اثر تعداد سلولهای گرانولوزا در محیط کشت در بیان ژن آنزیمهای مؤثر در ساخت هورمونهای استروییدی

نویسنده

گروه علوم دامی، دانشکده علوم دامی و شیلات دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری-ایران

چکیده

زمینه مطالعه: سلول‌های گرانولوزا دارای نقشی کلیدی در مسیر استروئیدوژنسیز هستند. هدف: از مطالعه حاضر بررسی تراکم سلول‌های گرانولوزا کشت داده شده حاصل از فولیکول‌های mm 5-2بر تراوش استرادیول و بیان ژن‌های مرتبط با ساخت استرادیول و پروژسترون بود. روش کار: به طور خلاصه، فولیکول‌های mm 5-2 از تخمدان گاوهای بالغ از کشتارگاه جمع آوری شدند، پس از جدا سازی و شمارش سلول‌ها با استفاده از رنگ تریپان بلو 4/0‌%، سلول‌های گرانولوزا در محیط DMEM/F12 به مدت شش روز کشت داده شدند. تیمارها شامل 1) 500 هزار سلول در mL‌500 محیط کشت، 2) 500 هزار سلول در mL 200 محیط کشت، 3) 250 هزار سلول در mL‌500  محیط کشت و 4) 250 هزار سلول در mL‌200 محیط کشت بود. داده‌های مربوط به بیان ژن‌ها با استفاده از نرم افزار JMP مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نتایج: در شرایطی که مقدار محیط کشت ثابت بود کاهش تعداد سلول‌ها (کاهش تراکم) منجر به افزایش غلظت استرادیول گردید و در شرایطی که تعداد سلول‌ها ثابت بود کاهش محیط کشت (افزایش تراکم) سبب کاهش غلظت استرادیول گردید. میزان پروتئین و RNA استخراجی تفاوتی بین تیمارها نداشت. با کاهش تراکم بیان ژن‌های FSHR، CYP19، 17βHSD افزایش و بیان ژن‌های GADD45β و StAR کاهش یافت. نتایج مطالعه حاضر نشان داد کاهش تراکم سلول سبب افزایش تولید استرادیول و همچنین افزایش mRNA کد کننده آنزیم‌های استروژنیک گردید ولی بالعکس سبب کاهش بیان mRNA کد کننده آنزیم‌های پروژستژنیک (Progestagenic) گردید. نتیجه‌گیری‌نهایی: غلظت پروتئین با کاهش تراکم سلول تغییر نکرد در نتیجه می‌توان سلول را از اثرات مضر افزایش تراکم محافظت کرد.
 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Effect of number of culture medium granulosa cells on gene expression of enzymes associated with synthesis of steroid hormones

نویسنده [English]

  • Essa Dirandeh
Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University, Sari-Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Granuloca cells have a key role during estroeidogenesis. OBJECTIVES: The purpose of this study was to determine the effect of number of culture medium granulosa cells on estradiol concentrations and mRNA codding estrogenic and progestagenic enzyme. METHODS: Briefly, follicles between 2 and 5 mm diameter were dissected from the ovaries of adult cows and were collected by rinsing the follicle walls with Dulbecco Modified Eagle medium/F12 (DMEM/F12). The number of cells was counted with a haemocytometer and the viable cells were assessed by the dye exclusion method using 0.4% Trypan Blue. Treatments were 1) 500,000 cell/500 ml, 2) 250,000 cell/500 ml, 3) 500,000 cell/200 ml 4) 250,000 cell/ 200 ml.  All data were analyzed by JMP (SAS). RESULTS: Low plating density increased E2 secretion and mRNA encoding LHR, FSHR and estrogenic enzymes (17βHSD, CYP19), whereas decreased mRNA encoding GADD45β. There were no differences among treatments for RNA and protein concentration. Low plating density also decreased protein amount but there was no difference among treatments for RNA amount. In conclusion, decreased cell density cause increase in mRNA encoding codding estrogenic enzyme gene expression and decrease in mRNA encoding progestagenic enzyme gene expression. CONCLUSIONS: Protein concentrations did not changed with decreased cell density therefore we can save cells against harmful effect of increasing cell density.
 
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • cell culture
  • granulosa cell
  • Holstein cow
  • PCR
  • RIA

مراجع

Adams, G.P., Matteri, R.L., Kastelic, J.P., Ko,
J.C., Ginther, O.J. (1992) Association between
surges of follicle-stimulating hormone and the
emergence of follicular waves in heifers. J Reprod
Fertil. 94: 177–88.
Baerwald, A.R., Adams, G.P., Pierson, R.A.
(2003) Characterization of ovarian follicular
wave dynamics in women. Biol Reprod. 69:
1023–31.
Bar-Ami, S., Gitaxy-Goren, H. (1993) Altered
steroidogenic activity of human granulosa-lutein
cells at different cell densities in culture. Mol
Cell Endocrinol. 90: 157–64.
Belanger, A., Couture, J., Caron, S., Roy, R.
(1990) Determination of nonconjugated and
conjugated steroid levels in plasma and prostate
after separation on C-18 columns. Ann NY Acad
Sci. 595: 251–9.
Campbell, B.K., Scaramuzzi, R.J., Webb, R.
(1996) Induction and maintenance of oestradiol
and immunoreactive inhibin production with
FSH by ovine granulosa cells cultured in serumfree
media. J Reprod Fertil. 106: 7–16.
Campbell, B.K., Souza, C., Gong, J., Webb, R.,
Kendall, N., Marsters, P. (2003) Domestic ruminants
as models for the elucidation of the mechanisms
controlling ovarian follicle development
in humans. Reprod Suppl. 61: 429–43.
Franks, S., Stark, J., Hardy, K. (2008) Follicle
dynamics and anovulation in polycystic ovary
syndrome. Hum Reprod Update. 14: 367–78.
Gonzalez-Robayna, I. J., Alliston, T. N., Buse, P.,
Firestone, G.L., Richards, J.S. (1999) Functional
and subcellular changes in the A-kinase–signaling
pathway: relation to aromatase and Sgk expression
during the transition of granulosa cells
to luteal cells. Mol Endocrinol. 13: 1318–37.
Gutierrez, C.G., Campbell, B.K., Webb, R.
(1997) Development of a long-term bovine
granulosa cell culture system: induction and
maintenance of estradiol production, response to
follicle-stimulating hormone, and morphological
characteristics. Biol Reprod. 56: 608–16.
Grimes, R.W., Ireland J.J. (1986) Relationship of 
macroscopic appearance of the surface of bovine
ovarian follicles concentrations of steroids in follicular
fluid, and maturation of oocytes in vitro.
Biol Reprod. 35: 725–32.
Henderson, K.M., McNatty, K.P., Smith, P.,
Gibb, M., O’Keeffe, L.E., Lun, S. (1987) Influence
of follicular health on the steroidogenic and
morphological characteristics of bovine granulosa
cells in vitro. J Reprod Fertil. 79: 185–93.
Hoffman, B., Liebermann, D.A. (2009) GADD45
modulation of intrinsic and extrinsic stress responses
in myeloid cells. J Cell Physiol. 218:
26–31.
Ireland, J.J., Roche, J.F. (1983) Development of
nonovulatory antral follicles in heifers: changes
in steroids in follicular fluid and receptors for gonadotropins.
Endocrinology. 112: 150–6.
Jimenez-Krassel, F., Ireland, J.J. (2002) Development
and validation of a shortterm, serum-free
culture system for bovine granulosa cells: evaluation
of the effects of somatotropin and growth
hormone-releasing factor on estradiol production.
J Dairy Sci. 85: 68–78.
Lambert, A., Harris, S.D., Knaggs, P., Robertson,
W.R. (2000) Improved FSH sensitization and
aromatase assay in human granulosa-lutein cells.
Mol Hum Reprod. 6: 677–80.
Lindeberg, M., Carlstrom, K., Ritvos, O., Hovatta,
O. (2007) Gonadotrophin stimulation of
nonluteinized granulosa cells increases steroid 
production and the expression of enzymes involved
in estrogen and progesterone synthesis.
Hum Reprod. 22: 401–6.
Murphy, B.D. (2000) Models of luteinization.
Biol Reprod. 63: 2–11.
Rosenfeld, C.S., Wagner, J.S., Roberts, R.M.,
Lubahn, D.B. (2001) Intraovarian actions of oestrogen.
Reproduction. 122: 215–226.
Sahmi, M., Nicola, E.S., Silva, J.M., Price, C.A.
(2004) Expression of 17b- and 3b-hydroxysteroid
dehydrogenases and steroidogenic acute regulatory
protein in nonluteinizing bovine granulosa
cells in vitro. Mol Cell Endocrinol. 223: 43–54.
Sen, A., Bettegowda, A., Jimenez-Krassel, F.,
Ireland, J.J., Smith, G.W. (2007) Cocaine and
amphetamine-regulated transcript regulation of
follicle-stimulating hormone signal transduction
in bovine granulosa cells. Endocrinology. 148:
4400–10.
Silva, J.M., Price, C.A. (2000) Effect of folliclestimulating
hormone on steroid secretion and
messenger ribonucleic acids encoding cytochromes
P450 aromatase and cholesterol sidechain
cleavage in bovine granulosa cells in vitro.
Biol Reprod. 62: 186–91.
Sirois, J., Fortune, J.E. (1988) Ovarian follicular
dynamics during the estrous cycle in heifers
monitored by real-time ultrasonography. Biol
Reprod. 39: 308–17.
Vallerio, P.M., Gustavo, Z., Price, C.A. (2010)
Cell plating density alters the ratio of estrogenic
to progestagenic enzyme gene expression in
cultured granulosa cells. Fertil Steril. 93: 2050-
2055.
Zheng, X., Price, C.A., Tremblay, Y., Lussier, J.
G., Carriere, P.D. (2008) Role of transforming
growth factor-b1 in gene expression and activity
of estradiol and progesterone-generating enzymes
in FSH-stimulated bovine granulosa cells.
Reproduction. 136: 447–57.

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار