شناسائی مرفومتریک و مولکولی دیکروسلیوم دندریتیکوم با استفاده از مارکرژنتیکی ND1 در دام های اهلی استان مرکزی

نوع مقاله: انگل شناسی و بیماری های انگلی

نویسندگان

گروه انگل شناسی و قارچ شناسی، دانشکده پزشکی ، دانشگاه علوم پزشکی کاشان،کاشان، ایران

چکیده

 
زمینه مطالعه: دیکروسلیازیس از شایع‌ترین بیماری‌های انگلی مجاری صفراوی و کیسه صفرای طیف وسیعی از پستانداران از جمله نشخوارکنندگان اهلی و گاهی انسان است. این بیماری حائز اهمیت پزشکی، دامپزشکی و اقتصادی فراوانی است به گونه‌ای که سالیانه باعث از دست رفتن مقادیر قابل توجهی مواد پروتئینی با ارزش از رژیم غذایی انسان می‌شود. به منظور کنترل بیماری، شناخت مرفولوژیکی و خصوصیات مولکولی انگل در مناطق آندمیک ضروری است.
هدف: مطالعه حاضر به منظور تعیین خصوصیات مرفولوژیک و مولکولی ایزوله‌های گاوی، گوسفندی و بزی دیکروسلیوم با استفاده از مارکر ژنتیکی ND1 دراستان مرکزی صورت گرفت.
روش کار: در این مطالعه مقطعی، 480 کرم بالغ تازه دیکروسلیوم از کبد120 گاو، گوسفند و بز ذبح شده در کشتارگاه استان مرکزی، جمع آوری گردید. به منظور تعیین گونه  انگل، شاخص‌های مرفولوژیک کرم بالغ بر اساس پارامترهای استاندارد محاسبه شد. از این تعداد DNA میتوکندریائی60 ایزوله استخراج و واکنش PCR برای تکثیر بخشی از ناحیه ND1 صورت گرفت. سپس محصول PCR خالص و تعیین توالی گردید و درصد مشابهت ژنتیکی بین سکانس‌ها و در مقایسه با موارد  ثبت شده در بانک ژن با استفاده از نرم افزار Clastalw2 تعیین و گونه دقیق انگل تشخیص داده شد.
نتایج: بررسی مرفومتریک کرم بالغ در تمامی ایزوله‌ها، بیضه‌ها را پشت سرهم و طول کرم را برای ایزوله‌های گاوی، گوسفندی و بزی به‌ترتیب: µm 967±7994، µm 100±6844 و µm 110±6570 (0.0001>P) و عرض کرم را برای 3 میزبان مورد بررسی به ترتیب:mµ 339±1649، µm 221±1490وµm 252±1430(0.0001>P) و نسبت طول به عرض را به ترتیب: 641/0±87/4، 625/0±58/4 و 622/0±64/4 (0.0001>P) نشان داد که مویدگونه دیکروسلیوم دندریتیکوم در میزبانان منطقه مورد مطالعه می‌باشد. آنالیز الکتروفروز ژل محصول PCR در تمامی ایزوله‌ها، وجود باند bp 200را نشان داد. درصد مشابهت ژنتیکی توالی‌های بدست آمده در مقایسه با موارد ثبت شده در بانک ژن بین97تا 99درصد بود.
نتیجه گیری نهایی: آنالیز مولکولی و مرفومتریک نشان داد که دیکروسلیوم دندریتیکوم، تنها عامل ایجاد کننده دیکروسلیازیس در دام‌های کشتارگاهی استان مرکزی می‌باشد. شناسائی مولکولی انگل با استفاده از مارکرهای ژنتیکی هسته توصیه می‌شود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Morphological and Molecular Detection of Dicrocoelium dendriticum Isolated from Domestic Animals Based on Genetic ND1 Marker in Markazi Province

نویسندگان [English]

