ترانسفکشن اسپرم انزالی گوسفند با پلاسمید حاوی ژن لیزوزیم انسانی

نویسندگان

1 پژوهشکده بیوتکنولوژی، سازمان پژوهش‌های علمی وصنعتی ایران، تهران–ایران

2 گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، تهران–ایران

3 گروه پزشکی مولکولی، موسسه پاستور تهران،‌تهران–ایران

4 دانش آموخته، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، تهران–ایران

چکیده

زمینه مطالعه: ‌انتقال ژن بواسطه اسپرم به عنوان یک روش ساده و ارزان برای تولید جانوران تراریخته مطرح شده است. هدف:‌ ‌هدف از این تحقیق بررسی جذب پلاسمید حاوی ژن لیزوزیم انسانی توسط اسپرم انزالی گوسفند و اثر زمان انکوباسیون و حضور مایع منی در میزان و شدت جذب این پلاسمید و تحرک اسپرم‌ها بود. روش کار:‌ ‌در آزمایش اول از 3 قوچ و 2 بار از هر قوچ، به روش الکتریکی اسپرم تهیه شده و پس از شستشو و حذف مایع منی، 106‌‌*‌‌1 اسپرم با ‌ng‌100 پلاسمید ‌pEGFP-IRES-hLys‌ نشان دار شده با ماده فلورسنت رودامین برای 15، 30، 60 و 120 دقیقه انکوبه شدند. سپس با میکروسکوپ فلورسنت از نظر تعداد و شدت جذب پلاسمید و تحرک بررسی شدند. برای بررسی ورود ‌DNA‌ خارجی به اسپرم، نمونه‌های اسپرم بعد از 60  دقیقه انکوباسیون تحت تیمار با ‌DNase‌ قرار گرفتند. در آزمایش دوم اثر وجود مایع منی در جذب ‌pEGFP-IRES-hLys‌، پس از 30 و 60  دقیقه انکوباسیون بررسی شد. نتایج:‌ ‌تعداد اسپرم‌هایی که ‌DNA‌ خارجی را جذب کرده‌اند و شدت جذب با افزایش زمان انکوباسیون افزایش می‌یافت اما تنها تا 30 دقیقه این افزایش معنی‌دار بود (05/0.)p< متوسط درصد جذب در 120 دقیقه 16/60 بود تحرک کل و پیش رونده اسپرم‌های انکوبه شده با پلاسمیدکاهش یافت اما هیچ اسپرم دارای جذب در ناحیه پشت آکروزوم متحرک نبود. پس از تیمار با ‌DNase‌ وجود بازتاب فلورسنت در ناحیه پشت آکروزوم  نشان دهنده ورود پلاسمید به سلول بود. وجود مایع منی باعث کاهش میزان و شدت جذب پلاسمید و کاهش تحرک اسپرم‌ها شد. نتیجه گیری‌نهایی: اسپرم  انزالی گوسفند می‌تواند به میزان بالایی پلاسمید حاوی ژن لیزوزیم انسانی را به خود جذب کند. اما هیچ اسپرم ترانسفکت شده‌ای متحرک نبود. انکوباسیون با مقادیر کمتر از ‌ng 100‌ پلاسمید و زمان‌های کمتر ممکن است بتواند اسپرم‌های متحرک حاوی پلاسمید به دست دهد.
 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Transfection of ram spermatozoa with pEGFP carrying human lysozyme gene

نویسندگان [English]

  • Khosro Hoseini Pajooh 1
  • Parviz Tajik 2
  • Mortez Karimipor 3
  • Mehdi Behdani 3
  • Seyed Mojtaba Davoudi 4
1 Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology, Tehran-Iran
2 Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran-Iran
3 Molecular Medicine Department, Biotechnology Research Center, Pasteur Institute of Iran, Tehran-Iran.
4 Graduated From the Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran-Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: As we all know, sperm has the capacity to take up foreign DNA, therefore, sperm mediated gen transfer can be an inexpensive and simple method in animal transgenesis in various species. However, there is not sufficient evidence of DNA uptake by ovine spermatozoa. Objectives: The purpose of the present study was to examine the uptake of human lysozyme gene contained plasmid (pEGFP-IRES-hLys) by ovin spermatozoa. Methods: In the first experiment, semen was prepared from three ram (each ram two times) by electrical method. After removal of seminal plasma, 1x106 spermatozoa were incubated with rhodamin-labled pEGFP-IRES-hLys in TCM199 for 15, 30, 60 and 120 minutes and then observed for motility, uptake percent and uptake intensity by florescent microscopy. Also after 60 minutes incubation sperms were treated by DNaseI to assay adsorption or uptake of pEGFP-IRES-hLys. In the second experiment, washed and unwashed sperms were incubated with rhodamin-labled pEGFP-IRES-hLys in TCM199 for 30 and 60 minutes to evaluate the effect of presence seminal plasma on sperm uptake and motility. Results: The findings showed that increasing incubation time increased number/percentage of spermatozoa carrying exogenous DNA and its intensity. But this different was significant only up to 30 minutes. We found that 60.16% of the cells were bound to DNA after 120 minutes incubation. Incubation with exogenous DNA induced a slightly decrease in sperm total and progressive motility. But no post acrosom uptaked sperm was motile. After treatment with DNaseI, strong florescent emission from post acrosom indicated absorption of pEGFP-IRES-hLys by spermatozoa. Presence of seminal plasma induced a slightly decrease in percent of DNA absorbed spermatozoa and absorption intensity, but did not inhibit completely. ConclusionS: Ram spermatozoa showed a high capacity to bind DNA quickly and reach a maximum after 30 min. However, no sperm with real uptake (post acrosomal) was motile. Incubation with lower DNA concentration and/or shorter time may be helpful. 
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • human lysozyme
  • ram
  • SMGT

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار