مطالعه تغییرات خونی و بافتی غضروف زانو با تزریق داخل‌مفصلی زهر زنبور عسل و ملیتین در موش صحرایی نر

مقالات آماده انتشار

نوع مقاله : فارماکولوژی و سم شناسی

نویسندگان

1 دانش آموخته دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

2 گروه علوم پایه، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

3 گروه علوم زیستی مقایسه‌ای، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

4 انستیتو تحقیقاتی علوم و تکنولوژی هسته‌ای، تهران، ایران

چکیده

زمینه مطالعه: درمان با زهر زنبور عسل یک روش درمانی با قدمت هزاران ساله است. زهر زنبور حداقل از ۱۸ ترکیب فارماکولوژیکی، شامل فسفولیپازها، ترکیبات پپتیدی و‌ آمینو‌‌اسیدی، مانند ملیتین که دارای خاصیت ضدالتهابی می‌باشد تشکیل شده است.
روش‎کار: در مطالعه حاضر از ۱۸ موش صحرایی نر سالم در 3 گروه کنترل، گروه زهر و گروه ملیتین استفاده شد. تزریق داخل‌مفصلی ۱ میلی‌گرم/کیلوگرم از زهر زنبور و ملیتین در موش صحرایی انجام شد و 1 ماه بعد از تزریق نتایج فاکتورهای هماتولوژی و نیز فاکتورهای ایمونولوژیک IL-6 وTNF-α  در مقایسه با گروه کنترل ارزیابی شد. همچنین مطالعات بافت‌شناسی و رنگ‌آمیزی‌های بافتی، شامل هماتوکسیلین ائوزین، پریودیک اسید شیف و تریکروم ماسون انجام و سطحTNF-α  بافتی با روش ایمونوهیستوشیمی بررسی شد.
نتایج: یافته‌های مطالعه حاضر اختلاف معنی‌داری در فاکتورهای هماتولوژی نشان نداد. مطالعات بافت‌شناسی افزایش ضخامت غضروف در گروه دریافت‌کننده زهر و کاهش معنی‌دار تعداد کندروسیت‌ها در هر دو گروه را نشان داد. همچنین کاهش رشته‌ای کلاژن و به‌هم‌ریختگی ماده زمینه در رنگ‌آمیزی پریودیک اسید شیف و تریکروم ماسون در گروه دریافت‌کننده ملیتین مشاهده شد. تومور نکروز فاکتور آلفا (TNF-α) و اینترلوکین ۶ (IL-6) در گروه دریافت‌کننده زهر و ملیتین افزایش معنی‌دار نشان داد، در‌حالی‌که در بررسی ایمونوهیستوشیمی، سطح بافتی TNF-α تغییرات معنی‌داری نشان نداد.
نتیجه­گیری نهایی: براساس نتایج مطالعه حاضر تزریق داخل‌مفصلی زهر زنبور و ملیتین تغییرات هماتولوژیک معنی‌داری ایجاد نکرد. هرچند افزایش معنی‌دار سطح بیومارکرهای التهابی IL-6 TNF-α, به مطالعات تکمیلی نیاز دارد. همچنین در بافت‌شناسی غضروف برخی تغییرات قابل‌بررسی، همچون کاهش تعداد کندروسیت‌های سالم لایه میانی مشاهده شد. با وجود اثرات درمانی و ارزشمند گزارش‌شده از زهر زنبور عسل، یافته‌های مطالعه حاضر پیشنهاد می‌کند زهر زنبور و جزء اصلی آن، ملیتین، ممکن است موجب افزایش پاسخ‌های ایمنی شود. البته اظهارنظر در‌رابطه‌با ایمنی زهر به مطالعات گسترده‌تری نیاز دارد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Hematological and Histological Changes in the Knee Cartilage of Male Rats Received Intra-Articular Injection of Bee Venom and Melittin

نویسندگان [English]

  • Hayedeh Keyhan 1
  • Hasan Morovvati 2
  • Mohammad Kazem Koohi 3
  • Jalal Hassan 3
  • Mohammad Mazidi 4
1 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine University of Tehran, Tehran, Iran
2 Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine University of Tehran, Tehran, Iran
3 Department of Comparative BioSciences (DCBs), Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran,Tehran, Iran
4 Research Institute of Nuclear Sciences and Technology, Tehran, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Bee venom therapy has been used for thousands of years. Bee venom consists of at least 18 active pharmacological compounds including phospholipases and peptide as well as amino acid compounds such as melittin, which has anti-inflammatory properties.OBJECTIVES: In this study, we aim to compare the effects of single intra-articular injections of bee venom and melittin on joint histology and hematology in male rats.METHODS: In this research, 18 healthy male rats were used in three groups: control, bee venom (BV), and melittin. Intra-articular injection of 1mg/kg of bee venom or melittin was performed two intervention groups. One month after the injection, their hematological and immunological factors including interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) were evaluated and compared with those of the control group. Also, histological studies and tissue staining by hematoxylin & eosin, periodic acid-Schiff (PAS), and Masson's trichrome were performed. Tissue expression of TNF-α was evaluated by immunohistochemical staining.RESULTS: The findings did not show significant differences between the groups in hematologic factors. The results for histological factors showed a significant increase in knee cartilage thickness in the BV group and a significant decrease in the number of chondrocytes in both BV and melittin groups. Also, the reduction of collagen fibers and disorganization of the ground substance were observed by PAS and Masson's trichrome staining in the melittin group. TNF-α and IL-6 significantly increased in both BV and melittin groups, while immunohistochemical staining of TNF-α showed a non-significant decrease due to bee venom injection.CONCLUSIONS: The intra-articular injection of bee venom and melittin cannot lead to hematological changes. They can increase the level of inflammatory biomarkers, TNF-α and IL-6, and reduce the number of healthy chondrocytes in the middle layer; however, further studies are needed to confirm these results. Our findings suggest that bee venom and its main component, melittin, may increase immune responses. Regarding the bee venom safety, more extensive studies are needed.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bee venom
  • IL-6
  • Intra-articular
  • Melittin
  • TNF-α

اصل مقاله

مقدمه

درمان با زهر زنبور عسل یک روش درمانی با قدمت هزاران ساله است. از گذشته از نیش زنبور زنده یا زهر به‌صورت قابل‌تزریق برای درمان بیماری‌های مختلف استفاده می‌کردند. اپی‌تراپی، استفاده‌ از ‌محصولات زنبور عسل برای مقاصد پزشکی می‌باشد که شامل عسل، ژل رویال، بره موم، گرده گل و عمدتاً زهر زنبور (Bee Venom) بوده که به‌عنوان اپی‌توکسین شناخته می‌شود. زهر زنبور حداقل از ۱۸ ترکیب فارماکولوژیکی فعال، شامل آنزیم‌ها مثل فسفولیپازها، ترکیبات پپتیدی و ‌آمینو‌‌اسیدی، مانند ملیتین تشکیل شده است (1).استفاده از زهر زنبور با بیش از ۵۰۰۰ سال قدمت در طب سنتی کاربرد داشته است (2)، به‌طوری‌که حتی فواید درمانی آن در کتاب‌های مقدسی مثل ودا (کتاب مقدس هند)، انجیل و قرآن ذکر شده است. پپتیدها و آنزیم‌های موجود در زهر زنبور عسل می‌تواند در درمان بیماری‌های التهابی و سیستم عصبی مرکزی مثل پارکینسون، آلزایمر و اسکلروز میوتروفیک و انواع مختلف سرطان مؤثر ‌باشد. همچنین فعالیت‌های ضد‌ویروسی آن حتی در برابر ویروس نقص ایمنی انسانی (HIV) دیده شده است (3). درمان با زهر زنبور و اجزای اصلی آن یک رویکرد بالینی مفید برای درمان بیماری‌های التهابی محسوب می‌شود (4). زنبور در هر نیش ۳/۰ میلی‌گرم زهر تزریق می‌کند. بیشتر مرگ‌و‌میر انسان در اثر یک یا چند نیش زنبور به‌دلیل واکنش‌های آلرژیک، نارسایی قلبی یا خفگی ناشی از تورم در اطراف گردن یا دهان است. اولین نیش باعث تولید آنتی‌بادی ایجاد‌کننده آلرژی، ایمونوگلوبولین IgE توسط بدن می‌شود و در‌نتیجه فرد نسبت به سم حساس می‌شود. یک واکنش آلرژیک معمولاً پس از گزش دوم یا بعدی توسط همان ‌گونه یا گونه‌های نزدیک به‌ هم اتفاق می‌افتد (5). مطالعات قبلی نشان دادند زهر می‌تواند هر دو لنفوسیت T و B را تحت تأثیر قرار دهد و باعث افزایش واکنش‌های ایمنی شود. مطالعات بیشتر در‌مورد اثرات ایمونولوژیک زهر زنبور عسل بر سلول‌های T و B، ازجمله پاسخ‌های ثانویه و اثرات آن بر تولید سلول‌های T سرکوبگر و ماکروفاژها می‌باشد (6).

 به‌علت وسعت بروز و وجود مشکلات مفصلی در جوامع امروزی، یافتن راهکارهای جدید درمانی اجتناب‌ناپذیر است. هرچند ایمنی استفاده مستقیم به‌کارگیری زهر بر روی بافت طبیعی غضروف نامشخص بوده و تاکنون مطالعه‌ای انجام نشده است؛ بنابراین مطالعه حاضر به‌منظور بررسی ایمنی و مقایسه تأثیر مستقیم زهر زنبور عسل و ملیتین بر غضروف سالم به روش تزریق داخل‌مفصلی با کمک روش‌های هیستولوژیک و ایمونولوژیک انجام شد.

مواد و روش کار

 زهر زنبور عسلApis mellifera) ) خریداری‌شده از نژاد زنبور بومی منطقه آذربایجان، کوهستان‌های مرند و میشو می‌باشد که پس از تهیه در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

تست حیوانی: در مطالعه حاضر از ۱۸ موش صحرایی نر نژاد ویستاراستفاده شد. حیوانات مورد‌آزمایش از شرکت پارس ایزوتوپ با سن ۳ ماه و به وزن ۱۵۰ تا ۲۰۰ گرم تهیه و در ۳ گروه ۶ تایی در قفس‌های مجزا نگهداری شد. تغذیه این حیوانات با غذای تهیه‌شده از شرکت خوراک دام پارس و به‌صورت آزاد در اختیار حیوانات قرار گرفت. حیوانات مورد‌آزمایش طی مطالعه به‌مدت ۳۰ روز در قفس‌های جداگانه نگهداری شدند. در این مدت، شرایط نگهداری و تغذیه موش‌ها تحت نظارت و به‌دور از عوامل بیماری‌زا بود.

گروه اول: به‌عنوان کنترل بدون هیچ‌گونه تزریق، نگهداری به‌مدت ۳۰ روز؛

گروه دوم: تک تزریق داخل‌مفصلی زهر زنبور با دُز ۱ میلی‌گرم/کیلوگرم و نمونه­برداری در روز سی‌ام؛

 گروه سوم: تک تزریق داخل‌مفصلی با ملیتین با دُز ۱ میلی‌گرم / کیلوگرم و نمونه‌برداری در روز سی‌ام.

به‌علت نیاز به بیهوشی عمیق و کامل حیوان در حین تزریق داخل‌مفصلی از مخلوط ۷۰/۳۰ درصد کتامین / زایلازین استفاده شد که به‌صورت داخل‌صفاقی به هر حیوان تزریق شد. بعد از گذشت ۱۰ دقیقه از تزریق داروهای هوشبری و حصول اطمینان از بیهوشی کامل حیوانات آزمایشگاهی مورد‌مطالعه، میزان ۱ میلی‌گرم/کیلوگرم زهر (7) و ملیتین به داخل مفصل زانوی حیوانات تزریق شد. برای ثابت نگه داشتن و ایجاد بی‌حرکتی در مطالعه حاضر از هیچ ابزار ثانویه‌ای، مانند آتل استفاده نشد.

جداسازی ملیتین: جهت انجام مرحله تخلیص ابتدا مقدار 1/0 گرم از سم زنبور در ۱ سی‌سی آب‌مقطر حل و از فیلتر ۴۵/۰ میکرون عبور داده شد. جداسازی اجزای تشکیل‌دهنده زهر زنبور عسل به‌وسیله دستگاهHPLC (Knauer GmbH)  فاز معکوس و با استفاده از ستون ۱۸C به‌عنوان فاز ساکن و 2 محلول ‌(‌استونیتریل ـ تری‌فلوئورواستیک ‌اسید ۱/۰ درصد و آب ـ تری‌فلوئورواستیک ‌اسید ۱/۰ درصد) به‌عنوان فاز متحرک، با روش گرادیانت خطی انجام شد. بعد از تزریق نمونه زهر (۲۰ میکرولیتر) به دستگاه، گرادینت استونیتریل در مدت ۵۰ دقیقه به ۶۵ درصد رسیده و سرعت جریان در تمام مراحل 1 میلی‌لیتر در دقیقه بود. جهت مشاهده پیک‌های به‌دست‌آمده از طول موج ۲۱۴ و ۲۸۰ نانومتر از دتکتور uv استفاده شد. پیک مشاهده‌شده در زمان ۳۵ دقیقه که با منحنی استاندارد مقایسه شد، مربوط به ملیتین بود که جمع‌آوری و جهت لیوفیلیزه، در یخچال نگهداری شد. نمونه جداشده جهت صحت به دستگاه تزریق و پیک ملیتین مشاهده شد (8).

آزمایش خون: هر‌یک از حیوانات در روز سی‌ام مطالعه، در دیسیکاتور متصل به کپسول دی‌اکسیدکربن قرار داده شدند و شیر کپسول برای حداقل مدت ۵ دقیقه باز شد. پس از قطع تنفس، حیوان بر روی صفحه مخصوص نگهداری متصل و پس از آن خون‌گیری به‌وسیله سرنگ ۵ میلی‌لیتری از قلب حیوان انجام شد. نمونه خون در لوله‌های آزمایش فاقد ماده ضدانعقاد برای آزمایشات IL-6 وTNF-α  قرار داده شد و به روش الایزا و با کیت‌های (Tnf, cat no: RTA00, R&D, USA) و  (IL6, CSBE04640r, susabio USA) اندازه‌گیری شد. جهت آزمایش هماتولوژی (CBC) نمونه خون در لوله حاوی ماده ضد‌انعقاد ریخته شد و با دستگاه سل کانتر، برند سیسمکسKX21N ‌، شمارش سلول‌های خونی، هموگلوبین و هماتوکریت انجام شد.

مطالعه بافت‌شناسی: جهت نمونه هیستولوژی، مفصل زانوی حیوانات جدا و در فرمالین ۱۰ درصد قرار داده شد. کلسیم‌گیری از آن‌ها به‌مدت ۳ هفته با محلول اسید فرمیک ۵ درصد در دمای اتاق انجام شد. سپس برش‌هایی با ضخامت ۵ تا ۶ میکرومتر طی مراحل معمول برای تهیه مقاطع بافتی تهیه شد. از رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین ـ ائوزین برای مطالعات هیستومورفولوژی استفاده شد. در این خصوص از نرم‌افزار AXIVISION استفاده شد. مطالعات هیستومورفولوژی، شامل بررسی ساختار بافت از‌نظر ظاهر، پراکندگی، وسعت و از‌هم‌پاشیدگی، وجود حفره یا شکاف در ماده زیرین، وجود تغییرات در آرایش سلول‌های غضروفی، تشکیل سلول‌های غضروفی بیضی و یا شرایط غیر‌طبیعی بود. همچنین رنگ‌های ماسون تری کروم و پریودیک اسید شیف (PAS) برای مطالعات هیستوشیمیایی به کار رفت (9).

در بررسی ایمونوهیستوشیمی، مقاطع بافت‌شناسی (ضخامت ۲ میکرومتر) پارافین‌زدایی و هیدراته شدند. لام‌ها با آلبومین سرم گاوی (BSA) به‌مدت ۳۰ دقیقه برای جلوگیری از واکنش‌های غیراختصاصی انکوبه شدند. پس از آن، در یک محلول بافر سیترات (۶=PH ) برای بازیابی آنتی‌ژن جوشانده و با محلول پراکسیدهیدروژن برای خاموش کردن فعالیت پراکسیداز درون‌زا انکوبه شدند. مقاطع با آنتی‌بادی اولیه‌(biorbyt/tnf-alpha-antibody-orb371962)  در حمام آب به‌مدت ۱ ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند. پس از شست‌وشوی لام‌ها با بافر مناسب، با افزودن کیت تشخیص (‌آنتی‌بادی ثانویه، پلیمر،DAB ) هر‌کدام به‌مدت ۱۵ دقیقه انکوبه شدند. سپس مقاطع مجدداً شستشو داده شدند و رنگ‌آمیزی با استفاده از هماتوکسیلین انجام و تصویر قهوه‌ای انتخاب شد. رنگ‌آمیزی با استفاده از میکروسکوپ نوری با بزرگ‌نمایی ۲۰× آنالیز گردید. در‌نهایت، سطح رنگ‌آمیزی و شدت رنگ‌آمیزی  TNF-a  به روش Allred پس از چندین آزمایش امتیازدهی شد. داده‌های حاصل از آنالیز تصاویر توسط آزمون آماریANOVA  یک‌طرفه و تست توکی (Tukey's Test) تجزیه‌و‌تحلیل شدند.

Proportion score: 0: No cells are immunoreactive. 1: ≤1درصد  of cells are immunoreactive. 2: 1-10,درصد  of cells are immunoreactive. 3: 35-11درصد  of cells are immunoreactive. 4: 66-34 درصد of cells are immunoreactive. 5: 67-100  درصد of cells are immunoreactive.

Intensity scores: 0: Negative. 1: Weak. 2: Intermediate. 3: Strong.

Allred score (P+I): 0-1: Negative. 2-3: Weak. 4-6: Moderate. 7-8: Strong

ارزیابی داده‌ها: با‌توجه‌به کمّی و پیوسته ­بودن داده­ها، تعداد گروه­های مستقل ‌ارزیابی شدند و نیز اطمینان از نرمال بودن توزیع داده­ها توسط آزمون کولموگروف اسمیرنف (Kolmogorov-Smirnov) صورت گرفت. ارزیابی آماری داده‌ها با استفاده از نرم­افزار SPSS نسخه ۱۹ انجام و تمام نتایج براساس میانگین­±­‌خطای استاندارد بیان شدند. جهت مقایسه بین گروه­ها، آنالیز واریانس یک­طرفه (One-way ANOVA) انجام و به­ دنبال آن تست­های مقایسه­ای چندگانه توکی استفاده شد. مقدار 05/0>P برای تعیین سطح معنی‌داری بین گروه­ها در نظر گرفته شد.

نتایج

 نتایج استخراج ملیتین: مشخص شد پپتید ملیتین با غلظت تقریباً 58/69 درصد در زهر زنبور مورد آزمایش وجود دارد )‌تصویر 1). حدود 4 پیک در کروماتوگرام زهر قابل‌تشخیص بود که بیشترین سطح زیر منحنی بین فراکشن‌های موجود، مربوط به ملیتین بود.

نتایج شمارش سلول‌های خونی، هموگلوبین و هماتوکریت: در بررسی تجویز داخل‌مفصلی زهر زنبور و ملیتین مشخص شد زهر و ملیتین تغییرات معنی‌داری در سطح گلبول‌های قرمز و سفید خون، هموگلوبین و هماتوکریت ایجاد نمی‌کنند. در‌مورد تعداد پلاکت، کاهش غیر‌معنی‌داری در گروه‌های مورد آزمایش در مقایسه با گروه شاهد دیده شد (جدول ۱).

نتایج بررسی فاکتورهای التهابی در خون: نشان‌دهنده افزایش معنی‌دار فاکتورهای التهابی در هر دو گروه تزریق زهر (۰۱/۰‌P<‌) و ملیتین (۰۰۱/۰‌P<) در مقایسه با گروه کنترل بود (جدول ۲).

مقایسه تغییرات بافتی غضروف مفصل در رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین/ ائوزین در اثر تزریق داخل‌مفصلی زهر و ملیتین: تعداد کندروسیت‌ها کاهش معنی‌دار در لایه سطحی و میانی با تزریق زهر نشان داد. همچنین ملیتین باعث کاهش معنی‌دار کندروسیت در لایه میانی شد (B۲). تعداد کندروسیت‌های بیضی در اثر تزریق زهر اختلاف معنی‌داری را نشان نداد، اما با تزریق ملیتین کاهش معنی‌دار نشان داد (C۲). همچنین تغییرات در تعداد لاکونا اختلاف معنی‌داری را نشان نداد. تعداد گروه‌های ایزوژنیک در هر دو گروه زهر و ملیتین با کاهش در لایه سطحی همراه بود (D‌۲)‌. تصویر ۲ نمایش رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین می‌باشد.

همان‌طور که در تصویر ۳ مشاهده می‌شود در رنگ‌آمیزی تریکروم ماسون در گروه BV کاهش رشته‌های کلاژن (رنگ آبی) و به‌هم‌ریختگی در ماده زمینه دیده می‌شود. در گروه ملیتین نیز کاهش رشته‌های کلاژن با کاهش رنگ‌پذیری ماده زمینه غضروف مشاهده شد. در رنگ‌آمیزی پریودیک اسید شیف در گروه BV افزایش کندروسیت‌ها قابل‌مشاهده است. نسبت ماده زمینه کمتر و همچنین تعداد لاکونای خالی در لایه عمقی افزایش داشت .تزریق ملیتین به‌تنهایی باعث به‌هم‌ریختگی ماده زمینه در لایه‌های غضروفی شده است.

ایمونوهیستوشیمی: در گروه  BVبیان TNF-α در مغز استخوان و بافت عضلانی و بافت‌های همبندی اطراف آن تقریباً منفی است. در گروه ملیتین بیان TNF-α در مغز استخوان مثبت، قوی و بالا است و در بافت عضلانی و بافت‌های همبندی اطراف تقریباً منفی است (تصویر ۴). همان‌طور که در جدول ۳ نمایش داده شده است، در بیان بافتی TNF-α‌، به‌ترتیب یک افزایش و کاهش در بیان TNF-α در اثر تزریق ملیتین و زهر مشاهده شد. هرچند در مقایسه با گروه کنترل معنی‌دار نبود.

تغییرات بافتی غضروف در 3 لایه سطحی، میانی و عمقی مورد بررسی قرار گرفت.̜ همان‌طور که در تصویر 5 نشان داده شده است، افزایش معنی‌دار ارتفاع غضروف در لایه سطحی و میانی در اثر تزریق زهر مشاهده شد. همچنین در لایه عمقی افزایش معنی‌دار ارتفاع در گروه دریافت‌کننده ملیتین مشاهده گردید. علی‌رغم اینکه در ارتفاع کلی اختلاف معنی‌دار وجود نداشت.

بحث

ایده استفاده از زهر زنبور در‌زمینه دارویی از این باور ناشی شد که زنبورداران به‌ندرت از روماتیسم یا درد مفاصل رنج می‌بردند (3). زهر زنبور به‌طور گسترده در مطالعات جهت درمان برخی بیماری‌ها، از‌جمله آرتریت‌ روماتوئید در طب سنتی شرق کاربرد داشته است (1)‌. برای درمان بیماری‌های مفصلی، مانند استئوآرتریت از روش‌های متعددی، ازجمله تزریق داخل‌مفصلی استفاده می‌شود (10). از مزایای این روش انجام شدن آن در زمان کوتاه با ایجاد کمترین حساسیت است. هرچند تزریق اشتباه می‌تواند با درد شدیدی همراه باشد (11). BV حاوی ترکیبات بسیاری، ازجمله هیستامین، فسفولیپاز ۲A ملیتین می‌باشد. هیستامین تحت عنوان سم عصبی در واکنش‌های آلرژیک گاه مرگبار دخیل است و فسفولیپاز ۲A، فسفولیپیدهای غشای سلولی را تجزیه می‌کند. همچنین ملیتین، یک مولکول با فعالیت لیزکنندگی بالاست که به‌عنوان سم عمل می‌کند (12). از‌آنجا‌که ملیتین به‌عنوان ترکیب اصلی زهر زنبور است، علاقه به خواص دارویی ملیتین در دهه‌های اخیر به‌شدت افزایش یافته است. بسته به غلظت آن، این بیوپپتید می‌تواند منافذ گذرا (جهت عبور یون‌ها) یا پایدار (جهت عبور مولکول‌های بزرگ مانند گلوکز) را القا کند. تشکیل منافذ ناشی از ملیتین مسئول فعالیت‌های همولیتیک آن است (3).اگرچه فهرست اثرات سودمند گزارش‌شده از درمان نیش زنبور عسل طولانی است، اما بیشتر مطالعات در شرایطی انجام شده است که استانداردهای دقیق پزشکی را برآورده نمی‌کند و به نظر می‌رسد اساساً بر‌اساس شواهد حکایتی باشد. به همین دلیل و به‌دلیل عدم وجود کارآزمایی‌های کنترل‌شده، قضاوت نهایی در‌مورد اثربخشی درمان BV هنوز وجود ندارد. باوجوداین، درمان BV به‌طور فزاینده‌ای محبوبیت پیدا کرده است (13)؛ بنابراین هدف از مطالعه حاضر بررسی ایمنی و مقایسه تغییرات بافت‌شناسی و فاکتورهای خونی بر اثر تک‌تزریق زهر زنبور و ملیتین در مفصل زانوی موش صحرایی سالم نر می‌باشد.

در مطالعه حاضر ملیتین با تکنیکRP-HPLC  جدا شد. کروماتوگرام به‌دست‌آمده از تجزیه زهر زنبور ایرانی نشان داد ملیتین بیش از ۶۰ درصد از وزن زهر را شامل شده است. این نتایج با مطالعات Helena RC و همکاران در سال ۲۰۰۴ مطابقت داشت (14).

در مطالعات هماتولوژی تغییر معنی‌داری در میزان هموگلوبین و هماتوکریت در مقایسه با گروه شاهد مشاهده نشد. البته در مطالعه Mabrouk A و همکاران در سال ۲۰۲۳، افزایش کمی در غلظت هموگلوبین و هماتوکریت گزارش شده است (13). این تفاوت می‌تواند ناشی از روش به‌کارگیری که به‌صورت تزریق زیرجلدی بوده است و همچنین دُز به‌کار‌رفته (۵/۲‌، ۵، ۱۰ میلی‌گرم / کیلوگرم) باشد. مشاهدات مطالعه حاضر در تعداد گلبول‌های سفید و قرمز، اختلاف معنی‌داری را بین گروه‌های دریافت‌کننده زهر زنبور و ملیتین با گروه شاهد نشان نداد. این یافته مشابه با مطالعه Melig و همکاران در سال ۲۰۲۰ بود (15). البته در مطالعه‌ Melig و همکاران در سال 2020 تزریق زهر به‌صورت داخل‌صفاقی به‌مدت ۲ ماه هر روز انجام شد. علاوه‌بر‌این کاهش غیرمعنی‌داری در تعداد پلاکت در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شد. این یافته هم‌راستا با مطالعاتMohammed  و همکاران در سال ۲۰۱۹ می‌باشد (16). در این راستا، Darwish  و همکاران در سال ۲۰۲۱ تأخیر در لخته شدن خون به‌دلیل وجود فسفولیپاز ۲A را گزارش کردند (17).

یافته‌های مطالعه حاضر افزایش معنی‌داری در فاکتورهای التهابی TNF-α و IL-6 را نشان داد که این نتایج با گزارش  Mabrouk A و همکاران در سال ۲۰۲۳ که از دُزهای ۵/۲، ۵، ۱۰ میلی‌گرم / کیلوگرم استفاده کردند مطابقت نداشت. البته مطالعه Stuhlmeier KM  در سال ۲۰۰۷ نشان داد ملیتین و زهر زنبور فعال‌سازی NF-kB ناشی از  IL-1βوTNFα  در سینوویوسیت‌های شبه‌فیبروبلاست بیماران روماتوئید را مهار نکردند (6). این نتیجه مشابه با مطالعه  Seong-Su Nahو همکاران در سال ۲۰۰۷ بود (18). همچنین بنابر گزارشMohanny  در سال ۲۰۱۴ زهر زنبور به‌‎عنوان یک ماده طبیعی می‌تواند باعث تحریک پاسخ‌های ایمنی در جوجه‌ها شود، اما عوارض نامطلوب به جا نمی‌گذارد (11). البته علی‌رغم افزایش سرمی TNF-α در مطالعات ایمونوهیستوشیمی مطالعه حاضر، افزایش معنی‌داری در بیان بافتی TNF-α مشاهده نشد.‌TNF  به 2 شکل ترشحی یا متصل به غشا وجود دارد که عمدتاً از مونوسیت‌ها و ماکروفاژها جدا می‌شود، اما انواع سلول‌های دیگر مانند لنفوسیت‌های T و ‌B، ماست سل‌ها، سلول‌های کشنده طبیعی، نوتروفیل‌ها، فیبروبلاست‌ها و استئوکلاست‌ها نیز می‌توانند TNF تولید کنند (19). IL-6 که از گلبول‌های سفید، ماکروفاژها و فیبروبلاست ترشح می‌شود، جزء پروتئین‌های فاز حاد محسوب شده و در پاسخ‌های التهابی و ایمنی نقش دارد (20). باتوجه‌به موارد ذکر‌شده، بالا بودن سایتوکاین‌های سرمی مذکور می‌تواند دلیلی بر ایجاد واکنش‌های حساسیتی توسط ملیتین و فسفولیپاز باشد. از طرفی باتوجه‌به اینکه سلول‌های متفاوتی می‌توانند در تولید TNF نقش داشته باشند، یافتن این تغییرات و ارتباط بین سطح سرمی و بافتی TNF به مطالعات بیشتر در آینده نیاز دارد.

مطالعات بافت‌شناسی انجام‌شده در مطالعه حاضر برخی تغییرات در ارتفاع غضروف، تعداد کندروسیت و لاکونا در لایه‌های مختلف غضروف در گروه تزریق زهر و ملیتین را نشان داد. افزایش ارتفاع غضروف در لایه سطحی و میانی به‌طور معنی‌داری در گروه دریافت‌کننده زهر زنبور بیشتر از گروه ملیتین بود. علی‌رغم کاهش کندروسیت در هر دو گروه، افزایش غیر‌معنی‌دار لاکونا در گروه ملیتین قابل‌مشاهده است. همچنین کاهش رشته‌ای کلاژن و به‌هم‌ریختگی ماده زمینه در رنگ‌آمیزی پریودیک اسید شیف و تریکروم ماسون در هر دو گروه دریافت‌کننده زهر زنبور و ملیتین مورد تأیید قرار گرفت. مطالعه‌ای که Stuhlmeier KM در سال ۲۰۰۷ بر روی سلول‌های فیبروبلاست مشابه سینوویوسیت انجام دادند، نشان داد زهر زنبور موجب آزاد شدن رادیکال‌های آزاد اکسیژن می‌شود. همان‌طور که مشخص است رادیکال‌های آزاد موجب تخریب بافتی می‌شوند که ممکن است در بدن این تأثیرات منفی با تولید کلاژناز و یا اینترلوکین ۸ تقویت شود (6).

 در مطالعاتی تأثیرات ضد‌التهابی، ضد‌درد و ضد‌سرطانی زهر زنبور عسل گزارش شده است که احتمالاً مرتبط با اجزای فعالی مانند ملیتین و فسفولیپاز ۲A است. گرچه هنوز اساس فارماکولوژیک زهر زنبور به‌درستی شناخته نشده است (21، 22)، اما ترکیب فسفولیپاز ۲A در زهر مار نیز به‌عنوان ترکیب مؤثر شناخته شده است (23). این آنزیم به‌‌عنوان یک آلرژن مهم در زهر زنبور عسل هم مطرح می‌باشد (24). در مطالعه‌ای که Bomalaski و همکاران در سال 1995 انجام دادند نشان داده شد فسفولیپاز ۲ A می‌تواند باعث تحریک سایتوکاین‌های التهابی ازجمله TNF شود (25). همین‌طور در مطالعه دیگری که Ribardo DA و همکاران در سال ۲۰۰۲ انجام دادند، نشان داده شد ملیتین به‌‌علت خاصیت آمفی‌پاتیک وارد غشای فسفولیید شده و دارای خوشه در قسمت c-terminal می‌باشد. مطالعات زیادی نشان دادند قسمت c-terminal می‌تواند باعث واکنش‌های آلرژیک شود. همین‌طور بررسی اثر ملیتین بر روی سلول‌های یوکاریوسیت، افزایش بیان TNF-α را نشان داد (12). ملیتین به 2 فرم مونومر و تترامر است که فرم مونومر آن دارای سمیت می‌باشد و تغییرات وابسته به دُز در غشا ایجاد می‌کند (26).

نتیجه‌گیری نهایی: با‌توجه‌به کاربردهای زهر زنبور عسل در کنترل آرتریت روماتوئید و بیماری‌های مفصلی، مطالعه‌ای در‌زمینه ایمنی زهر زنبور و اجزای اصلی آن در تجویز داخل‌مفصلی انجام نشده است. براساس نتایج مطالعه حاضر تزریق داخل‌مفصلی زهر زنبور و ملیتین به‌عنوان یکی از مهم‌ترین اجزای زهر، تغییرات هماتولوژیک در شرایط یکسان نداشته است. هرچند افزایش معنی‌دار سطح بیومارکرهای التهابی‌‌ TNF-α ‌و‌ IL-6 به مطالعات تکمیلی نیاز دارد. همچنین در بافت‌شناسی غضروف برخی تغییرات مانند کاهش تعداد کندروسیت‌های سالم لایه میانی مشاهده شد. با وجود اثرات درمانی و ارزشمند گزارش‌شده از زهر زنبور عسل به نظر می‌رسد اظهارنظر در‌رابطه‌با ایمنی زهر  منوط به مطالعات بیشتر و گسترده‌تری است. مطالعه حاضر اطلاعات اولیه باارزشی را درباره ارزیابی ایمنی زهر زنبور و اجزای آن فراهم می‌کند.

ملاحظات اخلاقی

تمام مراحل مطابق با دستورالعمل‌های محلی مراقبت از حیوانات آزمایشگاهی (با شماره تأییدیه اخلاقی: IR.UT.VETMED.REC.1402.37) انجام شد.

حامی مالی

این اثر تحت حمایت مادی صندوق حمایت از پژوهشگران و فناوران کشور (INSF) برگرفته از طرح شماره ۴۰۱۴۳۰۷ انجام شده‌است.

سپاسگزاری

نویسندگان از حوزه پژوهشی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران به سبب حمایت‌های مالی و معنوی تشکر می‌کند.

تعارض منافع

هیچ گونه تعارض منافعی در ارتباط با این مطالعه وجود ندارد.

مراجع

  1. Jaafar FS, Albushabaa SHH. General study of honey bee venom Apis mellifera: A Review, J Appl Health Sci Med. 2025;5(1):12-8. doi: 10.58614/jahsm512
  2. Carpena M, Nuñez-Estevez B, Soria-Lopez A, Simal-Gandara J. Bee venom: an updating review of its bioactive molecules and its health applications. Nutrients. 2020;12(11):3360. doi: 10.3390/nu12113360 PMID: 33142794
  3. Wehbe R, Frangieh J, Rima M, El Obeid D, Sabatier J-M, Fajloun Z. Bee venom: Overview of main compounds and bioactivities for therapeutic interests. Molecules. 2019;24(16):2997. doi: 10.3390/molecules24162997 PMID: 31430861
  4. Lee WR, Pak SC, Park KK. The protective effect of bee venom on fibrosis causing inflammatory diseases. Toxins. 2015;7(11):4758-72. doi: 10.3390/toxins7114758
  5. Ali M. Studies on bee venom and its medical uses. Int J Adv Res Technol. 2012;1(2):69-83.
  6. Stuhlmeier KM. Apis mellifera venom and melittin block neither NF-κB-p50-DNA interactions nor the activation of NF-κB, instead they activate the transcription of proinflammatory genes and the release of reactive oxygen intermediates. J Immunol. 2007;179(1):655-64. doi: 10.4049/jimmunol.179.1.655 PMID: 17579088
  7. Nipate S, Hurali PB, Ghaisas M. Evaluation of anti-inflammatory, anti-nociceptive, and anti-arthritic activities of Indian Apis dorsata bee venom in experimental animals: biochemical, histological, and radiological assessment. Immunopharmacol Immunotoxico. 2015;37(2):171-84. doi: 10.3109/08923973.2015.1009996 PMID: 25689950
  8. Haghi G, Hatami A, Mehran M. Qualitative and quantitative evaluation of melittin in honeybee venom and drug products containing honeybee venom. J Apic Sci. 2013;57(2):37-44. doi: 10.2478/jas-2013-0015
  9. Mazidi SM, Morovvati H, Yavari K. Histological evaluation of radiocolloidal Yttrium-90-hydroxyapatite in Enrofloxacin-Induced Rheumatoid Arthritis in the rat knee Joint. YUMSJ. 2019;24(4):577-596.
  10. Lee S-H, Kwon G-S, Kang M-S, Yoon H-M, Kim C-H. Comparative study on the effects of bee venom pharmacopuncture according to the treatment method for knee osteoarthritis. J Pharmacopuncture. 2012;15(4):7. doi: 10.3831/KPI.2012.15.011
  11. Ali A, Mohanny K. Effect of injection with bee venom extract on productive performance and immune response of broiler chicks. J Anim Poult Product. 5(5):237-246. 2014;5(5):237-46. doi: 10.21608/jappmu.2014.69561
  12. Ribardo DA, Peterson JW, Chopra AK. Phospholipase A 2-activating protein-An important regulatory molecule in modulating cyclooxygenase-2 and tumor necrosis factor production during inflammation. Indian J Exp Biol. 2002;40(2):129-38. PMID: 12622174
  13. Abo-Zaid MA, Yatimi KA, Ismail AH. The role of bee venom on immunological and hematological parameters in albino rats. Egypt J Immunol. 2023;30(2):11-25 PMID: 37031394
  14. Rybak-Chmielewska H, Szczêsna T. HPLC study of chemical composition of honeybee (Apis mellifera L.) venom. JAS. 2004;48(2):103-9.
  15. Meligi NM, Ismail SA, Tawfik NS. Protective effects of honey and bee venom against lipopolysaccharide and carbon tetrachloride-induced hepatoxicity and lipid peroxidation in rats. J Tox Res. 2020;9(5):693-705. doi: 10.1093/toxres/tfaa077 PMID: 33178430
  16. Mohammed ZI, Hassan AJ. Effect of bee venom on some blood and biochemical parameters in formaldehyde induced arthritis male rats in comparison with prednisolone drug. J Phys Conf Ser. 2019: IOP Publishing. doi: 10.1088/1742-6596/1234/1/012066
  17. Darwish DA, Masoud HM, Abdel-Monsef MM, Helmy MS, Zidan HA, Ibrahim MA. Phospholipase A2 enzyme from the venom of Egyptian honey bee Apis mellifera lamarckii with anti-platelet aggregation and anti-coagulation activities. J Genetic Eng and Biotechnol. 2021;19(1):10. doi: 10.1186/s43141-020-00112-z PMID: 33443641
  18. Nah S-S, Ha E, Mun SH, Won H-J, Chung J-H. Effects of melittin on the production of matrix metalloproteinase-1 and-3 in rheumatoid arthritic fibroblast-like synoviocytes. J Pharmacol Sci. 2008;106(1):162-6. doi: 10.1254/jphs.sc0070215 PMID: 18212480
  19. Chisari E, Yaghmour K, Khan W. The effects of TNF-alpha inhibition on cartilage: a systematic review of preclinical studies. Osteoarthritis Cartilage. 2020;28(5):708-18. doi: 10.1016/j.joca.2019.09.008
  20. Damas P, Ledoux D, Nys M, Vrindts Y, De Groote D, Franchimont P, et al. Cytokine serum level during severe sepsis in human IL-6 as a marker of severity. J Ann Surg. 1992;215(4):356. doi: 10.1097/00000658-199204000-00009
  21. Chen J, Lariviere WR. The nociceptive and anti-nociceptive effects of bee venom injection and therapy: a double-edged sword. J Pneurobio. 2010;92(2):151-83. doi: 10.1016/j.pneurobio.2010.06.006 PMID: 20558236
  22. Kasozi KI, Niedbała G, Alqarni M, Zirintunda G, Ssempijja F, Musinguzi SP, et al. Bee venom—a potential complementary medicine candidate for SARS-CoV-2 infections. J Fpubh. 2020;8:594458. doi: 10.3389/fpubh.2020.594458 PMID: 33363088
  23. Péterfi O, Boda F, Szabó Z, Ferencz E, Bába L. Hypotensive snake venom components—a mini-review. J Molecules. 2019;24(15):2778. doi: 10.3390/molecules24152778 PMID: 31370142
  24. Sedigheh N, Mohammad T, Sara A, Mahsa Shah B, Abbas GS, Zahra A. Generating S Cell Line for Producing Recombinant Phospholipase A2 of Honey Bee (Apis mellifera). J Vet Res. doi: 10.22059/jvr.2023.339344.3243
  25. Bomalaski JS, Ford T, Hudson AP, Clark MA. Phospholipase A2-activating protein induces the synthesis of IL-1 and TNF in human monocytes. J Immunol. 1995;154(8):4027-31.
  26. Yao J, Li X, Lin M, Han Z, Wang X, Guo J, et al. Bifunctional copper ion/melittin incorporated hydrogel with antimicrobial and antioxidant capabilities for infected skin wound healing. J Mat Des. 2025:113631. doi: 10.1016/j.matdes.2025.113631
مجله تحقیقات دامپزشکی (Journal of Veterinary Research)

مقالات آماده انتشار، پذیرفته شده
انتشار آنلاین از تاریخ 22 شهریور 1404

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار