and remodeling during the transition period of dairy cows. J Anim Sci Biotech, 8, 41. https://doi.org/10.1186/s40104-017-0174-4
    11. De Koster, J., Van Eetvelde, M., Hermans, K., Van Den Broeck, W., Hostens, M., Opsomer, G. (2017). Limitations of glucose tolerance tests in the assessment of peripheral tissue insulin sensitivity during pregnancy and lactation in dairy heifers. J Dairy Sci, 100, 2381-2387. https://doi.org/10.3168/jds.2016-11792
    12. De Koster, J.D., Opsomer, G. (2013). Insulin resistance in dairy cows. Vet Clin North Am Food Anim Pract, 29, 299-322. https://doi.org/10.1016/j.cvfa.2013.04.002
    13. Djokovic, R., Šamanc, H., Nikolić, Z., Bogosavljević, S.B. (2007). Changes in blood values of glucose, insulin and inorganic phosphorus in healthy and ketotic dairy cows after intravenous infusion of propionate solution. Acta Vet Brno, 76, 533-539. https://doi.org/ 10.2754/avb200776040533
    14. Djokovic, R., Šamanc, H., Ilić, Z., Kurćubić, V. (2009). Blood glucose, insulin and inorganic phosphorus in healthy and ketotic dairy cows after intravenous infusion of glucose solution. Acta Vet Brno, 78, 449-453. https://doi.org/10.2754/avb200978030449
    15. Doepel, L., Lapierre, H., Kennelly, J. (2002). Peripartum performance and metabolism of dairy cows in response to prepartum energy and protein intake. J Dairy Sci, 85, 2315-2334. https://doi.org/10.3168/jds. S0022-0302(02)74312-9
    16. Emmison, N., Zammit, V, Agius, L. (1992). Triacylglycerol accumulation and secretion in hepatocyte cultures. Effects of insulin, albumin and Triton WR 1339. Biochem J, 285, 655-660. https://doi. org/10.1042/bj2850655
    17. Frangioudakis, G., Gyte, A.C., Loxham, S.J., Poucher, S.M. (2008). The intravenous glucose tolerance test in cannulated Wistar rats: a robust method for the in vivo assessment of glucose-stimulated insulin secretion. J Pharmacol Toxicol Methods, 57, 106-113. https://doi. org/10.1016/j.vascn.2007.12.002
    18. Ferré, P. (2004). The biology of peroxisome proliferator-activated receptors: relationship with lipid metabolism and insulin sensitivity. Diabetes, 53, S43-S50. https://doi.org/10.2337/diabetes.53.2007.S43
    19. Hayirli, A., Bremmer, D., Bertics, S., Socha, M., Grummer, R. (2001). Effect of chromium supplementation on production and metabolic parameters in periparturient dairy cows. J Dairy Sci, 84, 1218-1230. https://doi.org/10. 3168/jds.S0022-0302(01)74583-3
    20. Hayirli, A. (2006). The role of exogenous insulin in the complex of hepatic lipidosis and ketosis associated with insulin resistance phenomenon in postpartum dairy cattle. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 30, 749-774. https://doi.org/10.1007/s11259-006-3320-6
    21. Holtenius, K., Agenäs, S., Delavaud, C., Chilliard, Y. (2003). Effects of feeding intensity during the dry period. 2. Metabolic and hormonal responses. J Dairy Science, 86, 883-891. https://doi.org/10.3168/jds. S0022-0302(03)73671-6
    22. Ingvartsen, K.L. (2006). Feeding-and management-related diseases in the transition cow: Physiological adaptations around calving and strategies to reduce feeding-related diseases. Anim Feed Sci Technol, 126, 175-213. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2005.08.003
    23. Kadowaki, T., Yamauchi, T., Kubota, N., Hara, K., Ueki, K., Tobe, K. (2006). Adiponectin and adiponectin receptors in insulin resistance, diabetes, and the metabolic syndrome. J Clin Invest, 116, 1784-1792. https://doi.org/10.1172/JCI29126
    24. Kaneko, J.J. (2008). Carbohydrate metabolism and its diseases. In: Clinical Biochemistry of Domestic Animals. (6th ed.) Kaneko, J.J., Harvey, J.W., Bruss, M.L. (eds.). Academic Press, San Diego, CA, p. 45-80.
    25. Kerestes, M., Faigl, V., Kulcsár, M, Balogh, O., Földi, J, Fébel, H., Chilliard, Y., Huszenicza G. (2009). Periparturient insulin secretion and whole-body insulin responsiveness in dairy cows showing various forms of ketone pattern with or without puerperal metritis. Domest Anim Endocrinol, 37, 250-261. https://doi.org/ 10.1016/j.domaniend.2009.07.003
    26. Myers, S.A. (2015). Zinc transporters and zinc signaling: new insights into their role in type 2 diabetes. Int J Endocrinol, 2015, 1-7. http://dx.doi.org/10. 1155/2015/167503
    27. Nocek, J., Socha, M., Tomlinson, D. (2006). The effect of trace mineral fortification level and source on performance of dairy cattle. J Dairy Sci, 89, 2679-2693. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(06)72344-X
    28. Norouzi, S., Adulcikas, J., Sohal, S.S., Myers, S. (2017) Zinc transporters and insulin resistance: therapeutic implications for type 2 diabetes and metabolic disease. J Biomed Sci, 24, 87-97. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0191727
    29. NRC, (2007). Nutrient requirements of small ruminants: sheep, goats, cervids, and new world camelids National Research Council. The National Academies Press, Washington, DC. p. 244-270.
    30. Okamoto, Y., Kihara, S., Funahashi, T., Matsuzawa, Y., Libby, P. (2006). Adiponectin: a key adipocytokine in metabolic syndrome. Clin Sci, 110, 267-278. https://doi.org/10.1042/CS20050182
    31. Petterson, J.A., Dunshea, F.R., Ehrhardt, R.A., Bell, A.W. (1993). Pregnancy and undernutrition alter glucose metabolic responses to insulin in sheep. J Nut, 123, 1286-1295. https://doi.org/10.1093/jn/123.7.1286
    32. Pires, J., Pescara, J., Grummer, R. (2007a). Reduction of plasma NEFA concentration by nicotinic acid enhances the response to insulin in feed-restricted Holstein cows. J Dairy Sci, 90, 4635-4642. https://doi. org/10.3168/jds.2007-0146
    33. Pires, J., Souza, A., Grummer, R. (2007b). Induction of hyperlipidemia by intravenous infusion of tallow emulsion causes insulin resistance in Holstein cows. J Dairy Sci, 90, 2735-2744. https://doi.org/10.3168/ jds.2006-759
    34. Rojas, L., McDowell, L., Cousins, R., Martin, F., Wilkinson, N., Johnson, A.B., Velasquez, J. (1995). Relative bioavailability of two organic and two inorganic zinc sources fed to sheep. J Anim Sci, 73, 1202-1207. https://doi.org/10.2527/1995.7341202x
    35. Rosen, E.D., Spiegelman, B.M. (2001). PPARγ: a nuclear regulator of metabolism, differentiation, and cell growth. J Biol Chem, 276, 37731-37734. https://doi.org/10.1074/jbc.R100034200
    36. Shen, H., MacDonald, R., Bruemmer, D., Stromberg, A., Daugherty, A., Li, Xa., Toborek, M., Hennig, B. (2007). Zinc deficiency alters lipid metabolism in LDL receptor–deficient mice treated with rosiglitazone. J Nut, 137, 2339-2345. https://doi.org/10.1093/jn/137.11.2339
    37. Sparks, J.D., Chamberlain, J.M., O’Dell, C., Khatun, I., Hussain, M.M., Sparks, C.E. (2011). Acute suppression of apo B secretion by insulin occurs independently of MTP. Biochem Biophys Res Commun, 406, 252-256. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2011.02.028
    38. Spears, J. (1989). Zinc methionine for ruminants: relative bioavailability of zinc in lambs and effects of growth and performance of growing heifers. J Anim Sci 67, 835-843. https://doi.org/10.2527/jas1989.673835x
    39. Subiyatno, A., Mowat, D., Yang, W. (1996). Metabolite and hormonal responses to glucose or propionate infusions in periparturient dairy cows supplemented with chromium. J Dairy Sci, 79, 1436-1445. https://doi.org/10.3168/jds. S0022-0302(96)76502-5
    40. Van Kempen, A.A., Van der Crabben, S.N., Ackermans, M.T., Endert, E., Kok, J.H., Sauerwein, H.P. (2006). Stimulation of gluconeogenesis by intravenous lipids in preterm infants: response depends on fatty acid profile. Am J Physiol Endocrinol Metab, 290, 723-730. https://doi.org/10.1152/ajpendo.00303.2005
    41. Wedekind, K., Hortin, A., Baker, D. (1992) Methodology for assessing zinc bioavailability: efficacy estimates for zinc-methionine, zinc sulfate, and zinc oxide. J Anim Sci, 70, 178-187. https://doi. org/10.2527/1992.701178x
    42. Yang, W.S., Jeng, C.Y., Wu, T.J., Tanaka, S., Funahashi, T., Matsuzawa, Y., Wang, J.P., Chen, C.L., Tai, T.Y., Chuang, L.M. (2002). Synthetic peroxisome proliferator-activated receptor-γ agonist, rosiglitazone, increases plasma levels of adiponectin in type 2 diabetic patients. Diabetes Care, 25, 376-380. https://doi.org/10.2337/diacare.25.2.376
    43. Zammit, V.A. (1996). Role of insulin in hepatic fatty acid partitioning: emerging concepts. Biochem J, 15, 1-14. https://doi.org/10.1042/bj3140001
Journal of Veterinary Research
Volume 75, Issue 4
December 2021
Pages 475-485

Files

Share

How to cite

Statistics