  • Elnaz Nezami
  • Mohsen Arbabi
  • Hossein Hooshyar
  • Mahdi Delavari
Department of Medical Parasitology and Mycology, School of Medicine, Kashan University of Medical Sciences, Kashan, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Dicrocoeliasis is one of the commonest parasitic diseases of the bile ducts and gallbladder in a wide range of mammals including ruminants and sometimes human being. The disease is really important in medicine, economy, and veterinary medicine. Annually, slaughter house loses a huge amount because of losing a great deal of valuable proteins in people daily diets. In order to bring the disease under control, morphological and molecular analysis of parasite in endemic districts is essential.
OBJECTIVES: The present study was conducted to determine the morphological as well as molecular characterization of cattle, sheep and goats isolated from Dicrocoelium by applying ND1 genetic marker in the Markazi province, Iran.
METHODS: In this cross-sectional study 480 fresh adult worms were collected from livers of 120 cattle, sheep and goats slaughtered in abattoirs in Markazi province. To diagnose the species of parasite, morphometric indices of mature worms were calculated based on standard parameters. Then DNA of 60 isolates with different morphometric characteristics was extracted and PCR reaction was performed for a part of ND1 (mtDNA). PCR was purified and its sequence was defined, the percentage of genetic similarity was compared to cases registered by GenBank and the exact species of parasite was recognized.
RESULTS: The morphometric analysis in all isolates was as follows: testicles were sequential, the length and the width of the worm for all cattle, sheep and goat isolates were 7994±967µm, 6844±100µm, 6570±110µm (P<0.0001) and 1649±339µm, 1490±221µm and 1430±252µm (P<0.0001) respectively. The proportion of the length to the width was 4.87±0.641, 4.58±0.625, and 4.64±0.622 respectively. All the results mentioned above confirmed Dicrocoelium dendriticum in the hosts of the district under investigation. The analysis of the gel electrophoresis in all isolates showed the existence of band 200pb.The percentage of genetic similarity to the registered items, cases were determined by the Gen bank between 97 and 99 percent.
CONCLUSIONS: Molecular identification and morphometric assays clearly showed that D. dendriticum is the only agent of Dicrocoeliasis among cattle, sheep and goats in the Marakazi province, Iran. Molecular diagnosis of parasite by applying genetic marker of the nucleus is recommended.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Dicrocoelium dendriticum
  • Morphometric assays
  • Molecular identification
  • ND1 gene
  • Livestock

دیکروسلیازیس یکی از شایع‌ترین بیماری‌های مجاری صفراوی و کیسه صفرای طیف وسیعی از نشخوارکنندگان اهلی و وحشی وگاهی خرگوش، خوک، اسب و انسان با گسترش جهانی می‌باشد(3،13). عامل ایجاد کننده بیماری ترماتود دی ژنه‌آ متعلق به جنس دیکروسلیوم است که تاکنون 3 گونه از آن به نام‌های: دیکروسلیوم دندریتیکوم از سراسراروپا، آفریقا و آمریکا، دیکروسلیوم‌هاسپس ازآفریقا و دیکروسلیوم چایننسیس از آسیا گزارش شده است(1). از بین این 3 گونه، دیکروسلیوم دندریتیکوم حائز اهمیت پزشکی، دامپزشکی و اقتصادی بیشتری است. شیوع آلودگی انسانی روند افزایشی داشته واز این جهت ترماتود کبدی دیکروسلیوم دندریتیکوم یکی از عوامل مهم تهدید کننده سلامت انسان بشمار می‌رود(14). این بیماری بشدت سلامت میزبان خودرا به خطر انداخته به گونه‌ای که باعث عفونت شدید کبد و در نتیجه تحمیل خسارات قابل توجهی به اقتصاد دامپروری، مرگ ومیر، کاهش تولیدات دامی و افزایش استفاده از داروهای ضد کرمی می‌شود(9،11،13). بررسی‌های صورت گرفته در نقاط مختلف ایران نشان می‌دهد، آلودگی به ترماتود کبدی دیکروسلیوم دندریتیکوم شیوع متفاوتی دارد، به گونه‌ای که نسبت آلودگی در گاو 01/0درصد تا 66درصد، گوسفند 03/0درصد تا20درصد، بز02/0درصد تا 3/23 درصد و در گاومیش 8/0درصد تا 1/11درصد در مناطق مختلف جغرافیائی کشور گزارش شده است(8-2). همچنین یک مرور سیستماتیک و متاآنالیز شیوع نسبی آلودگی درگوسفندان، بزها و گاوهای کشتارشده در مناطق مختلف کشور را به‌ترتیب: 1/3درصد، 3/1درصد و 5/0درصد نشان داده است(3). ارزش اقتصادی کبدهای معدوم شده دام‌های کشتارگاهی آلوده به این کرم در ایران بالغ بر 8099418 دلار برآورد شده است(7). تشخیص دیکروسلیازیس براساس آزمایش مدفوع و مشاهده تخم، بررسی‌های هماتولوژیک، شناسائی آنتی بادی‌های اختصاصی و تکنیک‌های بیوشیمیائی(16) صورت می‌گیرد. در کشتارگاه پس از اتوپسی کامل حیوان، تشخیص بر اساس مشاهده کرم بالغ در کبد، کیسه صفرا و همچنین معاینات آناتومیک و بررسی‌های ایمنوپاتولوژیک صورت می‌گیرد(5). استفاده از شاخص‌ها و نسبت‌های مرفومتریک از جمله: وضعیت قرارگرفتن بیضه‌ها، اندازه بدن (طول وعرض)، قطربادکش شکمی‌ (داخلی وخارجی)، قطر بادکش‌ دهانی (داخلی وخارجی)، طول وعرض بیضه‌ها وطول غدد وتیلوژن برای شناسائی گونه‌های جنس دیکروسلیوم توسط محققین بکارگرفته شده و براساس آن گونه‌های مختلف انگل از یکدیگر تشخیص داده شده است. درعین حال این روش برای تشخیص دقیق تغییرات درون گونه‌ای فاقد حساسیت لازم می‌باشد(1،2). امروزه برای شناسائی تغییرات درون گونه‌ای و بین گونه‌ای ترماتودهای کبدی جنس دیکروسلیوم از مارکرهای ژنتیکی قابل اعتماد از جمله ژن‌های هسته 18s، 28s و ITS2 و همچنین ژن‌های میتوکندریائی (ND1 و CO1) استفاده می‌شود. این مارکرها قادر به جداسازی و شناسائی گونه‌ها از یکدیگر بطور دقیق می‌باشد(2،6،20). علی‌رغم اهمیت دیکروسلیازیس، اطلاعات محدودی در مورد خصوصیات مرفومتریک و ژنومیک عامل ایجاد کننده بیماری در دسترس می‌باشد. با توجه به شیوع بالای دیکروسلیازیس و لزوم بکارگیری استراتژی‌های کنترل و پیشگیری مؤثر و کارآمد در دام‌های کشور، لازم است درکنار استفاده از روش‌های انگل شناسی، از تکنیک‌های نوین بخصوص روش‌های مولکولی حساس و قابل اعتماد جهت تشخیص دقیق عامل بیماری و انتشار گونه‌ها در میزبانان مناطق مختلف جغرافیائی کشور استفاده شود. به همین منظور هدف از مطالعه حاضر، تعیین خصوصیات مرفولوژیکی و مولکولی ایزوله‌های دیکروسلیوم جمع آوری شده از دام‌های ذبح شده در کشتارگاه استان مرکزی براساس مارکرژنتیکیND1  می‌باشد. نتایج این مطالعه می‌تواند در تشخیص، درمان، بکارگیری استراتژی‌های کنترل و پیشگیری از بیماری مورد استفاده قرار گیرد.

 

مواد و روش‌کار

جمع آوری نمونه: این تحقیق با طراحی مقطعی(Cross –Sectional)  روی120کبد شامل (40 کبد گاو، 40 کبد گوسفند و 40 کبد بز) جمع آوری شده از کشتارگاه صنعتی استان مرکزی طی سال 1395صورت گرفت. تشخیص آلودگی به ترماتود کبدی دیکروسلیوم پس از کالبد گشائی کامل حیوان و معاینه دقیق کبد و مجاری صفراوی و ایجاد برش در بافت توسط دامپزشک صورت گرفت. کبدهای آلوده در اسرع وقت به آزمایشگاه انگل شناسی منتقل و پس از باز نمودن کامل کلیه مجاری صفراوی، تمامی کرم‌های‌ موجود بدون هر گونه ‌آسیب فیزیکی جدا و شمارش گردید. از هر میزبان160کرم بالغ تازه دیکروسلیوم دندریتیکوم و در مجموع 480 کرم برای شناسایی ۲۱ شاخص مرفولوژیک و مرفومتریک پس از حداقل 3 بار شستشو با سرم فیزیولوژی انتخاب گردید. شاخص‌ها و نسبت‌های مرفولوژیک و مرفومتریک مورد مطالعه عبارت بود از: اندازه بدن (طول وعرض و نسبت طول به عرض بدن)، اندازه بادکش‌ها (قطر داخلی و خارجی بادکش شکمی و دهانی، نسبت قطر خارجی بادکش دهانی به شکمی و فاصله بین بادکش‌ها)، اندازه بیضه (طول و عرض)، اندازه تخمدان (طول وعرض)، طول غدد زرده (راست و چپ)، قطر اواوتیپ، فاصله بادکش شکمی تا انتهای خلفی بدن، اندازه رحم (طول وعرض)، طول سیر و نسبت طول بدن به طول غدد زرده برحسب میکرومتر اندازه‌گیری  و محاسبه شد(18). نمونه‌ها تا انجام کار مولکولی در C°80- نگهداری شد. داده‌ها با استفاده از آزمون آماری ANOVA و با استفاده ازنرم افزارآماری SPSS ویرایش 16 تجزیه و تحلیل و مورد قضاوت آماری قرار گرفت.

استخراج DNA ژنومی از کرم بالغ: از هر میزبان،20 کرم بالغ دیکروسلیوم با ویژگی‌های متفاوت مرفولوژیک و مرفومتریک و در مجموع60 نمونه برای استخراجDNA  انتخاب گردید. برای انجام این کار، نمونه‌ها را از فریزر خارج نموده و پس از 3 بار شستشو با بافر PBS استریل سرد، محلول هموژنی از بافت انگل تهیه و به آن µl 200 بافر لیز کننده اضافه و به مدت 3 ساعت درحمام آب گرم C°56 انکوبه و سپس عمل استخراج DNA با استفاده از کیت بافتیBioneer Accu Prep (کره جنوبی) و مطابق با دستور العمل کارخانه سازنده با تغییراتی در زمان انکوباسیون و مقدار آنزیم پروتئیناز K صورت گرفت. خلوص DNA استخراج شده با دو روش الکتروفورز ژل آگارز و اسپکترو فتومتری UV‌ در طول ‌موج‌های nmا‎260 و280 تایید گردید. طراحی پرایمرهای اختصاصی گونه برای ژن مورد مطالعه، با استفاده از نرم افزارPrimer3 صورت گرفت و اختصاصیت و عمکرد آن با نرم افزار BLAST تائید گردید. درجدول 1 توالی پرایمرهای مورد استفاده نشان داده شده است. پس از حصول اطمینان از کیفیت محصول، DNA استخراج شده با µl 80 محلول Elution‌ رقیق شده و تا زمان انجام واکنش PCR در C°20 - نگهداری شد.

واکنشPCR ، تعیین توالی ژن و ترسیم درخت فیلوژنیND1 : قطعه‌ای از ژن ND1 به اندازه تقریبیbp 200تکثیر شد. مخلوط PCR به حجم µl 20 شامل: µl2 DNA انگل،µl 2 Master Mix، 1µlپرایمر Forward، 1µlپرایمر Reverse و 14µl آب مقطر استریل تهیه و واکنش PCR با استفاده از دستگاه ترموسایکلر مدل Flex cycler2 (انگلستان) با پروتکل زیر صورت گرفت: مرحله واسرشت ابتدایی C°95 به مدت 5 دقیقه، مرحله واسرشت C°95 به مدت 1دقیقه، مرحله اتصال پرایمر C° 55 به مدت 45 ثانیه و مرحله طویل شدن زنجیره C° 72 به مدت 45 ثانیه. این 3مرحله به تعداد30 سیکل و در نهایت یک سیکل به مدت 10دقیقه در C° 72 انجام گرفت. سپس µl 4 از محصول PCR  تهیه شده به همراه µl 2 بافر loading در ژل آگاروز 5/1درصد به همراه مارکر وزنی DNAاbp 100، کنترل منفی (آب مقطر دو بار تقطیر) و کنترل مثبت (محصول PCR حاوی DNA استاندارد شده انگل) در ژل آگاروز 5/1درصد بارگذاری و در ولتاژ80 آمپر به مدت 45 دقیقه الکتروفورزو با استفاده ازترانس لومیناتور باندهای تشکیل شده آنالیز گردید. برای منظور دستیابی به توالی ژنND1 دیکروسلیوم، محصول PCR 8 ایزوله با استفاده از سکانسر DNA automa 310و هر دو پرایمر بکار رفته در واکنش PCR  تهیه شده و پس از مرتب سازی در بانک ژن ثبت شد. توالی‌ها با استفاده از نرم افزار BLASTا(Basic Local Alignment Search Tool) با موارد ثبت شده در بانک ژن مقایسه و میزان مشابهت ژنتیکی آن‌ها با استفاده از نرم افزارClastalw2 مورد آنالیز دوبدو قرار گرفت. همچنین درخت فیلوژنی پس از هم ترازی چندگانه توالی‌ها، به همراه چند توالی ثبت شده از راسته پلاژورکید در بانک ژن با استفاده ازنرم افزار MEGA5 و الگوریتم neighbor joining ترسیم گردید(19).

 

نتایج

بررسی مرفومتریک: از هرمیزبان مورد مطالعه،160کرم بالغ تازه دیکروسلیوم دندریتیکوم و در مجموع480 نمونه برای شناسایی21 شاخص و نسبت مرفومتریک مورد مطالعه قرارگرفت. مقایسه پارامترهای مرفومتریک نشان داد که اندازه شاخص‌ها در3 میزبان تحت مطالعه با یکدیگر متفاوت است(0.0001>P). در جدول 2 شاخص ها و نسبت های مرفولوژیک و مرفومتریک ترماتود کبدی دیکروسلیوم در گاو، گوسفند و بز با یکدیگر مقایسه شده است. موقعیت قرارگرفتن بیضه‌ها که معیار قابل اعتمادی برای تشخیص افتراقی گونه‌های دیکروسلیوم می‌باشد، در تمامی ایزوله‌ها، پشت سرهم (tandem) بود که خود موید گونه دیکروسلیوم دندریتیکوم در میزبانان منطقه مورد مطالعه می‌باشد.

بررسی مولکولی: پس از استخراج DNA موجود در پیکره60 کرم بالغ، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، واکنش PCR انجام و اندازه ناحیه ژنومی ND1 درتمامی ایزوله‌ها باندbp 200 نشان داده شد (تصویر1).

پس از بررسی‌های مولکولی، به منظور تائید گونه انگل، از محصول تخلیص شدهPCR  تعیین توالی صورت گرفت. توالی‌ها پس از مرتب سازی در بانک جهانی ژن باشماره‌های LC189318.1،LC189317.1 به ثبت رسید. نتایج آنالیز دوبدوی توالی‌های 3 میزبان مورد مطالعه و همچنین در مقایسه با موارد ثبت شده در بانک جهانی ژن، نشان‌دهنده مشابهت ژنتیکی ایزوله‌ها، بین 97 تا 99 درصد بود و به این ترتیب دیکروسلیوم دندریتیکوم تنها گونه آلوده کننده جنس دیکروسلیوم دربین نشخوارکنندگان استان مرکزی تعیین گردید. همچنین آنالیز فیلوژنتیک توالی‌ها نشان داد، تمامی ایزوله‌های مورد مطالعه مربوط به گونه دیکروسلیوم دندریتیکوم می‌باشد (تصویر 2).

 

بحث

دراین مطالعه با دوروش مرفومتریک وتعیین توالی نشان داده شد از بین  3 گونه جنس دیکروسلیوم، تنها دیکروسلیوم دندریتیکوم باعث آلودگی نشخوارکنندگان استان مرکزی می‌شود. یکی ازشاخص‌های مرفومتریک قابل اعتماد و مهم برای تشخیص افتراقی گونه‌های دیکروسلیوم، موقعیت قرار گرفتن بیضه‌ها می‌باشد. مطالعه Otranto و همکارانش در سال 2007 که بر روی گوسفندان اتریشی، آلمانی وایتالیایی آلوده به ترماتود کبدی دیکروسلیوم صورت گرفته بود، نشان داد ‌در تمامی‌ایزوله‌های ‌دیکروسلیوم ‌چایننسیس‌ دو ‌بیضه‌درکنار هم قرار دارد، ولی ‌در ایزوله‌های دیکروسلیوم دندریتیکوم موقعیت قرار گرفتن بیضه‌ها پشت‌ سرهم می‌باشد. همچنین پهنای بدن درقسمت میانی ‌دیکروسلیوم چایننسیس نسبت به دیکروسلیوم دندریتیکوم بیشتر می‌باشد (15). یافته‌های تحقیق حاضر نشان داد، بیضه‌ها در تمامی ایزوله‌ها موقعیت پشت سرهم دارد که بدین ترتیب می‌توان نتیجه گرفت، تنها عامل دیکروسلیازیس در استان مرکزی، دیکروسلیوم دندریتیکوم می‌باشد. Taira و همکاران وی در سال 2006 با استفاد از این شاخص، تنهاگونه آلوده کننده آهوی ika در ژاپن را دیکروسلیوم چایننسیس تشخیص دادند(18). شاخص مهم دیگر اندازه طول و عرض کرم بالغ می‌باشد. در مطالعه حاضرطول کرم بالغ دیکروسلیوم دندریتیکوم در ایزوله‌های گوسفند و بز به ‌ترتیب:mm 1/0±84/6  و mm 11/0±57/6 (0.0001>P) و عرض آن برای 2 میزبان مورد بررسی به ترتیب: µm 22/0±49/1و  25/0±43/1(0.0001>P) و نسبت طول به عرض به ترتیب: 625/0±58/4 و 622/0±64/4 (0.0001>P) محاسبه شد که مویدگونه دیکروسلیوم دندریتیکوم در میزبانان منطقه مورد مطالعه می‌باشد. در مطالعه Bari و همکاران در سال 2018 طول و عرض کرم بالغ در ایزوله‌های گوسفند دیکروسلیوم mm 66/1±71/7 و mm 046/0±65/1 ودرایزوله‌های بز mm 104/0±73/6 وmm 03/0±65/1محاسبه شده است(2). در مطالعهOtranto و همکارانش در سال 2007،  طول و عرض کرم بالغ دیکروسلیوم دندریتیکوم ایزوله گوسفند به ترتیب در محدوه mm 60/5-70/4 (mm 33/0±05/5 ) و mm 80/1-30/1 (mm 29/0±47/1)گزارش شده است(15) که بدین ترتیب طول و عرض کرم‌های بالغ دیکروسلیوم دندریتیکوم دام‌های کشتارگاهی استان مرکزی در مقایسه با  نتایج مطالعه Bari و همکاران کوتاه‌تر است (2) ولی در مقایسه با مطالعه Otranto و همکاران بلندتر می‌باشد (15). نتایج این تحقیق نشان داد، علی‌رغم مشاهده اختلافات مرفومتریک قابل ملاحظه درون گونه‌ای، تفاوت اندکی در توالی‌های ژن میتوکندریائیND1 مشاهده می‌شود، به گونه‌ای که در بین ایزوله‌ها و همچنین در مقایسه با موارد ثبت شده در بانک ژن حداقل70درصد مشابهت ژنتیکی وجود دارد که خودگویای این واقعیت است که تنها گونه دیکروسلیوم دندریتیکوم قادر به آلودگی دام‌های منطقه مورد مطالعه می‌باشد. تاکنون اطلاعاتی کمی در مورد خصوصیات مرفومتریک گونه‌های دیکروسلیوم دراختیار می‌باشد (10،12،17). ازاین‌رو ارزیابی تغییرات درون گونه‌ای و بررسی موتاسیون با این روش بطور دقیق امکان پذیر نمی‌باشد. بنابراین استفاده از تکنیک‌های نوین از جمله روش‌های مولکولی جهت تشخیص هویت انگل و بررسی تغییرات درون گونه‌ای و بین گونه‌ای با استفاده از مارکرهای ژنتیکی قابل اعتماد ضروری است. ﭘﻴﺸﺮﻓﺖ‌هایی ﻛﻪ در زﻣﻴﻨﻪ ﺑﻴﻮﻟﻮژی ﻣﻮﻟﻜـﻮلی ﺑـﻪ وﻳﮋه ﺗﻜﺜﻴﺮ ﻧﻮاﺣی ﺧﺎصی از ژﻧﻮم اﻧﮕـﻞ ﺑـﻪ ﺷـﻴﻮة واﻛـﻨﺶ‌های زﻧﺠﻴـﺮه‌ای ﭘﻠﻴﻤـﺮاز ﺣﺎﺻـﻞﺷـﺪه، اﺧﺘﻼﻓﺎت ﺑﺎرزی در ﻧﻮع و ﺗﺮﺗﻴﺐ ﺑﺎزهای آلی ﮔﻮﻧﻪ‌های ﻣﺨﺘﻠﻒ ﻣﻮﺟﻮدات ﺷﻨﺎﺳـﺎیی ﻧﻤـﻮده ﻛـﻪ اﻳـﻦ ﺗﻔﺎوت‌ها می‌ﺗﻮاﻧﻨﺪ ﮔﻮﻧﻪ‌های ﻣﺸﺎﺑﻪ را از هﻤﺪﻳﮕﺮ ﺗﻔﻜﻴک ﻛﻨﻨﺪ. مطالعات مولکولی در زمینه ویژگی‌های ژنتیکی گونه دیکروسلیوم به‌طور محدودی در ایران وجهان صورت گرفته است و در عین حال تمامی مطالعات نشان دهنده دیکروسلیوم دندریتیکوم به عنوان گونه غالب که قادر به ایجاد بیماری دیکروسلیازیس در دام‌های اهلی می‌باشد، از جمله مطالعات Bari و همکاران در سال 2018 که با استفاده از مارکر ژنتیکی(28S,rDNA) تنها  عامل دیکروسلیازیس درگوسفندان استان مازندران را دیکروسلیوم دندریتیکوم گزارش کرده است (2). همچنین Gorjipoor و همکاران در سال 2015 با استفاده از ژنND1 وITS2 و توالی بدست آمده گونه، و توالی بدست امده، دیکروسلیوم دندریتیکوم را تنها گونه غالب انگل در گاو و گوسفند در ایران معرفی کرده است (6). درتحقیق حاضراز این ژن برای توصیف تغییرات درون گونه‌ای دیکروسلیوم در استان مورد مطالعه استفاده شد. براساس این مارکربین توالی‌های ایزوله‌های گاوی گوسفندی بزی با مواردثبت شده دربانک جهانی ژن تا 99درصد شباهت دارند.

نتیجه گیری: پژوهش حاضرکه برای اولین بار در استان مرکزی به مطالعه شاخص‌های مرفومتریک وخصوصیات مولکولی (ND1) و تعیین توالی پرداخته است، نشان داد دیکروسلیوم دندریتیکوم تنهاگونه دیکروسلیوم است که باعث بروزدیکروسلیازیس درنشخوارکنندگان استان مرکزی می‌شود. ازاین رو باتوجه به زیان‌های اقتصادی بیماری کنترل و پیشگیری از آن کاملاًضروری می‌باشد.

 

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از مدیریت اداره دامپزشکی و دامپزشکان محترم مسئول فنی کشتارگاه استان مرکزی که در انجام نمونه‌گیری نهایت همکاری را مبذول داشته‌اند، تشکر و قدردانی می‌گردد. این تحقیق از محل اعتبار ویژه پژوهشی معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی کاشان (طرح شماره 94142) انجام شده که بدین وسیله از مسئولین محترم معاونت پژوهشی تشکرو قدردانی می‌گردد.

 

تعارض در منافع

بین نویسندگان  هیچ گونه تعارض در منافع  گزارش نشده است.

Arbabi, M., Dalim, A., Ghafarifar, F., Foroozaneh- Moghadam, M. (2011). Prevalence and Intensity of Dicrocoelium dendriticum in Sheep and Goats of Iran. Res J Parasitol, 6, 160-167. https://doi.org/10.3923/jp .2011.160.167

Bari, S., Arbabi, M., Gill, P., Sharif, M., Ziaei Hezarjaribi, H., Dodangeh, S., Alizadeh,  A., Hedayati, Z., Sarvi, S.H. (2018). Morphological and Molecular (28s rDNA) Characterization of Dicrocoelium dendriticum Isolates from Sheep, Goat and Cattle in Mazandaran Province, Iran. J Mazandaran Univ Med Sci, 28, 38-45 (Persian).

Bari, S., Sarvi, S.H., Daryani, A., ZiaeeiHezarjaribi, H., Arbabi, M., Pirestani, M., Mizani, A. (2015). Dicrocoelium dendriticum infection among domestic animals in Iran: A systematic Review and Meta-analysis. J Mazandaran  Uni Med Sci, 25(132), 362-370 (Persian).

Borji, H., Azizzadeh, M., Kameli, M. (2012). A retrospective study of abattoir condemnation due to parasitic infections and its economic importance in Ahwaz, southwestern of Iran. J Parasitol, 98, 954-957. https://doi.org/10.1645/GE-2988.1 PMID:22568697

Ferreras-Estrada, M.C., Campo, R., González-Lanza, C., Pérez, V., García-Marín, J.F., Manga-González, M.Y. (2007). Immunohistochemical study of the local immune response in lambs experimentally infected with Dicrocoelium dendriticum (Digenea). Parasitol Res, 101, 547-555.

https://doi.org/10.1007/s00436-007-0511-1  PMID:17393185

Gorjipoor, S., Moazeni, M., Sharifiyazdi, H. (2015). Characterization of Dicrocoelium dendriticum haplotypes from sheep and cattle in Iran based on the internal transcribed spacer 2 (ITS-2) and NADH dehydrogenase gene (nad1). J Helminthol, 89, 158-164. https://doi.org/10.1017/S0022149X13000679 PMID:24119243

Jahed Khaniki, Gh.R., Beigom Kia, E., Raei, M. (2013). Liver condemnation and economic losses due to parasitic infections in slaughtered animals in Iran. J Parasit Dis, 37, 240–244. https://doi.org/10.1007/s12639-012-0172-6 PMID:24431577

Khanjari, A., Bahonar, A., Fallah, S., Bagheri, M., Alizadeh, A., Fallah, M., Khanjari, Z. (2014).  Prevalence of fasciolosis and dicrocoeliosis in slaughtered sheep and goats in Amol Abattoir, Mazandaran, northern Iran. Asian Pac J Trop Dis, 4, 120–124. https://doi.org/10.1016/S2222-1808(14)60327-3 PMCID: PMC4032052

Kleiman, F., Pietrokovsky, S., Prepelitchi, L., Carbajo, A.E., Wisnivesky-Colli, C. (2007). Dynamics of Fasciola hepatica transmission in the Andean Patagonian valleys, Argentina. Vet Parasitol, 145, 274-286. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2006.12.020 PMID:17270347

Manga-González, M.Y., Gonzalez-Lanza, C. (2005). Field and experimental studies on Dicrocoelium dendriticumand  and dicrocoeliasis in northern Spain. J Helminthol, 79, 291–302. PMID: 16336711

Manga-González, M.Y., Quiroz-Romero, H., González-Lanza, C., Miñambres, B., Ochoa, P. (2010). Strategic control of  Dicrocoelium dendriticum (Digenea) egg excretion by naturally infected sheep. Vet Med, 55, 19–29. https://doi.org/10.17221/63/2009-VETMED

Maurelli, M.P., Rinaldi, L., Capuano, F., Perugini, A.G., Veneziano, V., Cringoli, G. (2007). Characterization of the 28S and the second internal transcribed spacer of ribosomal DNA of Dicrocoelium dendriticum and Dicrocoelium hospes. Parasitol Res, 101, 1251-1255. https://doi.org/10.1007/s00436-007-0629-1 PMID:17605007

Meshgi, B., Khodaveisi, M. (2014). Determination of immunodominant antigens of Dicrocoelium dendriticum by hyperimmune sera. Immunol Infect Dis, 2, 4-8. https://doi.org/ 10.13189/iid.2014.020102

Nguyen, T.G., Van De, N., Vercruysse, J., Dorny, P., Le, T.H. (2009). Genotypic characterization and species identification of Fasciola spp. with implications regarding the isolates infecting goats in Vietnam. Exp parasitol, 123, 354–361. https://doi.org/10.1016/j.exppara.2009.09.001 PMID:19733565

Otranto, D., Rehbein, S., Weigl, S., Cantacessi, C., Parisi, A., Lia, R.P., Olson, P.D. (2007). Morphological and molecular differentiation between Dicrocoelium dendriticum and Dicrocoelium chinensis (Sudarikov and Ryjikov, 1951)Tang and Tang,1978 (Platyhelminthes: Digenea). Acta Tropica, 104, 91-98. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2007.07.008 PMID:17803950

Samadie, H., Mohammadi Gh.R., Heidarpour, M., Azizzadeh, M., Maleki, M., Borji, H. (2016). Parasitic burdens, egg output, hemathologic, and biochemical changes in naturally infected lambs with Dicrocoelium dendriticum. Iran J Parasitol, 11, 358-363. PMID:28127341

Sandoval. H., Manga-González. Y., Campo, R., García, P., Castro, J.M., Pérez de la Vega, M. (1999). Preliminary study on genetic variability of Dicrocoelium dendriticum determined by randomamplified polymorphic DNA. Parasitol Int, 48, 21–26. PMID:11269322

Taira, K., Shirasaka, S., Taira, N., Ando, Y., Adachi, Y. (2006). Morphometry on lancet flukes found in Japanese Sika deer (Cervusnippon centralis) captured in Iwate Prefecture, Japan. J Vet Med Sci, 68, 375–377. https://doi.org/10.1292/jvms.68.375. PMID:16679730

Tamura, K. ,Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., Kumar, S. (2011). MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Bio Evol, 28, 2731–2739. https://doi.org/10.1093/molbev/msr121 PMID: 21546353

Zhao, G.H., Bian, Q.Q., Ren, W.X., Jia, Y.Q., Cheng, W.Y., Fang, Y.Q., Song, J.K., Lin, Q.  (2013). Genetic variability among Dicrocoelium dendriticum isolates from different regions in Shaanxi Province, China revealed by sequences of three mitochondrial genes. Mitochondrial DNA, 24, 683-688. https://doi.org/10.3109/19401736.2013.772168 PMID:23521316