Isolation and Molecular Identification of Gallibacterium Anatis Isolates in Layer Flocks

Document Type : Avian (Poultry) Health Management

Authors

1 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran

2 Department of Avian Diseases, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization, Karaj, Iran

3 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Shahrekord, Shahrekord, Iran

4 Departement of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran

5 Department of Poultry Diseases, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran

Abstract

BACKGROUND: Gallibacterium anatis is a recently defined genus, which is a member of the Pasteurellaceae family. This advantageous pathogen is frequently found as part of the normal microflora of the upper respiratory tract and lower genital tract of the healthy poultry. Provided with appropriate conditions, it leads to various diseases, such as salpingitis, peritonitis, and loss of egg production with mortality in layer flocks. According to previous studies, multiple antibiotic resistance has been observed among G. anatis isolates, which can impose high costs on layer flocks. Due to the lack of the pathognomonic symptoms in the conflicts caused by this bacterium,  not enough comprehensive research has been conducted to date on the condition of this disease in Iran.
OBJECTIVES: This study aimed to investigate the infection rates of this bacterium via PCR.
METHODS: 295 tracheal swabs were collected from 10-layer flocks. Subsequently, the suspected colonies were isolated and identified with morphological features, differential cultivation, and PCR.
RESULTS: 43.72 % of the samples were positive.
CONCLUSIONS: The results of this study indicated that laying farms in Iran were infected with Gallibacterium anatis; thus, certain measures should be taken to control the factors reducing the production of layer flocks.

Keywords

Full Text

مقدمه

 

گالی‌باکتریوم آناتیس از اعضای خانواده پاستورلاسه می‌باشد که اغلب به عنوان بخشی از میکروفلور طبیعی دستگاه تنفس فوقانی و قسمت انتهایی دستگاه تولید مثلی طیور شناخته می‌شود. این باکتری نخستین بار از کلوآک مرغ و خروس‌های به ظاهر سالم و با توانایی همولیز خون و همزمان نیز از کشت‌های خالص پرندگان درگیر پریتونیت و سالپنژیت حاد جداسازی گردید و در سال 1950 میلادی توسط  Kjos-Hansen تحت عنوان "cloaca bacterium" معرفی شد (1).

عبارت گالی‌باکتریوم اولین بار توسط Bisgaard در سال 1982 برای نامگذاری آن استفاده شد. همچنین  قبل از شناسایی به عنوان یک جنس مستقل در سال 2003 میلادی، این باکتری تحت نام‌های اکتینوباسیلوس سالپنژیتیدیس، باکتری‌های شبه پاستورلا همولیتیکای طیور یا پاستورلا آناتیس در درگیری‌های مشابه گزارش شده است (2).

گالی‌باکتریوم طیف میزبانی وسیعی در پرندگان اهلی و حیات وحش دارد این جنس شامل چهار گونه گالی‌باکتریوم آناتیس، گالی‌باکتریوم ملوپسیتاسی، گالی‌باکتریوم سالپنژیتیدیس، گالی‌باکتریوم تریهالوسی فرمنتانس و سه گونه ژنومی می‌باشد، ولی مهم‌ترین گونه این جنس آناتیس بوده که گالی‌باکتریوم آناتیس خود شامل دو بیووار قابل تفکیک از نظر فنوتیپی همولیتیکا و غیر همولیتیکا است، گالی‌باکتریوم آناتیس بیووار همولیتیکا و گونه‌های ژنومی 1 و 2 توانایی ایجاد همولیز بتا با قطر 1 تا 2 میلی‌متر دور کلنی‌ها در آگار حاوی خون گاو، اسب، خوک، گوسفند، خرگوش یا مرغ را دارند. این باکتری‌ها، گرم منفی، کپسول‌دار، اکسیداز و کاتالاز مثبت می‌باشند. گالی‌باکتریوم آناتیس گسترش جهانی داشته و گزارش‌های جداسازی آن در تمام پنج قاره اصلی وجود دارد (1).

گالی‌باکتریوم آناتیس می‌تواند به صورت دائمی از نای و کلوآک پرندگان سالم جداسازی شود. این موضوع ثابت می‌کند این باکتری بخشی از میکروفلور این نواحی است. از طرفی این باکتری در حالت پاتوژن ضایعات پاتولوژیکی از جمله سپتی‌سمی، پریکاردیت، هپاتیت، اووفوریت، تحلیل فولیکول‌ها، انتریت، زخم‌های دستگاه تنفس فوقانی، سالپنژیت و پریتونیت ایجاد می‌کند که باعث کاهش تولید تخم‌مرغ، کاهش رفاه زیستی پرنده و در انتها افزایش مرگ و میر در گله‌های تولید کننده تخم‌مرغ می‌شود (1).

