جداسازی، تخلیص و بررسی خاصیت باکتری کشی کال پروتکتین از نوتروفیل های خون گاو

نویسندگان

1 گروه علوم پایه، دانشکده دامپزشکی دانشگاه ارومیه، ارومیه- ایران

2 گروه میکروبیولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه ارومیه، ارومیه- ایران

چکیده

زمینه مطالعه: نوتروفیل‌های گاو پپتیدهای یاخته‌کشی تولید می‌کنند که باعث از بین بردن میکروارگانیسم‌های قارچی و باکتریایی از جمله عامل ماستیت می‌شوند. هدف: استخراج و تخلیص پروتئین P7/P23 گاوی و بررسی فعالیت ضد باکتریایی آن علیه باکتری‌های Staphylococcus aureus، Aeromonas hydrophila و Yersinia ruckeri بود. روش کار: ابتدا یاخته‌های نوتروفیل گاو توسط روش رسوب‌دهی با دکستران و سانتریفیوژ روی فایکول از سایر یاخته‌های خون سالم جداسازی گردیدند. سپس زنده‌مانی آنها با کمک تریپان بلو تعیین و پس از خرد کردن آنها با سونیکاتور مقدار پروتیئن‌های تام سیتوزولی توسط سانتریفیوژ جداسازی شد. در مرحله بعد، پس از جداسازی به منظور تخلیص ابتدا دیالیز و سپس کروماتوگرافی تعویض یونی دو مرحله‌ای صورت گرفت. بررسی فعالیت ضد یاخته‌ای آن‌، با روش‌های تعیین حداقل غلظت مهار کنندگی، حداقل غلظت کشندگی و آزمون انتشار در آگار بررسی شد. نتایج: یاخته‌های نوتروفیل‌ با زنده‌مانی بیشتر از 95% جداسازی شدند. نتایج کروماتوگرافی و الکتروفورز ژل پروتئین نشان داد که پروتئین هترودیمر P7/P23 با موفقیت طی دو مرحله تخلیص شده است (مرحله اول حدود 60% و در مرحله دوم با خلوص بیشتر از 95%). وزن مولکولی هر کدام از منومرهای کوچک و بزرگ به ترتیب kDa‌‌7 و 23 تعیین شد. پروتئین تخلیص شده دارای فعالیت باکتری کشی بوده و تأثیر آن بر یرسینیا روکری (µg/ml 64) بیش‌تر از دو باکتری دیگر بود. نتیجه‌گیری نهایی: پروتئین تخلیص شده در طی فرایند تخلیص فعالیت خود را حفظ می‌کند. به علاوه فعالیت ضد باکتریایی نوتروفیل می‌تواند ناشی از پروتئین P7/P23  باشد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Isolation, purification and anti-bacterial property of calprotectin from bovine neutrophil

نویسندگان [English]

  • Mahdi Imani 1
  • Amir Tukmechi 2
1 Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Urmia University, Urmia- Iran
2 Department of Microbiology, Faculty of Veterinary Medicine, Urmia University, Urmia- Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: It is believed that bovine neutrophils contain several peptides and protein which exhibit antimicrobial activity against microorganisms such as fungi and bacteria. Objectives: The purpose of this study was to isolate and purify a potential antibacterial protein from bovine neutrophil and test its anti bacterial activity. Methods: Neutrophils were isolated from bovine blood using dextran sedimentation and centrifugation on Ficoll-Hypaqe. Cell viability is examined by trypan blue dye exclusion method. Protein extract was then dialyzed and applied onto ion exchange chromatography for further purification, and its potential cytostatic activity was examined against Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila and Yersinia ruckeri. Results: Viability of isolated neutrophil was over 95%, chromatographic results and SDS-PAGE analysis exhibited that neutrophil cytosolic proteins were fractionated so that the purification of P7/P23 was almost 60% in the first step and purification was completed in the second phase. Using calibration curve according to molecular mass markers, the relative molecular mass of P7 and P23 determined as 7 kDa and 23 kDa, respectively. Also, results showed that this protein has antibacterial activity and has higher bactericidal activity against Y. ruckeri. Conclusions: It could be concluded that purification of P7/P23 sustains its biological activity and has wide range antibacterial activity. Moreover, taking all data into account may suggest that the cytostatic activity of neutrophil, to some extent, results from P7/P23 protein which is abundant in the cytosole.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Antibacterial activity
  • isolation
  • neutrophil
  • P7/P23

مراجع

Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254.##
Dell’Angelica, E.C., Schleicher, C.H., Simpson, R.J., Santome, J.A. (1996) Complex assembly of calgranulins A and B, two S100-like calcium-binding proteins from pig granulocytes. Int J Biochem Cell Biol. 28: 53-62.##
Dianoux, A.C., Stasia, M.J., Garin, J., Gaqnon, J., Viqnais, P.V. (1992) The 23-kilodalton protein, a substrate of protein kinase C in bovine neutrophil cytosol is a member of the S100 family. Biochem. 31: 5898-5905.##
Donato, R. (1999) Functional roles of S100 proteins, calcium-binding proteins of the EF-hand type. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Mol. Cell Res. 1450: 191-231.##
Doussiere, J., Bouzidi, F., Vignais, P.V. (2002) The S100A8/A9 protein as a partner for the cytosolic factors of NADPH oxidase activation in neutrophils. Europ J Biochem. 269: 3246-3255.##
Gennaro, R., Dolzani, L., Romeo, D. (1983) Potency of bactericidal proteins purified from the large granules of bovine neutrophils. Infect Immun. 40: 684-690.##
Grieve, P.A., Mattila T. (1989) Non-oxidative antibacterial activity of bovine neutrophil granule proteins towards mastitis pathogens. J Vet Med. 36: 500-508.##
Heilmann, R.M., Suchodolski, J.S., Steiner, J.M. (2008) Purification and partial characterization of canine calprotectin. Biochim. 20: 1306-1315.##
Katircioglu, H.Y.B., Aslim, B., Yüksekdag, Z., Atic, T. (2005) Screening for Antimicrobial Agent Production of SomeFreshwater. Internet J Microbiol. 2: 123-131.##
Liu, J.Z., Jellbauer, S., Poe, A.J., Ton, V., Pesciaroli, M., Kehl-Fie, T.E., Restrepo, N.A., Hosking, M.P., Edwards, R.A., Battistoni, A., Pasquali, P., Lane, T.E., Chazin, W.J., Vogl, T., Roth, J., Skaar, E.P., Raffatellu, M. (2012) Zinc Sequestration by the Neutrophil Protein Calprotectin Enhances Salmonella Growth in the Inflamed Gut. Cell Host Microbe. 11: 227-239.##
Loomans, H.J., Hahn, B.L., Li, Q.Q., Phadnis, S.H., Sohnle, P.G. (1998) Histidine-based zinc-binding sequences and the antimicrobial activity of calprotectin. J Infect Dis. 177: 812-814.##
Mark, T., Quinn, F.R.D., Gary M.B. (2007) Neutrophil Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). (1st ed.) Humana Press Inc,  New Jersy, USA. ##
Regenhard, P., Leippe, M., Schubert, S., Podschun, R., Kalm, E., Grötzinger, J., Looft, C.  (2009) Antimicrobial activity of bovine psoriasin. Vet Microb. 136: 335-340.##
Qaiyami, S. (2007) Macro and microdilution methods of antimicrobial susceptibility testing. In: Antimicrobial Susceptibility Testing Protocols. Schwalbe, R., Steele-Moore, L., Goodvin, A.C. (eds.). (1st ed.). Taylor and Francis Group, New York, USA. p. 75-79.##
Schagger, H. (2006) Tricine-SDS-PAGE. Nat Prot. 1: 16-22.##
Schleicher, C.H., Dell’Angelica, E.C., Santome, J.A. (1993) Isolation and N-terminal sequence of two low molecular weight calcium-binding proteins from pig granulocytes. Int J Biochemi. 25: 1251-1256.##
Skoog, W.A., Beck, W.S. (1956) Studies on the fibrinogen, dextran and phytohemagglutinin methods of isolating leukocytes. Blood. 11: 436-454.##
Stasia, M.J., Dianoux, A.C., Vignais P.V. (1989) A 23-kDa protein as a substrate for protein kinase C in bovine neutrophils. Purification and partial characterization. Biochem. 28: 9659-9667.##
Yang, T.H., Tzeng, S., Cheng, I., Burnett, M.G., Yoshizawa, Y., Fukoyama, K., Lee, S.C., Epstein, W.L.  (1997) Identification of the mouse calcium-binding proteins, MRP 8 and MRP 14, in Schistosoma mansoni-induced granulomas: biochemical and functional characterization. J Leukoc Biol. 61: 258-266.##
Yui, S., Mikami, M., Yamazaki, M. (1995) Purification and characterization of the cytotoxic factor in rat peritoneal exudate cells: its identification as the calcium binding protein complex, calprotectin. J Leukoc Biol. 58: 307-316.##
Yui, S., Nakatani Y., Mikami M. (2003) Calprotectin (S100A8/S100A9), an inflammatory protein complex from neutrophils with a broad apoptosis-inducing activity. Biol Pharma Bull. 26: 753-760.##

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار