نوع مقاله : بهداشت مواد غذایی
نویسندگان
گروه بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تخصصی فن آوریهای نوین آمل، آمل، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
BACKGROUND: Staphylococcus aureus is one of the most important pathogenic bacteria for human that is easily transferred during slaughtering, processing, packaging, storage and handling of meat and meat products as a result of poor hygienic principles, and causes staphylococcal food poisoning.
Objectives: The objective of this study was to evaluate the contamination of raw and cooked ground beef in retail shops of Mazandaran to S. aureus and also detection of enterotoxin-producing genes in the isolates.
Methods: One-hundred fifty ground beef samples (95 raw and 65 cooked) were collected randomly from retail shops, 21 May-21 July 2017. S. aureus was counted via culturing on Baird Parker Agar medium. Detection of enterotoxins A-E and G, H, I and J producing genes was conducted applying real-time PCR technique.
Results: 68% of samples showed S. aureus contamination. The average count in raw and cooked ground beef samples was 3.1×105 cfu/g and 5.7×103 cfu/g, respectively. From 92 S. aureus isolates, 23 isolates (25%) were carrying enterotoxin coding genes; amongst them 15 isolates (65.2%) were carrying just a single gene and the rest more than one gene. Two isolates carrying SEA+ SEC, two isolates SEA+SEE, one isolate SEA+SEG, one isolate SEC+SEI, one isolate SEA+SEC+SEG and one isolate SEE+SEG.
Conclusions: These results show that enterotoxigenic S. aureus strains are present on considerable numbers in retail ground meat in Mazandaran.
کلیدواژه‌ها [English]
بیماری‌های منتقله از راه غذا معضل اصلی سلامت و بهداشت عمومی محسوب می‌شوند که سالانه میلیون‌ها نفر از جمعیت جهان بدان مبتلا و بخشی نیز دچار مرگ و بستری شدن در بیمارستان‌ها می‌شوند. استافیلوکوکوس اورئوس به عنوان دومین و گاهی سومین علت مهم این بیماری‌ها محسوب می‌شود(7). مسمومیت غذایی استافیلوکوکی که به علت حضور سویه‌های انتروتوکسیژنیک آن در مواد غذایی ایجاد می‌شود برخلاف مسیر آرام خود خسارات اقتصادی قابل ملاحظه‌ای به بار می‌آورد (3). این باکتری به علت سهولت رشد در شرایط مختلف، از انواع مواد غذایی مانند شیر و محصولات لبنی، محصولات گوشتی، سبزیجات و سالاد، غذاهای پخته و نمکی بخصوص مواد غذایی که تهیه آن‌ها مستلزم دستکاری‌های طولانی باشد قابل جدا شدن است (11). استافیلوکوکوس اورئوس انواع مختلفی از انتروتوکسین‌ها را تولید می‌نماید و در میان توکسین‌های باکتریایی خارج سلولی (اگزوتوکسین‌ها)، توکسین‌های استافیلوکوکوس اورئوس بالاترین درصد احتمال ایجاد بیماری را دارند. این انتروتوکسین‌ها، اگزوپروتئین‌های تک زنجیری مقاوم به حرارت با وزن مولکولی Da 26000 تا 30000 هستند که سندرم گاستروانتریت در انسان ایجاد می‌کنند. زنجیرهای پلی پپتیدی منفرد توسط یک پل دی سولفیدی به یکدیگر متصل شده و حلقه سیستینی ویژه‌ای را به وجود می‌آورند و تصور می‌شود که این حلقه قسمت سمی مولکول و مقاومت قابل ملاحظه این انتروتوکسین‌ها نسبت به حرارت باشد. در حال حاضر بیش از 20 انتروتوکسین استافیلوکوکی متفاوت از نظر سرولوژی شناخته شده است که متشکل از انتروتوکسین‌های کلاسیک (A تا E) و انتروتوکسین‌های استافیلوکوکی اخیرا تعریف شده (SEG تا SER و SEU) می‌باشند. مطالعات اخیر نشان داده که همه آن‌ها در ایجاد مسمومیت غذایی استافیلوکوکی نقش ندارند. از بین انتروتوکسین‌های مختلف، نوع A و D اغلب عامل مسمومیت‌های غذایی هستند و انتروتوکسین A در ایجاد مسمومیت غذایی نسبت به سایر انتروتوکسین‌های استافیلوکوکی بیشترین نقش را دارد (1،11). افزایش جمعیت استافیلوکوکوس اورئوس تا cfu/g 105 و بلع حدود ng100 از انتروتوکسین می‌تواند باعث بروز علائم مسمومیت استافیلوکوکی (شامل تهوع، استفراغ، دل پیچه، اسهال، احساس خستگی و سردرد) گردد (7). همانطور که پیش تر ذکر گردید دستکاری مواد غذایی و نیز نگهداری ماده غذایی طبخ شده در شرایط دمایی نامناسب و یا دمای محیط (به ویژه در فصل تابستان) به مدت طولانی (مانند آنچه در اغلب اغذیه فروشی‌ها رخ می‌دهد) موجب افزایش تعداد استافیلوکوکوس اورئوس و تولید انتروتوکسین می‌گردد و به علت مقاومت حرارتی انتروتوکسین‌های استافیلوکوکی حرارت دادن مجدد ماده غذایی موجب سالم سازی آن نمی‌گردد. از آنجا که گوشت منبع غذایی غنی برای رشد و فعالیت این باکتری به شمار می‌رود و شکل‌های مختلف آن به خصوص گوشت چرخ شده در اغذیه فروشی‌ها به میزان زیاد عرضه می‌گردد، در این مطالعه به بررسی میزان آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس و ارزیابی ﻓﺮاواﻧی ژنهای عامل تولید انتروتوکسین‌های استافیلوکوکی در نمونههای گوشت چرخ شده خام و طبخ شده در اغذیه فروشیهای استان مازندران پرداخته شد.
مواد و روش کار
جمع آوری نمونه: تعداد 150 نمونه گوشت چرخ شده گوساله (95 نمونه خام و 55 نمونه طبخ شده) به روش نمونه گیری تصادفی از اغذیه فروشیهای استان مازندران، طی خرداد و تیر ماه 1396، جمع آوری گردید. نمونه گیری حتی الامکان به صورت استریل انجام و نمونه‌ها در کیسه‌های پلی اتیلن استریل در مجاورت یخ به آزمایشگاه منتقل شدند. آزمون‌های مربوطه بلافاصله پس از تحویل نمونه‌ها به آزمایشگاه انجام گردید.
شمارش استافیلوکوکوس اورئوس: با استفاده از قاشق فلزی استریلg 25 از نمونه گوشت چرخ شده برداشت شده و در‌هاون چینی استریل یکنواخت گردید. سپس، نمونه همگن شده با ml 225 محلول آب پپتونه بافرشده (مرک، آلمان) به خوبی مخلوط و به مدت h 24 ساعت در دمای ºC 37 گرمخانه گذاری شد. سپس رقت‌های مورد نظر تهیه و مقدار ml 1/0 از هر رقت در سطح سه پلیت حاوی محیط کشت برد پارکر آگار (مرک، آلمان) غنی سازی شده با زرده تخم مرغ و تلوریت پتاسیم انتقال داده شد و به مدت 48 ساعت در دمای ºC 37 گرمخانه گذاری و در نهایت شمارش گردید. کلنی‌های سیاه، محدب، براق با یا بدون‌هاله روشن، جهت به دست آوردن کلنی‌های منفرد، روی محیط آگار خوندار حاوی 5 درصد خون گوسفند کشت داده و به مدت h 24 در دمای ºC 37 گرمخانه گذاری شدند. وجود استافیلوکوکوس اورئوس از طریق وضعیت همولیز روی آگار خوندار، رنگ آمیزی گرم، آزمون‌های تائیدی مانند واکنش کاتالاز (پراکسید هیدروژن 3/0درصد)، واکنش کوآگولاز و تخمیر گلوکز و مانیتول تائید گردید (28).
استخراج DNA از استافیلوکوکوس اورئوس جدا شده از نمونه‌ها گوشت چرخ شده: محلول استخراج Tripure (روشه، ایالات متحده) جهت استخراج DNA به کار رفت و کلیه مراحل مطابق دستورالعمل شرکت تولید کننده انجام شد. جهت بررسی کمی و تعیین غلظت DNA، دانسیته نوریul 2 از محلول حاوی DNA در طول موج nm 260 با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ (مدل NanoDrop Spectrophotometre 2000 ThermoScientific,USA) قرائت و بر اساس ng/ul گزارش شد. نسبت میزان جذب در طول موج nm 260 به nm 280 (A260/A280) بیانگر عدم وجود آلودگی و خلوص DNA می‌باشد. DNA به دست آمده تا زمان انجام PCR در دمای ºC 20- نگهداری شد.
پرایمرها: پرایمرهای به کار رفته جهت انجام PCR (جدول 1) از شرکت تکاپوزیست (تهران، ایران) تهیه شد. جهت به دست آوردن منحنی ذوب پرایمرها دامنه حرارتی ºC 95-70 با شیب ºC/min 1 اعمال شد.
انجام Real Time PCR: واکنش Real Time PCR جهت جستجوی ژن مولد انتروتوکسین‌های استافیلوکوکی با استفاده از محلول (Applied Biosystems, USA)اPower SYBR Green انجام شد، مستر میکس تهیه شده شامل پرایمرهای forward و reverse ul 1، الگوی DNA (غلظت نهایی ng/ul 10)، ul 10 مسترمیکس Power SYBR Green و آب فاقد نوکلئاز بود. واکنش در یک ترموسایکلر ABI PRISM 7,500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France) انجام شد. شرایط چرخه حرارتی واکنش به صورت زیر بود: یک سیکل در ºC50 به مدت min 2، یک سیکل در ºC 95 به مدت min 2، 40 چرخه در ºC 95 به مدت sec 15 و ºC 60 به مدت min 1. آنالیز کلیه نمونه‌ها در سه تکرار صورت گرفت.
آنالیز آماری: بررسی داده‌ها بر اساس آنالیز آماری توصیفی و با استفاده از نسخه 22 نرم افزار SPSS انجام شد. نتایج شمارش باکتری به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شد.
نتایج
در این مطالعه، تعداد 92 نمونه از 150 نمونه مورد بررسی (68درصد) آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس تشخیص داده شدند. میانگین تعداد در نمونههای گوشت چرخ شده خام و طبخ شده، به ترتیب، برابر با cfu/g 105×1/3 و cfu/g 103×7/5 بود. بالاترین میزان آلودگی در نمونههای گوشت خام مشاهده گردید و تفاوت معناداری میان میزان آلودگی نمونههای خام و پخته وجود داشت (05/0>P). در میان 92 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس، 23 جدایه (25درصد) حامل ژن کد کننده انتروتوکسین بودند. از 23 جدایه فوق، 15 جدایه (2/65درصد) حامل یک ژن مولد انتروتوکسین و بقیه حامل بیش از یک ژن بودند (جدول 2). دو جدایه دارای ژنهای SEA و SEC، دو جدایه حامل ژنهایSEA و SEE، یک جدایه حامل ژنهایSEA و SEG، یک جدایه حامل ژنهای SEC و SEI، یک جدایه حامل ژنهای SEA ،SEC و SEG و یک جدایه حامل ژنهای SEE و SEG بود.
بحث
استافیلوکوکوس اورئوس از مهمترین باکتری‌های بیماریزا برای انسان به شمار می‌رود که واجد قابلیت تجمع و تکثیر روی پوست انسان و حیوانات می‌باشد. این باکتری به راحتی از طریق زخم‌های پوستی افراد، عطسه و سرفه، خاک، آب و هوا به ماده غذایی منتقل شده و در سراسر بافت گوشت طی ذبح، فرآوری، بسته بندی، نگهداری و دستکاری پخش می‌شود. عدم رعایت اصول و موازین بهداشتی در تهیه محصولات گوشتی باعث بروز میزان قابل ملاحظه‌ای از آلودگی و شیوع گسترده مسمومیت غذایی استافیلوکوکی می‌گردد. فاصله زمانی طولانی بین آلوده شدن ماده غذایی تا زمان فروش و یا مصرف و نیز نگهداری ماده غذایی در دمای اتاق یا بالاتر از آن به مدت زیاد موجب افزایش تعداد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و تولید مقدار کافی انتروتوکسین جهت ایجاد مسمومیت غذایی می‌گردد. از آنجا که گوشت منبع غذایی غنی برای باکتری‌ها به شمار می‌رود، طی فرایند تهیه ماده غذایی به خصوص در مراکز خرد عرضه غذاهای آماده، دستکاری غیربهداشتی محصولات گوشتی، تماس با ظروف و ابزار آلوده، تماس دست و لباس آلوده افراد با ماده غذایی و نگهداری محصول در شرایط دمایی نامناسب خطر تولید انتروتوکسین و احتمال بروز مسمومیت استافیلوکوکی را افزایش می‌دهد (22).
درصد بالایی از مسمومیت‌های استافیلوکوکی در سراسر جهان در اثر مصرف گوشت خام یا پخته آلوده رخ می‌دهد چنانکه طی یک بررسی 5 ساله در کره جنوبی، علت بروز حدود یک سوم از مسمومیت‌های استافیلوکوکی مصرف فرآورده‌های گوشتی بوده است (26). در مطالعه حاضر، 68درصد از مجموع نمونههای مورد بررسی به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده بودند. میانگین تعداد باکتری در نمونههای گوشت چرخ شده خام معادل cfu/g 105×1/3 بود و میزان آلودگی در نمونههای طبخ شده که در دمای محیط و یا در یخچال ویترین اغذیه فروشی‌ها نگهداری می‌شدند به طور معناداری کمتر از نمونههای خام و برابر با cfu/g 103×7/5 بود. نتایج مشابهی توسط Tang و همکاران در سال 2017 در دانمارک به دست آمد که 69درصد از نمونههای گوشت خام عرضه شده در خرده فروشی آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس بوده اند(24). در مطالعه Rahimi و همکاران در سال 2013، 3/60درصد از نمونههای گوشت خام مورد ارزیابی در اصفهان از لحاظ آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس مثبت تشخیص داده شدند و میانگین بار آلودگی به این باکتری 102×6/2 الی cfu/g 103×8/4 بود (23). در مطالعه Al-Tarazi و همکاران در سال 2009 در اردن نیز 8/80 درصد از نمونههای گوشت خام و فرآوری شده به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده بوده و میانگین تعداد این باکتری در نمونه‌ها 102×3/5 الی cfu/g 104×2/5 بود(2)؛ لیکن در برخی دیگر از پژوهش‌ها سطح آلودگی پائین تر بوده است، به طور مثال Thapaliya و همکاران در سال 2017 میزان آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس در نمونههای گوشت و محصولات گوشتی خام در ایالت آیووا (ایالات متحده) را 8/27 درصد (25) و Marthenge و Ombui در سال 2007 میزان آلودگی را 5/10درصد گزارش نمودند(16). همچنین، در پژوهشی که توسط Zargar و همکاران در سال 2014 انجام شد 6/15درصد از نمونههای گوشت گوساله و 8/14درصد از نمونههای گوشت گوسفند مورد بررسی در تهران آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس بوده‌اند (28). در یک بررسی گسترده در پنج شهر ایالات متحده، 37درصد نمونههای گوشت گوساله آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس تشخیص داده شدند (27). تفاوت در نتایج مطالعات مختلف در خصوص بالا یا پائین بودن میزان آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس می‌تواند به علت، به ترتیب، ضعف و یا رعایت موازین بهداشتی در کشتارگاه‌های مختلف باشد. از علل آلوده بودن گوشت خام به استافیلوکوکوس اورئوس می‌توان تماس لاشه با محتویات روده یزرگ و پوست دام، تماس باسطوح، ابزار و تجهیزات آلوده (مانند چاقو، اره و چرخ گوشت) یا انتقال آلودگی از افراد را برشمرد (22)
نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که میزان آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس در گوشت خام بیشتر از محصولات گوشتی پخته می‌باشد، علت این امر، علاوه بر دلایل ذکر شده در بالا، آنست که شرایطی مانند pH و آب در دسترس در گوشت خام نسبت به محصولات گوشتی طبخ شده یا فرآوری شده برای رشد و فعالیت استافیلوکوکوس اورئوس مناسب تر است (21). علت اصلی آلودگی گوشت به این باکتری وقوع آلودگی ثانویه در اثر دستکاری گوشت توسط افراد بیمار، عدم شستن دست‌ها پیش از تماس با ماده غذایی و نگهداری طولانی مدت ماده غذایی در دمای محیط می‌باشد(5).
از آنجا که انتروتوکسین‌های استافیلوکوکی در مقادبر بسیار اندک نیز مسمومیت زا می‌باشند، بررسی وجود سویه‌های توکسین زای این باکتری به خصوص در مواد غذایی که طی فرایند دستکاری می‌شوند ضروری به نظر می‌رسد. احتمال آلودگی محصولات تهیه شده از گوشت چرخ شده از قبیل همبرگر، کباب لقمه و کباب کوبیده به انتروتوکسین‌های استافیلوکوکی قابل ملاحظه است چرا که حرارت به کار رفته طی تهیه این مواد غذایی قادر به از بین بردن انتروتوکسین‌های مقاوم به حرارت استافیلوکوکوس اورئوس نمی‌باشد. مطابق نتایج این پژوهش، از 92 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس، 23 جدایه (25درصد) حامل ژن مولد انتروتوکسین تشخیص داده شدند. وجود سویه‌های انتروتوکسیژنیک استافیلوکوکوس اورئوس در گوشت خام و محصولات گوشتی علاوه بر مطالعه حاضر در مطالعات سایر محققین نیز گزارش گردیده است. در برخی از پژوهش‌ها فراوانی سویه‌های انتروتوکسیژنیک بسیار بالاتر از کار حاضر اعلام گردیده، به طور مثال در مطالعه Marthenge و Ombui در سال 2007 فراوانی استافیلوکوکوس اورئوس حامل ژن انتروتوکسین 66درصد بوده است (16). در تحقیقی در چین نیز فراوانی جدایه‌های انتروتوکسیژنیک در نمونههای گوشت بز 8/36درصد گزارش شده است (13)، بر خلاف نتایج فوق، در مطالعه Zargar و همکاران در سال 2014 در تهران 6/17درصد از سویه‌های مورد بررسی استافیلوکوکوس اورئوس حامل ژن مولد انتروتوکسین A بوده‌ند (28). نتایج مطالعه Rahimi و همکاران در سال 2013 در اصفهان نیز نشان داد که از 223 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس، تنها 30 جدایه (3/13درصد) انتروتوکسیژنیک بوده اند(23). تفاوت در نتایج مطالعه ما با گزارشات دیگر محققین می‌تواند به علت تفاوت در روش‌های نمونه برداری، خطای افراد نمونه گیر، تعداد نمونه‌ها، فصل نمونه برداری، شرایط حمل به آزمایشگاه و روش‌های متفاوت کشت و شمارش باشد. همچنین، در برخی از تحقیقات تنها از روش‌های ایمنواسی جهت بررسی وجود سویه‌های انتروتوکسین زا استفاده شده در حالی که روش‌های دقیق تر ملکولی همچون PCR نتایج قابل اعتمادتری به دست می‌دهند.
در میان 23 جدایه انتروتوکسیژنیک، 15 جدایه (2/65درصد) حامل یک ژن مولد انتروتوکسین و بقیه حامل بیش از یک ژن بودند. دو جدایه (7/8درصد ) دارای ژنهای SEA و SEC، دو جدایه (7/8درصد) حامل ژنهایSEA و SEE، یک جدایه (35/4درصد) حامل ژنهایSEA و SEG ، یک جدایه (35/4درصد) حامل ژنهای SEC و SEI، یک جدایه (35/4درصد) حامل ژنهای SEA ،SEC و SEG و یک جدایه (35/4درصد) حامل ژنهای SEE و SEG بود. چنانچه از نتایج برمی آید، فراوانی جدایه‌های مولد انتروتوکسین A بیشتر از سایر انتروتوکسین‌ها بوده است. طبق متون منتشر شده SEA شایع ترین انتروتوکسین در سویه‌های انتروتوکسیژنیک استافیلوکوکوس اورئوس می‌باشد و بیشترین نقش را در بروز مسمومیت استافیلوکوکی بر عهده دارد (4،19). در این مطالعه ژن SEAدر میان سایر ژنهای مولد انتروتوکسین مورد ارزیابی غالب (4/30درصد) بود که این نتیجه با یافته‌های Di Giannatale و همکاران در سال 2011 در ایتالیا (3/30درصد) و نیز سایر محققین همخوانی دارد (10،18،20،23) و پس از آن ژنهای SEC (08/26درصد) و SEG (7/21درصد) بیشترین فراوانی را داشتند. ژن مولد انتروتوکسین‌های B، H و J در هیچ کدام از جدایه‌ها مشاهده نشد. در مطالعه‌ای در ژاپن، 9/17درصد از جدایه‌های استافیلوکوکوس اورئوس مولد SEA، 6/2درصد مولد SEA و SEB و 6/2درصد مولد SEA و SEC بودند (14). در مطالعه Rahimi و همکاران در سال 2013، در 18درصد جدایه‌ها ژن مولد SEG مشاهده گردید (23) که مشابه نتیجه مطالعه حاضر می‌باشد با این تفاوت که در یافته‌های ایشان ژنهای مولد SEG و SEI همزمان در جدایه‌ها وجود داشته‌اند در حالی که در این پژوهش یک جدایه حامل ژن SEI به تنهایی بود. از آنجا که ژنهای SEG و SEI در یک شاخه ژنتیکی قرار گرفته‌اند، یافتن ژن SEI بدون SEG می‌تواند به علت ایجاد جهش نقطه‌ای در ژن SEG و یا تغییر در شاخه‌ای باشد که این دو ژن در آن قرار گرفته‌اند (12).
تفاوت جدایه‌ها در توانایی تولید انتروتوکسین‌های مختلف می‌تواند به منشای بوم شناختی باکتری، طبیعت جدایه، محیط رشد و مواد مغذی در اختیار باکتری (نوع ماده غذایی) مرتبط باشد (9،13)، چنانکه در موارد مسمومیت ناشی از مواد لبنی آلوده، SEA و سپس SED بیشترین فراوانی را در جدایه داشته‌اند (15،18). نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که تعداد سویه‌های انتروتوکسیژنیک استافیلوکوکوس اورئوس در نمونههای گوشت چرخ شده در اغذیه فروشیهای استان مازندران قابل ملاحظه است و با توجه به بالا بودن تعداد مصرف کنندگان محصولات عرضه شده در این مراکز این مساله تهدیدی برای سلامت و بهداشت عمومی به شمار می‌رود.
نظر به یافته‌های این مطالعه و سایر پژوهش‌های مشابه و با توجه به ظهور سویه‌هایی از استافیلوکوکوس اورئوس که قادر به تولید انتروتوکسین‌هایی غیر از انواع کلاسیک (SEA-SEE) می‌باشند، خطر بروز مسمومیت‌های استافیلوکوکی جدی تر به نظر می‌رسد. انجام بررسی‌های گسترده تر جهت شناسایی ویژگی‌های این انتروتوکسین‌های نوظهور، تعیین نقش آن‌ها در بروز مسمومیت‌های استافیلوکوکی، عوامل مؤثر در بیان ژنهای مرتبط با آن‌ها و همچنین، بسط روش‌های مولکولی تشخیص سریع سویه‌های انتروتوکسیژنیک و یا وجود انتروتوکسین‌های جدید در کنار انواع کلاسیک در مواد غذایی جهت جلوگیری از بروز مسمومیت به خصوص در مراکز عرضه مواد غذایی نیاز است.
تشکرو قدردانی
این پژوهش در قالب پروژه تحقیقاتی با استفاده از اعتبارات ویژه پژوهشی دانشگاه تخصصی فناوری‌های نوین آمل انجام گردیده است.
تعارض در منافع
بین نویسندگان هیچ گونه تعارض در منافع گزارش نشده است.
', './data/jvr/coversheet/cover_fa.jpg'))