ارزیابی مقایسه ایی سمیت نانوذرات نقره شیمیایی و بیوسنتز شده توسط دو گونه ماکروجلبک دریایی در شاخص زیستی آرتمیا

نوع مقاله: بهداشت و بیماری های آبزیان

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی دریا، دانشکده علوم و فنون دریایی، دانشگاه هرمزگان

2 2گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران

چکیده

زمینه مطالعه: نظر به گرایش فزاینده به استفاده از نانو مواد مختلف در سطح جهان و راه یابی نهایی آن‌ها به اکوسیستم‌های آبی، سنجش سمیت آن‌ها بر محیط زیست آبزیان و ارائه راهکارهای زیست سازگار در تولید آن‌ها، ضروری به نظر می‌رسد.
هدف: در این راستا در تحقیق حاضر، سمیت نانوذرات نقره شیمیایی و بیوسنتز شده توسط جلبک‌های دریایی با استفاده از نشانگر زیستی آلودگی، ناپلیوس آرتمیا (Artemia fransiscana) ارزیابی و مقایسه گردید.
روش کار: به این منظور از روش استاندارد OECD استفاده شد. بدین صورت که منظور ناپلی آرتمیا، در غلظت‌های متوالی افزایشی نانوذرات نقره شیمیایی و بیوسنتز شده با استفاده از عصاره آبی دو گونه ماکروجلبک دریایی Ulva flexuosa (جلبک‌های سبز) وSargassum boveanum (جلبک‌های قهوه‌ای) قرار داده شد و تلفات ناپلی‌ها در زمان‌های h 12،24، 36 و 48 بعد از مجاورت ثبت و با نرم افزار Probit آنالیز گردید.
نتایج: نتایج نشان داد که سمیت هر سه نوع نانوذره نقره بر ناپلی آرتمیا با افزایش غلظت و نیز با افزایش مدت زمان مجاورت روند افزایشی داشته و تفاوت‌ها میان آن‌ها معنی‌دار بود (0.05>P). بطوریکه h LC5048، در نانوذرات نقره شیمیایی 8/31 و در نانوذرات نقره بیوسنتزی ازU. flexuosa وS. boveanum به ترتیب برابر mg/l 9/366 و 1/141 بود.
نتیجه گیری نهایی: مقایسه نتایج سمیت این سه نوع نانوذره در ناپلی آرتمیا، نشان داد که در غلظت‌های مشابه، نانوذرات نقره شیمیایی تا 10 برابر سمی تر از نانوذرات بیوسنتزی بودند علاوه بر این سمیت نانوذرات نقره بیوسنتز شده توسط جلبک‌های دریایی به نوع جلبک نیز بستگی دارد چرا که نانوذرات نقره بیوسنتز شده توسط U. flexuosa در مقایسه با نوع تهیه شده از S. boveanum پتانسیل سمیت کمتری را نشان دادند.
 

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Comparative Toxicity Assessment of Chemical Nanosilver and Biosynthetic Silver Nanoparticles Produced by Marine Macroalgae from the Persian Gulf in Biomarker: Artemia nauplii

نویسندگان [English]

  • Sakineh Mashjoor 1
  • Mojtaba Aishahi 2
  • Zahra Tulabi Dezfuli 2
1 1Department of Marine Biology, Faculty of Marine Sciences and Technology, Hormozgan University, Bandar Abbas, Iran
2 2Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND:  Considering the progressing tendency of administration of nanomaterials products in the world and their entrance to aquatic ecosystems, their toxicity assessment on the aquatic environment and proposing the biocompatible solutions in their production seems indispensable.
OBJECTIVES: In this study, the toxicity of silver nanoparticles (AgNPs), chemical and biosynthetic forms were evaluated using the biomarker, artemia nauplii (Artemia fransiscana).
METHODS: For toxicity assessment, the OECD standard method was used. The artemia nauplii were exposed to additive serial concentration of biosynthetic and chemical silver nanoparticles. For biosynthesis of silver nanoparticles, aqueous extracts of two species of marine macroalgae Ulva flexuosa (green algae) and Sargassum boveanum (brown algae) were used. Artemia nauplii mortality in the times of 12, 24, 36 and 48 hours after exposure to silver nanoparticles were recorded and analyzed via Probit software.
RESULTS: Survey findings showed that not only the toxicity of these three types of silver nanoparticles on artemia nauplii increased in a dose- dependent manner, but also their toxicity increased along with duration of exposure time. The toxicity of these nanoparticles were significantly different (P<0.05). The 48 h LC50 value of chemical AgNPs in the artemia nauplii was 31.8 mg/l, while 48 h LC50 for biosynthesis AgNPs  produced by U. flexuosa, and S. boveanum were 366.96 and 141.16 mg/l respectively.
CONCLUSIONS: Comparison of the toxicity of these three types of AgNPs on artemia nauplii showed that, the chemical form of AgNPs was more toxic (up to 10 times) than a biosynthetic form of AgNPs. Moreover, the source of biosynthesis of silver nanoparticles had a considerable impact on toxicity of final production, because a biosynthetic form of AgNPs produced by U. flexuosa was less toxic than the same form prepared from S. boveanum.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Toxicity
  • Artemia fransiscana
  • Marine macroalgae
  • Silver nanoparticles

فن‌آوری نانو با کاهش اندازه مواد در ابعاد nm 1 تا 100، منجر به ایجاد خواص فیزیکی، شیمیایی و زیستی متفاوتی می‌شود که این امر کاربرد‌های جدید و منحصر به فردی را برای نانو مواد امکان پذیر می‌سازد (19). افزایش و گسترش استفاده از نانو-ذرات در علوم و تکنولوژی در دهه‌های اخیر در حوزه‌هایی چون پزشکی، کشاورزی، الکترونیک، صنعت، داروسازی، تولیدات آرایشی بهداشتی، انرژی‌های تجدیدپذیر، تصفیه محیط‌زیست و غیره (10)، اهمیت و ضرورت درک اثرات زیان آور احتمالی آن‌ها بر انسان و اکوسیستم را دو چندان ساخته است. امروزه نانو ذرات مهندسی شده (ENPs: Engineered nanoparticles) بعنوان یک گروه جدید از آلاینده‌ها با درجه اهمیت بوم سم شناسی (Ecotoxicology) برای اکوسیستم‌های دریایی معرفی شده‌اند، زیرا ورود آن‌ها به خاک و نهایتاً مسیرهای آبی منتهی به دریاها و اقیانوس‌ها امری اجتناب ناپذیر است (17). از این رو نظر به کمبود اطلاعات و داده‌ها در ارتباط با پتانسیل اثرات منفی این ذرات در مقیاس نانو بر اکوسیستم‌های دریایی، بواسطه طبیعت فیزیکی و شیمیایی و متعاقباً تأثیرپذیری سرنوشت، رفتار و سمیت آن‌ها از دیگر پدیده‌های زیستی(24)، لزوم درک این فرآیندها و طرح سوالات جدی در ارتباط با خطرات آتی آن‌ها، بسیار حائز اهمیت است. بعلاوه ایران در چند سال اخیر پیشرفت‌های شگرفی در زمینه علم نانوتکنولوژی داشته است، بنحویکه توانسته در سال 2013 رتبه 8 را در سطح جهانی در زمینه تولید علم نانو کسب نماید از این رو جای بسی امید است که در امر شناسایی و حذف آلاینده‌های زیست محیطی تولید شده توسط این حوزه تحقیقاتی نیز با بهره از تکنیک‌های روز دنیا بتوان پیش گام بود.

نانوذرات نقره، با کاربرد در 383 محصول و میانگین تولید جهانی 55 تن در سال، جزء پر مصرف‌ترین نانومواد ساخت دست بشر هستند (26). بیشترین کاربرد نانوذرات نقره مبتنی بر خواص ضد میکروبی قوی آن‌ها بر پاتوژن‌هایی چون باکتری‌ها و ویروس‌ها است (4،11)، که باعث گردیده در تولیدات مختلفی چون، شوینده‌ها، پوشاک، کفش، افزودنی‌های غذایی، مواد آرایشی، تنفسی، فیلترهای تصفیه، تلفن همراه، لپ‌تاپ و غیره کاربرد داشته باشد (36). تولید نانو‌ذرات نقره نیز به روش‌های فیزیکی، شیمیایی و زیستی امکان پذیر است (2،14،27). لکن نانو‌ذرات تولیدی در روش‌های شیمیایی و فیزیکی به دلیل استفاده از مواد شیمیایی سمی مانند سدیم، نیترات سدیم و الکل که نقش عوامل احیایی و تثبیت کننده را ایفا می‌کنند (32)، علاوه بر آتش زا بودن، در طبیعت به صورت تجزیه ناپذیر باقی مانده و نهایتاً آلودگی‌های محیط زیست را به دنبال دارند. از این رو نظر به مشکلات و برخی معایب زیست محیطی احتمالی در امر تولید نانو‌ذرات نقره، توسعه روش‌های زیستی سازگار با محیط زیست، مقرون به صرفه و عاری از مواد شیمیایی امری اجتناب ناپذیر بوده و سنتز زیستی نانو‌ذرات نقره با استفاده از میکروارگانیسم‌‌ها، قارچ‌‌ها، گیاهان و جلبک‌‌ها می‌تواند رویکرد جایگزین مناسبی محسوب شود (16). در این بین، جلبک‌ها به ویژه ماکروجلبک‌های دریایی در میان دیگر گزینه‌های زیستی، جایگاه ویژه‌ایی را به خود اختصاص داده‌اند، زیرا علاوه بر این که در سواحل در فصول رشد به میزان انبوه یافت شده و اهمیت اقتصادی دارند، واجد منابع مهم فیتوشیمیایی از جمله کارتنوئیدها، اسیدهای چرب ضروری، پلی ساکاریدها و مواد معدنی نیز هستند و از توان بالایی نیز برای احیای یون‌های نقره و تولید نانوذرات پایدار، غیر سمی و ایمن با قابلیت دستکاری برخورداراند (29) که تحقیقات صورت گرفته توسط Rahimi و همکاران در سال2014 و نیز Yousefzadi و همکاران در سال 2014، ضمن تایید این امر، نشان دادند که ماکروجلبک‌های خلیج فارس می‌توانند کاندیدای مناسبی برای سنتز زیستی نانوذرات نقره با خواص و کاربردهای زیستی باشند(28،37).

به منظور سمیت سنجی زیستی بسیاری از آلاینده‌ها از یک سری آزمون‌های سمیت و غربالگری اولیه در شرایط برون تنی (آزمایشگاهی) استفاده می‌شود که ضمن هزینه پایین و کوتاهی زمان اجرای آزمون، از حساسیت بالایی نیز برخورداراند. یکی از این روش‌ها، سنجش اثرات سمیت حاد با استفاده از نشانگر زیستی آرتمیا (میگوی آب شور) است. این سخت پوست در آب‌های بسیار شور زندگی کرده و با فیلتر کردن غیر‌انتخابی از ذرات کمتر از µm 50 تغذیه می‌کند(23). آرتمیا به عنوان یک نشانگر زیستی آب‌هایی با درجه شوری بالا در جهان شناخته شده و متعلق به شاخه بندپایان، رده سخت پوستان، زیر رده آبشش پایان، راسته بی پوششان، خانواده Branchiothidae‌ و جنس Artemia است. مراحل لاروی این سخت پوست از حساسیت بالایی در مقابل آلاینده‌های محیطی و سموم برخوردار است (8). از این رو در مطالعه حاضر از گونه‌ای از آرتمیا موسوم به Artemia franciscana که یک گونه غیر‌بومی است و به دریاچه مهارلو و دریاچه نوق نیز معرفی شده است، با هدف بررسی مقایسه‌ایی اثرات سمیت بالقوه نانوذرات نقره شیمیایی (تجاری) و بیوسنتزی (تهیه شده از دو از گونه ماکروجلبک دریایی سبز و قهوه‌ایی در خلیج فارس) استفاده گردید.

 

مواد و روش کار

نانوذرات نقره: سه نوع نانوذره نقره به مشخصات زیر، در این تحقیق مورد ارزیابی قرار گرفت.

1- کلوئید نانوذرات نقره شیمیایی با نام تجاری نانوسیدL2000  (شرکت نانونصب پارس)، که از طریق احیا فوتوشیمیایی محلول نیترات نقره در حضور هیدرازین و آلکیل بنزن سولفونات تولید شده است(1).

2- نانوذرات نقره بیوسنتزی تهیه شده از عصاره آبی جلبک دریاییSargassum boveanum  (جلبک‌ قهوه‌ای) که در مطالعه حاضر، مطابق بر روش ارائه شده توسط Rahimi و همکاران در سال 2014 ساخته شد (28).

3- نانوذرات نقره بیوسنتزی تهیه شده از عصاره آبی جلبک دریایی Ulva flexuosa (جلبک‌ سبز) که مطابق بر روش توصیه شده توسط Rahimi و همکاران در سال 2014 تولید گردید (28).

خصوصیات فیزیکی و شیمیایی نانوذرات نقره: غلظت کلوئید نانوذرات نقره شیمیایی با نام تجاری نانوسید L  2000بنا بر گزارش شرکت سازنده، برابر mg/l 4000 و اندازه ذرات نقره در این محصول nm  63/1±1/7 است. خصوصیات فیزیکی و شیمیایی این محصول کلوئیدی عبارتند از: میانگین پتانسیل زتای mV 86/7 ± 33/53، اسیدیته 4/2 و میانگین هندسی قطر برابر با nm  46/1 ± 65/12 بوده و بنابر نتایج دستگاهICP-AES، غلظت واقعی نقره در کلوئید نانو ذرات نقره مذکور معادل mg/l  3988 اندازه گیری شده است(5).

در مطالعه حاضر خصوصیات فیزیکی و شیمیایی نانوذرات نقره بیوسنتزی تهیه شده از عصاره آبی جلبک دریاییS. boveanum  توسط دستگاه Particle size analyzer مدل: Scatterscope I qudix اندازه گیری گردید و جهت تایید کریستالی بودن نوع فلز تولید شده از روش پراش اشعه‌ی  Xتوسط دستگاه مجهز به آنالایزر اشعه ایکس منتشر کنند انرژی (EDX)  مدل X’Pert Pro، شرکت Panalytical و نیز به منظور شناسایی گروه‌های عاملی درگیر در احیا‌ی بیوسنتزی یون‌های نانونقره، از طیف سنج تبدیل فوریه مادون قرمز (FT-IR) مدل  Nicolet IR100استفاده گردیده و شکل هندسی و اندازه ذرات نقره موجود در این کلوئید، در تصویر میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) توسط دستگاه FESEM: مدل Sigma شرکت سازنده Zeiss آلمان، تعیین گردید.

در ارتباط با نانوذرات نقره بیوسنتزی تهیه شده از عصاره آبی جلبک دریایی U. flexuosa  اندازه متوسط نانوذرات نقره تولیدی توسط دستگاهParticle size analyzer  (مدل: ScatterScope 1 qudix، ساخت کشور کره) اندازه گیری شد و .مشخصات نانوذرات بیوسنتزی و شیمیایی در جدول 1 آورده شده است.

نانوذرات از اندازه متوسطی در محدوده nm  25، شکل دایره‌ای و با اندازه بین nm 2 تا 32 و متوسط قطر nm 5/1 ± 15 برخوردار بوده و نتایج آنالیز اشعه ایکس منتشر کننده انرژی آن نشان داده است که تنها ماده اصلی موجود در این کلوئید، نقره می‌باشد(37).

بیوسنتز نانوذرات نقره از ماکرو جلبکهای دریایی: در این تحقیق نانوذرات نقره بیوسنتزی با استفاده از عصاره آبی جلبک‌های دریایی U. flexuosa وS. boveanum  به روش توصیه شده توسط Rahimi و همکاران در سال 2014 ساخته شد(28). برای این منظور ماکروجلبک دریایی در زمان بیشینه‌ی جزر از سواحل قشم و بوشهر جمع آوری شده و برای از بین بردن گل و لای، نمک و اپی فیت‌های چندین مرتبه با آب معمولی و آب مقطر شستشو و در سایه خشک و نهایتاً به کمک آسیاب پودر گردید. سپس عصاره آبی آن (جوشاندن g 10 پودر جلبک در cc 200 آب دیونیزه) تهیه و این عصاره با استفاده کاغذ صافی واتمن فیلتر شد. به منظور بیوسنتز نانوذرات نقره، cc 10 از این عصاره آبی جلبکی به cc 90 محلول نیترات نقره mM  1 اضافه گردیده و این محلول به مدت h 24 در روشنایی در دمای C°25 قرار گرفت. مشاهده تغییر رنگ و تیره شده محلول نشانی از احیای زیستی یون‌های نقره توسط عصاره آبی جلبک دریایی و تولید نانوذرات نقره می‌باشد که این روند و تغییرات میزان جذب، با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (UV-Visible)  تحت کنترل قرار گرفت. در ادامه به منظور تغلیظ و خالص سازی این نانوذرات، محلول احیایی به فالکون‌های ml 50 منتقل شده و به مدت min 20 در دور rpm 4000 سانتریفیوژ گردید. در ادامه مایع رویی دور ریخته شده و پلت ته لوله‌ها در آب مقطر دیونیزه مجدداً حل شده و محتوای لوله‌ها با هم تلفیق و دوباره سانتریفوژ گردید و به منظور خالص سازی و زدون نیترات نقره اضافی از این محلول شتشو این پلت با آب مقطر و سانتریفیوژ آن سه بار انجام پذیرفت. سپس µl 100 از این محلول خشک و وزن گردیده و بر مبنای آن تعیین غلظت استوک نهایی نانوذرات نقره بیوسنتزی انجام شد.

آزمون سمیت سنجی بوسیله آرتمیا (Brine shrimp lethality assay): در این روش برای سنجش اثرات سمیت از سیست‌های گونه‌ای آبزی و سخت پوست به نام A. franciscana (تولید شده در شرکت INVE (Thailand) LTD با درصد تفریخ 90درصد) استفاده شد. منبع آب مورد استفاده آب شور مصنوعی (آب لوله کشی و g 30 نمک دریا) بود، که به منظور کلرزدایی به مدت یک هفته از قبل تحت هوادهی شدید قرار گرفته بود. زیرا در بررسی سمیت زیستی نانو‌ذرات نقره به دلیل احتمال واکنش نقره با ترکیبات سولفاته نمی‌توان برای کلر زدایی آب از تیوسولفات‌سدیم استفاده نمود. تفریخ (تخم گشایی) سیست‌های آرتمیا، بر اساس روش Sorgeloos و همکاران در سال 2001، در pH 8/7، دمای C° 27 و نور  Lux2000 صورت پذیرفت(35). h 24 بعد از اضافه نمودن سیست آرتمیا، ناپلیوس‌های تازه از سیست خارج شده، با توجه به نورگرایی، لاروهای آرتمیا به یک بشر در مکانی تاریک منتقل شده و ناپلی‌های سالم و متحرک بر مبنای نورگرایی مثبت و تجمع در سطح بشر با استفاده از یک پیپت پاستور جمع آوری گردیدند(35). در ادامه با هدف سمیت سنجی، رقت‌های متوالی از نانوذرات نقره شیمیایی و بیوسنتزی (هر غلظت در 3 تکرار) در چاهک‌های پلیت‌های کشت سلول 24 خانه محتوی آب با شوری ppt 30 در حضور کنترل (3 گروه فاقد نانو نقره به عنوان گروه شاهد)، ایجاد گردیده و به هر چاهک 30 ناپلی آرتمیا فرانسیسکانا اضافه گردید و با توجه به رهنمود استاندارد شماره 203 می‌شودسازمان توسعه و همکاری اقتصادیمی‌شود (25). در ارتباط با آبزیان، تعداد تلفات در h 12، 24، 36، و 48 بعد از مجاورت با نانوذرات نقره شیمیایی و بیوسنتزی ثبت گردیده و برای تعیین درصد مرگ و میر در غلظت‌های متفاوت و محاسبه LC50 از نسخه 5/1 نرم افزار EPA Probit Analysis (منتشر شده توسط سازمان حفاظت محیط زیست امریکا) استفاده شد.

 

نتایج

در مطالعه حاضر بیوسنتز نانوذرات نقره با استفاده از عصاره آبی دو گونه ماکروجلبک دریایی U. flexuosa وS. boveanum خلیج فارس انجام پذیرفت. بنحوی‌که شروع تغییر رنگ محلول نیترات نقره و عصاره ماکروجلبک حدود min  30 پس از واکنش و پیشرفت آن در محلول‌ها تا h 24 بعد به سمت تیره ترشدن، دلیل احیای یون‌های نقره در محلول و تولید بیوسنتزی نانوذرات نقره می‌باشد. اندازه و نحوه پراکنش نانوذرات نقره بیوسنتزی تولید شده از هر دو نوع جلبک U. flexuosa وS. Boveanum  در جدول 1 آورده شده است. که نتایج حاصله از دستگاه آنالیز اندازه ذره نشان داد که متوسط اندازه نانوذرات تولید شده توسط U. flexuosa برابر 98/0±39/5 نانومتر و توسطS. boveanum  در برابر 99/1±90/2 نانومتر است. تصویر میکروسکوپ الکترونی گذاره (TEM) از نانوذرات نقره بیوسنتزی تولید شده توسطS. boveanum  بر روی یک صفحه کربنی پوشانیده شده از مس، نیز تایید نمود که شکل این نانوذرات تولید شده کروی شکل است (تصویر 1- الف). بعلاوه نتایج آنالیز اشعه ایکس منتشر کننده انرژی نیز نشان داد که تنها فلز اصلی سنتز شده توسط عصاره این جلبک قهوه‌ای، نانوکریستال‌های نقره می‌باشد (تصویر 1- ب) و طیف FT-IR آن نیز واجد پیک‌های در محدوده cm-1 3424، 1629، 1419، 1256 و 1043 بوده که به‌ترتیب، نشان دهنده حضور پیوندهای N-H، C-N، C-H، C-H و C-C بعنوان گروه‌های عاملی در سنتز نانوذرات نقره توسطS. boveanum  است (تصویر 1- ج).

مشاهدات میکروسکوپی نشان داد که h 24-48 پس مواجهه لارو آرتمیا با نانوذرات نقره، این نانوذرات توانسته‌اند در روده آرتمیا تجمع یابند. آنالیز داده‌ها در تحقیق حاضر نشان می‌دهد که اثرات سمیت هر سه نوع نانوذره نقره بر لارو آرتمیا با افزایش غلظت و نیز با افزایش مدت زمان مجاورت روند افزایشی را به دنبال داشته است و تفاوت‌ها میان آن‌ها معنی‌دار بوده است (0.05>P). بنحوی‌که پس از h 48، غلظت ایجاد کننده‌ی 50درصد تلفات (LC50)، در ناپلی آرتمیا با نانوذرات نقره شیمیایی با نام تجاری نانوسید  L-2000 mg/l 8/31 بوده، حال آنکه این غلظت برای نانوذرات نقره بیوسنتز شده توسط جلبک سبزU. flexuosaا mg/l 9/366 و در ارتباط با نانوذرات نقره بیوسنتز شده توسط جلبک قهوه اییS. boveanumا mg/l 1/141 ارزیابی شده است (تصویر 2).  مقایسه نتایج سمیت این سه نوع نانوذره، نشان می‌دهد که نانوذرات نقره شیمیایی از قدرت سمیت نسبتاًً بالایی برخورداراند، لکن نوع بیوسنتزی تهیه شده از آن بالاخص نانوذرات نقره بیوسنتز شده از جلبک U. flexuosa  توانسته است، قریب 10 برابر پتانسیل سمیت کمتری را بروز دهد، حال آنکه این میزان برای نانوذرات نقره ساخته شده از S. boveanum تنها به میزان 4 برابر بوده است (تصویر 3). بعلاوه همانطور که ذکر شد، توان سمیت نانوذرات نقره بر آرتمیا با افزایش زمان مجاورت افزایش یافته است، بطوریکه غلظت کشنده میانی نانوذرات نقره (LC50) h 12 و 48 بعد از مجاورت به ترتیب برای نانوذرات نقره شیمیایی mg/l 2/315 و 8/31 بوده است (تصویر 2) که نشان دهنده‌ی تفاوت سمیت تا حد 10 برابر بین این دو دوره‌ی زمانی است و برای نانوذرات نقره بیوسنتزی به ترتیب ازU. flexuosa  4/755 و 9/366 و ازا mg/l S. boveanum 6/277 و 1/141 (تفاوت سمیت تا حد 2 برابر) ارزیابی شده است (تصویر 2). از طرفی نسبت تلفات نیز با غلظت نانوذره نقره در هر دوره زمانی نسبت مستقیم را نشان داده است، بطوریکه در ارتباط با نانوذرات نقره شیمیایی، طی مدت زمان h 48 بعد از مجاورت، غلظت  mg/l 54/9، 01/12، 81/31 و 13/106، به ترتیب ایجاد 10، 20، 50 و 90 درصد  تلفات در لاروهای آرتمیا نموده‌اند و این میزان برای ناپلیوس‌های آرتمیا طی مجاورت h 48 با نانوذرات نقره بیوسنتزی ازU. flexuosa  در غلظت‌هایmg/l 4/75، 5/159، 9/366، 9/1783 ایجاد شده و در مواجهه با نانوذرات نقره بیوسنتز شده ازS. boveanum  در غلظت‌های mg/l 4/42، 9/74، 1/141، 7/469 رخ داده است.

 

بحث

امروزه مطالعات نانوبوم سم شناسی دریایی عمدتاًً متمرکز بر ارزیابی تأثیرات منفی آتی نانوذرات است. در این میان نانوذرات نقره عمدتاًً به اثرات ضدباکتریایی معروف می‌باشند، از این حیث امکان کاربری‌های متنوع آن‌ها در بخش بهداشت آبزیان دور از ذهن نیست (30). لذا یافتن غلظت‌های کشنده و نیز حداکثر غلظت مجاز این مواد در گونه‌های آبزی نظیر آرتمیا که به عنوان غذای زنده و حامل مکمل‌های خوراکی، ویتأمین‌ها و داروها (15)، برای بچه ماهیان کاربرد دارد، می‌تواند حائز اهمیت باشد. بعلاوه آرتمیا به عنوان یک نشانگر زیستی آلودگی در آب‌هایی با شوری بالا محسوب شده و نقشی مشابه دافنی در آب شیرین دارد (34). گزارشات مختلفی از سمیت نانوذرات نقره بر آبزیان موجود است، لکن در ارتباط با اثرات منفی نانوذرات نقره بر محیط زیست آبی نظرات محققین تا حدودی متفاوت بوده است. Kumar و همکاران در سال 2012، میزان LD50 24 ساعته را در ناپلی A. salina برای سمیت نانوذرات نقره بیوسنتز شده از جلبک  دریایی S. ilicifolium اnM/ml 10 گزارش نموده اند(21). در تایید این تحقیق Arulvasu و همکاران در سال 2014 نیز بیان داشتند که غلظت‌های nM نانوذرات نقره برای سیست و ناپلیوس آرتمیا سمی بوده و با افزایش غلظت تا nM/ml 10 کاهش نرخ تخمه گشایی، افزایش نرخ مرگ و میر ناپلی‌ها، تجمع روده‌ایی و نهایتاً بروز اثرات کارسینوژنیک و آسیب DNA، را در پی داشته است(3). در تحقیقی مشابه نیز، سمیت حاد و مزمن نانو ذرات نقره بر روی دافنی آب شیرین Daphnia magna به عنوان یک نشانگر زیستی آلودگی در آب‌های شیرین مورد بررسی قرار گرفته که نتایج بدست آمده حاکی از تجمع زیست محیطی بالای این ماده می‌باشد، به نحویکه مواجهه دافنی با نانو ذرات نقره با غلظت mg/l 50 منجر به بروز تلفات 50 درصدی گردیده و غلظت mg/l 5 این ماده نیز کاهش رشد و باروری دافنی را در پی داشته است(9). Becaro و همکاران نیز در سال 2015، اثرات سمیت نانوذرات نقره تثبیت شده با پلی ونیل الکل (PVA) را در غلظت‌های مختلف طی جذب زیستی توسط میکروجلبکPseudokirchneriella subcapita، آرتمیا A. salina و دافنی Daphnia similis بعنوان مدل‌های زیستی ارزیابی نمودند که نتایج ایشان نشان داد که مقدار EC50 به ترتیب برایP. subcapita  وA. salina برابر با  mg/l 09/1 و 2-10× 5/5 است و برای دافنی EC50   h48 برابر با  و mg/l 4-10× 62/2 است(7). از این رو نظر به دسته بندی ارائه شده توسط سازمان ملل متحده آمریکا (18)، چنانچه ماده‌ایی واجد EC50 h 48 با سمیت کمتر از mg/l 1/0 باشد، جز مواد بسیار سمی تلقی گردیده و از این حیث، نانوذرات نقره در این گروه جای می‌گیرند. Gaiser و همکاران نیز در سال 2011، سمیت حاد  h 96 نانو و میکروذرات نقره را بر نوزادهای D. magna ارزیابی نموده و نرخ مرگ و میر حدوداً 56درصد و 100درصد را برای نانوذرات نقره و 13درصد و 80 درصد را برای میکروذرات نقره به ترتیب در غلظت‌های  mg/l 1/0 و 1 گزارش کردند(13).

اساساً سمیت نانو ذرات نقره (Ag-NPs) در ارگانیسم‌ها به حمل یون‌های نقره (+Ag) توسط آن‌ها نسبت داده می‌شود، که آسیب‌های نگران کننده‌ای را بر غشای سلولی و نیز دیگر ترکیبات درون سلولی وارد می‌سازد و عمدتاًً در ارتباط با استرس اکسیداتیو، اثرات القایی آن بر DNA، لیپو پروتئین‌ها و فعالیت‌های معین متابولیسمی است که می‌تواند وابسته به فاکتورهای مختلفی چون طبیعت نانوذره، شکل، سایز و برخی فاکتورهای محیطی چون شوری، دما و اکسیژن محلول باشد از این رو برهمکنش‌های نانوذرات Ag-NPs با پدیده‌های زیستی در آبهای شور (SW) و شیرین (EW) متفاوت است(22). بر اساس نتایج یاد شده می‌توان نتیجه گرفت که نانوذرات نقره در آب‌های شور سمیت کمتری نسبت به آب شیرین داشته و مقاومت آرتمیا که شاخص آب‌های با درجه شوری بالاست، بسیار بیشتر از آبزیان آب شیرین می‌باشد، از این رو اثرات زیست محیطی نانوذرات نقره بایست بیشتر در منابع آب شیرین ارزیابی گردد. در تحقیق حاضر، اثرات کشنده کلوئید نانو ذرات نقره بر روی ناپلی آرتمیا در زمان‌های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. که نتایج بدست آمده از آنالیز داده‌ها گواه این است که اثرات سمیت سلولی هر سه نوع نانوذره نقره بر لارو آرتمیا با افزایش غلظت و نیز با افزایش مدت زمان مجاورت روند افزایشی را به دنبال داشته است. بنحویکه میزان LC50 طی افزایش زمان در معرض گذاری یک روند کاهشی را نشان داده و در نتیجه غلظت کمتری از ماده مورد نیاز است تا 50 درصد تلفات به ثبت رسد. از این رو LC50 در h 24 اولیه بیشتر از میزان LC50 در پایان دوره (h 96) است. از دیگر نتایج مشاهده شده در مطالعه حاضر، تجمع نانوذرات نقره در روده آرتمیا بوده است که می‌توان احتمال داد که این امر منجر به بروز اثرات سمیت (مشاهده رفتارهایی چون: کندی سرعت حرکت، شنای نامتعارف و سکون) گردیده و نهایتاً به مرگ منتهی شده است. Gambardella و همکاران در سال 2014 سمیت نانوذرات اکسیدهای فلزی  (Fe3O4 ,CeO2 ,SnO2)را بر میگوی آب شور A. salina بواسطه ارزیابی مرگ و میر و واکنش‌های رفتاری (تغییرات سرعت شنا) و فعالیت بیوشیمیایی (ChE،GST ، CAT) بررسی نمودند، که مشاهدات میکروسکوپی و آنالیزهای شیمیایی ایشان نشان داد که لاروها نانوذرات فلزی را درون روده‌هایشان جذب کرده‌اند هرچند این تجمع بعد از h 48 منجر به مرگ ومیر شایان توجهی نشده است. لکن نظر به نوع نانوذرات سنجشی این عدم القای مرگ و میری در لاروها، تغییرات رفتاری چون کاهش قابل توجه سرعت شنا و تغییرات فاکتورهای بیوشیمیایی را در پی داشته است (12). در تحقیق حاضر بیوسنتز نانوذرات نقره بواسطه عصاره آبی دو گونه ماکروجلبک دریایی U. flexuosa وS. boveanum  خلیج فارس مطابق بر روش Rahimi و همکاران در سال 2014 انجام پذیرفت(28). Yousefzadi و همکاران در سال 2014، خواص ضدباکتریایی قوی را نسبت به باکتری‌های گرم مثبت برای نانوذرات نقره بیوسنتز شده توسط U. flexuosa نشان دادند(37). در رویکردی مشابه Shanmugam و همکاران در سال 2014 نیز، بیوسنتز نانوذرات نقره را توسط گونه‌ای از جلبک قهوه‌ایی سارگاسم، موسوم به S. wightii ارائه می‌کنند که خواص ضد باکتریایی مؤثری در برابر پاتوژن‌هایی چون S. aureus، K. pneumoniae و S. typhi را نشان داده است(33). از دیگر گزارشات مبتنی بر بیوسنتز ماکروجلبکی Ag-NPs، می‌توان به کار تحقیقاتی Azizi و همکاران در سال 2013 اشاره نمود که توانستند با بهره گیری از عصاره آبی ماکروجلبک دریایی قهوه‌ایی S. muticum، بعنوان یک عامل احیایی، نانوذرات نقره را با طیف اندازه 5-15 به روش زیستی سنتز نمایند که در مقایسه با تحقیق حاضر، نانوذرات نقره تهیه شده از عصاره آبی جلبکS. boveanumا (nm 57/7) که از همان جنس سارگاسم لیکن از گونه متفاوتی بوده است، محدود اندازه درشت تری را نشان داده است(28، 6). Kumar و همکارانش در سال 2012، نیز سنتز زیستی نانوذرات نقره در محدوده اندازه nm 18-46 تهیه شده از عصاره آبی جلبک قرمز Gracilaria corticata با قابلیت ضدقارچی در مقابل پاتوژن‌های Candida albicans و C. glabrata را گزارش نمودند (20) و علاوه بر آن‌ها در سال 2014 تحقیقات Sangeetha و همکارش Saravanan نشان داد که نانوذرات نقره بیوسنتز شده توسط جلبک سبز U. lactuca که گونه دیگری از جنسUlva (مشابه با مطالعه حاضر) می‌باشد، از قابلیت‌های زیستی ضدباکتریایی در برابر عوامل باکتریایی بیماریزایی چون  Bacillus sp,                                                                                                    Escherichia coli, Pseudomonas sp برخوردار است (31).

نتیجه گیری: بنا بر داده‌های بدست آمده از مقایسه نتایج سمیت سه نوع نانوذره نقره بر لارو آرتمیا، نانوذرات نقره شیمیایی از قدرت سمیت نسبتاًً بالایی برخوردار بوده (mg/l 8/31)، لکن نوع بیوسنتزی تهیه شده از جلبک دریایی بالاخص ازU. flexuosa  توانسته است، به میزان 10 برابر پتانسیل سمیت کمتری را نشان دهد (mg/l 9/366) و این امر گویای این است که رویکرد سنتز سبز نانوذرات فلزی با استفاده از بافت‌های گیاهی غیر فعال، عصاره‌ها، ترشحات و دیگر بخش‌های گیاهان با محتوای آنتی اکسیدانی بالا (پلی فنول‌ها) و پلی ساکاریدهای سولفاته، نقش مضاعفی را در احیاء یون‌های فلزی و ممانعت از اکسیداسیون (بخاطر خاصیت عاملی پوششی) ایفا می‌کند و این امر می‌تواند روش جایگزین و نوید بخشی در تولید نانوذرات نقره ایمن و دوستدار محیط زیست باشد که ضمن حفظ قابلیت‌های صنعتی ارزشمند نانومواد، در تولید و توسعه کاربری‌هایی با اهداف زیست مدیریتی پیشگام بوده و دیگر فاقد هر گونه مواد شیمیایی مضر است. در انتها می‌توان چنین عنوان نمود که، مطالعات نانوبوم سم‌شناسی آبزیان، شاخص مناسبی برای پیش‌بینی اثرات احتمالی رهایش نانو مواد به بوم سازگان‌های آبی است.

 

تشکر و قدردانی

این پژوهش با حمایت مالی معاونت پژوهشی دانشگاه شهید چمران اهواز و از محل پژوهانه نگارندگان انجام پذیرفت.

 

تعارض در منافع

بین نویسندگان  هیچ گونه تعارض در منافع  گزارش نشده است.

Alavi, S.V., Dehpour, A.A. (2010). Evaluation of the nanosilver colloidal solution in comparison with the registered fungicide to control greenhouse cucumber downy mildew disease in the north of Iran. Acta Hortic, 877, 877. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2010.877.226

Amulyavichus, A., Daugvila, A., Davidonis, R., Sipavichus, C. (1998). Study of chemical composition of nanostructural materials prepared by laser cutting of metals. Phys Met Metallogr, 85, 111-117.

Arulvasu, C., Jennifer, S., Prabhu, D., Chandhirasekar, D. (2014). Toxicity effect of silver nanoparticles in brine shrimp artemia. Sci World J, 2014, 1-10. https://doi.org/10.1155/2014/256919 PMID: 24516361

Arya, V. R. (2013). Biological synthesis of silver nanoparticles from aqueous extract of endophytic fungus Aspergillus terrus and its antibacterial activity. Int J Nanomater Biostr, 3, 35-37.

Asghari, S., Johari, S. A., Lee, J. H., Kim, Y. S., Jeon, Y. B., Choi, H. J., Moon, M. C., Yu, I. J. (2012). Toxicity of various silver nanoparticles compared to silver ions in Daphnia magna. J Nanobiotechnol, 10, 10-14. https://doi.org/10.1186/1477-3155-10-14 PMID: 22472056

Azizi, S., Namvar, F.,  Mahdavi, M., Bin Ahmad, M., Mohamad, R. (2013). Biosynthesis of silver nanoparticles using brown marine macroalga, Sargassum Muticum aqueous extract. Mater J, 6, 5942-5950. https://doi.org/10.3390/ma6125942 PMID: 28788431

Becaro, A. A., Jonsson, C. M., Puti, F. C., Siqueira, M. C., Mattoso, L. H. C., Correa, D. S., Ferreira, M. D. (2015). Toxicity of PVA-stabilized silver nanoparticles to algae and microcrustaceans. Environ Nanotechnol Monit Manag, 3, 22-29. https://doi.org/10.1016/j.enmm.2014.11.002 Clark, L. S., Bowen, S. T. (1978). The genetic of Artemia salina. J Hered, 67, 385-388. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.jhered.a108758 PMID: 1021596

Chun- Mei, Z., Wen-xiong, W. (2011). Comparison of acute and chronic toxicity of silver nanoparticles and silver nitrate to Daphnia magna. Environ Toxicol Pharmacol, 30, 885-892. https://doi.org/10.1002/etc.451 PMID:21191880

Fabrega, J., Luoma, S. M., Tyler, C. R., Galloway, T. S., Lead, J. R. (2011). Silver nanoparticles: behaviour and effects in the aquatic environment. Environ Int, 37, 517-531. https://doi.org/10.1016/j.envint.2010.10.012 PMID:21159383

Fidel, M., Laura, B., Alessandra, A., Elpidio, M., Sanchez, H., Horacio, B., Facundo, R., Garth, J. (2013). Antibiofilm avtivity of silver nanoparticles against different microorganisms. Bioadhes Biofilm Res, 6, 651-660. https://doi.org/10.1080/08927014.2013.794225 PMID: 23731460

Gambardella, C., Mesaric, T., Milivojević, T., Sepčić, K., Gallus, L., Carbone, S., Ferrando, S., Faimali, M. (2014). Effects of selected metal oxide nanoparticles on Artemia salina larvae: evaluation of mortality and behavioural and biochemical responses. Environ Monit Assess, 186, 4249-59. https://doi.org/10.1007/s10661-014-3695-8 PMID:24590232

Gaiser, B. K., Biswas, A., Rosenkranz, P., Jepson, M. A., Lead, J.R., Stone, V., Tyler, C. R., Fernandes, T. F. (2011). Effects of silver and cerium dioxide micro- and nano-sized particles on Daphnia magna. J Environ Monit, 13, 1227-1235. https://doi.org/10.1039/c1em10060b PMID: 21499624

Gavhane, A. J., Padmanabhan P, Kamble, S. P., Jangle, S. N. (2012). Synthesis of silver nanoparticles using extract of Neem leaf and triphala and evaluation of their Antimicrobial activities. Int J Pharm Biol Sci, 3, 88-100.

Gomez, G.B., Herrara, M.A., Abreu, F.A., Roque, A. (1998). Bioencapsulation of two different vibrio species in nauplii of the brine shrimp. Microbialogy, 64, 2318-2322. https://doi.org/10.3923/jfas.2016.323.330 PMID: 9603861

Jagtap, U.B., Bapat, V.A. (2013). Green synthesis of silver nanoparticles using Artocarpus heterophyllus lam. seed extract and its antibacterial activity. Ind Crop Prod, 46, 132-137. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2013.01.019

Ju-Nam, Y., Lead, J. R. (2008). Manufactured nanoparticles: an overview of their chemistry, interactions and potential environmental problems. Sci Total Environ, 400, 396-414. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2008.06.042 PMID:18715626

Kim, K.H., Song, D.J., Yu, M.H., Park, Y.S., Noh, H.R., Kim, H.J., Choi, J.W. (2013). Hazard classification of household chemical products in korea according to the globally harmonized system of classification and labeling of chemicals. Ann Occup Environ Med, 25(1), 11. https://doi.org/10.1186/2052-4374-25-11 PMID: 24472347

Kreyling, W.G. (2010). Acomplementary definition of nanomaterial. Nano Today, 5, 165-168. https://doi.org/10.1016/j.nantod.2010.03.004

Kumar, P., Senthamil Selvi, S., Govindaraju, M. (2012). Seaweed-mediated biosynthesis of silver nanoparticles using Gracilaria corticata for its antifungal activity against Candidaspp. Appl Nanosci, 3, 495-500. https://doi.org/10.1007/s13204-012-0151-3

Kumar, P., Selvi, S. S., Praba, A. L., Selvaraj, M., Rani, L. M., Suganthi, P., Sarojini Devi, B., Govindaraju, M., (2012). Antibacterial activity and in-vitro cytotoxicity assay against brine shrimp using silver nanoparticles synthesized from Sargassum ilicifolium. Dig J Nanomater Biostruct, 7, 1447-1455.

Lapresta-Ferna´ndez, A., Ferna´ndez, A., Blasco, J. (2012). Nanoecotoxicity effects of engineered silver and gold nanoparticles in aquatic organisms. Trends Analyt Chem, 32, 40-59. https://doi.org/10.1016/j.trac.2011.09.007

Lavens, P., Sorgelos, P. (1996). Manual on the production and use of live food for aquaculture. FAO, Fisheris Technical Paper, 361, 283-295.

Matranga, V., Corsi, I. (2012). Toxic effects of engineered nanoparticles in the marine environment: Model organisms and molecular approaches. Mar Environ Res, 76, 32-40. https://doi.org/10.1016/j.marenvres.2012.01.006 PMID: 22391237

OECD. (1992). OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. Organization for Economic Cooperation and Development, Paris, France.

Piccinno, F., Gottschalk, F., Seeger, S., Nowack, B. (2012). Industrial production quantities and uses of ten engineered nanomaterials for Europe and the world. J Nanopart Res, 14, 1109-1120. https://doi.org/10.1007/s11051-012-1109-9

Prabhu, S., Poulose, E.K. (2012). Silver nanoparticles: mechanism of antimicrobial action, synthesis, medical applications, and toxicity effects. Int Nano Lett, 2, 32. https://doi.org/10.1186/2228-5326-2-32

Rahimi, Z., Yousefzadi, M., Noori, A., Akbarzadeh, A. (2014). Synthesis of Silver Nanoparticles using Three Marine Macro algae from the Persian Gulf, Iran. Oceanography, 5, 71-78.

Rajeshkumar, S., Malarkodi, C., Gnanajobitha, G., Paulkumar, K., Vanaja, M., Kannan, C., Annadurai, G. (2013). Seaweed-mediated synthesis of gold nanoparticles using Turbinaria conoides and its characterization. J Nanostruct Chem, 3, 44. https://doi.org/10.1186/2193-8865-3-44

Reynolds, G.H. (2001). Environmental Regulation of Nanotechnology: Some Preliminary Observations, Nano Archive, 31, 10681-10688. https://doi.org/1-800-433-5120

Sangeetha, N., Saravanan, K. (2014). Biogenic silver nanoparticles using marine seaweed (Ulva lactuca) and evaluation of its antibacterial activity. J Nanosci Nanotechnol, 2, 99-102.

Senapati, S., Syde, A., Moeez, S., Kumar, A., Ahmah, A. (2012). Intracellular synthesis of gold nanoparticles using alga Tetraselmis kochinensis. Mater Lett, 79, 116-118. https://doi.org/10.1016/j.matlet.2012.04.009

Shanmugam, N., Rajkamal, P., Cholan, S., Kannadasan, N., Sathishkumar, K., Viruthagiri, G., Sundaramanickam A. (2014). Biosynthesis of silver nanoparticles from the marine seaweed Sargassum wightii and their antibacterial activity against some human pathogens. Appl Nanosci, 4, 881-888. https://doi.org/10.1007/s13204-013-0271-4

Sharma, K., Yngard, R.A. Lin, Y. (2009). Silver nanoparticles: green synthesis and their antimicrobial activities. Adv Colloid Interface Sci, 145, 83-96. https://doi.org/10.1016/j.cis.2008.09.002 PMID: 18945421

Sorgeloos, P., Dehert, P., Candreva, P. (2001). Use of the brine shirinp, Artemia spp., in marine fish larviculture. Aquaculture, 200, 147-759. https://doi.org/10.1016/S0044-8486(01)00698-6

Wijnhoven, S.W.P., Peijnenburg, W.J.G.M., Herberts, C.A., Hagens, W.I., Oomen, A.G., Heugens, E.H.W., Roszek, B., Bisschops, J., Gosens, I., Meent, D. van de, Dekkers, S., Jong, W.H. de, Zijverden, M. van, Sips, A., Geertsma, R.E. (2009). Nano-silver - a review of available data and knowledge gaps in human and environmental risk assessment. Nanotoxicology, 3(2), 109-138. https://doi.org/10.1080/17435390902725914

Yousefzadi, M., Rahimi, Z., Ghafori, V. (2014). The green synthesis, characterization and antimicrobial activities of silver nanoparticles synthesized from green alga Enteromorpha flexuosa (wulfen) J Agardh Mater Lett, 137, 1-4. https://doi.org/10.1016/j.matlet.2014.08.110