مقدمه

پیچ‌خوردگی تخمدان به چرخش تخمدان دور خط میانی که شامل لیگامنت‌ها توبواورین (Tubo Ovarian ligament) و اینفاندیبولوپلویک (Infundibulopelvic ligament) می‌باشد، گفته می‌شود. این بیماری به‌دلیل کاهش خون‌رسانی به تخمدان می‌تواند ایسکمی ایجاد کرده و باعث نکروز بافتی و به تبع آن ناباروری شود (1، 2). کیست‌های تخمدانی، اویداکت با طول بلند و سندرم تحریک بیش‌از‌حد تخمدان (OHSS)، از فاکتورهای مستعدکننده پیچ‌‌‌خوردگی تخمدان می‌باشد. از علائم بالینی شایع این بیماری می‌توان به درد در ناحیه لگن، تهوع و استفراغ اشاره کرد. تشخیص این بیماری براساس علائم بالینی امکان‌پذیر نیست و تنها در برخی مواقع با کمک سونوگرافی داپلر تشخیص داده می‌شود. درمان این بیماری، مداخله جراحی بوده که در آن تخمدان به حالت طبیعی بازمی‌گردد. هرچند در صورت وجود بافت نکروزه، احتمال ایجاد ایسکمی رپرفیوژن به‌دلیل بازگشت خون‌رسانی وجود دارد (3، 4).

گرلین (Ghrelin) یک هورمون پپتیدی است که از مخاط معده ترشح می‌شود، اما در بافت‌‌‌های مختلف نیز بیان می‌شود. عملکرد بیولوژیکی گرلین به‌طور گسترده‌ای شناخته شده است، از‌جمله تنظیم مصرف غذا، وزن بدن، دستگاه گوارش، قلب و عروق، تولیدمثل، عملکردهای ایمنی، تکثیر سلولی و ترشح هورمون. گیرنده ترشح‌کننده هورمون رشد (GHS-R) اثر گرلین را واسطه می‌کند. بسته به نوع سلول، گرلین یا آپوپتوز را القا‌‌‌ می‌کند یا اثر ضد‌آپوپتوز دارد (5). همچنین نشان داده شده است این هورمون بر روی گنادها نیز حاوی گیرنده می‌‌باشد (6، 7). مطالعات نشان داده‌اند گرلین در تعدیل آپوپتوز در سلول‌های کاردیومیوسیت، سلول‌های بتا پانکراس، هیپوفیز و چربی نقش دارد. همچنین پیش‌بینی می‌شود گرلین روند مرگ سلولی و تکثیر در بیضه و تخمدان را کنترل کند (8).

خانواده BCL-2 دارای جفت‌‌‌های مختلفی از پروتئین‌‌‌های آنتاگونیست و آگونیست است که آپوپتوز را تنظیم می‌کند و وابسته بودن عملکرد این دو به یکدیگر نامشخص است. طی یک مطالعه با استفاده از رویکردی ژنتیکی، از مدل‌های افزایش و کاهش عملکرد Bcl-2 و Bax، نشان داده شد بیان ژن Bax در غیاب Bcl-2 باعث آپوپتوز می‌‌شود و در مقابل، بیان بیش‌از‌حد Bcl-2 همچنان آپوپتوز را در غیاب Bax سرکوب می‌کند (9).

خانواده پروتئین‌های Bcl-2 نقش کلیدی در تنظیم آپوپتوز، از‌طریق تعادل بین اعضای پیش‌آپوپتوتیک، مانند Bax و ضدآپوپتوتیک مانند Bcl-2 ایفا می‌‌کند. مطالعات ژنتیکی اخیر نشان داده‌اند بیان Bax می‌‌تواند به‌طور مستقل و حتی در غیاب Bcl-2، مسیرهای آپوپتوز را فعال کند، در‌حالی‌که Bcl-2 قادر است بدون حضور Bax نیز با مکانیسم‌های جایگزین، آپوپتوز را مهار کند (9). این تعاملات پیچیده فراتر از مدل سنتی هترودایمریزاسیون بوده و شامل تعاملات با سایر پروتئین‌های غشایی و تنظیم پتانسیل غشای میتوکندری است که بقای سلولی را تضمین می‌‌کند (10).

نقش پروتئین‌های Bcl-2 و Bax در تنظیم آپوپتوز سلولی در بافت تخمدان از اهمیت بالایی برخوردار است. در بافت سالم تخمدان، تعادل بین این دو پروتئین برای حفظ هموستاز سلولی ضروری است. مطالعات نشان می‌دهند در شرایط پاتولوژیک تخمدانی، کاهش سطح Bax و افزایش بیان Bcl-2 به کاهش آپوپتوز و بقای غیرطبیعی سلول‌های اکتوپیک منجر می‌شود که به پیشرفت بیماری کمک می‌کند (11). در مطالعات بافت‌های هیپرپلاستیک و نئوپلاستیک تخمدان، اختلال در تعادل بیان این دو مارکر با تغییرات در گیرنده‌های استروژن و پروژسترون مرتبط است که نشان‌دهنده تعامل پیچیده بین مسیرهای هورمونی و آپوپتوتیک در پاتوژنز بیماری‌‌ها است (12). این یافته‌ها اهمیت این مارکرها را در مطالعات بیماری‌های تخمدان برجسته می‌کند.

هدف از انجام مطالعه حاضر، بررسی فاکتور‌‌‌های اپوپتوتیک و آنتی‌اپوپتوتیک در تخمدان موش صحرایی سالم و تعیین میزان بیان پپتیدهای Bax و Bcl-2 در تخمدان موش صحرایی متعاقب به ایسکمی ریپرفیوزن و همچنین تزریق گرلین در آن‌ها است.

مواد و روش کار

حیوانات موردمطالعه: در مطالعه حاضر، از 21 سر موش صحرایی ماده با میانگین وزنی 50±200 گرم، در دمای 24 درجه سانتی‌گراد، تحت شرایط نوری استاندارد (12 ساعت روشنایی، 12 ساعت تاریکی)، همراه با رطوبت نسبی محیط 40 تا 60 درصد و امکان دسترسی به غذا و آب کافی استفاده شد. موش‌ها در مطالعه حاضر به 3 گروه 7 تایی تقسیم شدند:

گروه شم: در این گروه ایسکمی‌ـ‌رپرفیوژن تخمدان القا نشد. موش‌ها پس از انجام جراحی شکمی، به‌صورت داخل‌صفاقی 100 میکرولیتر نرمال سالین دریافت کردند.

گروه ایسکمی: در این گروه موش‌ها، میزان 100 میکرولیتر محلول نرمال سالین به‌صورت درون‌صفاقی، نیم‌ساعت قبل از ایجاد ایسکمی و هم‌زمان با رپرفیوژن دریافت کردند.

گروه گرلین: گرلین با دُز 10 نانومول به ازای هر موش به‌صورت درون‌صفاقی‌، نیم‌ساعت قبل از ایجاد ایسکمی و هم‌زمان با رپرفیوژن تزریق شد.

مراحل ایجاد ایسکمی ـ رپرفیوژن: در هر سه گروه مورد‌مطالعه قبل از جراحی، موش‌ها تحت بیهوشی با ترکیب کتامین 10 درصد (آلفاسان، هلند) با دُز 80 میلی‌گرم بر کیلوگرم و زایلازین 2 درصد (رویان دارو، ایران) با دُز 10 میلی‌گرم بر کیلوگرم قرار گرفتند. سپس ناحیه شکم تراشیده و تحت شرایط آسپسی، برشی به طول 5/2 الی 3 سانتی‌متر روی خط میانی شکم ایجاد شد.

در گروه شم، پس از برش محوطه شکمی و پس از کمی دستکاری تخمدان، شکم با استفاده از نخ نایلون سه صفر بخیه شد. در گروه‌های ایسکمی و گرلین، تخمدان‌ها با استفاده از پنس خون‌بند به میزان 720 درجه حول محور رباط‌های توبواورین چرخانده شدند. پنس در تمام مدت 2 ساعت روی پایک‌های عروقی باقی ماند تا ایسکمی پایدار ایجاد شود. برای محافظت از موضع جراحی در این مدت، تامپون استریل بر روی تخمدان قرار داده شد. پس از پایان این مدت، پنس برداشته شد تا رپرفیوژن آغاز گردد. در‌نهایت، در موش‌ها با تزریق داخل‌قلبی داروی سولفات منیزیم، آسان‌کشی صورت گرفت و سپس بافت تخمدان جهت بررسی‌های ایمونوهیستوشیمی برداشته شد. نمونه‌های اخذ‌شده تا زمان آزمایشات بعدی در فرمالین بافره نگهداری شدند.

تهیه گرلین: رقیق‌سازی گرلین (Tocris Cook Son Ltd., Bristol, UK) با نرمال سالین صورت گرفت و محلول موردنظر با نسبت 10 نانومول گرلین در هر 100 میکرولیتر از هورمون رقیق‌شده تهیه شد. انتخاب دُز گرلین بر‌اساس واحد نانومول به‌‌دلیل ماهیت پپتیدی این ترکیب و وزن مولکولی آن (تقریباً 3370 دالتون) صورت گرفت. استفاده از واحد مولار در مطالعات دارویی رایج است، زیرا امکان محاسبه دقیق‌تر غلظت و مقایسه بهتر با مطالعات سلولی و فارماکولوژیک را فراهم می‌‌‌کند. مطالعات پیشین نیز دُزهای مشابهی را با همین واحد برای ارزیابی اثرات سیستمیک گرلین در مدل‌های ایسکمی ـ رپرفیوژن در موش گزارش کرده‌اند (13).

ارزیابی ایمونوهیستوشیمی: جهت تهیه لام بافتی، پاساژ نمونه‌های اخذ‌شده صورت گرفت. سپس از آن‌ها بلوک‌های پارافینی تهیه گردید و مقاطعی با ضخامت 3 میلی‌متر تهیه شد. پس از آن، مراحل پارافین‌زدایی و آب‌گیری انجام و نمونه‌ها در محلول بازیافت آنتی‌ژن Tris-EDTA غوطه‌ور و در حمام حرارتی (98 درجه سانتی‌گراد) به‌مدت 20 دقیقه قرار گرفت. جهت متوقف کردن پراکسیداز درون‌زا، نمونه‌ها با پراکسید هیدروژن (H2O2 3 درصد) در محلول PBS به‌مدت 15 دقیقه غوطه‌ور شدند و در PBS از سرم خرگوش سالم (5 درصد) جهت جلوگیری از رنگ‌آمیزی غیراختصاصی زمینه، استفاده شد. نمونه‌ها با آنتی‌بادی‌‌‌های اولیه به‌مدت 1 ساعت انکوبه شدند. از کیت‌های رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی مارکر Bax و Bcl-2 (Biocare، ایالات متحده آمریکا) جهت رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی نمونه‌ها استفاده شد.

تحلیل آماری: برای استخراج داده‌های کمی، در هر اسلاید بافتی، 10 میدان دید تصادفی در بزرگ‌نمایی 400 برابر با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی شد. تعداد سلول‌های رنگ‌پذیر مثبت برای مارکرهای Bax و Bcl-2 به‌صورت دستی و توسط دو مشاهده‌گر کور (blinded observers) شمارش شد.

داده‎ها جهت ترسیم نمودار در نرم‌افزار Microsoft Excel وارد و برای هر گروه به‌صورت میانگین ± خطای استاندارد میانگین (Mean ± SEM)  نشان داده شده‎اند.

تجزیه‌و‌تحلیل آماری با استفاده از نرم‌افزار GraphPad Prism نسخه 10 انجام گرفت. برای داده‌های دارای توزیع نرمال، از آزمون ANOVA یک‌طرفه (One-way ANOVA) و برای داده‌هایی که توزیع غیر‌نرمال داشتند معادل غیرپارامتری ANOVA یک‌طرفه یعنی آزمون کروسکال ـ والیس (Kruskal-Wallis test) انجام شد. همچنین برای مقایسه بین گروه‌ها از آزمون تعقیبی توکی (Tukey’s post-hoc test) استفاده شد. سطح معنی‌داری در مطالعه حاضر (05/0>P) در نظر گرفته شد.

نتایج

بیان پروتئینBax  در سلول‌‌‌های تکا: همان‌طور که در تصویر 1، نمودار A نشان می‌دهد، ایسکمی به افزایش معنی‌دار بیانBax  در سلول‌های تکای تخمدان نسبت به گروه شم (0001/0>P) منجر گردید. این یافته حاکی از آن است که ایسکمی به‌طور قابل‌توجهی فرایند آپوپتوز در سلول‌های تکا را تحریک کرده است. در گروه تحت درمان با گرلین، این افزایش در بیان Bax به‌طور معنی‌داری کاهش یافت (001/0>P) که نشان‌دهنده اثر محافظتی گرلین در مهار آپوپتوز ناشی از ایسکمی است. با‌این‌حال در گروه گرلین، بیان Bax هنوز نسبت به گروه شم به‌طور معنی‌داری بالاتر بود (01/0>P) که می‌تواند نشان‌دهنده تأثیر نسبی درمان باشد.

بیان پروتئینBax  در سلول‌های گرانولوزا: همان‌طور که در تصویر 1، نمودار B نشان می‌دهد، القای ایسکمی به افزایش معنی‌دار بیان Bax در سلول‌های گرانولوزای تخمدان نسبت به گروه شم (0001/0>P) منجر شد. این یافته حاکی از آن است که ایسکمی به‌طور قابل‌توجهی فرایند آپوپتوز را در سلول‌های گرانولوزا تحریک کرده است. در گروه تحت درمان با گرلین، این افزایش در بیان Bax به‌طور معنی‌داری کاهش یافته است (0001/0>P) که نشان‌دهنده اثر محافظتی گرلین در مهار آپوپتوز ناشی از ایسکمی است. با‌این‌حال، در گروه گرلین، بیان Bax همچنان نسبت به گروه شم به‌طور معنی‌داری بالاتر است (05/0>P) که می‌تواند نشان‌دهنده تأثیر نسبی درمان باشد. این نتایج به‌طورکلی نشان‌دهنده اثر مثبت گرلین در کاهش آپوپتوز ناشی از ایسکمی است.

بیان پروتئینBax  در سلول‌های جسم زرد: ایسکمی به افزایش قابل‌توجه بیان Bax در سلول‌های جسم زرد تخمدان نسبت به گروه شم منجر گردید (0001/0>P) و به‌وضوح در تصویر 1، نمودار C این موضوع مشخص است. همچنین این تغییر نشان‌دهنده تحریک شدید فرایند آپوپتوز در این سلول‌ها در اثر ایسکمی است. تجویز گرلین به کاهش معنی‌دار بیان Bax در مقایسه با گروه ایسکمی منجر شد (0001/0>P) که نشان‌دهنده اثر محافظتی این پپتید در مهار آپوپتوز ناشی از ایسکمی است. با‌این‌حال، در گروه گرلین، بیان Bax هنوز نسبت به گروه شم به‌طور معنی‌دار بالاتر بود (01/0>P) که نشان می‌دهد گرلین نمی‌تواند به‌طور کامل اثرات ایسکمی را از بین ببرد و سطح Bax را به حد نرمال گروه شم برگرداند.

بیان پروتئینBax  در سلول‌های استروما: همان‌طور که در تصویر 1، نمودارD   مشاهده می‌‌شود، القای ایسکمی موجب افزایش بسیار معنی‌دار بیان Bax در سلول‌های استروما در مقایسه با گروه شم شده است (0001/0>P) که نشان‌دهنده افزایش شدید آپوپتوز ناشی از ایسکمی در این سلول‌هاست. در گروه تحت درمان با گرلین، بیان Bax به‌طور قابل‌توجهی کاهش یافت (0001/0>P) که بیانگر نقش محافظتی گرلین در تعدیل پاسخ‌های سلولی به فرایند ایسکمیک است. با‌این‌حال سطح بیان Bax در گروه گرلین همچنان به‌طور معنی‌داری بالاتر از گروه شم باقی ماند (05/0>P). این موضوع نشان می‌‌دهد اگرچه گرلین اثر تعدیل‌کننده مطلوبی دارد، اما قادر به بازگرداندن کامل سطح آپوپتوز به حالت نرمال نبوده است.

همچنین در تصاویر ایمونوهیستوشیمی مربوط به بیان Bax (تصویر 2)، توزیع و شدت بیان پروتئین Bax در سلول‌های تخمدان در گروه‌های مختلف تفاوت‌های قابل‌ملاحظه‌ای را نشان می‌‌دهد. در گروه (شم)، سلول‌ها دارای مورفولوژی طبیعی با هسته‌های مشخص و سیتوپلاسم یکنواخت بوده و رنگ‌پذیری بسیار ضعیفی برای Bax نشان می‌‌دهند که بیانگر سطح پایه و فیزیولوژیک این پروتئین در شرایط طبیعی است. در گروه (ایسکمی)، علاوه‌بر تغییرات ساختاری، مانند نامنظم شدن غشای سلولی و تراکم کروماتین، افزایش قابل‌توجه رنگ‌آمیزی قهوه‌ای در سراسر سلول مشاهده می‌‌شود که نشان‌دهنده افزایش چشمگیر بیان Bax و شروع روندهای آپوپتوتیک می‌‌‌باشد. در گروه (گرلین)، شدت رنگ‌آمیزی Bax نسبت به گروه ایسکمی کاهش یافته و سلول‌ها تا حدودی ویژگی‌های مورفولوژیک طبیعی خود را بازیافته‌اند، هرچند هنوز نسبت به گروه شم بیان بالاتری از Bax را نشان می‌‌دهند.

بیان پروتئینBcl-2  در سلول‌های تکا: همان‌طور که در تصویر 3، نمودارA  مشاهده می‌‌شود، بین گروه‌های مورد‌مطالعه از‌نظر میزان بیان پروتئین Bcl-2 تفاوت آماری معنی‌داری وجود دارد (0001/0>P). القای ایسکمی به کاهش بسیار معنی‌دار بیان Bcl-2 در سلول‌های تکای تخمدان نسبت به گروه شم منجر شده است (0001/0>P) که این کاهش می‌‌تواند بیانگر سرکوب قابل‌توجه مکانیسم‌های ضدآپوپتوزی تحت شرایط ایسکمیک باشد. درمقابل، تجویز گرلین در گروه درمان سبب افزایش معنی‌دار بیان Bcl-2 نسبت به گروه ایسکمی گردید (0001/0>P) که نشان‌دهنده اثر محافظتی این پپتید در تقویت مسیرهای ضدآپوپتوزی و تعدیل آسیب ناشی از ایسکمی است. در‌عین‌حال، میزان بیان Bcl-2 در گروه دریافت‌کننده گرلین همچنان به‌طور معنی‌داری پایین‌تر از گروه شم باقی ماند (0001/0>P) که نشان می‌دهد گرلین اگرچه توانسته بخشی از کاهش ناشی از ایسکمی را جبران کند، اما نتوانسته سطح بیانBcl-2  را به حد طبیعی بازگرداند. 

بیان پروتئینBcl-2  در سلول‌های گرانولوزا: تصویر 3، نمودار Bنشان می‌دهد بین گروه‌های مورد‌مطالعه از‌نظر میزان بیان پروتئین Bcl-2 در سلول‌های گرانولوزا تفاوت آماری معنی‌داری وجود دارد (0001/0>P). القای ایسکمی باعث کاهش بسیار معنی‌دار بیان Bcl-2 نسبت به گروه شم شده است (0001/0>P) که این کاهش می‌تواند نشان‌دهنده تضعیف مکانیسم‌های ضد‌آپوپتوزی در شرایط ایسکمیک باشد. تجویز گرلین در گروه درمان سبب افزایش معنی‌دار بیان Bcl-2 نسبت به گروه ایسکمی شده است (0001/0>P) که بیانگر اثر محافظتی گرلین در کاهش آسیب سلولی ناشی از ایسکمی است. با‌این‌حال سطح بیان Bcl-2 در گروه درمان با گرلین همچنان به‌طور معنی‌داری پایین‌تر از گروه شم باقی ماند (0001/0>P) که نشان می‌‌دهد گرلین به‌تنهایی نتوانسته به سطح نرمال بازگردد.

در تصاویر ایمونوهیستوشیمی مربوط به بیان پروتئین Bcl-2 (تصویر 4) در سلول‌‌‌های تکا و گرانولوزا، تفاوت معنی‌داری در شدت بیان پروتئین ضدآپوپتوز Bcl-2 مشاهده می‌‌شود؛ به‌طوری‌که گروه کنترل  بیشترین شدت رنگ‌آمیزی را نشان می‌دهد که بیانگر سطح بالای این پروتئین و حفظ بقای سلولی است. در گروه ایسکمی، شدت رنگ‌آمیزی به‌طور قابل‌توجهی کاهش یافته که نشان‌دهنده کاهش بیان Bcl-2 و افزایش احتمال فعال ‌شدن مسیرهای آپوپتوز است. گروه درمان‌شده با گرلین بیان نسبی Bcl-2 را نسبت به گروه ایسکمی بهبود بخشیده، اما همچنان کمتر از گروه کنترل باقی مانده است. این تغییراتِ بیان پروتئین در سلول‌های تکا و گرانولوزا که نقش کلیدی در تنظیم مرگ برنامه‌ریزی‌شده و بقای سلولی دارند، با داده‌های آماری همخوانی کامل داشته و نشان‌دهنده تأثیر محافظتی گرلین در تعدیل پاسخ سلولی به آسیب ایسکمیک است. کاهش بیان Bcl-2 در شرایط ایسکمی می‌تواند موجب افزایش آپوپتوز و اختلال در عملکرد سلول‌های تکا شود، در‌حالی‌که گرلین با تعدیل این مسیر، به حفظ سلولی کمک می‌کند.

بیان پروتئینBcl-2  در سلول‌‌‌های جسم زرد و استروما: همان‌طور که در تصویر 3، نمودارهای C وD  دیده می‌‌شود، هیچ تفاوت آماری معنی‌داری بین گروه‌های مورد‌مطالعه (شم، ایسکمی و گرلین) در میزان و شدت بیانBcl-2  در سلول‌های جسم زرد و استروما وجود نداشت (05/0>P). به‌عبارت‌دیگر، ایسکمی به‌طور معنی‌داری بر میزان بیانBcl-2  در این سلول‌ها تأثیری نگذاشت. همچنین تجویز گرلین نیز تأثیر معنی‌داری بر میزان بیان Bcl-2 در سلول‌های استروما و جسم زرد نسبت به گروه ایسکمی و شم نداشت.

بحث

پیچ‌خوردگی تخمدان به‌عنوان یک اورژانس جراحی در جنس ماده محسوب می‌‌شود که در اثر چرخش ساختارهای آدنکس (شامل تخمدان و / یا لوله فالوپ) حول محور رباط‌های نگه‌دارنده آن رخ می‌‌دهد (2). این عارضه به اختلال در خون‌رسانی و بروز ایسکمی بافتی منجر می‌‌شود که در‌نهایت به مرگ سلولی می‌‌انجامد. اگرچه بازگشت جریان خون (رپرفیوژن) برای احیای بافت ایسکمیک ضروری است، مطالعات نشان می‌‌دهند فرایند خون‌رسانی مجدد می‌‌تواند آسیب بافتی را در مقایسه با ایسکمی به‌تنهایی تشدید کند (14). این پدیده که به آسیب ایسکمی ـ رپرفیوژن معروف است، با تظاهراتی همچون ادم، خون‌ریزی، تغییر رنگ بافتی و در‌نهایت نکروز همراه می‌‌باشد (2).

مکانیسم آسیب ایسکمی ـ رپرفیوژن ناشی از اختلال در متابولیسم سلولی به ‌دنبال کاهش اکسیژن‌رسانی و تجمع متابولیت‌های سمی است، در‌حالی‌که خون‌رسانی مجدد برای بازگشت عملکرد بافت ضروری است، می‌تواند به تولید گونه‌های فعال اکسیژن و تشدید پاسخ‌های التهابی منجر شود که نتیجه آن افزایش آسیب سلولی و مهار بازگشت بافت به عملکرد طبیعی است. جالب توجه آنکه اگرچه آسیب بافتی هم در فاز ایسکمی و هم در فاز رپرفیوژن رخ می‌‌دهد، سهم آسیب ناشی از خون‌رسانی مجدد اغلب نادیده گرفته می‌شود (14).

در این میان، خانواده پروتئین‌های Bcl-2 به‌عنوان تنظیم‌کننده‌های کلیدی آپوپتوز شناخته می‌‌شوند. تعادل بین اعضای پیش‌آپوپتوز (مانند‌Bax ) و ضد‌آپوپتوز (مانندBcl-2 ) نقش تعیین‌کننده‌ای در سرنوشت سلول دارد.Bcl-2  یک پروتئین ضد‌آپوپتوز است و در بافت‌های مختلف، از‌جمله سیستم ایمنی بیان می‌‌شود. مطالعات نشان داده‌اند سطح بیان این پروتئین در مراحل اولیه تمایز لنفوسیتی پایین است و با بلوغ سلول‌های B و T افزایش می‌‌یابد که این افزایش با مقاومت بیشتر سلول‌ها در برابر آپوپتوز همراه است (9، 10). در مقابل، Bax به‌عنوان یک پروتئین پیش‌آپوپتوز با خنثی ‌کردن اثرات‌Bcl-2 ، مسیرهای مرگ سلولی را فعال می‌کند (10). نسبت Bax به Bcl-2 عامل تعیین‌کننده‌ای در پاسخ سلول به محرک‌های آپوپتوزی است؛ به‌طوری‌که غلبه Bax به مرگ سلولی منجر می‌‌شود، در‌حالی‌که غلبه Bcl-2 از آپوپتوز جلوگیری می‌کند.

گرلین، یک پپتید 28 اسید‌آمینه‌ای است که به‌عنوان لیگاند اندوژن گیرنده هورمون رشد عمل می‌کند. این هورمون عمدتاً در معده و هیپوتالاموس تولید می‌‌شود و در تحریک ترشح هورمون رشد و تنظیم اشتها نقش مهمی ایفا می‌کند (15). اگرچه بیان ژن گرلین در بافت‌های مختلفی، از‌جمله معده، روده کوچک و مغز گزارش شده است، بالاترین سطح آن در معده مشاهده می‌شود (16). در تخمدان، گرلین و گیرنده‌های آن در سلول‌های بینابینی، لوتئال، اووسیت و فولیکول‌ها شناسایی شده‌اند که نشان‌دهنده نقش احتمالی این هورمون در تنظیم عملکرد فولیکولی و لوتئال است (17، 18). مطالعات بر روی موش‌های صحرایی نیز بیان مداوم گرلین را در طول چرخه استروس تأیید کرده‌اند، به‌طوری‌که کمترین سطح بیان در فاز پروستروس و بیشترین آن در دیاستروس مشاهده شده است (7).

گرلین با تعدیل مسیرهای انتقال پیام (Signaling)، نقش مهمی در کاهش آپوپتوز سلول‌های تخمدانی ایفا می‌کند. مطالعات نشان می‌دهند گرلین با افزایش بیان پروتئین‌های ضد‌آپوپتوتیک مانند Bcl-2 و کاهش فعالیت کاسپاز-۳ (آنزیم اجرایی آپوپتوز)، بقای سلول‌های گرانولوزا و لوتئال را تقویت می‌کند ‌(19). همچنین گرلین از‌طریق فعال‌سازی مسیرهای پیغامبر ثانویه مانند ERK1/2، تکثیر سلولی را تحریک و مرگ برنامه‌ریزی‌شده را مهار می‌کند (20). در مدل‌های حیوانی، افزایش هم‌زمان گرلین و استرادیول در فولیکول‌های تخمدانی طی بارداری، با افزایش بیان PCNA (شاخص تکثیر سلولی) و کاهش نشانگرهای آپوپتوتیک همراه است که نشان‌دهنده تعامل این هورمون با فاکتورهای استروئیدی در تنظیم هموستاز تخمدانی است (19). علاوه‌براین، گرلین با تعدیل ترشح هورمون‌های گنادوتروپین (نظیر LH و FSH) و کاهش استرس اکسیداتیو، محیطی ضد‌آپوپتوز را در بافت تخمدان ایجاد می‌کند (20). این مکانیسم‌ها به‌طور هماهنگ، بقای سلول‌های تخمدانی را در شرایط فیزیولوژیک و پاتولوژیک بهبود می‌بخشند.

در مطالعه حاضر، برای اولین‌بار تأثیر گرلین بر فعالیت‌های آپوپتوزی و غیرآپوپتوزی سلول‌های تخمدان موش صحرایی تحت شرایط پیچ‌خوردگی تجربی بررسی شد. یافته‌ها نشان داد تجویز گرلین به کاهش معنی‌دار بیان Bax و افزایش Bcl-2 در سلول‌های گرانولوزا و تکا منجر می‌شود. همچنین کاهش بیان Bax در سلول‌های جسم زرد و استروما مشاهده شد که نشان‌دهنده نقش محافظتی گرلین در کاهش التهاب و نکروز ناشی از ایسکمی ـ رپرفیوژن در تخمدان است. هرچند استروما عمدتاً به‌عنوان یک بافت حمایتی در تخمدان شناخته می‌شود و از سلول‌های فیبروبلاست، عروقی و ایمنی تشکیل شده است، اما نسبت به آسیب‌های ناشی از ایسکمی ـ رپرفیوژن حساسیت بالایی دارد. شرایط ایسکمی ـ رپرفیوژن به بروز استرس اکسیداتیو شدید در این سلول‌ها منجر می‌شود که می‌تواند باعث القای آپوپتوز و افزایش بیان پروتئین‌هایی مرتبط نظیر Bax گردد؛ فرایندی که بیانگر تلاش سلول‌ها برای حفظ تعادل میان بقا و مرگ برنامه‌ریزی ‌شده است (21).

این نتایج با مطالعه Kheradmand و همکاران در سال 2014 همسو است که نشان دادند تجویز 14 روزه گرلین در موش‌های صحرایی سالم به کاهش Bax و افزایش Bcl-2 در سلول‌های تخمدان منجر می‌شود. علاوه‌بر‌این، گزارش کردند گرلین باعث افزایش بیان PCNA (نشانگر تکثیر سلولی) می‌شود، در‌حالی‌که تأثیر معنی‌داری بر فعالیت کاسپاز ـ 3 نداشته است (8). نکته قابل‌توجه در مطالعه حاضر این است که در مقابل تجویز روزانه گرلین به‌مدت 2 هفته، حتی تجویز تک‌دُز گرلین در زمان پیچ‌خوردگی و پیش از شروع ایسکمی نیز اثرات محافظتی قابل‌توجهی دارد.

در مقایسه با سایر مطالعات، Gencer  و همکاران در سال 2015 تأثیر ملاتونین را بر آسیب ایسکمی ـ رپرفیوژن تخمدان ارزیابی کردند و کاهش قابل‌توجهی در تغییرات هیستوپاتولوژیک مانند احتقان عروقی، ادم و خون‌ریزی در گروه دریافت‌کننده ملاتونین مشاهده نمودند (22). از‌سوی‌دیگر، Saat  و همکاران در سال 2019 با بررسی اثر ملاتونین بر رحم موش‌های آبستن دریافتند این ترکیب می‌تواند آسیب ناشی از پیچ‌خوردگی رحم را کاهش دهد. هرچند تغییر معنی‌داری در بیان Bax و  Bcl-2  مشاهده نشد (23). این تفاوت ممکن است ناشی از تفاوت در ارگان هدف (رحم در مقابل تخمدان) و یا تفاوت در مارکر موردبررسی باشد.

Abdolgaber و همکاران در سال 2020 نیز نشان دادند نیکوراندیل (NIC) با کاهش استرس اکسیداتیو و بیومارکرهای آپوپتوزی مانند COX-2 و‌CD68 ، اثرات محافظتی در برابر آسیب ایسکمی ـ رپرفیوژن تخمدان دارد (24).  این یافته‌ها از‌نظر تأثیر بر مارکرهای آپوپتوزی با نتایج مطالعه حاضر همخوانی دارد. به‌‌علاوه، Gungor و همکاران در سال 2014 با بررسی هسپرتین گزارش کردند این ترکیب به کاهش آپوپتوز (کاهش کاسپاز-3) و بهبود آسیب بافتی در مدل ایسکمی ـ رپرفیوژن تخمدان منجر می‌شود (25) که مجدداً تأییدکننده نتایج این مطالعه است.

مطالعه Sayyah-Melli و همکاران در سال 2011 نیز نشان داد اریتروپویتین می‌تواند با کاهش استرس اکسیداتیو (کاهش مالون دی‌آلدئید و افزایش آنتی‌اکسیدان‌ها) در آسیب ناشی از پیچ‌خوردگی تخمدان نقش محافظتی ایفا کند (26). این مکانیسم ممکن است مشابه اثر گرلین در کاهش مرگ سلولی از‌طریق کاهش استرس اکسیداتیو باشد.

شواهد دیگر حاکی از آن است که گرلین با افزایش ترشح استرادیول (E2) از‌طریق فعال‌سازی آروماتاز در سلول‌های گرانولوزا، آپوپتوز در فولیکول‌های تخمدانی را مهار کرده و بقای فولیکولی را تقویت می‌کند (27، 28). این یافته‌ها به‌خوبی از نتایج مطالعه حاضر حمایت می‌کنند و نشان می‌دهند گرلین می‌تواند به‌عنوان یک عامل محافظتی در برابر آسیب ایسکمی ـ رپرفیوژن تخمدان مطرح باشد.

نتیجه‌گیری نهایی: به‌طور‌کلی در مطالعه حاضر تغییرات سلول‌های گرانولوزا، تکا، جسم زرد و استروما و همچنین بیان Bax  پایین و بیان Bcl-2  بالا، نشان‌دهنده سطح پایین آپوپتوز و بقای سلولی مناسب بود. نشانه‌های التهاب یا نکروز در بافت مشاهده نشد. همچنین در گروه ایسکمی، در بافت سلول استرومای تخمدان، تغییرات ناشی از ایسکمی مشاهده گردید. علاوه‌بر‌این، بی‌نظمی در ساختار بافت، تغییر در اندازه و شکل سلول‌ها و افزایش فضای بین سلولی دیده شد. همچنین بیان Bax افزایش و بیان Bcl-2 کاهش یافت که نشان‌دهنده افزایش آپوپتوز بود و نشانه‌هایی از التهاب یا نکروز نیز در بافت مشاهده نشد. علاوه‌بر‌این در گروه تحت درمان (گرلین)، بافت سلول استرومای تخمدان در این گروه بهبود نسبی را نشان داد. همچنین ساختار بافت نسبت به گروه ایسکمی منظم‌تر بود و سلول‌ها شکل و اندازه نزدیک‌تر به نرمال داشتند. بیان Bax کاهش و بیان Bcl-2 افزایش یافته بود، اما احتمالاً این مقادیر به‌طور کامل به سطح گروه شم نرسیدند و همین باعث شد ساختار کاملاً شبیه نرمال نباشد. علاوه‌بر‌این نشانه‌های التهاب یا نکروز در مقایسه با گروه ایسکمی کاهش پیدا کرده بود، اما همچنان به‌طور کامل برطرف نشده بود.

در‌نهایت، نتایج مطالعه حاضر نشان داد تزریق داخل‌صفاقی گرلین قبل از ایسکمی و هم‌زمان با رپرفیوژن تخمدان پیچ‌خورده باعث کاهش قابل‌توجه بیان Bax و افزایش Bcl-2 در سلول‌های گرانولوزا و تکا و کاهش چشمگیر بیان Bax در سلول‌های جسم زرد و استروما می‌شود که بیان‌کننده تأثیر  بسزای گرلین در کاهش مرگ سلولی ناشی از ایسکمی ـ رپرفیوژن پیچ‌خوردگی تخمدان است.

ملاحظات اخلاقی

نحوه تزریق، جراحی و کشتار موش‌ها بر‌اساس دستورالعمل کمیته اخلاق در پژوهش دانشگاه لرستان به شماره LU.ECRA.2023.77 انجام شده است.

سپاسگزاری

بدین وسیله نویسندگان از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه لرستان جهت تأمین هزینه انجام مطالعه حاضر تشکر و قدردانی می‌نمایند.

تعارض منافع

هیچ گونه تعارض منافعی در ارتباط با این مطالعه وجود ندارد.