مقدمه

بیماری تب برفکی   (Foot-and-Mouth Disease, FMD)یک بیماری بسیار واگیر است که سبب زیان­های اقتصادی زیادی در دام­ها می‌شود. این بیماری ناشی از یک ویروس RNA  بسیار متغیر از خانواده پیکورناویریده (Picornaviridae) و جنس آفتوویروس (Aphthovirus) می­باشد. این ویروس دارای 7 سروتیپ به نام‌های ‌A،O،C،Asia1،SAT1،SAT2‌ و SAT3 ‌است (1، 2). هر ویریون حاوی ژنوم RNA تک‌رشته با طول حدود 8500 جفت‌باز و یک ساختار کپسیدی 20 وجهی، دارای 60 کپی پروتئین­های ساختمانی VP4 -VP1 و همچنین 7 پروتئین غیرساختمانی است (3). عفونت زمانی اتفاق می‌افتد که ذرات ویروسی به داخل سلول میزبان راه پیدا می‌کند و ویروس سلول میزبان را مجبور به تولید هزاران کپی از خود می­‌کنند که نهایتاً با انهدام سلول، ذرات ویروسی در خون رها می­شوند. این ویروس از‌نظر آنتی‌ژنی دائماً در‌حال تغییر است و همین موضوع تأثیر واکسیناسیون را با اشکال روبه‌رو می­کند (4، 5). مقاومت عامل بیماری در طبیعت همراه با سایر عوامل، ازجمله تغییرات آنتی‌ژنتیکی ویروس و پیدایش زیرتیپ­های جدید آن و مهم­تر از همه توان ایجاد بیماری در گونه­های مختلف نشخوارکنندگان اهلی و وحشی و وجود دام­های ناقل و حامل ویروس تب برفکی که اغلب متعاقب عفونت طبیعی پدیدار می‌شوند، در بقای عفونت و بیماری در یک جمعیت و منطقه تأثیر دارند و کنترل این بیماری را بسیار مشکل و همراه با هزینه‌های کلان می‌کند (6).

طیف وسیع میزبانی و تنوع سرو‌تیپ­ها و تحت تیپ­های ناشی از تغییرات آنتی‌ژنیکی باعث بروز اپیدمی­هایی از این بیماری در جهان و ایران می­شود و مبارزه و کنترل این بیماری را مشکل کرده است. آنتی‌بادی­های خنثی‌کننده، معیار ارزیابی مهم از جهت محافظت علیه بیماریFMD  و سایر پیکورنا ویروس­ها می­باشند. درک نوع میان‌کنش میان آنتی‌بادی­ها و ویروس FMD در تهیه آنتی‌ژن­های اپی‌توپی (پپتیدی) و تهیه آنتی‌بادی جهت مصارف تشخیصی، تفکیک تایپ­ها و ساخت کیت­های تشخیصی و واکسن بسیار حائز اهمیت است.

در ایران سروتیپ­های Asia1 -O-A عمده­ترین ویروس­های مولد تب برفکی می‌باشند که در بین آن‌ها سروتیپ­های A و O حدود 50 سال در گردش بوده است (7).

آنتی‌ژن­هایی که در واکسن­ها در حال حاضر برای کنترل تب برفکی استفاده می­شوند، ماحصل غیر‌فعال‌سازی ویروس­ها توسط مواد شیمیایی­اند که امولسیون­هایی همراه با ادجوانت می‌باشند و به‌صورت تزریقی مورد استفاده قرار می­گیرند. از این آنتی‌ژن‌ها جهت توسعه کیت‌های الایزا SPC-ELISA (Solide phase competitive-ELISA) نیز استفاده می­شود. با وجود استفاده گسترده از این روش، ایمن‌سازی با واکسن­های حاوی ویروس غیر‌فعال‌شده توسط مواد شیمیایی مضراتی دارد، از‌جمله ناقص غیرفعال شدن ویروس، دشواری تشخیص حیوانات واکسینه‌شده از حیوانات آلوده و نیاز به واکسیناسیون مجدد با سویه­های ویروسی که از‌نظر آنتی‌ژنی مشابه سویه­های در چرخش می‌باشند. ضمن اینکه برای هر بار تهیه واکسن به پاساژ مجدد نیاز می‌باشد که همین امر خود به تضعیف و یا حتی تغییر در ویروس منجر خواهد شد. بنابراین واکسن­های زیرواحد (subunit)، واکسن­های نوترکیب، DNA واکسن­ها و واکسن­های پپتیدی به‌طور وسیعی مورد مطالعه قرار گرفته­اند تا جایگزین­های امن و مؤثری برای واکسن­های متداول تب برفکی یافت شود (8).

در صورتی زیرواحدهای پروتئینی می­توانند به‌عنوان واکسن­های موفق به کار برده شوند که بتوانیم فعال­ترین اپی­توپ­های آن‌ها را تعیین و پپتیدهای مشابه این اپی­توپ­ها را سنتز کنیم و سپس به‌عنوان واکسن به کار بریم (9، 10). بنابراین به‌دست آوردن پروتئین مورد‌نظر از ارگانیسم، شناخت قطعات پپتیدی مشتق از آن و در‌نهایت شناسایی فعالیت ایمنی‌زایی آن‌ها لازم است (11).

مزایای این‌گونه واکسن­ها شامل سهولت سنتز تحت شرایط کنترل‌شده و همچنین تولید کاملاً ایمن آن‌ها می­باشد. هرچند پپتیدهای سنتزی به‌عنوان واکسن، به‌دلیل اثرگذاری پایینی که ایجاد می­کنند تاکنون نتوانسته‌اند فاز بالینی را طی کنند. استفاده از کونژوگه­ها و ادجوانت­ها و روش­های دارورسانی هدفمند نیاز است تا تحریک کافی و مناسب در سیستم ایمنی ایجاد شود و پاسخ ایمنی طولانی­تری رخ دهد (12-15).

الایزا یکی از آزمایش‌های سرولوژیکی سریع برای تشخیص آنتی‌بادی‌های اختصاصی علیه پاتوژن‌ها می‌باشد. پروتئین مورد ‌استفاده جهت الایزا باید خواص آنتی‌ژنی، حساسیت، خلوص و قابلیت دسترسی برای سیستم ایمنی را از خود نشان دهد (1، 2). بنابراین توسعه رویکردهای سرولوژیکی مبتنی بر پپتیدهایی با قابلیت ایمنی‌زایی و تولید‌کننده آنتی‌بادی­های خنثی‌کننده، برای تشخیص قابل اعتماد و ردیابی آنتی‌بادی‌های علیه سروتیپ‌های مختلف تب برفکی ارزشمند می‌باشد. از دید دیگر در ارزیابی اثربخشی واکسن تب برفکی و نظارت بر سطح ایمنی گله پس از واکسیناسیون تب برفکی بسیار حائز اهمیت است. از سوی دیگر به‌دلیل نوع انتخاب این پپتید نتایج آن باید بتواند با تست خنثی‌سازی سرم (Serum neutralization test) برابری کند.

برای بهبود عملکرد الایزا به‌عنوان رایج­ترین روش در تشخیص FMD، تمهیدات زیادی انجام شده است که عمدتاً بر توسعه آنتی‌ژن­های پوششی جدید نظیر پپتیدها در کیت‌های تشخیص سرمی و آنتی‌بادی­های منوکلونال جدید (mAbs) یا چند‌وجهی (Polyspecific) به‌عنوان آنتی‌بادی­های به دام انداخته‌شده در هر دوی کیت‎های جستجوی آنتی بادی و آنتی ژن تمرکز دارند (16).

در این مطالعه 2 توالی 14 و 20 آمینواسیدی از توالی­های پپتیدی نواحی ایمونوژنیک پروتئین VP1ویروس تب برفکی با روش‌های بیوانفورماتیکی انتخاب و سنتز شدند. برخی شاخص­ها در انتخاب این دو توالی مد‌نظر بوده است. در این خصوص می­توان به مواردی از قبیل قدرت آنتی‌ژنی، حراست و تکرار‌پذیری آن‌ها در سویه­های مختلف ویروس تب برفکی و وجود اپی‌توپ­های B cell (به‌دلیل اهمیت این رده سلولی در القای پاسخ ایمنی همورال و داشتن نقش کلیدی در مهار تکثیر ویروس تب برفکی در بدن دام) اشاره کرد.

پس از تخلیص و شناسایی توالی­ها، هر پپتید به‌صورت جداگانه با ادجوانت فرموله‌شده و همراه با کنترل (PBS) به حیوان مدل تزریق شد. علاوه‌بر کنترل علائم بالینی، خون‌گیری انجام شد و با استفاده از تست الایزای پپتیدی توسعه داده‌شده میزان تولید آنتی‌بادی نسبت به نمونه کنترل منفی بررسی شد (تصویر 1).

مواد و روش­ کار

مواد شیمیایی و بیولوژیک: تمام آمینو‌اسیدهای محافظت‌شده، رزین 2-کلروتریتیل کلراید و معرف کوپل‌کننده 2-(H1-بنزوتری آزول-1-ایل)-3،3،1،1-تترامتیل آمینیوم تترا فلوئورو بورات (TBTU) از کمپانی چینی GL Biochem‌، سرم گاوی رفرنس (BRS) از مؤسسه انگلیسی پیربرایت، پروتئین آلبومین سرم گاوی، تویین-20 (P1379)، کراس لینکر گلوتر آلدئید، سوبسترای تترا متیل بنزیدین TMB و آنتی‌بادی بزی ضدخرگوشی کونژوگه با HRP از کمپانی سیگما-آلدریچ و سایر حلال‌ها و ترکیبات شیمیایی از کمپانی مرک آلمان خریداری شدند. همچنین ادجوانت­های آلومینیوم هیدروکساید و آلومینیوم فسفات به‌صورت نوزاد تهیه شد.

حیوانات تحت آزمایش: حیوان مدل مورد‌استفاده خرگوش نر سفید نژاد نیوزیلندی بود که از بخش حیوانات آزمایشگاهی مؤسسه واکسن و سرم‌سازی رازی تهیه شد. بر‌اساس وزن و سن (سن 6 هفتگی)، خرگوش­ها تهیه و سپس به 3 گروه تقسیم شدند:

گروه 1: 3 خرگوش دریافت‌کننده پپتید 20 آمینواسیدی فرموله‌شده به میزان 400 میکروگرم در هر دُز با ادجوانت آلومینیوم هیدروکساید. نیمی از فرموله به‌صورت زیرجلدی و نیم دیگر به‌صورت عضلانی تزریق شد. دُز یادآور 200 میکروگرم در نظر گرفته شد.

گروه 2: 3 خرگوش دریافت‌کننده پپتید 14 آمینواسیدی فرموله‌شده به میزان 400 میکروگرم در هر دُز با ادجوانت دو‌گانه (آلومینیوم هیدروکساید/آلومینیوم فسفات). نیمی از فرموله به‌صورت زیرجلدی و نیم دیگر به‌صورت عضلانی تزریق شد. دُزهای یادآور 200 میکروگرم در نظر گرفته شد.

گروه 3: 3 خرگوش به عنوان کنترل منفی آزمایش که مشابه با نمونه‌های مربوط به سرم خرگوش در روز صفر است.

خرگوش­ها در روز صفر مورد تزریق اولیه و سپس در روز 14 و 28 مورد تزریق یادآور قرار گرفتند (یادآور نیمی از دُز شروع بود) و سپس خون‌گیری به فاصله 7 روز پس از آخرین تزریق انجام شد. نمونه­های خون با 3500 دور در دقیقه، برای مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ و سرم­ها جدا شدند و در میکروتیوب در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

دستگاه­های مورد‌استفاده: محصولات به‌دست‌آمده پپتیدی به کمک دستگاه کروماتوگرافی مایع تهیه­ای شرکت Knauer آلمان با پمپ دوگانه، آشکارساز UV2500 تک‌رنگ و ستون C18 (120×20 میلی­متر، 100 آنگستروم، 10 میکرومتر) خالص شدند. جهت اطمینان از خالص شدن ترکیب از دستگاه کروماتوگرافی تجزیه­ای شرکت Agilent با پمپ چهارگانه، دتکتور طول موج چندگانه و ستون C18 (150×6/4 میلی­متر، 100 آنگستروم، 5 میکرومتر) استفاده شد. برای خشک کردن نمونه پپتیدی خالص از فریزدرایر آلمانی Christ، مدل Alpha 1-2 LD plus استفاده شد.

برای شناسایی محصول خالص‌شده از Ms-LC، دستگاه Agilent Triple Quadrupole LC/MS 6410 و طیف‌سنج جرمی با مشخصات یونیزاسیون‌کننده الکترواسپری با منبع ولتاژ 5/3 کیلوولت فشار گاز نبولایزر  50 پوند بر اینچ مربع  استفاده شد.

در طی مراحل الایزا از میکروپلیت 96 خانه پلاستیکی Maxiport برند Nunc، برای جداسازی پلاسما از سانتریفیوژ آلمانی Hettich مدل Rotofix 32A، برای کنترل دما از انکوباتور آلمانی Memmert مدل Inc246، برای شست‌وشوی میکروپلیت از الایزا واشر ایرانی Hydroflow مدل 2CH-8M و برای خوانش جذب از دستگاه الایزا ریدر آمریکایی Chromate مدل 4306 استفاده شد.

بیانیه اخلاقی: بخش کار با حیوانات مطالعه حاضرتحت نظارت کمیته اخلاق کار با حیوانات آزمایشگاهی مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی (با کد اخلاق RVSRI. REC. 98.019) و در شرایط نگهداری و تغذیه استاندارد حیوانات توسط افراد خبره و متخصص انجام شد.

انتخاب توالی­های پپتیدی: بررسی مطالعات گذشته‌نگر نشان داد در ناحیه لوپ G-H، 2 جایگاه شاخص آنتی‌ژنیکی یا ایمونودومیننت وجود دارد. جایگاه اول که اهمیت بیشتری دارد، توالی اسید‌آمینه­های 141-160 و جایگاه دوم توالی 198-211 می­باشد (17، 18). در مطالعه حاضر این دو ناحیه به‌ترتیب پپتید A و B نامیده شد و به روش بیوانفورماتیک مورد بررسی قرار گرفتند.

برای این منظور ابتدا توالی نوکلئوتیدی  VP1در ویروس تب برفکی سویه O2016 بررسی شد. روش کار به‌طور خلاصه از این قرار بود: ابتدا استخراج RNA ژنومیک از 200 میکرولیتر سوسپانسیون ویروسی O2016 توسط کیت سیلیکا فیلتر (High Pure Viral RNA Extraction Kit, Roche) انجام شد. سپس ژن 1D توسط کیت One-Step RT-PCR (Titanium^® tube, Roche)  و پرایمر اختصاصی تایپ O به طول bp800 تکثیر شد. سپس محصول PCR جهت تعیین توالی به روش خوانش دو‌طرفه (Eurofins MWG Operon LLC) ارسال شد. ویروس O2010 که تا سال 1395 در واکسن مورد استفاده قرار می­گرفت نیز با همین روش تعیین توالی شده است. پس از بررسی توالی نوکلئوتیدی و کسب اطمینان از کیفیت توالی، ژن مزبور توسط نرم‌افزار Bioedit   نسخه 7.2.5 به اسید‌آمینه ترجمه شد. توالی اسید‌آمینه VP1 در سایت NCBI توسط سرویس BLAST (Protein Biological Local Alignment Tool) بررسی شد. 24 عدد از ویروس­های همولوگ(E=0)  با ویروس مزبور از Genebank انتخاب و با یکدیگر مقایسه شدند. جایگاه­های آنتی‌ژنیک پروتئین VP1 در 24 ویروس انتخاب‌ و ویروس­های O2016 و O2010 با یکدیگر مقایسه شدند و توالی پپتیدهای بررسی‌شده جهت تهیه واکسن پپتیدی استفاده شدند (19).

در مطالعه حاضر 2 توالی، 14 و 20 آمینواسیدی به‌ترتیب با سکانس­های EARHKQKIVAPVKQ و ATNVRGDLQVLAQKAARTLP انتخاب شدند. این توالی­ها جهت سنتز آزمایشگاهی استفاده گردیدند.

سنتز پپتید: توالی­های پپتیدی طبق استراتژی فاز جامد (Solid phase peptide synthesis (SPPS)) و مطابق پروتکل Fmoc بر بستر رزین 2-کلروتریتیل کلراید سنتز شدند. در هر مرحله کوپل شدن آمینواسیدها با معرف کایزر چک شد. پس از انجام سنتز با حفظ محافظت­های زنجیر جانبی و انتهای آمینی، توالی با استفاده از محلول 1 درصد تری فلوئورواستیک اسید از رزین جدا شد.

محافظت­های زنجیر جانبی آمینواسیدهای توالی­های سنتز‌شده با استفاده از واکنشگر K (5/82 درصد تری فلوئورو استیک اسید: 5/4 درصد تیوآنیسول: 5/4 درصد آب: 5/4 درصد فنول: 5/2 درصد اتیلن دی تیول: 5/1 درصد تری اتیل سیلان) جدا شدند. سپس حلال تحت خلأ تقطیر شد و حجم محلول به 2 میلی‌لیتر کاهش یافت. به محتویات باقیمانده به‌آرامی دی اتیل اتر اضافه شد. رسوب تشکیل‌شده پس از فیلتر شدن در آون خشک شد.

خالص‌سازی پپتیدها: محصول به‌دست‌آمده به کمک کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا تهیه­ای (Semi-Prep HPLC)، با برنامه گرادیان فاز متحرک (محلول فاز A، آب همراه با یک‌دهم درصد تری فلوئورو استیک اسید و فاز B حاوی مخلوط 70 به 30 از استونیتریل و آب همراه با یک‌دهم درصد تری فلوئورو استیک اسید) از 95 تا صفر درصد A با سرعت شارش 10 میلی­لیتر در دقیقه در طول موج 218 نانومتر خالص شد. سپس خلوص برش­های جمع‌آوری‌شده با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالای تجزیه­ای مطابق برنامه گرادیان فاز متحرک (فاز A، آب همراه با یک‌دهم درصد تری فلوئورو استیک اسید و فاز B حاوی مخلوط 70 به 30 از استونیتریل و آب همراه با یک‌دهم درصد تری فلوئورو استیک اسید)، با سرعت شارش 1 میلی­لیتر در دقیقه در طول موج 218 نانومتر بررسی شد (جدول 1) و به دنبال آن با خارج کردن حلال آلی (استونیتریل)، محلول آبی باقیمانده با استفاده از دستگاه فریزدرایر (در دمای 55- درجه سانتی‎گراد با حداکثر قدرت پمپ برای ایجاد خلأ) خشک و پپتید خالص جمع‌آوری شد.

شناسایی پپتیدهای سنتز‌شده: جهت شناسایی و تأیید ساختار ترکیبات سنتز‌شده پپتیدی نمی­توان از روش­های معمول طیف‌سنجی نظیر رزونانس مغناطیسی هسته­ای پروتون و کربن بهره گرفت، چرا‌که به‌دلیل کثرت تعداد کربن و پروتون در این ترکیبات، طیف­های پیچیده­ای حاصل می­شود که به‌سختی می­توان آن­ها را تفسیر کرد. مگر آنکه طیف­های دو‌بعدی ترکیبات تهیه شوند و بر‌این‌اساس بتوان در‌مورد ساختار آن­ها اظهارنظر کرد. بنابراین بهترین روش برای این منظور استفاده از طیف‌سنجی جرمی است.

ارزیابی ایمنی‌زایی (فرمولاسیون و تزریقات نمونه­های پپتیدی): برای انجام تست میزان پاسخ ایمنی به پپتید، به ایمن‌سازی حیوان مدل و تهیه آنتی‌بادی هایپر ایمیون نیاز است. ایمن‌سازی خرگوش­ها با استفاده از پپتیدها انجام شد. برای تهیه سرم­های کنترل مثبت نیز از سرم‌های BRS (Bovine Reference Serum) سروتیپ O که سرم­های منووالان استاندارد علیه یک سروتیپ O تب برفکی با تست خنثی‌سازی (SN) 2 ≤  بودند، استفاده شد. ویروس­ها تغلیظ‌ و پپتیدها در بافر نمکی فسفات 011/0 مولار با 4/7 pH= حل شدند.

به سبب نقطه ایزوالکتریک (Isoelectric point، pI) (بالای 10)، خصوصیات فیزیکوشیمیایی و ترکیب ‌به‌خصوص پپتیدهای استفاده‌شده، ابتدا این پپتیدها به پروتئین حامل BSA به‌واسطه گلوترآلدئید کراس لینک شدند، سپس فرمولاسیون آن­ها با ادجوانت آبی آلومینیوم هیدروکساید به نسبت 1:3 (ژل آلومینیوم هیدروکساید به کمپلکس پپتید+BSA) انجام و به‌مدت 2 ساعت با سرعت 200 دور در دقیقه مخلوط شد.

آزمایش الایزا برای تعیین پاسخ آنتی‌بادی: از‌آنجا‌که pH ایزوالکتریک پپتیدها از بافر کوتینگ کربنات ـ بی‌کربنات بیشتر بود، ابتدا پروتئین حامل BSA به کف میکروپلیت چسبانده و سپس با استفاده از لینکر، سر آمینی‌پپتیدها به پروتئین BSA فراکشن V (با نسبت 20:1 از پروتئین به پپتید) متصل شدند. از‌این‌رو BSA در بافر کربنات بی‌کربنات (05/0 مولار) به مقدار 15 میکروگرم در هر میلی‌لیتر حل شد و کوتینگ با آن انجام گرفت. سپس پلیت با فویل آلومینیومی پوشانده و در ظرف پلاستیکی قرار داده شد. در گام بعدی پس از 1 شب انکوباسیون در 4 درجه سانتی‌گراد، مایع رویی (حاوی مقدار کمی پروتئین­های BSA متصل‌نشده) دور ریخته شد و سپس2 بار با PBS شست‌وشو صورت گرفت. در ادامه با به‌کارگیری سیستم متصل‌کننده­های متقاطع (گلوترآلدئید) به میزان 2/0 درصد (حجمی / حجمی)، آمینواسیدهای لایزین سطحی BSA جهت واکنشگری با گروه‎های آمینی‌پپتید فعال شدند. بر‌این‌اساس مقدار از پیش تعیین‌شده 300 نانوگرم از هر پپتید در هر چاهک بر‌اساس نتایج غلظت مناسب آنتی‌ژن (پپتید) به آنتی‌بادی با چکر بورد (Chequerboard test‌)، میزان 100 میکرولیتر از بافر حاوی پپتید به هر چاهک میکروپلیت 96 خانه­ای افزوده شد و بدین صورت کوتینگ دو‌مرحله­ای (یک مرحله کوتینگ BSA و مرحله دوم کوتینگ پپتید به BSA فعال‌شده با گلوترآلدئید) انجام گرفت. پس از 90 دقیقه انکوباسیون در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد، محتویات دور ریخته شد و چاهک­ها 3 بار با بافر نمکی فسفات 011/0 مولار شسته شدند. چاهک­ها با 200 میکرولیتر بافر بلاکینگ (05/0 درصد حجمی/حجمی) PBS-Tween 20 حاوی 1 درصد کازئین مسدود‌سازی (Blocking) شدند. سپس 3 بار شست‌وشوی مجدد با بافر PBS-T صورت گرفت. در ادامه با سرم خرگوشی (رقیق‌شده 1:40) در 37 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 1 ساعت انکوبه شدند. سپس 3 بار با PBS-T شست‌وشو صورت گرفت و انکوباسیون با آنتی‌بادی بزی ضد‌خرگوشی کونژوگه با HRP‌ انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 40 دقیقه صورت گرفت. سپس 3 بار با PBS-Tween 20  شست‌وشو صورت گرفت و پس از آن 100 میکرولیتر از TMB افزوده و انکوباسیون به‌مدت 20 دقیقه در فضای تاریک انجام شد. در پایان با افزودن 50 میکرولیتر اسید سولفوریک 1 مولار متوقف و جذب نوری (OD) در طول موج 450 نانومتر، با استفاده از الایزا ریدر خوانش شد. برای تأیید تکرار‌پذیری نتایج برای هر پپتید، تعداد تکرار متعدد در هر چاهک در نظر گرفته شد.

نتایج

نتایج بخش طراحی بیوانفورماتیکی پپتید و آنالیزها: پپتید 20 آمینواسیدی انتخابی با وزن مولکولی 46/2221 بود. pI آن 84/10 و میزان پایداری آن در آزمایشگاه 90/19=Instability index  و نیمه عمر آن نیز مطلوب است. باتوجه‌به خصوصیات فیزیکوشیمیایی، pI این پپتید نسبتاً بالا می­باشد که با استفاده از پروتئین حامل در تست­ها اصلاح می­‌شود. همچنین مقادیر آن در اسپکتروفتومتری به سبب عدم وجود برخی از آمینواسیدها در خوانش نوری، قابل‌بررسی نمی­باشد. نیمه عمر آن در حالت محلول و بدون نگهدارنده براساس محاسبات بیوانفورماتیکی (سرور Protparam)، در دمای آزمایشگاه حدود 6 ساعت است (مطابق با تست زمان واقعی (Real time) ‌کنترل کیفی در ارزیابی پایداری فراورده­های بیولوژیک) و امکان شروع تجزیه آن بعد از این زمان وجود دارد، بنابراین می­بایست به‌صورت پودر به‌طور مستمر در 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شود.

 شاخص Gravy پپتید 20 آمینواسیدی نشان می­دهد حل شدن این پپتید در آب‌مقطر یا PBS ایزوتونیک (pH فیزیولوژیک) کمی با تأخیر و اندکی کمتر از حالت معمول است، اما این امر برای پپتید 14 آمینواسید پایین‌تر از 1- بوده است. بنابراین حلالیت آن مناسب­تر است. این پپتید بعداً نیز در حل شدن به PBS کدورت ضعیفی می‌داد. عموماً gravy بالای 5/0- می‌بایست باشد و کمتر از آن حلالیت پپتید پایین است (Gravy هرچه منفی­تر باشد، حلالیت بیشتر است). از‌نظر موقعیت ژنومی، در مقایسه با سوش رفرانس این پپتید در موقعیت آمینواسیدی 865 تا 884، ژنوم ویروس تب برفکی تایپ O و در توالی پروتئینی مابین اسید‌آمینه 161-141: VP1 واقع شده است.

در پپتید 14 آمینواسیدی با‌توجه‌به خصوصیات فیزیکوشیمیایی، pI نسبتاً بالا می­باشد. همچنین به‌دلیل نوع توالی آمینواسید آن در اسپکترفتومتری قابل‌بررسی از‌نظر مقدار نیست. نیمه عمر آن در حالت محلول و بدون نگهدارنده در دمای آزمایشگاه براساس محاسبات بیوانفورماتیکی حدود 2 ساعت می­باشد. پپتید ناپایدار است و امکان تجزیه آن بعد از گذشت این زمان وجود دارد، بنابراین می­بایست به‌صورت پودر باشد و به‌طور مستمر در 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شود. همچنین مدت این نگهداشت کمتر از 1 سال است (مطابق با تست زمان واقعی کنترل کیفی در ارزیابی پایداری فراورده­های بیولوژیک و معادله آرنیوس در کنترل کیفی). شاخص gravy پپتید 14 آمینواسیدی نشان می­دهد این پپتید به‌راحتی در آب‌مقطر ایزوتونیک (pH فیزیولوژیک) حل می­شود و حلالیت آن از پپتید 20 آمینواسیدی بهتر است.

جهت ارزیابی قدرت آنتی‌ژنی و وجود اپی‌توپ­های B cell از نرم‌افزار تحت شبکه با آدرس دسترسی http://tools.iedb.org/main/bcell استفاده شد (20).

نتایج و آنالیزهای بخش سنتز پپتید (خالص‌سازی پپتیدها): پس از انجام کروماتوگرافی مایع با کارایی بالای تهیه­ و خشک شدن با استفاده از فریز درایر، خلوص نمونه­های پپتیدی 14 و 20 آمینواسیدی به‌ترتیب 96 و 98 درصد بودند.

شناسایی توالی­های سنتز‌شده: در طیف جرمی توالی 14 آمینواسیدی، پیک­های شاخص [M+2H]²⁺/2، [M+3H]³⁺/3 و [M+4H]⁴⁺/4 به‌ترتیب در جرم­های 8/817، 2/545 و 9/408 تأیید‌کننده سنتز نمونه بودند. برای ترکیب با توالی 20 آمینو‌اسیدی نیز پیک­های 1063 و 708 به‌ترتیب نشان‌دهنده جرم­های [M+2H]²⁺/2، [M+3H]³⁺/3 بودند.

ارزیابی قدرت آنتی‌ژنی و وجود اپی‌توپ­های B cell: ارزیابی شاخص­های آنتی‌ژنی و وجود اپی‌توپ­های B cell حاکی از آن بود که علی‌رغم کوتاه بودن 2 پپتید سنتز‌شده، می­توانند در القای ایمنی موفق عمل کنند. نکته دیگر اینکه اپی‌توپ­های B cell  در داخل و یا منطبق بر بخش آنتی‌ژنی هر دو توالی بودند. در جدول 2 به نتایج آنالیز این دو شاخص اشاره شده است. میزان آب‌دوستی پپتیدهای سنتز‌شده با نرم‌افزار Bioedit  نسخه 7.0.9.0 بررسی شد که نتایج در تصویر 2 آورده شده است. نواحی‌ای که بیشترین میزان آب‌دوستی را نشان می­دهند، با نواحی آنتی‌ژنیک و اپی‌توپ­های B cell منطبق بودند.

نتایج ایمن‌سازی و بررسی پاسخ ایمنی به پپتیدها با روش الایزای غیرمستقیم: پس از انجام تزریق سوم و تکمیل شدن ایمن‌سازی، خون‌گیری انجام و سرم­ جدا شد. سپس نمونه­ها با اضافه کردن 20 درصد گلیسرول در دمای 70- درجه سانتی‌گراد تا زمان استفاده ذخیره‌سازی شدند. چکر بورد جهت بررسی میزان غلظت مناسب آنتی‌ژن پپتیدی به آنتی‌بادی و سپس کونژوگه نسبت به این دو انجام شد. نتایج نشان‌دهنده ارزش ایمن‌سازی با مقدار 400 میکروگرم پپتید متصل به پروتئین حامل (BSA) در دُز آغازین و 200 میکروگرم در دُزهای یادآور بود. در چکر بورد، غلظت مناسب پپتیدی جهت کوتینگ 300 نانوگرم در هر چاهک برای هر پپتید و غلظت مناسب سرم 1:40 به دست آمد. همچنین کونژوگه نیز با رقت 1:10000 به‌عنوان بهینه­ترین غلظت انتخاب شد.

نقطه جداکننده (Cutt-off) برای تمایز بین سیگنال­های مثبت و منفی 4/0 واحد OD تعیین شد که با استفاده از مقدار متوسط 3 آزمایش مستقل و میانگین 3 نمونه سرم مرجع منفی استاندارد خرگوش، به علاوه 15/0 به دست آمد.

 در ادامه بر روی نمونه­های سرم­های به‌دست‌آمده از اولین روز تزریق (روز صفر) و 7 روز بعد از تزریق سوم خرگوش تست الایزا گذاشته شد. نتایج بیانگر موفقیت ایمن‌سازی و نتایج بهتر ایمنی‌زایی در حیوان مدل، توسط پپتید 20 آمینواسیدی در مقایسه با پپتید 14 آمینواسیدی بود. در جدول 3، ستون 1 تا 5 نتایج پلیت الایزای پوشش داده‌شده با پپتید 20 آمینواسیدی و ستون 7 تا 11 نتایج پپتید 14 آمینواسیدی نشان داده شده است. از سرم خرگوش­های هایپر ایمیون پس از 5 بار تزریق جهت الایزا استفاده شده است. ستون 6 (پپتید 20 آمینواسیدی) و 12 (پپتید 14 آمینواسیدی) سرم­های خرگوش در روز صفر بوده که به‌عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شدند. هرچه طول توالی پپتید بیشتر باشد در موفقیت پاسخ ایمنی تأثیر‌گذارتر است و از سوی دیگر اگر این پپتید علاوه‌بر ایمنی‌زایی خواص خنثی‌کنندگی هم داشته باشد، می­تواند در محافظت و خنثی‌سازی علیه ویروس نقش پررنگ­تری ایفا کند و همچنین نتایج بالاتری در تست خنثی‌سازی ویروس نشان دهد.

میانگین کلی OD برای پپتید 20 آمینواسیدی و 14 آمینواسیدی در چاهک­­های پلیت به‌ترتیب 116/1 و 970/0 بوده است. همچنین پپتید 14 آمینواسیدی تفاوت بیشتری در CV در یک سنجش را (The coefficient of variation (CV) Intra-assay) در بین چاهک­ها نسبت به پپتید 20 آمینواسیدی نشان می­دهد. از سوی دیگر، اگر در اتصال پپتیدها به ته چاهک میکروپلیت پلی استیرن از پروتئین BSA به‌عنوان پروتئین پایه­ای نگهدارنده به پلیت استفاده نشود، سیگنال­های به‌دست‌آمده به سبب pH ایزوالکتریک بالای پپتیدها، طول کوتاه توالی آن­ها، پایداری کم و امکان دفن شدن حین بلاکینگ، پایین‌تر از OD‌های 6/0 خواهد بود.

ابتدا آزمون آماری کولموگروف اسمیرنف (Kolmogorov-Smirnov) برای تست نرمالیتی داده­ها انجام شد و از‌آنجا‌که توزیع داده­ها نرمال نبود، از آزمون آماری ناپارامتریک من ویتنی یو (Mann-Whitney U) برای مقایسه مقادیر قبل و بعد و نیز 2 گروه پپتید 20 و پپتید 14 اسید‌آمینه­ای استفاده شد (40 نمونه در گروه پپتید 20 آمینواسیدی، 40 نمونه در گروه پپتید 14 آمینواسیدی بعد از تزریق و 8 نمونه در گروه پپتید 20 آمینواسیدی قبل از تزریق و 8 نمونه نیز در گروه پپتید 14 آمینواسیدی قبل از تزریق تحلیل شدند).

براساس نتیجه آزمون آماری، مقادیر قبل و بعد در هر دو پپتید 20 و 14 اسید‌آمینه­ای با هم تفاوت آماری معنی‎دار دارند و نیز مقادیر OD بعد از تزریق، در پپتید 20 اسیدآمینه‌ای به‌طور معنی‎دار بیشتر است. در‌مورد مقادیر قبل از تزریق، OD تفاوت آماری معنی‎دار ندارد (جدول 4 و تصویر 3).

بحث

یک بخش مجزا از پروتئین آنتی‌ژن می­تواند به‌عنوان یک واکسن زیرواحد مؤثر عمل کند. این بخش کوچک آنتی­ژن پپتید است که از زنجیره­ای کوچک از آمینواسیدها تشکیل شده است و یک اپی­توپ واحد را تشکیل می­دهد. پپتیدهای کوچکی که شامل اپی­توپ­ها می‌باشند، ایمونوژن بوده و می­توانند به‌عنوان واکسن پپتیدی استفاده شوند. به‌عنوان مثال پروتئین- FMDV (VP1)، یک پپتید ایمونوژنیک است که به‌طور شیمیایی سنتز شده و برای ایجاد پاسخ ایمنی مورد آزمایش قرار گرفته است. با‌این‌حال، پپتیدهای خیلی کوچک شامل 15 تا 20 آمینو‌اسید، به اندازه کافی ایمونوژنیک نمی‌باشند و نسبت به پپتیدهای بزرگ‌تر ایمنی­زایی کمتری دارند (15).

واکسن پپتیدی یک واکسن زیرواحدی است که براساس هر پپتیدی که برای ایمن‌سازی ارگانیسم در برابر عامل بیماری­زا عمل می­کند، طراحی می­شود. واکسن­های پپتیدی اغلب سنتزی می‌باشند و پروتئین­های طبیعی موجود در عوامل بیماری‌زا را تقلید می­کنند (21). این واکسن­ها در برانگیختن پاسخ ایمنی بسیار مؤثر و گزینشی عمل می­کنند. علاوه‌بر عوامل بیماری­زا واکسن­های پپتیدی می­توانند به‌عنوان واکسن­های درمانی سرطانی استفاده شوند (22).

در حال حاضر، الایزا یکی از رایج­ترین رویکردها در تشخیص FMDV علاوه بر روش­های جداسازی ویروس، VNT و تکنیک‌های مبتنی بر PCR است. طبق گزارشی از آزمایشگاه مرجع منطقه‌ای برای FMD در آسیای جنوب شرقی، بیش از 13000 الایزا در مقایسه با 304 VNT و 790 سنجش مبتنی بر PCR برای تشخیص FMD در سال 2017 انجام شده است (1، 2، 16).

الایزای رقابتی فاز جامد SPC-ELISA نیز برای تشخیص FMDV توسعه داده شده است. این روش بر‌اساس رقابت بین آنتی‌بادی‎های موجود در سرم­های آزمایش‌شده و آنتی‌بادی­های ضد FMDV خوکچه هندی اختصاصی سروتیپ است (1، 2). Wong و همکاران در سال 2020 با توجه به ارازیابی داده‎های آزمایشگاهی بیان کردند که هر دو LPB-ELISA و SPC-ELISA دارای حساسیت و محدودیت تشخیص مشابهی می‌باشند، اما باوجوداین ویژگی SPC-ELISA بالاتر گزارش شده و یک روش تشخیصی بر‌اساس آنتی‌بادی اختصاصی FMDV بهبود‌یافته را برای غربالگری انبوه (Mass screening) ارائه می­دهد. همچنین Hatem و همکاران در سال 2022 و سایر محققین نشان دادند SPC-ELISA نسبت به VNT برای تشخیص زودهنگام عفونت FMDV در گاو و گوسفند حساس‌تر است (1، 2، 16).

علاوه‌بر‌این، حساسیت SPC-ELISA کمتر تحت‌تأثیر سویه‌های FMDV مورد‌استفاده در سنجش قرار می‌گیرد، در‌حالی‌که حساسیت VNT می‌تواند به‌طور قابل‌توجهی در صورت استفاده از ویروس هترولوگ کاهش یابد.

الایزای رقابتی فاز جامد که کیت­های رایج در ایران و جهان‌ می‌باشند، می‌توانند آنتی‌بادی‌ها علیه 6 سروتیپ غیر (A, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3, and Asia 1) FMDV O با ویژگی بین 4/99 تا 9/99 درصد و حساسیت قابل‌مقایسه با LPB-ELISA و VNT را تشخیص دهند (16). اخیراً طی مطالعه‎ای حساسیت کیت SPC-ELISA برای تشخیص اختصاصی سروتیپ O FMDV کمتر بود و نتایج مثبت کاذب بیشتری در مقایسه با LPB-ELISA و VNT ایجاد کرد (1، 2).

در این پروژه مطالعاتی، توالی­های طراحی‌شده پس از بررسی روش­های سنتز بر روی رزین 2-کلروتریتیل کلراید طبق پروتکل فاز جامد سنتز شدند. پس از محافظت‌زدایی زنجیره جانبی توالی­ها، خالص‌سازی توسط کروماتوگرافی انجام و  سپس با استفاده از طیف جرمی، ساختار توالی­های سنتز‌شده بررسی شد. در قدم نهایی برای بررسی توالی­های طراحی‌شده، نمونه­ها پس از فرموله شدن با ادجوانت مناسب، در حیوان مدل تزریق شدند. پس از 3 دوره تزریق با فاصله زمانی 2 هفته در هر تزریق، خون‌گیری انجام و سرم­ها جداسازی شدند. با سرم­های به‌دست‌آمده تست ایمنی‌زایی انجام شد.

نتیجه‌گیری نهایی: نتایج تست الایزا نشان می­دهد این دو پپتید در صورت مطالعات بیشتر می­توانند کاندیدهای مناسبی جهت ارزیابی پاسخ ایمنی علیه ویروس تب برفکی در تست­های سرولوژیک و در حیوانات واکسینه و غیر‌واکسینه یا آلوده به ویروس وحشی باشند. در این میان پپتید 20 آمینواسید نتایج ایمنی‌زایی بهتری را نسبت به پپتید 14 آمینواسیدی در خرگوش نشان داد.

به نظر می­رسد سنتز پپتیدهای انتخابی برداشت‌شده از ناحیه V1 ژنوم ویروس که مسئول سنتز کل کپسید می‌باشد، قدرت ایمنی‌زایی مؤثر در حیوان آزمایشگاهی داشته و همچنین این ایمنی واکنش متقاطع با ویروس کامل دارد. این پپتید در ادامه قادر به استفاده جهت توسعه کیت­های الایزا پپتیدی می­باشد. مطالعات صورت‌گرفته حاکی از آن است که کوتاه بودن پپتیدهای سنتزی ممکن است شکل فضایی منطبق با نواحی متناظر با ویروس کامل را ایجاد نکند و از سوی دیگر سبب سرعت تخریب سریع­تر آن شود. احتمالاً این موضوع اثر نامطلوبی بر قدرت ایمنی‌زای پپتیدها در حیوان خواهد داشت. بنابراین پیشنهاد می­شود از پپتیدهای بالای 20 آمینواسید با ارزیابی میزان پاسخ ایمنی، حفظ کانفورمیشن فضایی و مهندسی ساخت با بهینه‌سازی خواص فیزیکوشیمیایی برای فرمولاسیون مؤثرتر و همچنین استفاده در ساخت کیت و امکان کونژوگاسیون بعدی استفاده شود. همه این داده­ها نشان می­دهد پپتیدها قادر به تحریک سیستم ایمنی در خرگوش بوده و کیت­های الایزای پپتیدی تهیه‌شده حاصل از آن­ها که در مطالعه حاضر تولید شده است، می­توانند به‌عنوان یک ابزار نظارت سرولوژیکی سریع و قابل‌اعتماد برای نظارت بر عفونت یا سطح ایمن‌سازی پس از واکسیناسیون باشد.

سپاسگزاری

نویسندگان از معاونت پژوهشی مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی جهت حمایت مالی از مطالعه حاضر تشکر و قدردانی می‌کنند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.