Effect of Chitosan and Nano-Chitosan Loaded Clinoptilolite on Histomorphology and Pepsin Activity in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) Stomach

Document Type : Aquatic Animal Health Management

Authors

1 Graduated from the Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

2 Department of Aquatic Animal Health, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran

3 Department of Food Hygiene and Aquatic Animals, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tabriz, Tabriz, Iran

4 Department of Fisheries, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

5 Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tabriz, Tabriz, Iran

Abstract

BACKGROUND: Numerous studies have investigated the positive effect of chitosan and nano-chitosan loaded clinoptilolite on growth performance, digestive enzyme activity, and intestinal histomorphology in different fish species. However, there are no data evaluating the potential effect of the composites on the fish stomach.
OBJECTIVES: In the current study, the effects of chitosan and nano-chitosan loaded clinoptilolite on histological features and pepsin activity in the rainbow trout stomach were considered.
METHODS: Chitosan and nano-chitosan loaded clinoptilolite were synthesized, and then two hundred and forty fish (~27.75 g) fish were distributed in eight groups each in three replicates. Ten days after adaptation, the fish were fed with eight diets, including control diet (CTR), clinpotilolite (T1), chitosan composites (T2, T3, T4), and nano-chitosan composites (T5, T6, T7) for 70 days. Afterward, all fish in each tank were anesthetized in clove extract (50 μl/l), and tissue samples were obtained for pepsin activity (n= 5) and histological assay (n = 5).
RESULTS: The groups administrated with nanochitosan composites showed the highest pepsin activity (P˂0.05). Additionally, histological examinations exhibited a higher epithelial height, increased mucosal density, and oxynticopeptic cells hypertrophy in fish fed composites compared to the CTR group (P˂0.05). Meanwhile, nanochitosan composite administration could cause higher reaction of secreted granules to periodic acid–Schiff (PAS) staining.
CONCLUSIONS: The findings demonstrated the potential application of chitosan and nano-chitosan loaded clinoptilolite composites for improvements in the histomorphology and pepsin activity of the rainbow trout stomach, resulting in higher growth performance.

Keywords

Main Subjects

Full Text

مقدمه

کیتوزان یکی از انواع پلی‌ساکاریدهای پرکاربرد در صنایع مختلف مانند نساجی، کشاورزی، بهداشتی و صنایع غذایی می‌باشد (1). اثرات کیتوزان در بهبود رشد، تقویت سیستم ایمنی، افزایش مقاومت در برابر بیماری‌ها و صنایع شیلاتی در گونه‌های آبزی مشخص شده است (2، 3). مطالعات نشان داده است که کوچک کردن اندازه ذرات این ترکیب سبب بهبود حلالیت و کارایی آن در مقایسه با اندازه‌های بزرگ‌تر کیتوزان می‌شود به طوری که بهبود اثرات مفید نانوکیتوزان در مقایسه با کیتوزان در ماهی تیلاپیای نیل (Oreochromis nilotica) گزارش شده است (4).

کلینوپتیلولیت نوعی زئولیت طبیعی است که در صنایع کشاورزی، صنایع طبیعی و پزشکی کاربرد دارد‌‌ (5). افزودن این ترکیب به خوراک ماهی نیز قادر به بهبود رشد، کاهش تلفات و کاهش مسمومیت می‌باشد ‌(6). ضمناً این ترکیب به عنوان پایه جهت ساخت انواع کامپوزیت به شمار می‌رود. مطالعات گذشته نشان داد که استفاده از کامپوزیت‌های کیتوزان و نانوکیتوزان بارگذاری شده بر روی کلینوپتیلولیت قادر به افزایش اثرات مفید مربوط به هر کدام از ترکیبات به تنهایی می‌باشد (7-9).

در سال‌های اخیر، استفاده از مواد افزودنی مختلف به منظور بهبود روند هضم و کارایی خوراک، افزایش رشد و افزایش مقاومت در مقابل عوامل بیماریزای مختلف در گونه‌های مختلف ماهی معمول گردیده است (10-14). در همین راستا، اثرات این افزودنی‌ها بر فعالیت‌های گوارشی، جذب مواد و بهبود ساختار روده و در نهایت افزایش رشد نیز مورد بررسی قرار گرفته است (10-14). هر چند بررسی در زمینه اثرات این مواد بر میزان فعالیت آنزیم پپسین تا حدودی مدنظر قرار گرفته است اما مطالعات بسیار محدودی در زمینه اثرات برخی ترکیبات مانند روغن‌های فرار و عصاره برگ کنار هندی (Ziziphus mauritiana) بر ساختار بافتی معده در گونه‌های ماهی گزارش گردید (15، 16). با توجه به فقدان اطلاعات در زمینه اثرات کامپوزیت‌های کیتوزان و نانوکیتوزان بارگذاری شده بر روی کلینوپتیلولیت بر معده ماهی، مطالعه حاضر پایه‌ریزی گردید تا اثر این نوع کامپوزیت‌ها بر ساختار بافت‌شناسی معده و فعالیت آنزیم پپسین را ارزیابی کند.

مواد و روش کار

آماده‌سازی کیتوزان و نانوکیتوزان بارگذاری شده در کلینوپتیلولیت: کلینوپتیلولیت طبیعی خریداری شده از شرکت افرند توسکا (اصفهان، ایران) با هاون به ذرات کوچک‌تر (کمتر از 100 میکرومتر) تبدیل شده و سپس از صافی رد شدند. برای آماده‌سازی نانوکیتوزان بارگذاری شده در کلینوپتیلولیت، کیتوزان با وزن مولکولی متوسط تهیه شده از شرکت سیگما (آمریکا) (26/0 گرم) با محلول اسید استیک 5/0 درصد (20 میلی‌لیتر) و آب مقطر (130 میلی‌لیتر) مخلوط شد و سپس محلول تری‌پلی‌ فسفات سدیم (95/4 میلی لیتر) با غلظت 1/54 میلی‌گرم در میلی‌لیتر به این ترکیب اضافه شد. نانوکیتوزان‌های ساخته شده به میزان 05/0، 5/0 و 5 گرم با کلینوپتیلولیت (28/14 گرم) هم زده شد و به مدت 30 دقیقه سونیکه شد.

برای ساختن کیتوزان بارگذاری شده در کلینوپتیلولیت، کیتوزان به میزان 05/0، 5/0 و 5 گرم و کلینوپتیلولیت (28/14 گرم) به صورت جداگانه با آب مقطر (50 میلی لیتر) حل شدند و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق هم زده شدند. محلول‌های کیتوزان و کلینوپتیلولیت با هم مخلوط شده و به مدت 24 ساعت هم زده شد و در دمای 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت خشک شد (9).

طراحی آزمایشگاهی: مطالعه حاضر در یک مرکز پرورش ماهی خصوصی واقع در فیروزکوه انجام شد. مراحل مطالعه بر روی ماهی براساس دستورالعمل کمیته اخلاق زیست پزشکی دانشگاه تبریز (کد FVM.REC.1396.938) انجام شد. در مطالعه حاضر، 240 قطعه ماهی قزل‌آلای سالم با میانگین وزن 34/0 ± 75/27 گرم در 24 بتونی به ابعاد 7/1 × 60/0 × 30/0 متر و با تراکم 10 قطعه ماهی در هر تانک توزیع شدند. شاخص‌های فیزیکوشیمیایی آب چاه مورد استفاده در مطالعه حاضر به قرار زیر بود: درجه حرارت (1/1 ± 2/12 درجه سانتی‌گراد)، pH (3/0 ± 5/7)، اکسیژن محلول (4/0 ± 7/8 میلی‌گرم در لیتر). در مدت 10 روزه سازگاری، ماهی‌ها با جیره پایه (جدول 1) به میزان 1/2 درصد و سه بار در روز تغذیه شدند.

در مطالعه حاضر، همانند مطالعه قبلی (9)، هشت گروه مختلف به قرار زیر مورد بررسی قرار گرفتند:

گروه CTR (تغذیه شده با جیره پایه فاقد کیتوزان، نانوکیتوزان و کامپوزیت)

گروه T1 (تغذیه شده با جیره حاوی 28/14 گرم در کیلوگرم کلینوپتیلولیت)

گروه T2 (تغذیه شده با جیره حاوی 05/0 گرم کیتوزان بارگذاری شده در 28/14 گرم کلینوپتیلولیت)

گروه T3 (تغذیه شده با جیره حاوی 5/0 گرم کیتوزان بارگذاری شده در 28/14 گرم کلینوپتیلولیت)

گروه T4 (تغذیه شده با جیره حاوی 5 گرم کیتوزان بارگذاری شده در 28/14 گرم کلینوپتیلولیت)

گروه T5 (تغذیه شده با جیره حاوی 05/0 گرم نانوکیتوزان بارگذاری شده در 28/14 گرم کلینوپتیلولیت)

گروه T6 (تغذیه شده با جیره حاوی 5/0 گرم نانوکیتوزان بارگذاری شده در 28/14 گرم کلینوپتیلولیت)

گروه T7 (تغذیه شده با جیره حاوی 5 گرم نانوکیتوزان بارگذاری شده در 28/14 گرم کلینوپتیلولیت)

ترکیبات موجود در جیره پایه (9) با مقادیر ذکر شده از کلینوپتیلولیت و یا کامپوزیت‌های ساخته شده در بالا مخلوط و بعد از پلت زنی از صافی‌های 4-5/3 میلی‌متری رد شد و در پلاستیک‌های جداگانه تا زمان مصرف در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگه‌داری شد. بعد از اتمام دوره سازگاری، ماهی‌های نگه‌داری شده در گروه‌های مختلف به مدت 70 روز پیاپی خوراک مربوط به گروه کنترل و یا تیمار ذکر شده در بالا را به میزان 1/2-2 درصد وزن بدن به صورت روزانه دریافت نمودند.

بررسی میزان فعالیت پپسین: در روز 70ام، 5 قطعه ماهی در هر تانک به صورت کاملاً تصادفی انتخاب و پس از بیهوشی در عصاره گل میخک (50 میکرولیتر در لیتر)، بافت معده هر ماهی به صورت کامل جدا شد و پس از شستشو با بافر PBS (Phosphate buffer saline)، بافت‌های مورد نظر در نیتروژن مایع فریز شد. بعد از له نمودن، بافت‌های همگن شده با بافرتریس هیدروکلرید 25 میلی‌مولار مخلوط شدند. ترکیب ایجاد شده به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ (4000 دور در دقیقه) شد و محلول‌رویی جمع‌آوری شده و در دمای 20- درجه سانتی‌گراد جهت بررسی میزان فعالیت آنزیم پپسین ذخیره سازی شد.

برای بررسی فعالیت پپسین، ابتدا میزان محتوای پروتئینی موجود در بافت معده ماهی‌ها به روش لوری ‌(17) محاسبه گردید. در این مطالعه، هموگلوبین به عنوان سوبسترا مورد استفاده قرار گرفت. ترکیب مورد نظر حاوی هموگلوبین گاوی 1 درصد (5/0 میلی‌لیتر) حل شده در اسیدکلریدریک 075/0 مولار با هموژن معدی (4/0 میلی‌لیتر) مخلوط شد و انکوباسیون به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انجام گردید. واکنش با افزودن تری‌کلرواستیک اسید 10 درصد (1 میلی‌لیتر) متوقف شد و سپس سانتریفیوژ (4000 دور در دقیقه) به مدت 10 دقیقه انجام گردید. در انتها میزان تیروزین (میکروگرم) آزادسازی شده با فعالیت آنزیم پپسین در هموژن معدی به روش لوری (17) محاسبه شد (7).

مطالعه بافت‌شناسی: پس از اتمام دوره پرورش، از هر تانک به طور تصادفی 5 ماهی انتخاب و پس از بیهوشی در عصاره گل میخک (50 میکرولیتر در لیتر)، ابتدا کل لوله گوارش خارج و سپس معده به طور کامل و با دقت جدا و در محلول تثبیت کننده فرمالین بافر 10 درصد قرار داده شد. قبل از قرار دادن نمونه‌های بافتی در محلول تثبیت کننده با استفاده سرنگ مقداری از محلول تثبیت کننده درون حفره داخلی معده تزریق شد تا تثبیت طبقه مخاطی به خوبی صورت پذیرد. پس از انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاه بافت‌شناسی، از کل معده برش‌های متوالی 1 سانتی‌متری تهیه و برای پاساژ بافتی و قالب‌گیری به روش استاندارد و روتین با استفاده از دستگاه هیستوکینت مدل 2000 (لایکا، آلمان) آماده شد. سپس از قالب‌های پارافینی توسط میکروتوم دورانی برش‌های نازک به ضخامت 5 میکرومتر (جهت مطالعه هیستولوژی) و برش‌های ضخیم به ضخامت 30 میکرومتر (جهت مطالعات هیستومورفومتری و استریولوژیک) به صورت متوالی تهیه شد تا پس از خشک شدن مورد رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین (H&E)، پریودیک اسید شیف (PAS) و آلسین بلو (AB) قرار گیرند.

برای مقایسه دقیق و کمی تغییرات ساختار بافتی معده از مطالعات هیستومورفومتری و استریولوژی بهره گرفته شد. کلیه مطالعات استریولوژیک با استفاده از میکروسکوپ متصل به میکروکیتور، دوربین مدار بسته و سیستم رایانه‌ای مجهز به نسخه شماره 9 نرم افزار Stereo- investigator انجام شد. به منظور تعیین اولین مقطع و حداقل فواصل بین مقاطع، از مطالعه پایلوت استفاده شد. در تمام مراحل نمونه‌گیری جهت مطالعات استریولوژیک، رعایت اصل انتخاب تصادفی یکنواخت منظم در نظر گرفته شد. بدین صورت که اولین برش به ضخامت 30 میکرومتر انتخاب (با استفاده از اعداد تصادفی) و پس از آن چهار برش به ضخامت 5 میکرومتر تهیه و انتخاب شد. سپس 400 میکرون از بافت برداشته شده و مجدداً یک برش به ضخامت 20 میکرومتر و چهار برش به ضخامت 5 میکرومتر تهیه و انتخاب گردید و این عمل تا انتهای نمونه در بلوک پارافینی ادامه پیدا کرد به نحوی که از هر بلوک 15 تا 18 برش ضخیم جهت مطالعات استریولوژیک انتخاب شد. با توجه به این که کلیه مراحل تهیه مقاطع بافتی و رنگ‌آمیزی در همه گروه‌ها کاملاً یکسان و مشابه بوده و به روش استاندارد انجام گرفت، لذا میزان چروکیدگی بافتی ناشی از این مراحل در همه گروه‌ها یکسان بوده و اثر آن در محاسبات کمی جهت مقایسه متغیرها بین گروه‌های مختلف در نظر گرفته نشد.

برای تعیین ارتفاع بافت پوششی با استفاده از سیستم Stereo- investigator فاصله سطح سلول پوششی تا قاعده آن که بر روی غشاء پایه قرار دارد با لنز شیئی 100 در 10 سلول از هر مقطع و حداقل 100 سلول در یک ماهی اندازه‌گیری شد و میانگین آن گزارش گردید. برای اندازه‌گیری ضخامت طبقات مختلف دیواره معده شامل طبقه مخاطی، زیر مخاطی، عضلانی و سروزی در چهار ناحیه از دو قطر عمود بر هم از داخلی‌ترین مرز تا خارجی‌ترین مرز مربوط به آن طبقه اندازه‌گیری شده و میانگین آن به عنوان ضخامت هر طبقه در هر مقطع در نظر گرفته شد.

برای تعیین نسبت حجمی بافت پوششی و هر طبقات مخاطی، زیر مخاطی، عضلانی و سروزی با استفاده از تکنیک شمارش نقطه‌ای چگالی حجمی (حجم نسبی) هر ساختار نسبت به کل دیواره با استفاده از بزرگنمایی مناسب و گرید نقطه‌ای با فرمول زیر محاسبه شد:

VV(structure/wall) = P(structure) / P(Wall)

که در آن "P(structure)" تعداد نقاط برخورد کرده با هر ساختار و "P(Wall)" تعداد نقاط گرید که با کل بافت دیواره معده برخورد کرده است می‌باشد.

برای تخمین تراکم عددی یا متوسط تعداد سلول‌های اکسینتیکوپپتیک در هر میلی‌متر مکعب از طبقه زیر مخاط معده از روش دایسکتور نوری بر روی برش‌های ضخیم استفاده شد:

NV(cell/ref) :=

که "∑Q-" تعداد هسته‌های شمارش شده سلول‌های اکسینتیکوپپتیک، "∑A" مساحت مجموع قاب‌های شمارش شده در همه میدان‌های دید مورد بررسی توسط نرم افزار Stereo- investigator و "h" ارتفاع دایسکتور نوری است.

متوسط حجم سلول‌های اکسینتیکوپپتیک با روش نوکلئوتور تخمین زده شد. بدین‌ صورت که در بزرگنمایی 1000 (لنز شیئی x 100)، نقطه مرجع در مرکز هندسی سلول اکسینتیکوپپتیک مشخص شد و سپس از طریق برنامه مخصوص آن در نرم افزار سیستم Stereo- investigator دو محور عمود بر هم در نقطه مرجع ایجاد شد، به نحوی که غشاء سلول را در 4 نقطه قطع ‌کرد. این 4 نقطه علامت‌گذاری شدند و نرم افزار حجم ساختار (بر حسب میکرومتر مکعب) را بر اساس فرمول  VO =4.3 πlo3 محاسبه نمود. که در این فرمول "lo" نشان دهنده میانگین قسمت طولی بین نقطه مرجع و نقطه قطع شده غشاء می‌باشد. تعداد سلول‌های ارزیابی شده برابر با تعداد سلول‌های انتخاب شده به وسیله قاب شمارش برای تعیین تراکم عددی بود. در نهایت میانگین اعداد به دست آمده (VO (µm3) = ΣVO / n) به عنوان متوسط حجم سلول اکسینتیکوپپتیک در هر مقطع گزارش گردید.

آنالیز آماری: در تمام موارد داده‌ها به صورت خطای استاندارد ± میانگین (mean±SEM) گزارش شده و با استفاده از نرم‌افزار آماری SPSS نسخه 21 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. ضریب تغییرات (CV) و میانگین ضریب خطا (CE) داده‌های استریولوژی جهت بررسی اعتبار داده‌ها به روش Gundersen و همکاران در سال 1999 محاسبه گردید. جهت بررسی توزیع نرمال داده‌ها، از آزمون کولموگوروف- اسمیرنوف و جهت مقایسه داده‌های مربوط به فعالیت پپسین، هیستومورفومتری و استریولوژیک و مقایسه آن‌ها بین گروه‌های مورد مطالعه از آزمون آماری آنالیز واریانس یک طرفه و پس‌ آزمون (آزمون تعقیبی) توکی استفاده شد.

نتایج

در مطالعه حاضر، میزان فعالیت آنزیم پپسین در گروه‌های دریافت کننده کامپوزیت کیتوزان و نانوکیتوزان در مقایسه با گروه‌های کنترل (CTR) و گروه دریافت کننده کلینوپتیلولیت (T1) افزایش معنی‌داری یافت (000/0=P). مقایسه دوزهای مختلف کامپوزیت‌ها نشان داد که بالاترین میزان فعالیت در نانوکامپوزیت‌ها به خصوص در دوز بالا (T7) مشاهده شد (نمودار 1). ضخامت نواحی مختلف دیواره بدنه (fundus) معده بعد از مصرف کلینوپتیلولیت و کامپوزیت‌های کیتوزان و نانوکیتوزان بارگذاری شده در کلینوپتیلولیت در جدول 1 نشان داده شده است. مطالعه حاضر نشان داد که ارتفاع بافت پوششی معده در دوز بالای کامپوزیت کیتوزان (T4) (044/0=P) و دوزهای مختلف نانوکامپوزیت (T5-T7) افزایش معنی‌داری در مقایسه با گروه کنترل نشان داد (به ترتیب 006/0=P، 002/0=P و 000/0=P). ضخامت طبقه مخاطی معده با مصرف کامپوزیت‌ها به خصوص نوع نانوکامپوزیت افزایش یافت (T2 در مقایسه با کنترل 035/0=P و T3 تا T7 در مقایسه با گروه کنترل 000/0=P).

نسبت حجمی نواحی مختلف دیواره بدنه معده بعد از مصرف کلینوپتیلولیت و کامپوزیت‌های کیتوزان و نانوکیتوزان بارگذاری شده در کلینوپتیلولیت در جدول 2 نشان داده شده است. نسبت حجمی طبقه مخاطی به دیواره معده الگوی مشابه ضخامت طبقه مخاطی را در گروه‌های مختلف نشان داد (T2 در مقایسه با کنترل 036/0=P و T3 تا T7 در مقایسه با گروه کنترل 000/0=P). در مقابل، نسبت حجمی طبقه زیر مخاطی (T3 در مقایسه با کنترل 044/0=P، T4 در مقایسه با کنترل 008/0=P و T5 تا T7 در مقایسه با گروه کنترل 000/0=P) و طبقه عضلانی (T3 در مقایسه با کنترل 001/0=P و T4 تا T7 در مقایسه با گروه کنترل 000/0=P) به دیواره معده در گروه‌های مختلف در مقایسه با گروه کنترل کاهش یافت.

به علاوه، تغییرات در تراکم، مورفولوژی، اندازه و شدت رنگ‌پذیری سلول‌های ترشحی غدد معدی در ناحیه پارین طبقه مخاطی دیواره معده ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان در گروه‌های مختلف مشاهده شد (تصویر 1،2،3،4،5،6). اندازه و تراکم سلول‌های اکسینتیکوپپتیک (oxynticopeptic cells) غدد معدی در گروه دریافت کننده زئولیت (T1) نسبت به گروه کنترل (CTR) کاهش پیدا کرد (000/0=P) اما شدت رنگ‌پذیری گرانول‌های سیتوپلاسمی آن به رنگ‌آمیزی PAS دچار تغییر معنی‌داری نشد.

افزودن کامپوزیت کیتوزان با دوزهای متوسط و بالا (T3 و T4) باعث افزایش میانگین حجم سلول‌های اکسینتیکوپپتیک شد (000/0=P). این تغییرات در گروه‌های دریافت کننده دوز بالای کامپوزیت کیتوزان (T4) نسبت به دوزهای کم و متوسط (T2 و T3) بیشتر بود (000/0=P). اثر اضافه نمودن دوزهای مختلف کامپوزیت نانوکیتوزان بر وضعیت هیستولوژیک سلول‌های اکسینتیکوپپتیک بیشتر از دوزهای مشابه کامپوزیت کیتوزان بود (000/0=P)، به نحوی که در گروه دریافت کننده دوز بالای کامپوزیت نانوکیتوزان (T5)، میانگین حجم سلول‌های ترشحی افزایش یافت و سلول‌های بزرگ با گرانول‌های ترشحی مشخص که اکثراً به شدت با رنگ PAS واکنش مثبت نشان دادند، قابل مشاهده بود (نمودار 2). در مقابل، مصرف کامپوزیت‌های کیتوزان و نانوکیتوزان تغییر معنی‌داری در تعداد سلول‌های اکسینتیکوپپتیک معده ماهی‌ها در مقایسه با گروه کنترل ایجاد نکرد (نمودار 3).

بحث

مطالعات پیشین کارایی کیتوزان، نانوکیتوزان و کلینوپتیلولیت به تنهایی و در فرم کامپوزیت بر رشد، تقویت سیستم بیوشیمیایی و ایمنی و بهبود ساختار روده را نشان دادند (7-9). در مطالعه حاضر، مصرف کامپوزیت‌های کیتوزان و نانوکیتوزان سبب افزایش فعالیت پپسین و بهبود ساختار بافت‌شناسی معده از نظر ارتفاع بافت پوششی، ضخامت طبقه مخاطی و میانگین حجم سلول‌های اکسینتیکوپپتیک در مقایسه با گروه کنترل گردید.

افزودن کامپوزیت‌های کیتوزان و نانوکیتوزان به خوراک ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان سبب افزایش فعالیت آنزیم پپسین گردید؛ هر چند در مقایسه، کامپوزیت نانوکیتوزان اثر قوی‌تری را در مقایسه با گروه کنترل نشان داد. در مطالعات پیشین نیز متعاقب مصرف افزودنی‌های مختلف اثر مشابهی گزارش گردید. به عنوان مثال، عصاره اتانولی بره بوم موجود در خوراک فیل ماهی (Huso huso) سبب افزایش فعالیت پپسین گردید (18). در همین راستا، افزودنی شامل گزنه (Urtica dioica) و انبه (Mangifera indica) در خوراک ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان قادر به افزایش فعالیت پپسین بود (19). فعالیت آنزیم‌های گوارشی از اعمال مهم متابولیک در بدن جانداران می‌باشد که در نهایت سبب افزایش میزان رشد می‌شود. بنابراین به نظر می‌رسد که افزایش رشد متعاقب مصرف این کامپوزیت‌ها که در مطالعه قبلی (9) گزارش گردید تا حدودی مرتبط با افزایش فعالیت آنزیم‌های گوارشی مانند پپسین باشد.

ویژگی‌های ساختاری و عملکرد پروتئولیتیک سلول‌های اکسینتیکوپپتیک در ناحیه بدنه معده بسیاری از ماهیان استخوانی واجد معده حقیقی مانند قزل‌آلای رنگین‌کمان به خوبی شناخته شده است (16، 20). به خوبی مشخص شده است که این سلول‌ها می‌توانند پروتئین‌های رژیم غذایی را به زنجیره‌های پپتیدی کوچک‌تر تبدیل کرده و پلیمریزه کنند (21-23). تولیدات و ترشحات این سلول، هضم اولیه و خارج سلولی پروتئین‌های موجود در جیره غذایی و سپس انتقال آن از طریق غشاء به درون سلول را فراهم می‌کند. این عملکرد فرآیندی کارآمدتر نسبت به برداشت پروتئین‌ها با عمل پینوسیتوز و هضم درون سلولی آن‌ها می‌باشد (24). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که به کارگیری کامپوزیت‌های کیتوزان و نانوکیتوزان تغییری در تعداد سلول‌های اکسینتیکوپپتیک ایجاد نمی‌کند اما استفاده از آن‌ها و به طور ویژه استفاده از 

نانوکیتوزان به صورت وابسته به دوز و مقدار مصرف آن در جیره باعث تغییر در اندازه و حجم این سلول‌ها می‌شودکه نشان دهنده افزایش فعالیت و عملکرد آن‌ها در حضور نانوکیتوزان است که نتیجه نهایی آن، افزایش ترشح آنزیم پپسین بود. نتایج ارزیابی میزان فعالیت آنزیم پپسین معده در مطالعه حاضر نیز این مسئله را تأیید نمود.

در مطالعه حاضر، آنالیز مورفومتریک معده انجام شد تا فهم بهتر اثرات کامپوزیت‌های مورد استفاده در سطح بخشی از دستگاه گوارش انجام شود که نتیجه نهایی آن تأثیر بر رشد ماهی می‌باشد. ارتفاع بافت پوششی در گروه‌های تیمار شده با کامپوزیت‌ها به خصوص از نوع نانوکامپوزیت‌ها در مقایسه با گروه کنترل افزایش یافت. بررسی مطالعات قبل نشان داد که بافت پوششی نواحی مختلف معده در ماهیان استخوانی واجد معده حقیقی، از نوع استوانه‌ای ساده است که هسته در ناحیه نزدیک به قاعده قرار دارد و در سیتوپلاسم رأسی آن‌ها موسین قابل مشاهده می‌باشد (20). سلول‌های پوششی معده در اکثر ماهیان استخوانی، موسین خنثی تولید می‌کنند که موکوس ترشح شده توسط آن‌ها نقش محافظتی برای مخاط ایفا می‌نماید (25). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که استفاده از نانوکیتوزان به صورت وابسته به دوز باعث افزایش ارتفاع بافت پوششی شد. به نظر می‌رسد افزایش ارتفاع سلول‌های پوششی نشان دهنده افزایش کارایی و فعالیت آن‌ها می‌باشد.

استفاده از کامپوزیت کیتوزان به صورت وابسته به دوز باعث افزایش ضخامت طبقه مخاطی معده شد. در این مورد اثر فرم نانوکیتوزان به طور معنی‌داری بیشتر از کیتوزان بود. طبقه مخاطی ناحیه بدنه معده اساساً از غدد لوله‌ای منشعب ساده‌ای تشکیل شده است که دارای سلول‌های ترشحی اکسینتیکوپپتیک می‌باشد. مابین غدد بافت همبند نازک مربوط به پارین (لامینا پروپریا) و بستر مویرگی بسیار ظریف قرار دارد (26). از آنجا که تعداد سلول‌های ترشحی غدد تغییر معنی‌داری پیدا نکرد اما اندازه و حجم آن‌ها به واسطه مصرف کیتوزان و بالاخص نانوکیتوزان به طور معنی‌داری افزایش پیدا کرد، لذا به نظر می‌رسد افزایش ضخامت و همچنین نسبت حجمی طبقه مخاطی به همین دلیل باشد.

یکی از نتایج جالب توجه مطالعه حاضر اثر استفاده از کیتوزان و نانوکیتوزان بر وضعیت گرانول‌های ترشحی موجود در سیتوپلاسم سلول‌های اکسینتیکوپپتیک بود. مشخص شد که نانوکیتوزان باعث ایجاد واکنش شدیدتر گرانول‌های ترشحی به رنگ آمیزی پریودیک اسید شیف (PAS) می‌گردد. هرچند به خوبی مشخص شد که وضعیت ساختاری سلول‌های ترشحی غدد معده دقیقاً به عادات غذایی و ترکیب رژیم غذایی ماهی مرتبط است اما این سلول‌ها حاوی پروتئین‌های غنی از آمینواسیدهای مختلف مانند تیروزین، آرژنین و تریپتوفان می‌باشند که نشان دهنده وجود پیش‌سازهای آنزیمی مانند پپسینوژن یا آنزیم‌های گوارشی مشابه است. در سیتوپلاسم رأسی آن‌ها محصولات ترشحی گرانول‌های حاوی موسین‌های خنثی مشاهده می‌شود که در رنگ آمیزی با PAS ارغوانی رنگ می‌شود (24). هرچند مطالعات تکمیلی بیشتری در این مورد نیاز است اما گزارشاتی وجود دارد که نشان می‌دهد موسین خنثی تولید شده در معده نقش مهمی در انتقال ماکرومولکول‌ها، افزایش کارایی گوارشی، دفاع در برابر باکتری‌ها اثر بافری بر اسیدیته بالای محتوای معده و جلوگیری از آسیب پروتئولیتیک به بافت پوششی معده بر عهده دارد (27).

در کل، مطالعات بسیار محدودی درباره اثرات افزودنی‌های خوراکی بر ساختار بافتی معده ماهی وجود دارد. Mazzoni و همکاران در سال 2021 نشان دادند که ترکیب جیره غذایی می‌تواند باعث تغییر در تعداد و عملکرد سلول‌های اکسینتیکوپپتیک گردد. نتایج این مطالعه مشخص نمود که استفاده از روغن‌های ضروری می‌تواند باعث کاهش تعداد این سلول‌ها در غدد معده ماهی شود (16). همچنین تنها در یک مطالعه (15)، افزایش ضخامت لایه مخاطی و عضلانی معده در ماهی تیلاپیای نیل تغذیه شده با عصاره برگ کنار هندی (Ziziphus mauritiana) گزارش گردید. هر چند تغییرات مشخصی در ضخامت طبقه مخاطی در تیمارهای مختلف مطالعه حاضر مشاهده شد اما تغییرات معنی‌داری در ضخامت طبقه عضلانی متعاقب استفاده از کامپوزیت کیتوزان و نانوکیتوزان مشاهده نگردید. شایان ذکر است که در کنار اثرات مثبت کیتوزان، اثرات منفی کیتوزان، به خصوص در مقادیر زیاد، بر کارایی رشد و سیستم آنتی‌اکسیدان مربوط به تولید رادیکال‌های فعال اکسیژن در ماهی‌های مختلف مشخص گردیده است (28، 29). بنابراین، استفاده از مقادیر مناسب کیتوزان و نانوکیتوزان در گونه‌های ماهی مهم به نظر می‌رسد.

نتیجه‌گیری نهایی: به طور کلی نتایج مطالعه حاضر بیانگر اثرات مثبت کامپوزیت‌های مورد استفاده، به خصوص کامپوزیت نانوکیتوزان بارگذاری شده در کلینوپتیلولیت، بر فعالیت پپسین، ارتفاع بافت پوششی و ضخامت طبقه مخاطی و همچنین میانگین حجم سلول‌های اکسینتیکوپپتیک معده در ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان می‌باشد. مطالعات تکمیلی در زمینه بررسی اثرات این کامپوزیت‌ها بر ساختار معده با روش‌های ایمونوهیستوشیمی و real-time PCR به منظور فهم بهتر مکانیسم عمل این افزودنی‌ها توصیه می‌گردد.

سپاسگزاری

مطالعه حاضر با حمایت مالی معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات انجام گرفته است.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

References

  1. Shariatinia Z. Pharmaceutical applications of chitosan. Adv Colloid Interface Sci. 2019;263:131-194. doi: 10.1016/j.cis.2018.11.008
  2. Alishahi A, Aïder M. Applications of chitosan in the seafood industry and aquaculture: A review. Food Bioproc Tech. 2011;5:817-830. doi: 10.1007/s11947-011-0664-x
  3. Abdel-Ghani HM, Salem MES. Effects of dietary chitosan supplementation on farmed fish; a review. Rev Aquac. 2021;12:438-452. doi: 10.1111/raq.12326
  4. Wang Y, Li J. Effects of chitosan nanopaticles on survival, growth and meat quality of tilapia, Oreochromis nilotica. Nanotoxicology. 2011;5:425-431. doi: 10.3109/17435390.2010.530354 PMID: 21039183
  5. Pavelić SK, Medica JS, Gumbarević D, Filoŝević A, Pržulj N, Pavelić K. Critical review on zeolite clinoptilolite safety and medical applications in vivo. Front Pharmacol. 2018;9:1350. doi: 10.3389/fphar.2018.01350 PMID: 30538633
  6. Ghasemi Z, Sourinejad I, Kazemian H, Rohani S. Application of zeolites in aquaculture industry: a review. Rev Aquac. 2018;10:75-95. doi: 10.1111/raq.12148
  7. Sheikhzadeh N, Kouchaki M, Mehregan M, Tayefi-Nasrabadi H, Divband B, Khatamian M, Khani Oushani A, Shabanzadeh S. Influence of nanochitosan/zeolite composite on growth performance, digestive enzymes and serum biochemical parameters in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquac Res. 2017;48(12):5955–5964. doi: 10.1111/are.13418
  8. Hamidian G, Zirak K, Sheikhzadeh N, Khani Oushani A, Shabanzadeh S, Divband B. Intestinal histology and stereology in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) administrated with nanochitosan/zeolite and chitosan/zeolite composites. Aquac Res. 2018;49:1803-1815. doi: 10.1111/are.13634
  9. Khani Oushani A, Soltani M, Sheikhzadeh N, Shamsaie Mehrgan M, Rajabi Islami H. Effects of dietary chitosan and nano-chitosan loaded clinoptilolite on growth and immune responses of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish Shellfish Immunol. 2020;98:210-217. doi: 10.1016/j.fsi.2020.01.016 PMID: 31935551
  10. Dawood MAO, Koshio S, Esteban MA. Beneficial roles of feed additives as immunostimulants in aquaculture: a review. Rev Aquac. 2018;10:950-974. doi: 10.1111/raq.12209
  11. Dawood MAO, Koshio S, Abdel-Daim MM, Van Doan H. Probiotic application for sustainable aquaculture. Rev Aquac. 2019;11:907-924. doi: 10.1111/raq.12272
  12. Mohan K, Ravichandran S, Muralisankar T, Uthayakumar V, Chandirasekar R, Seedevi P, Rajan K. Potential uses of fungal polysaccharides as immunostimulants in fish and shrimp aquaculture: A review. Aquaculture. 2019;500:250-263. doi: 10.1016/j.aquaculture.2018.10.023
  13. Hossain MS, Koshio S, Kastemont P. Recent advances of nucleotide nutrition research in aquaculture: a review. Rev Aquac. 2020;12:1028-1053. doi: 10.1111/raq.12370
  14. Elumalai P, Kurian A, Lakshami S, Faggio C, Esteban MA, Ringo E. Herbal immunomodulators in aquaculture. Rev Fish Sci Aquac. 2021;29:1-19. doi: 10.1080/23308249.2020.1779651
  15. Amin A, Asely AE, El-Naby ASA, Samir F, El-Ashram A, Sudhakaran R, Dawood MAO. Growth performance, intestinal histomorphology and growth-related gene expression in response to dietary Ziziphus mauritiana in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture. 2019;512:734301. doi: 10.1016/j.aquaculture.2019.734301
  16. Mazzoni M, Lattanzio G, Bonaldo A, Tagliavia C, Parma L, Busti S, Gatta PP, Bernardi N, Clavenzani P. Effect of essential oils on the oxyntopeptic cells and somatostatin and ghrelin immunoreactive cells in the European sea bass (Dicentrarchus labrax) gastric mucosa. Animals. 2021;11(12):3401-3410. doi: 10.3390/ani11123401 PMID: 34944178
  17. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951;193:265-275. doi: 10.1016/S0021-9258(19)52451-6 PMID: 14907713
  18. Eslami M, Zaretabar A, Dawood MAO, Mohammadzadeh S, Shahali Y, Ahmadifar E, Sheikhzadeh N, Shahriari Moghadam M, Hoseinifar SH, Van Doan H. Can dietary ethanolic extract of propolis alter growth performance, digestive enzyme activity, antioxidant, and immune indices in juvenile beluga sturgeon (Huso huso)? Aquaculture. 2022;552:737939. doi: 10.1016/j.aquaculture.2022.737939
  19. Awad E, Austin B, Lyndon A. Effect of dietary supplements on digestive enzymes and growth performance of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum). J Am Sci. 2012;8:858-864.
  20. Ostos-Garrido MV, Nuñez-Torres MI, Abaurrea-Equisoain MA. Histological, histochemical and ultrastructural analysis of the gastric mucosa in Oncorhynchus mykiss. Aquaculture. 1993;115:121-132. doi: 10.1016/0044-8486(93)90363-4
  21. Luizi FS, Gara B, Shields RJ, Bromage NR. Further description of the development of the digestive organs in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) larvae, with notes on differential absorption of copepod and Artemia prey. Aquaculture. 1999;176:101-116. doi: 10.1016/S0044-8486(99)00054-X
  22. Rønnestad I, Dominguez RP, Tanaka M. Ontogeny of digestive tract functionality in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus studied by in vivo microinjection: pH and assimilation of free amino acids. Fish Physiol Biochem. 2000;22:225-235. doi: 10.1023/A:1007801510056
  23. Zaiss MM, Papadakis IE, Maingot E, Divanach P, Mylonas CC. Ontogeny of the digestive tract in shi drum (Umbrina cirrosa L.) reared using the mesocosm larval rearing system. Aquaculture. 2006;260:357-368. doi: 10.1016/j.aquaculture.2006.06.001
  24. Zambonino-Infante JL, Gisbert E, Sarasquete C, Navarro I, Gutiérrez J, Cahu CL. Ontogeny and physiology of the digestive system of marine fish larvae. In: Cyrino, J.E.F., Buraeu, D.P., Kapoor, B.G. editors. 1th ed. Feeding and Digestive Functions of Fishes. CRC press. Boca Raton, USA. 2008.p.281-348.
  25. Trevino L, Alvarez-Gonzalez CA, Perales-Garcia N, Avevalo-Galan L, Uscanga-Martinez A, MorquezCouturier G, Fernandez I, Gisbert E. A histological study of the organogensis of the digestive system in baysnook (Peternia splendid Gunther, 1862) from hatching to the juvenile stage. J Appl Ichthyol. 2011;27:73-82. doi: 10.1111/j.1439-0426.2010.01608.x
  26. Micale V, Mughia U. Comparative ontogeny of the digestive tract in Sharpsnout sea bream Diplodus puntazzo (Cetti, 1777). Open Mar Biol J. 2011;5:31-34. doi: 10.2174/1874450801105010034
  27. Ekele I, Uchenna N, Okechukwu N, Isaiah A. The stomach of the adult African Catfish (Clarias gariepinus, Siluriformes: Clariidae) in farm conditions: A morphological and mucin histochemistry analysis. Rev Med Vet. 2014;55(1):4-10.
  28. Dautremepuits C, Paris-Palacios S, Betoulle S, Vernet G. Modulation in hepatic and head kidney parameters of carp (Cyprinus carpio L.) induced by copper and chitosan. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 2004;137:325-333. doi: 10.1016/j.cca.2004.03.005 PMID: 15228950
  29. Shiau SY, Yu YP. Dietary supplementation of chitin and chitosan depresses growth in tilapia, Oreochromis niloticus × O. aureus. Aquaculture. 1999;179:439-446. doi: 10.1016/S0044-8486(99)00177-5
Journal of Veterinary Research
Volume 78, Issue 3
September 2023
Pages 183-195

Files

Share

How to cite

Statistics