گالی‌باکتریوم آناتیس به‌طور معمول از طیور اهلی جداسازی می‌شود اما موارد متعددی از جداسازی در طیف وسیعی از پرندگان اهلی و غیر اهلی شامل بوقلمون، غاز، اردک، بلدرچین، قرقاول و پرندگان خانگی و پرندگان وحشی گزارش شده است. این باکتری از سالپنژیت اردک، سپتی‌سمی و سالپنژیت غاز، سپتی‌سمی و پنومونی کبوتر، سپتی‌سمی بوقلمون، پنومونی قرقاول، سپتی‌سمی طوطی استرالیایی و طوطی طوقدار جداسازی شده است. آلودگی انسانی با گالی‌باکتریوم آناتیس در موارد بسیار نادر در افراد دچار بیماری‌های تضعیف کننده ایمنی گزارش شده است. راه انتشار طبیعی همچنان مورد بحث است ولی بیشترین پذیرش روی انتقال افقی باکتری به عنوان راه اصلی وجود دارد و به نظر می‌رسد عفونت بالارونده از طریق کلوآک محتمل‌ترین راه گسترش عفونت باشد، اگرچه یک مورد انتقال از راه تخمدان در سطح ضعیف و متعاقب آن جداسازی گالی‌باکتریوم آناتیس از کیسه زرده مشاهده شده است که احتمال وجود انتقال عمودی را نیز یادآور می‌شود (1).

گالی‌باکتریوم آناتیس نیز همانند سایر باکتری‌های خانواده پاستورلاسه دارای عوامل یا فاکتورهای حدّت است، که اجزایی از ارگانیسم بوده که به آن توانایی ایجاد بیماری می‌دهند و قدرت بیماریزایی ارگانیسم را تعیین می‌کنند. این عوامل در بسیاری از جنبه‌های درگیری میزبان _ پاتوژن مثل قدرت کلونیزاسیون، استفاده از مواد مغذی ضروری، گریز از ایمنی و سرکوب ایمنی دخیل هستند و نقش بازی می‌کنند. فاکتورهای حدّت باکتری شامل توکسین‌ها، آنزیم‌ها و مولکول‌های چسبنده هستند (1).

از مهم‌ترین عوامل حدّت گالی‌باکتریوم آناتیس می‌توان به GtxA، فیمبریه، وزیکول‌های سطح غشایی، کپسول، متالوپروتئاز‌ها، هماگلوتینین و تشکیل بیوفیلم اشاره کرد.

GtxA نوعی از RTX توکسین‌ها می‌باشد.  RTX توکسین‌ها به وسیله بسیاری از باکتری‌های خانواده پاستورلاسه ترشح می‌شوند و عامل ایجاد خواص همولیتیک و لوکوتوکسیک این باکتری‌ها هستند. این توکسین‌ها از طریق سیستم ترشحی نوع 1 (T1SS) که مختص باکتری‌های گرم منفی است ترشح می‌گردند. پروتئین GtxA ترشح شده از گالی‌باکتریوم آناتیس دارای فعالیت همولیتیک علیه گلبول‌های قرمز طیف وسیعی از پرندگان و پستانداران و فعالیت لکوتوکسیک علیه ماکروفاژهای لاینHD11  طیور هستند و موتانت‌های فاقد آن به شدت تخفیف حدّت پیدا می‌کنند (1).

از مهم‌ترین جنبه‌های کلونیزاسیون باکتری توانایی چسبیدن و حمله به بافت‌های میزبان است. اخیراً چندین خوشه فیمبریایی شبیه کلاس F-17 در ژنوم سه سویه مختلف گالی‌باکتریوم آناتیس دیده شده‌اند. فیمبریه‌های کلاس F-17 گروهی از فیمبریه‌ها هستند که با رسپتورهای حاوی N-acetyl-D-glucosamine (Glc-NAc) سلول‌های میزبان باند می‌شوند و بنابراین در چسبندگی باکتری به سطوح موکوسی بافت‌های میزبان نقش دارند (1).

وزیکول‌های سطح غشایی (OMV) ساختارهای کروی با غشاء دو لایه هستند که در نتیجه دارای پروتئین‌های غشاء خارجی و LPS هستند و به عنوان وسیله انتقال لیپیدها، پروتئین‌ها، اجزای DNA و توکسین‌ها به غشاء سلولی استفاده می‌شوند تا با شرایط بدن میزبان مقابله کنند (2).

نقش کپسول در افزایش مقاومت سرمی، چسبندگی سلولی، فعل و انفعلات بین سلولی و فرار از ایمنی میزبان به اثبات رسیده است، در مطالعات دیده شده که موتانت‌های فاقد کپسول باکتری حدّت بیشتری نسبت به انواع وحشی نشان می‌دهند، به نظر می‌رسد فقدان کپسول موجب در معرض قرار گرفتن آنتی‌ژن‌هایی می‌شود که در حالت طبیعی به واسطه وجود کپسول از دسترس ایمنی میزبان خارج می‌شوند و در نتیجه فقدان کپسول به افزایش پاسخ ایمنی منجر می‌شود (1).

متالوپروتئاز‌ها یکی از انواع پروتئاز‌ها هستند که در توانایی کلونیزه شدن، فراهم آوری احتیاجات زیستی باکتری‌ها، فرار از ایمنی میزبان و تسهیل نفوذ باکتری به گردش خون میزبان و انتشار به سایر ارگان‌ها نقش دارند. همچنین با اثر روی ایمونوگلوبولین‎ها و پروتئین‌های سیستم ایمنی میزبان و اجزای سرمی آن پاسخ ایمنی میزبان را تعدیل می‌کنند (1). گالی‌باکتریوم آناتیس متالوپروتئازهایی را ترشح می‌کند کهIgG  طیور را غیر فعال می‌کنند. پس در فرار از ایمنی میزبان نقش مهمی دارند (2).

