شناسایی مولکولی گونه های تیلریا و ناقلین آن در گاوهای شهرستان یزد با روش Semi-nested PCR

نویسندگان

1 دانش آموخته انگل شناسی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد-ایران

2 گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد-ایران

چکیده

زمینه مطالعه: تیلریوز یکی از بیماریهای تک یاخته‌ای خونی در گاو بوده که سبب مرگ و میر بالا می‌شود. تاکنون مطالعات میکروسکوپی زیادی درباره شناسایی گونه‌های آلوده کننده تیلریا در گاو و کنه‌های ناقل صورت گرفته که در مقایسه با روش‌های مولکولی از حساسیت و ویژگی کمی‌برخوردارند. هدف: دراین مطالعه سعی شدگونه‌های تیلریاوناقلین آن درگاوهای شهرستان یزدباروشSemi-nested PCR موردشناسایی قرارگیرند. مواد و روش کار: طی ماههای خرداد تا شهریور سال 1391، تعداد 100 نمونه خون EDTA به همراه گسترش‌های نازک خون  ازگاوهای شیری  نژاد  هلشتاین مشکوک به تیلزیوز بدون سابقه واکسیناسیون بر علیه بیماری تهیه گردید. همزمان  با بازرسی بدن گاوها  تعداد 249 عدد کنه جمع آوری شدندگسترش تهیه شده با گیمسا رنگ آمیزی شدندو  DNA از  نمونه‌های خون با استفاده از کیت تجاری استخراج گردیدند. کنه‌ها همچنین با استفاده از کلید‌های تشخیص شناسایی و بر اساس جنس و گونه کنه به 50 مجموعه 5 کنه‌ای تقسیم  شدند و بااستفاده از  لوپ  و وسایل حشره شناسی غدد بزاقی آنها جدا سازی و DNA آنها نیز استخراج گردید. نمونه‌های DNA  استخراج شده با آنSemi-nested PCR بر روی ژن18S rRNA، مورد آزمایش قرار گرفتند. جهت تشخیص تیلریا لستوکاردی و تفریق آن از تیلریا آنولاتا در نمونه‌های کنه از روش PCR-RFLP استفاه شد. نتایج: در بررسی اولیه انجام شده با میکروسکوپ نوری، در 4 گسترش خونی (4%) اشکال حلقوی انگل مشاهده گردید. همچنین همه کنه‌های جمع آوری شده  هیالوما آناتولیکوم آناتولیکوم تشخیص داده شدند. نتایج به دست آمده با روش Semi-nested PCR، نشان دهنده آلودگی 11 نمونه خون (11%) و سه مجموعه غدد بزاقی کنه به تک یاخته تیلریا آنولاتا بودند. هیچ یک  از نمونه‌ها آلوده به تیلریا اورینتالیس نبودند. مطالعات تکمیلی با PCR-RFLP با استفاده از آنزیم MspI نیز نشان داد که نمونه‌های کنه‌ها همگی از نظر آلودگی به تیلریا لستوکاردی منفی می‌باشند. نتیجه گیری نهایی: بر پایه نتایج بدست آمده  تیلریا آنولاتا و کنه هیالوما آناتولیکوم آناتولیکوم عامل و ناقل مهم  تیلریوز گرمسیری در شهرستان یزد می‌باشند.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Molecular detection of Theileria species and its vectors in cattles in Yazd area by semi-nested PCR method

نویسندگان [English]

  • Soghra Khodabandeh 1
  • Gholamreza Razmi 2
1 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad-Iran
2 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad-Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Theileriosis is a blood protozoan disease with high mortality in cattle in tropical and subtropical regions of the world. Several studies were conducted to identify Theileria species in infected cattles and vector ticks by microscopic examination. However, microscopic technique has lower sensitivity compared to molecular method.                  OBJECTIVES: This study was carried out to identify Theileria species and its carriers in cattles of Yazd city, sing semi nested PCR. METHODS: Between June to September of 2012, 100 EDTA blood samples and 249 ticks were collected from Holstein breed with no history of vaccination against the ileriosis in Yazd area. The collected samples were transported to the laboratory, then prepared the blood smears and stained with Giemsa method. Also, the collected ticks were separated into 50 tick pools, according to their species. Then their salivary glands were removed using stereomicroscope in 0.85% saline. DNA of blood and salivary glands was extracted using a commercial kit and analyzed by Semi-nested PCR. PCR-RFLP was also used to differentiate Theileria lestoquardi from Theileria annulata in positive samples of ticks. RESULTS: Ring forms of Theileria spp. were found in 4 (4%) of blood smears. All ticks were Hyalomma a.anatolicum. Results of PCR were indicated that 11 (11%) of blood samples and three pools of tick’s salivary glands were infected with Theileria. Theileria annulata were only detected in all positive samples by Semi-nested PCR. The results of PCR-RFLP using MspI enzyme showed that the tick’s salivary glands were negative to Theileria lestoquardi infection. CONCLUSIONS: Based on the results, it is concluded that Theileria annulata and Hyalomma a.anatolicum are important agent and vector tick of tropical theileriosis in dairy cattles of Yazd area.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cattle
  • semi-nested PCR
  • Theileria spp
Azizi, H., Shiran, B., Farzaneh-Dehkordi, A., Salehi, F., Taghadosi, C. (2007) Detection of Theileria annulata by PCR and its comparison with smear method in native carrier cows. Biotechnology. 7: 574-577.

Ghaemi, P., Hoghooghi-Rad, N., Shayan, P., Eckert, B. (2011) Detection of Theileria orientalis in Iran by semi-nested PCR. Parasitol Res. 10: 1-5.

Gubbels, J.M., de Vos, A,P., Vader weid, M., Viseras, J., Schouls, L.M., de Vries, E., Jongejan, F. (1999) Simultaneous detection of bovine Theileria and Babesia species by reverse line blot hybridization. J Microbiol. 37: 1782-1789.

Hashemi-Fesharaki, R. (1986) Bovine theileriosis in Iran. Arch Razi Inst. Razi Institue Pub (1st ed.) Karaj-Iran.

Hoghooghi-Rad, N., Ghaemi, P.,Shayan, P., Eckert, B., Sadr-Shirazi, N. (2011) Detection of native carrier cattle infected with Theileria annulata by Semi-bested PCR and smear method in golestan province of Iran. World Appl Sci J. 12: 317-323.

Leemans, I., Brown, D., Hooshmand-Rad, P., Kirvar, E., Uggla, A. (1999) Infectivity and cross-immunity studiesof Theileria lestoquardi and Theileria annulata in sheep and cattle: I. In vivo responses. Vet Parasitol. 82: 179-192.

Morshedi, A., Horr-Yadollahi M.R., Tavassoli, M., Dalir-Naghade, B. (2003) A seroprevalence survey of Theileria infection by ELISA, compare with blood-smear observation in cattle. J Fac Vet Med Uni Teh. 58: 319-22.

Mozafari, A., Noorollahifard, S., Mohammadi, V. (2008) A survey of bovine theileriosis in Zahedan cattles. Iran Vet J. 3: 67-70.

Radostis, O.M., Gay, C.C., Hinchliff, K.W., Constable, P.D. (2007)Veterinary Medicine (10th ed.) W.B. Saunders. London, UK.

Razmi, G.R., Ebrahimzadeh. E., Aslani, M.R. (2003) A study about tick vectors of bovine theileriosis in an endemic region of Iran. J Vet Med (B) Infect Dis. 50: 309-310.

Razmi, G.R., Barati, F., Aslani, M.R. (2009) Prevalence of Theileria annulata in dairy cattle in Mashhad area, Iran. J Vet Parasitol. 23: 81-83.

Shahgholian, L., Meshki, B., Momtaz, H., Samipour, V. (2003) A survey of prevalence of bovine theileriosis in shahrekord.Pajohesh va Sazandegi. (In persian). 59: 41-43.

Shayan, P., Rahbari, S. (2005) Simultaneous differentiation between Theileria spp. and Babesia spp. on stained blood smear using PCR. Parasitol Res. 97: 281–286.

Soulsby, E.J.L. (1982) Helminthes, Arthropods and Protozoa of Domesticated Animals (7th ed.) Bailliere-Tindal. London, UK.

Spitalska, E., Torina, A., Cannella, V., Caracappa, S., Sparagano, O.A. (2004) Discrimination between Theileria lestoquardi and Theileria annulata in their vectors and hosts by RFLP based on the 18S rRNA gene. Parasitol Res. 94: 318-320.

Tavassoli, M., Tabatabaei, M., Esmaeilnejad, B., Hasani-Tabatabaei, M., Najafabadi, A., Pourseyed, S.H. (2011) Detection of Theileria annulata by the PCR-RFLP in ticks (Acari, Ixodidae) collected from cattle in West and North-West Iran. Acta Parasitol. 1: 8-13.

Walker, A., Camicas, J., Bouattour, A., Estrada-pana, A. (2004) Ticks of Domestic Animals in the Mediterranean Region (1st ed.) University of Zaragosa. Zaragosa, Spain.