گالی‌باکتریوم آناتیس می‌تواند به سطوح خنثی متصل شود که مرحله اول تشکیل بیوفیلم است. تشکیل بیوفیلم با تسهیل در انتقال ژن و فعال شدن ژن‌های مربوط به حدّت باکتری به بقاء باکتری در شرایط سخت محیط زیستی کمک می‌کند، که به ایجاد شکل مزمن بیماری می‌انجامد. همچنین با ایجاد مقاومت دارویی از طریق نفوذ ناپذیری آنتی بیوتیک در ماتریکس پلیمری، درمان را سخت و طولانی مدت می‌کند (1).

برخی از سویه‌های گالی‌باکتریوم آناتیس قادرند گلبول‌های قرمز پرندگان را آگلوتینه کنند که به واسطه بروز هماگلوتینین در آن‌ها است که می‌تواند با رسپتورهای سطحی گلبول‌های قرمز باند شود. علاوه بر هماگلوتینین سطحی در برخی سویه‌های گالی‌باکتریوم هماگلوتینین از طریق OMV‌ها نیز ترشح می‌شود (1).

با وجود تلاش‌های انجام شده برای ساخت واکسن، همچنان آنتی بیوتیک درمانی مهم‌ترین روش مهار بیماری ناشی از گالی‌باکتریوم آناتیس است، با این وجود، ثابت شده است که گالی‌باکتریوم آناتیس به سرعت در برابر دارو‌ها مقاوم می‌شود. علاوه بر این، رعایت شرایط امنیت زیستی و بهداشت عمومی می‌تواند به روشی مشابه کنترل سایر بیماری‌های مسری در مرغداری‌ها، در این مورد نیز کارساز باشد (2).

بروز مقاومت‌های آنتی بیوتیکی در باکتری‌های خانواده پاستورلاسه از جمله گالی‌باکتریوم آناتیس مشاهده شده است. اگر‌چه عفونت‌های گالی‌باکتریوم اغلب درمان‌پذیر به نظر می‌رسند، شکست درمان آنتی یوتیکی در موارد درگیری با گالی‌باکتریوم مشکل رایجی است. مقاومت سویه‌های جداشده گالی‌باکتریوم از طیور به نووبیوسین، تایلوزین، کلیندامایسین، اسپکتینومایسین، تتراسیکلین و پنی‌سیلین گزارش شده است (2).

علی‌رغم ضرر اقتصادی متعاقب درگیری با گالی‌باکتریوم آناتیس در گله‌های ماکیان تخم‌گذار در نقاط مختلف دنیا تحقیقات بسیار اندکی در خصوص وضعیت آلودگی گله‌های تخم‌گذار کشور تا به امروز انجام شده است لذا هدف از مطالعه حاضر بررسی و جداسازی این باکتری در گله‌های تخم‌گذار کشور با استفاده از روش PCR و کشت باکتری می‌باشد.

مواد و روش کار

جمع‌آوری نمونه‌ها: در مطالعه حاضر به منظور بررسی وجود آلودگی با باکتری گالی‌باکتریوم آناتیس در گله‌های مرغ تخم‌گذار تحت آزمایش به روش ردیابی DNA باکتری با روش واکنش ‌زنجیره‌ای پلیمراز معمول (PCR) ابتدا لازم بود نمونه‌گیری از گله‌ها صورت گیرد. بنابراین پس از اخذ اجازه ورود به مرغداری‌های هدف نمونه‌گیری انجام شد. هدف اولیه نمونه‌گیری از مرغداری‌های استان تهران بود که به علت مشکلات و همزمانی با شیوع آنفلونزای فوق حاد و عدم اجازه ورود به بسیاری از مرغداری‌ها در نهایت نمونه‌گیری از پنج استان انجام شد. در مرحله اول پس از هماهنگی‌های معمول و رعایت اصول نمونه‌برداری استریل بر پایه نمونه‌گیری تصادفی خوشه‌ای از روش نمونه‌برداری با سوآب از نای پرندگان موجود در سالن‌های تولید استفاده شد. پس از اخذ نمونه‌ها در محل مرغداری سوآب‌ها به صورت تکی در لوله‌های استریل حاوی 2 سی سی محیط  BHIقرار داده شد و در کوتاه‌ترین زمان ممکن به آزمایشگاه انتقال داده شدند. در آزمایشگاه ابتدا لوله‌های حاوی نمونه و محیط را 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری کرده و پس از آن نمونه‌ها بر روی پلیت‌های محیط آگار خوندار (Blood Agar) حاوی خون سیتراته 5 درصد گوسفند کشت خطی داده شدند و مجدد به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شدند. در مرحله بعد کلنی‌ها بر اساس ویژگی‌های فنوتیپی شناسایی اولیه شدند و کلنی‌های مشکوک به گالی‌باکتریوم مجدداً در محیط آگار خوندار کشت خطی داده شدند تا تک کلنی به دست آید.

کلنی‌های جداسازی شده در این مرحله تا زمان انجام آزمایش‌های مولکولی و بیوشیمیایی به محیط برین-هارت بافر حاوی حدود 500 میکرولیتر BHI و محلول گلیسیرین 60 درصد استریل شده به میزان هم حجم انتقال داده و در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. محلول گلیسیرین به جهت محافظت از جداره باکتری و پیشگیری از تخریب آن مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این مرحله کلنی‌های بتا-همولیز با قطر 1-2 میلی‌متر خاکستری، صاف، نیمه شفاف، گرد با حاشیه مشخص جداسازی شدند. سپس جهت شناسایی نهایی بر روی نمونه‌ها آزمایش PCR انجام شد.

برای بررسی خصوصیات بیو‌شیمیایی نمونه‌های مثبت قطعی پس ازPCR  از بین نمونه‌های سالن‌های مثبت شده 5 نمونه به صورت تصادفی از هر سالن انتخاب شد و آزمایش‌های رنگ‌آمیزی گرم، کشت روی محیط آگار مک‌کانکی، اکسیداز، کاتالاز، اوره‌آز، نیترات، ایندول روی آن‌ها انجام شد.

استخراج DNA: برای استخراج DNA مقدار 200 میکرولیتر از سویه‌هایی که قبلاً در محیط BHI کشت داده شده بود، به میکروتیوب حاوی همین مقدار نرمال سالین استریل انتقال داده و در حرارت آب جوش به مدت 15 دقیقه قرار داده شد، بقیه مراحل جداسازی را طبق پروتکل جداسازی کیت استخراج DNA ساخت شرکت MBST انجام داده و نمونه هموژن نهایی را تا زمان انجام PCR در یخچال منفی 60- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

روش PCR: محلول کار PCR شامل 10 میکرولیتر مستر‌میکس، 5/0 میکرولیتر از هر تک جفت پرایمر، 5/0 میکرولیتر از نمونه آلوده و 5/8 میکرولیتر آب مقطر دوبار تقطیر عاری از آنزیم DNase و RNase بود که در مجموع حجم کل نمونه برابر با 20 میکرولیتر شد. برنامه دمایی به این صورت تنظیم شد که ابتدا به مدت 4 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد سپس 35 سیکل متشکل از 30 ثانیه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد، 30 ثانیه در دمای 55 درجه سانتی‌گراد و 1 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‌گراد و در نهایت به مدت 10 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‌گراد جهت مرحله اکستنشن پایانی یا امتداد‌یابی انجام شد. محصولات PCR با استفاده از ژل آگاروز 1 درصد و رنگ اتیدیوم بروماید با استفاده از دستگاه فرابنفش مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. برای کنترل مثبت از سویه (12656-12) G. anatis biovar haemolytica اهدایی پروفسور Bojesen شاغل در بخش میکروبیولوژی دامپزشکی دانشگاه کپنهاگ دانمارک و برای کنترل منفی از آب مقطر استریل استفاده شد.

در مطالعه حاضر با استفاده از توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA در باکتری گالی‌باکتریوم آناتیس با شماره دسترسی AF228011.1، توسط برنامه تحت شبکه primer3 یک زوج پرایمر طراحی شد. سپس با استفاده از نرم‌افزار BLAST از اختصاصی بودن پرایمرها برای ردیابی توالی‌های نوکلئوتیدی مشابه ثبت شده در بانک ژن جهانی (Genbank) اطمینان حاصل شد و حساسیت و ویژگی پرایمرها با DNA استخراج شده از باکتری مزبور به عنوان کنترل مثبت مورد تأیید قرار گرفت. سپس توالی نوکلئوتیدی توسط شرکت سیناکلون ساخته شد. برای انجام کار نیز از مستر‌میکس آماده مصرف ساخت شرکت سیناکلون استفاده شد. در نهایت اندازه باند محصول نهایی واکنش برابر با 154 bp بود (جدول 1).

نتایج

در مطالعه حاضر 295 نمونه از 10 گله مرغ تخم‌گذار مورد بررسی قرار گرفت و پس از مراحل کشت و جداسازی کلنی‌های مشکوک کوچک، صاف، خاکستری، نیمه‌شفاف با همولیز به شعاع بین 2 الی 3 میلی‌متر در اطراف کلنی پس از 24 ساعت کشت در محیط بلاد آگار مشابه آنچه در تصویر 1 نشان داده شده است، برای بررسی بیشتر و انجام PCR جمع‌آوری و ذخیره‌سازی شدند. پس از انجام PCR از مجموع 295 نمونه سوآب نای اخذ شده، 72/43 درصد نمونه‌ها مثبت بودند. نمونه نتایج PCR در تصویر 2 نشان داده شده است. میزان شیوع گالی‌باکتریوم آناتیس به تفکیک گله و شهر نیز در جدول 2 نشان داده شده است. تمام 45 نمونه انتخاب شده برای بررسی بیوشیمیایی کلونی‌های بتا-همولیز، گرم منفی، اکسیداز مثبت، کاتالاز مثبت، اوره‌آز منفی، ایندول منفی، مک‌کانکی منفی بودند.

بحث

گالی‌باکتریوم آناتیس طیف میزبانی وسیعی در پرندگان اهلی و حیات‌ وحش دارد. این باکتری می‌تواند به عنوان بخشی از میکروفلور طبیعی دستگاه تنفس فوقانی و قسمت‌های انتهایی دستگاه تولید‌ مثل طیور در صورت فراهم شدن شرایط کاهنده سطح ایمنی میزبان، به تنهایی و یا همراه سایر باکتری‌ها تغییرات پاتولوژیک وسیعی به ویژه در دستگاه تولید مثلی طیور ایجاد کند (2).

Matthes و  Löligerدر سال 1976 طی مطالعه‌ای با وارد کردنcfu 102 گالی‌باکتریوم به چینه‌دان جوجه‌های SPF یک روزه و جوجه‌های 6 هفته به طور جداگانه و بررسی میزان ماندگاری باکتری در 8 هفته دریافتند، باکتری پس از مدت کوتاهی از روده‌ها و در موارد کمتر از سایر ارگان‌های داخلی پرندگان مورد مطالعه قابل جداسازی است این مطالعه نشان می‌دهد گالی‌باکتریوم می‌تواند به صورت عفونتی طولانی مدت یا دائمی درآید (3).

شیوع گالی‌باکتریوم در گله‌های مرغ تخم‌گذار صنعتی به وسیله Mushin و همکاران در سال 1980 گزارش شده است. آن‌ها از 322 نمونه جمع‌آوری شده از 23 گله متفاوت مرغان تخم‌گذار به ظاهر سالم و بدون علامت، 97 درصد نمونه‌ها را آلوده با گالی‌باکتریوم تشخیص دادند (4). این مطالعه در تطابق با مطالعات قبلی Bisgaard در سال 1977 بود که گالی‌باکتریوم را به عنوان یکی از باکتری‌های فلور طبیعی دستگاه تنفس فوقانی مرغان تخم‌گذار مطرح کرد (5).

براساس مطالعات اخیر Paudel و همکاران درسال 2014 گالی‌باکتریوم پاتوژن فرصت‌طلبی است که در شرایط مناسب قادر است بیماری ایجاد کند و عوامل مستعد کننده از قبیل عفونت‌های همزمان با سایر میکروارگانیسم‌ها، تأثیرات هورمونی، سن، تغییرات فصلی، استرس، وضعیت‌های کاهنده ایمنی و استعداد ژنتیکی میزبان در تعیین نتیجه درگیری با باکتری مؤثرند (6).

Paudel و همکاران درسال 2014 طی یک مطالعه تجربی دریافتند در جوجه خروس‌هایی که از راه تلقیح داخل بینی با گالی‌باکتریوم آناتیس آلوده شده بودند یک هفته بعد از درگیری از کشت بیضه و اپیدیدیم آن‌ها باکتری به صورت خالص قابل جداسازی است و در این مورد کاهش شدید تعداد و حرکت اسپرم‌ها و کاهش حرکات پیشرونده مؤثر در اسپرم‌ها و کاهش مقاومت غشایی آن‌ها از عوارض آلودگی با گالی‌باکتریوم آناتیس بود که به شدت باروری آن‌ها را کاهش می‌داد. همچنین جداسازی باکتری از خروس‌ها و نقش آن در کاهش کیفیت و کمیت اسپرم‌های فعال نشان داد خروس‌ها در انتقال باکتری در گله‌های مولد نقش مهمی دارند (6).

امروزه روش PCR به علت توانایی شناسایی چندین نمونه به صورت همزمان، حساسیت بالا و عدم نیاز به کشت گالی‌باکتریوم آناتیس به عنوان روش قطعی و طلایی جایگزین روش‌های سنتی شناسایی فنوتیپی این باکتری شده است.

Shaw و همکاران در سال 1989 در مینه‌سوتای آمریکا طی بررسی 5 گله ماکیان تخم‌گذار که با افزایش مرگ و میر ناگهانی مواجه شده بودند با استفاده از PCR وجود گالی‌باکتریوم آناتیس را در 3 گله در کنار ویروس لارنگوتراکئیت تأیید کردند و مطرح کردند که این باکتری باعث افزایش خسارت ناشی از بیماری‌های ویروسی می‌شود (7).

Bojesen و همکاران در سال 2007 برای تعیین میزان حساسیت و ویژگی PCR برای شناسایی گالی‌باکتریوم، 122 ایزوله را با استفاده از دو پرایمر(1133fgal)   16S rRNAو 23S rRNA (114r) مورد ارزیابی قرار دادند که در این میان 75 نمونه از 18 گله مرغ تخم‌گذار از مناطق مختلف مکزیک، 25 نمونه بیووارهای مختلف گالی‌باکتریوم به عنوان مرجع و کنترل مثبت، 17 نمونه از باکتری‌های مختلف خانواده پاستورلاسه به جز گالی‌باکتریوم و 5 نمونه از خانواده‌های فلاووباکتریاسه و انتروباکتریاسه برای تشخیص تفریقی بودند که تمام نمونه‌های گالی‌باکتریوم باندهای قابل انتظار حاصل تکثیر ژنی را روی ژل الکتروفورز نهایی نشان دادند در حالی که در 22 نمونه دیگر هیچ باندی دیده نشد. این نتایج کفایت روش PCR برای شناسایی و تفکیک گالی‌باکتریوم از سایر باکتری‌ها را به خوبی نشان می‌دهد (8).

Zepeda و همکاران در سال 2010 با تزریق باکتری داخل بینی ماکیان و روش‌های مولکولی تکمیلی و سپس تهیه لام پاتولوژی نشان دادند که گالی‌باکتریوم آناتیس توانایی ایجاد ضایعات میکروسکوپی در نای،کیسه‌های هوایی، ریه و کبد را دارا بوده و از این‌ جهت به عنوان پاتوژن اولیه در ماکیان مطرح می‌باشد (9).

Huangfu و همکاران در سال 2012 با روش qPCR روی ژن gtxA گالی‌باکتریوم آناتیس برای رد‌یابی باکتری، 5/36 درصد از 181 نمونه بافتی مورد بررسی را آلوده تشخیص دادند. آن‌ها با بررسی بافت‌های متفاوت دریافتند بیشترین میزان باکتری از نای و تخمدان‌ها و حتی در جوجه‌های 4 روزه قابل ردیابی است (10).

Jones و همکاران در سال 2013 طی یک مطالعه گذشته‌نگر از نوامبر 2006 تا دسامبر 2011 روی میزان جداسازی گالی‌باکتریوم آناتیس و پاستورلا مولتوسیدا در نمونه‌های مرغ تخم‌گذار و مادر ارجاعی به آزمایشگاه تحقیق و تشخیص بیماری‌های طیور می‌سی‌سی‌پی دریافتند که میزان جداسازی گالی‌باکتریوم آناتیس در طی یک دوره 5 ساله رو به افزایش بوده است (11).

Wang و همکاران درسال 2016 برای تعیین روش شناسایی گونه‌ای گالی‌باکتریوم به وسیله (qPCR) روی ژن (gyrB) مطالعه‌ای انجام دادند که طی آن 22 نمونه از بیووارهای مختلف گالی‌باکتریوم آناتیس به عنوان مرجع و کنترل، 9 نمونه از 6 گونه گالی‌باکتریوم دیگر به جز گالی‌باکتریوم آناتیس و 21 نمونه از سایر باکتری‌های مهم خانواده‌های پاستورلاسه، فلاووباکتریاسه و انتروباکتریاسه مرتبط با طیور برای تشخیص تفریقی بهتر استفاده شدند. که آن‌ها توانستند با موفقیت تمام نمونه‌های مثبت را شناسایی کنند و ژن (gyrB) را که قبلاً توسط Bojesen و همکاران در 2007 شناسایی شده بود بین رقت‌های 10 تا 108 با حساسیت 97 درصد در مقابل 78 درصدPCR  عادی، شناسایی کنند (12).

El-Adawy و همکاران در آلمان در سال 2017 با استفاده از روش  PCR-RFLPروی 120 نمونه بافتی به دست آمده از ماکیان دارای علائم تنفسی و کاهش تولید در 18 منطقه جغرافیایی مختلف در ایالت تورینجیای آلمان به بررسی میزان آلودگی با گالی‌باکتریوم در ماکیان، بوقلمون و کبک پرداختند. این محققین از ارگان‌های مختلف دچار ضایعات پاتولوژیک از جمله کیسه‌های هوایی و نای جهت بررسی نمونه اخذ کردند و از 19 پرنده آلوده تعداد 9 پرنده (4/47 درصد) فقط درگیر با گونه گالی‌باکتریوم بودند و مابقی آن‌ها (6/52 درصد) علاوه بر گالی‌باکتریوم با انواع دیگری از باکتری‌ها نظیر اشریشیاکلی، کلستریدیوم پرفرنجنس و مایکوپلاسما و آدنوویروس‌ها آلوده بودند (13).

اولین جداسازی و شناسایی گالی‌باکتریوم آناتیس در ایران توسط Ataei و همکاران در سال 2016 گزارش شد. آن‌ها از پرایمر طراحی شده توسط Bojesen و همکاران در 2007 استفاده کردند که برمبنای شناسایی قطعه (ITS) بین 16S rRNA و 23S rRNA طراحی شده است. این محققین با اخذ نمونه سوآب از تخمدان، اویداکت، کلوآک و محوطه شکمی ماکیان تخم‌گذار دارای سالپنژیت ارجاعی به کشتارگاه صنعتی با استفاده از روش PCR و روش‌های فنوتیپی وجود گالی‌باکتریوم آناتیس را تأیید کردند (14).

در ادامه Omidvar و همکاران در سال 2018 وجود گالی‌باکتریوم آناتیس را در 5 گله انتخابی (2 گله تخم‌گذار صنعتی و 3 گله مرغ بومی تخم‌گذار رنگی) در استان اصفهان به وسیله PCR مورد تأیید قرار دادند. در این مطالعه از جفت پرایمر طراحی شده توسط نرم افزار Blast در سایت NCBI به منظور جستجوی ژنومی جنس گالی‌باکتریوم در نمونه‌ها مطابق روشی که قبلاً توسط محقق دانمارکی Bojesen و همکارانش در سال 2007 انجام شده بود استفاده کردند، با این تفاوت که از جفت پرایمر مخصوص جنس گالی‌باکتریوم برای ژن 16S rRNA به طول 154 bp برای شناسایی گالی‌باکتریوم آناتیس استفاده شد. نتایج حاکی از آن بود که از 50 نمونه سوآب اخذ شده از کلوآک و نای، 9 نمونه (18 درصد) آلوده به گالی‌باکتریوم آناتیس بود. نتایج تفکیکی مطالعه اخیر به این صورت بود که از 20 نمونه اخذ شده از دو گله تخم‌گذار صنعتی7 نمونه (35 درصد) از نمونه‌ها آلوده به باکتری بودند.

Bojesen و همکاران در سال 2003 به بررسی درصد شیوع گالی‌باکتریوم آناتیس بیووار همولایتیکا در گله‌های مرغ با سطوح امنیت زیستی متفاوت شامل مرغ تخم‌گذار ارگانیک با تغذیه در فضای باز، مرغ تخم‌گذار صنعتی، مرغ مادر تخم‌گذار، مرغ مادر گوشتی و گله اجداد گوشتی در دانمارک پرداختند. آن‌ها از هر مزرعه 30 پرنده انتخاب و سوآب نایی و کلوآک از هر یک اخذ کردند و تعیین کردند حتی اگر یک نمونه مثبت شد کل مزرعه را آلوده در نظر بگیرند. از کل 27 مزرعه مورد مطالعه تمام پرندگان مزارع اجداد گوشتی منفی و فاقد آلودگی بودند در حالی که 28 درصد پرندگان مرغ مادر گوشتی، 40 درصد پرندگان مرغ مادر تخم‌گذار، 67 درصد پرندگان گله‌های مرغ تخم‌گذار صنعتی و 96 درصد پرندگان مزارع مرغ تخم‌گذار ارگانیک با تغذیه در فضای باز مثبت بودند. از 9/95 درصد پرندگان مزارع آلوده (با انحراف معیار 6/7 درصد) گالی‌باکتریوم آناتیس بیووار همولایتیکا جداسازی شد و به صورت معنی‌داری درصد نمونه‌های مثبت در سوآب‌های اخذ شده از نای بالاتر از سوآب‌های کلوآک بود. این مطالعه اهمیت رعایت سطوح بالاتر امنیت زیستی را در کاهش میزان آلودگی مزارع یادآور می‌شود (15).

مطالعات Sorour و همکاران در سال 2015 در مصر با استفاده از PCR در اردک و ماکیان مبتلا به سندرم تنفسی نشان داد که گالی‌باکتریوم در 24 درصد ماکیان و 26 درصد اردک‌ها از 50 نمونه اخذ شده وجود داشت. این مطالعه نیز نقش امنیت زیستی را مورد تأکید قرار داده است (16).

مطالعات انجام شده دیگر بسیاری نیز نقش امنیت زیستی در میزان آلودگی گله‌ها به باکتری گالی‌باکتریوم آناتیس را مورد تأیید قرار می‌دهند. نتایج به دست آمده در مطالعه حاضر با نتایج سایر محققین در این مورد همخوانی دارد که با افزایش سن گله‌ها به علت مواجهه بیشتر با عوامل عفونی و کاهش میزان مقاومت سیستم ایمنی پرندگان و لغزش‌های مدیریت بهداشتی در پرورش گله‌ها میزان آلودگی روند افزایشی دارد. هر چند به علت گوناگونی نژاد‌های پرورشی گله‌های تخم‌گذار و شرایط پرورشی متنوع، لازم است تحقیقات بیشتری روی نقش تفاوت‌های نژادی در مقاومت به عفونت انجام پذیرد که از هدف تعیین شده مطالعه حاضر فاصله دارد. همچنین می‌توان نتیجه گرفت که بالاتر بردن سطح مدیریت بهداشتی و امنیت زیستی گله‌ها نقش تعیین کننده‌ای در کاهش میزان موارد آلودگی دارد (لازم به یادآوری است که تعیین توالی جدایه‌های به دست آمده که نتایج آن می‌تواند در ارتقاء مطالعات آتی کاملاً مؤثر باشد از اهداف بعدی محققین می‌باشد).

با توجه به نتایج به دست آمده در مطالعه حاضر و آلودگی 72/43 نمونه‌ها به گالی‌باکتریوم آناتیس و با توجه به محدودیت‌های اخذ نمونه‌ها به دلیل شیوع اپیدمی آنفلونزای فوق حاد در سطح کشور در زمان نمونه‌برداری می‌توان نتیجه گرفت آلودگی با گالی‌باکتریوم قطعاً در سطح گسترده‌ای در ایران وجود دارد و برای تعیین میزان شیوع کلی و برآورد میزان خسارت‌های سالانه ناشی از عفونت با این باکتری لازم است مطالعات جامع‌تری انجام شود. در کل با توجه به اطلاعات موجود، نبود واکسن مؤثر به صورت صنعتی و مقاومت ذاتی این باکتری به آنتی بیوتیک‌ها تنها راه کاهش خسارات بیماری رعایت بیشتر موارد امنیت زیستی در گله‌های مولد تخم‌مرغ می‌باشد.

سپاسگزاری

مطالعه حاضر براساس طرح مشترک مصوب دانشگاه تهران و موسسه واکسن و سرم سازی رازی انجام گرفته است. لذا نویسندگان برخود لازم می‌دانند از توجهات و مساعدت‌های معاونت پژوهشی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، اداره کل دامپزشکی استان تهران، معاونت پژوهشی موسسه واکسن و سرم سازی رازی، گروه میکروبیولوژی و ایمونولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران و سایر عزیزانی که ما را یاری کردند تشکر و قدردانی نمایند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

 

References

  1. Persson G, Bojesen AM. Bacterial determinants of importance in the virulence of Gallibacterium anatis in poultry. Vet Res. 2015; 46(1): 57. doi: 1186/s13567-015-0206-z
  2. Varan Singh S, Singh BR, Sinha DK, Kumar V, Prasannavadhana A, Bhardwaj M, Dubey S. Gallibacterium anatis: An Emerging Pathogen of Poultry Birds and Domiciled Birds. J Vet Sci Technol. 2015; 7(3): 1-7. doi: 4172/2157-7579.1000324
  3. Matthes S, Löliger HC. Beitrag zur Kinetik bakterieller Infektionen beim Huhn [Kinetics of bacterial infections in hens]. Berl Munch Tierarztl Wochenschr. 1976 Mar 1; 89(5): 98-102. German. PMID: 1259695
  4. Mushin R, Weisman Y, Singer N. Pasteurella haemolytica Found in the Respiratory Tract of Fowl. Avian Dis. 1980; Avian Diseases. 24(1): 162-168. doi: 2307/1589775
  5. Bisgaard M. Incidence of Pasteurella haemolytica in the respiratory tract of apparently healthy chickens and chickens with infectious bronchitis. characterisation of 213 strains. Avian Pathol. 1977; 6(4): 285-92. doi: 1080/03079457708418238
  6. Paudel S, Liebhart D, Aurich C, Hess M, Hess C. Pathogenesis of Gallibacterium anatis in a natural infection model fulfils Koch's postulates: 2. Epididymitis and decreased semen quality are the predominant effects in specific pathogen free cockerels. Avian Pathol. 2014; 43(6): 529-34. doi: 1080/03079457.2014.967176
  7. Shaw DP, Cook DB, Maheswaran SK, Lindeman CJ, Halvorson DA. Pasteurella haemolytica as a co-pathogen in pullets and laying hens. Avian Dis. 1990 Oct-Dec; 34(4): 1005-8. PMID: 2177972
  8. Bojesen AM, Vazquez ME, Robles F, Gonzalez C, Soriano EV, Olsen JE, Christensen H. Specific identification of Gallibacterium by a PCR using primers targeting the 16S rRNA and 23S rRNA genes. Vet Microbiol. 2007; 123(1-3): 262-268. doi: 1016/j.vetmic.2007.02.013
  9. Zepeda A, Ramırez S,Vega V, Morales V, Talavera M, Salgado-Miranda C, Simon-Martınez J, Bojesen AM, Soriano-Vargas E. Hemagglutinating Activity of Gallibacterium Avian Dis. 2009; 53(1): 115-118. doi: 10.1637/8375-060908-resnote.1
  10. Huangfu H, Zhao J, Yang X, Chen L, Chang H, Wang X, Li Q, Yao H, Wang C. Development and Preliminary Application of a Quantitative PCR Assay for Detecting gtxA-Containing Gallibacterium Species in Chickens. Avian Dis. 2012; 56(2): 315-320. doi: 1637/9907-082511-reg.1
  11. Jones KH,Thornton JK, Zhang Y, Mauel MJ. A 5-year retrospective report of Gallibacterium anatis and pasteurella multocida isolates from chickens in Mississippi. Poult Sci. 2013; 92(12): 3166-3171.doi: 3382/ps.2013-03321
  12. Wang C, Robles F, Ramirez S, Riber AB, Bojesen AM. Culture-independent identification and quantification of Gallibacterium anatis ( anatis) by real-time quantitative PCR. Avian Pathol. 2016; 45(5): 538-544. doi: 10.1080/03079457.2016.1184743
  13. El-Adawy H, Bocklisch H, Neubauer H, Hafez HM, Hotzel H. Identification, differentiation and antibiotic susceptibility of Gallibacterium isolates from diseased poultry. Ir Vet J. 2018; 71: 5. doi: 1186/s13620-018-0116-2
  14. Ataei S, Bojesen AM, Amininajafi F, Ranjbar MM, Banani M, Afkhamnia M, Abtin A, Goodarzi H. First report of Gallibacterium isolation from layer chickens in Iran. Arch Razi Inst. 2017; 72(2): 125-130. doi: 22092/ari.2017.109842
  15. Bojesen AM, Christensen H, Nielsen OL, Olsen JE, Bisgaard M. Detection of Gallibacterium in Chickens by Fluorescent 16S rRNA In Situ Hybridization. J Clin Microbiol. 2003; 41(11): 5167-5172. doi: 10.1128/JCM.41.11.5167-5172.2003
  16. Sorour HK, Al Atfeehy NM, Shalaby AG. Gallibacterium Anatis Infection in Chickens and Ducks. Assiut Vet Med J. 2015; 61(147): 80-86.
Journal of Veterinary Research
Volume 77, Issue 1
March 2022
Pages 19-27

Files

Share

How to cite

Statistics