ارزیابی خواص آنتی اکسیدانی اسانس میوه گیاه زنیان و تأثیر آن بر پایداری اکسیداتیو روغن کانولا

روغن‌های خوراکی به‌دلیل خواص تغذیه‌ای خود و تأثیر در طعم و بوی مواد غذایی، به‌طور گسترده‌ای در صنعت مواد غذایی مورد استفاده قرار گرفته‌اند. در میان آن‌ها، روغن کانولا یکی از مهم‌ترین روغن نباتی در بازار جهان است. روغن کانولا خام غنی از منابع اسید‌های چرب امگا3، آنتی اکسیدان‌ها (پلی فنل‌ها، توکوفرول‌ها، استرول‌ها، کاروتنوئیدها) و دیگر مواد مغذی ضروری برای سلامت انسان می‌باشد(30). از سوی دیگر، مقدار بسیار کمی از یون‌های فلزی در روغن کانولا خام، بر پایداری اکسیداتیو آن تأثیر منفی دارد، که مربوط به چندین پارامتر فیزیکوشیمیایی و خواص حسی روغن می‌باشد. یون‌های فلزی (مس، منگنز، آهن) به عنوان کاتالیزور پرواکسیدان‌ها، هیدروپراکسید‌ها را به رادیکال‌های آزاد و محصولات اکسیداسیون ثانویه مانند آلدئیدها، کتون‌ها، اسیدها و اپوکسید‌ها تجزیه می‌کنند(17). با این حال، در طول فرآیند تصفیه روغن کانولا خام در جهت کاهش فلزات پرواکسیدانی و دیگر عناصر(یون‌های کلسیم، منیزیم، سدیم، پتاسیم)، مقدار زیادی از آنتی اکسیدان‌ها مانند پلی فنل‌ها، توکوفرول‌ها، استرول‌ها و کاروتنوئیدها از بین می‌روند، در نتیجه جهت حفظ پایداری روغن به آن‌ها مواد آنتی اکسیدان سنتزی اضافه می‌کنند (10،11،30،33).  فرآیند اکسیداسیون یکی از مسیرهای مهم برای تولید رادیکال‌های آزاد در مواد غذایی، داروها و حتی بدن انسان است. آنتی اکسیدان‌های سنتزی در حال حاضر، بوتیلات هیدروکسی انیزول ((BHA (Butylated Hydroxy Anisole)، بوتیلات هیدروکسی تولوئن  ((BHT( Butylated Hydroxy Toluene) بوتیل هیدروکینون‌ها و استرهای اسید گالیک می‌باشند، که مشکوک به علت و یا تسریع اثرات منفی بر سلامت‌اند. از این‌رو، محدودیت قوی در روند استفاده آن‌ها وجود دارد و برنامه جایگزین آن‌ها با آنتی اکسیدان‌های طبیعی وجود دارد (24). فعالیت آنتی اکسیدانی گیاهان ممکن است به علت ترکیبات فنلی خود ‌باشد(6).گیاه زنیان متعلق به خانواده چتریان و بومی مناطق با خاک شور، خشک و نیمه خشک است (3،14،19)، و به‌طور گسترده‌ای درهند، عراق، ایران، افغانستان، پاکستان و مصر کشت و توزیع شده است. ادویه دانه این گیاه از نظر دارویی بسیار با ارزش است. میوه آن دارای طعم و مزه تلخ و تند می‌باشد، از اسانس آن برای عطر، حفظ مواد غذایی و در پزشکی استفاده می‌شود (3،21). جزء اصلی اسانس زنیان، تیمول (35- 60درصد) است، به جزء تیمول شامل، پارا سیمن، گاما ترپنین، آلفا پینن، بتا پینن و به‌طور جزئی از دیگر ترکیبات می‌باشد(34). Gandomi و همکاران در سال  2014، ترکیبات شیمیایی اسانس زنیان بوسیله کروماتوگرافی گازی مجهز به اسپکترومتر جرمی مورد بررسی قرار دادند که تیمول (4/63درصد)، پارا سیمن (19درصد) و گاما ترپنین (9/16درصد) به‌عنوان اجزای اصلی اسانس شناسایی شدند، و نشان دادند که اسانس زنیان فعالیت ضد میکروبی و آنتی اکسیدانی قوی دارد که می‌توان از آن برای غذاهایی با چربی بالا و فاسد شدنی بخوبی استفاده کرد. همچنین فعالیت آنتی اکسیدانی اسانس با روش 2،2- دی فنیل- 1- پیکریل هیدرازیل (◦DPPH) با 50IC (غلظتی از ترکیب است که باعث 50درصد بازدارندگی در ظرفیت رادیکالی می‌شود) به میزان µg/ml 34 ارزیابی کردند، در روش بتاکاروتن/اسیدلینولئیک نتایج نشان دادند که، اسانس به‌طور مؤثری قادر به مهار اکسیداسیون اسید لینولئیک به میزان 16/82 درصد بود که مشابه با BHT می‌باشد(9). Hashemi و همکاران در سال 2014، از غلظت‌های مختلف (025/0، 05/0 و 075/0درصد) اسانس زنیان بر پایداری اکسیداتیو روغن آفتابگردان استفاده و با BHA و BHT در طی دمای ذخیره سازی 37 و 47 درجه سانتی‌گراد مقایسه کردند و نشان دادند که همه غلظت‌های اسانس در مقایسه با BHA و BHT اثر آنتی اکسیدانی دارند و نتیجه گرفتند که اسانس می‌تواند به عنوان یک آنتی اکسیدان طبیعی در چربی‌های مواد غذایی استفاده شود(12). با وجود تحقیقات متعدد بر روی خواص آنتی اکسیدانی اسانس میوه گیاه زنیان،  منابع اندکی در مورد خصوصیات آنتی اکسیدانی این اسانس در سامانه غذایی مثل روغن کانولا نسبت به روغن آفتابگردان با توجه به درصد بالای اسیدهای چرب خانواده امگا 3 وجود دارد. لذا ضرورت شناخت اثرات آنتی اکسیدانی این گیاه برای استفاده صنعتی و جایگزینی با آنتی اکسیدان‌های سنتزی می‌باشد. هدف از این تحقیق استفاده از اسانس میوه گیاه زنیان در پایداری اکسایشی روغن کانولا بود.

مواد و روش‌ کار

مواد گیاهی: اسانس زنیان از شرکت گل قطره توس (مشهد، ایران) در شیشه‌های نفوذناپذیر به هوا خریداری گردید و ترکیبات تشکیل دهنده‌ی آن با دستگاه GC/MS تعیین شد.

روغن: روغن کانولا (تصفیه شده، بی رنگ شده، بی بو شده و بدون آنتی اکسیدان) از کارخانه روغن نباتی بهشهر  تهیه گردید.

مواد شیمیایی: تمام مواد شیمیایی و حلال‌های مورد استفاده با درصد خلوص بالا از شرکت مرک آلمان، و رادیکال آزاد ◦DPPH، بتا کاروتن، لینولئیک اسید، بوتیلات هیدروکسی تولوئن (BHT) از شرکت سیگماآلدریچ تهیه شدند، تمام مواد شیمیایی با خلوص بالا بدون هیچ گونه خالص سازی مجدد مورد استفاده قرارگرفتند.

تجزیه اسانس زنیان توسط GC/MS: اسانس توسط دستگاه گاز کروماتوگرافی متصل به طیف سنج جرمی (GC/MS) تجزیه شد. دستگاه GC/MS از نوع Thermo Quest Trace GC 2000 FINNIGAN (انگلستان) بود. شناسایی اجزاء از طریق مقایسه مدت زمان بازداری مجموعه‌ای از n- آلکان‌ها (شاخص بازداری نسبی) صورت گرفت و نیز نتایج شاخص بازداری نسبی و طیف جرمی ترکیبات، با نمونه‌های مرجع (استانداردها) مقایسه گردید(2).

سنجش خاصیت آنتی رادیکالی با آزمون 2و2- دی فنیل،1- پیکریل هیدرازیل (◦DPPH): فعالیت آنتی رادیکالی اسانس، با استفاده از رادیکال‌های پایدار ◦DPPH که یک ترکیب رادیکالی پایدار است، به عنوان معرف انجام گرفت. در این آزمون، رادیکال چربی دوست ◦DPPH با آنتی اکسیدان‌های دهنده ی هیدروژن واکنش داده و به شکل کاهش یافته در می‌آید و رنگ آن از بنفش تیره به زرد روشن تبدیل می‌گردد و در نتیجه میزان جذب در طول موجnm 517 کاهش می‌یابد. در این آزمایش اسانس در غلظت‌های 10، 20، 40 و 80 (ppm) و BHT به عنوان کنترل مثبت در غلظت‌های 5، 10، 20 و 40 (ppm) تهیه گردید. سپس غلظت 004/0 درصد از ◦DPPH در متانول حل گردید و بعد µl 50 از غلظت‌های مختلف اسانس به آن اضافه گردید. بعد از 30 دقیقه در دمای محیط و در تاریکی، نگهداری شد. سپس جذب نوری محلول در طول موج nm  517 برعلیه کنترل، با استفاده از اسپکترو فتومتر خوانده شد و از متانول خالص برای صفر کردن دستگاه استفاده گردید. سپس درصد مهار رادیکال‌های آزاد ◦DPPH یا میزان فعالیت حذف کنندگی رادیکال اسانس Radical Scavenging Activityا(RSA) با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید:

درصد100 × [RSA =[( A_control - A_sample) / A_control

در این رابطه:

Asample میزان جذب نمونه؛ Acontrol میزان جذب کنترل منفی، RSA فعالیت گیرندگی رادیکال است،کنترل منفی: فاقد اسانس و تنها حاوی 004/0درصد ◦DPPH در متانول و RSA فعالیت حذف کنندگی رادیکال را نشان داده و بیان گر فعالیت آنتی اکسیدانی و درصد بازدارندگی است.به جهت بررسی بهتر فعالیت آنتی رادیکالی اسانس، از شاخص 50 ICاستفاده شد که بیان‌گر غلظتی از اسانس که قادر به کاهش غلظت رادیکال آزاد ◦DPPH اولیه به 50درصد مقدار اولیه است، همچنین از آنتی اکسیدان سنتزی BHA به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید و کلیه آزمایش‌ها سه بار تکرار شدند(18).

تعیین فعالیت آنتی اکسیدانی اسانس زنیان به روش بی رنگ شدن بتا کاروتن: برای انجام آزمایش ابتدا یک محلول پایه از بتاکاروتن- لینولئیک اسید به صورت زیر تهیه گردید:

5mg/0بتاکاروتن در ml 1 کلروفرم حل شد و سپس به فلاسک ته‌گردی که حاوی µl 25 لینولئیک اسید و mg 200 توئین 40 بود اضافه شد و کاملاًً مخلوط گردید. سپس در دمای محیط با استفاده از دستگاه تبخیرکننده چرخان تحت خلاء،کلروفرم به طور کامل تبخیر و خارج گردید، سپس ml 100 آب مقطر اشباع شده از اکسیژن (30دقیقه تحت فشارml/min 100) به فلاسک افزوده گردید و فلاسک برای تشکیل امولسیون به شدت همزده شد. سپس µl 2500 از محلول تهیه شده فوق به لوله‌های آزمایشی که حاوی µl 350 از اسانس و استاندارد BHT (غلظت g/l 2 در اتانول HPLC grade) بود اضافه گردید، بلافاصله درزمان صفر جذب نمونه‌ها در طول موج nm 490 خوانده شد. سپس لوله‌های آزمایش به مدت 48 ساعت در دمای اتاق گرمخانه‌گذاری و جذب نوری نمونه‌ها درnm 490 خوانده شد. در این آزمایش BHT به عنوان کنترل مثبت، و کنترل منفی فاقد آنتی اکسیدان یا اسانس (فقط حاوی µl 350 اتانول)بود و میزان فعالیت آنتی اکسیدانی از مقایسه جذب نوری نمونه‌ها با زمان صفر و از روی میزان پایداری رنگ زرد بتا کاروتن به صورت درصد مورد سنجش قرار گرفت(25).

فعالیت آنتی رادیکالی نمونه‌ها با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید:

100 ×(₍₄₈₎ A_control-₍₀₎ A_control)/ (₍₄₈₎ A_control-₍₄₈₎ A_sample)ا= Iدرصد

درصدI = درصد بازدارندگی، A_sample(48) = جذب نمونه بعد از 48 ساعت، = A_control(0)جذب کنترل در زمان صفر و A_control(48) = جذب کنترل بعد از 48 ساعت

بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی اسانس مورد آزمون در روغن کانولا: شیشه‌های حاوی روغن در گروه‌های جداگانه تهیه و اسانس در غلظت‌های مختلف به روغن.افزوده شد. اسانس هر کدام در سه تیمار (ppm 200، 400، 800) و آنتی اکسیدان سنتزی BHT (کنترل مثبت) در دو تیمار(ppm 100، 200) به روغن کانولا بدون آنتی اکسیدان، در شیشه‌های تیره رنگ اضافه گردید و درب شیشه‌ها بسته شد. سپس نمونه‌ها به همراه کنترل منفی (روغن کانولا بدون افزودن اسانس وآنتی اکسیدان سنتزی) برای مدت 49 روز در انکوباتوردر دمای 3±60 درجه سانتی گراد، در غیاب نور نگهداری شد. هر هفته ضمن همزدن روغن‌ها، مقادیر عدد پراکسید و تیوباربیتوریک اسید نمونه‌های روغن اندازه گیری شد. آزمایشات به مدت 49 روز در روزهای 0، 7، 14، 21، 28، 35،42 و 49 تکرار گردید.

روش تعیین عدد پراکسید روغن (Peroxide value): برای تعیین عدد پراکسید، g 2 روغن در ml 30 استیک اسید و کلروفرم (به نسبت 3 به 2) حل گردید. سپس ml 1 محلول اشباع یدید پتاسیم به آن افزوده شد. بعد از 1 دقیقه نگهداری در تاریکی، ml 30 آب مقطر به آن اضافه شد و محلول ساخته شده به وسیله تیوسولفات سدیم 02/0 نرمال در حضور محلول نشاسته 1درصد به‌عنوان معرف تا از بین رفتن رنگ آبی تیتر گردید. تمامی مراحل فوق برای شاهد بدون افزودن روغن به صورت موازی انجام گردید.

عدد پراکسید با استفاده از فرمول زیر بر حسب میلی اکی والان پراکسید در هر کیلوگرم (meq/kg ) روغن محاسبه گردید:

W/(N×ا(s2-s1)100 =(meq/kg)اPV

در رابطه‌ی فوق S1 میزان میلی لیتر مصرفی تیوسولفات سدیم برای تیتراسیون نمونه، S2 میزان میلی لیتر مصرفی تیوسولفات سدیم برای تیتراسیون کنترل،N  نرمالیته تیوسولفات سدیم مصرفی وw وزن روغن مورد آزمایش می‌باشد(25).

روش تعیین عدد اسید تیوباربیتوریک ((TBARS( Thiobarbituric acid- reactive Substances): تعیین عدد TBARS به روش AOCS (1998)،انجام گرفت. در این آزمون مقدار mg 50 از نمونه روغن درml 10، 1- بوتانلحل شد، سپس ml 10 از محلول 2/0درصد تیوباربیتوریک اسید در1- بوتانل به آن اضافه گردید و برای مدت 2 ساعت در بن ماری 95 درجه قرار داده شد و پس از آن به مدت 10 دقیقه سرد گردید (زیر شیرآب)، سپس جذب محلول در طول موج nm 532 توسط دستگاه طیف سنج نوری در مقابل بلانک قرائت شد و عدد  TBARSبر مبنای "میلی مول مالون دی آلدئید درگرم روغن" گزارش گردید، آزمایشات سه بار تکرار و میانگین آن‌ها گزارش شد(25).

تجزیه و تحلیل آماری: داده‌ها با آزمون (One-Way ANOVA) با استفاده از نرم افزار آماری  SPSS 16آنالیز شدند، و رسم نمودارها با نرم افزار EXCEL صورت گرفت. 50 ICبا استفاده از نرم افزار M و مقایسه میانگین‌ها با استفاده از روش حداقل تفاوت‌های معنی‌دار (LSD) تعیین گردید، و تمامی نتایج به صورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار بیان شد.

نتایج

بررسی ترکیبات شیمیایی اسانس زنیان: درصدترکیبات با استفاده از مساحت پیک حاصل از آشکارساز یونیزاسیون شعله‌ای (FID) محاسبه شد، با شناسایی پیک‌های به دست آمده توسط دستگاه کروماتوگرافی به کمک شاخص بازداری و مقایسه‌ی آن‌ها با مقادیری که در منابع مختلف منتشر گردیده و نیز با استفاده از اطلاعات موجود در کتابخانه رایانه‌یGC/MS، 11ترکیب در مجموع83/94درصد در اسانس زنیان شناسایی شد (جدول 1). ترکیبات عمده آن عبارت‌اند از: تیمول (Thymol)(4/36 درصد)، گاماترپینن (γ -Terpinene) (73/21 درصد)  وپاراسیمن(ρ-Cymene) (4/31 درصد) بودند، که سه ترکیب فوق بیش از 53/89 درصد اسانس را تشکیل می‌دادند، البته به میزان کمتری ترکیباتی مثل بتا پینن(β -pinene)، کاروون(Carvone) وکارواکرول (Carvacrol) نیز مشاهده شد.

قدرت مهار رادیکال آزاد ◦DPPH: تصویر1 فعالیت آنتی اکسیدانی BHTبه عنوان کنترل مثبت برای اسانس زنیان در این آزمون را نشان می‌دهد، و با توجه به تصویر 2، می‌توان دریافت ارتباط مستقیمی بین غلظت‌های مختلف اسانس گیاه زنیان با قدرت مهار رادیکال آزاد (Iدرصد) آن‌ها وجود دارد و با افزایش غلظت اسانس، قدرت مهار رادیکال آزاد نیز افزایش پیدا می‌کند .همچنین با استفاده از آزمایش ◦DPPH، 50 ICاسانس زنیان وBHT  بدست آمد ، فاکتور50IC نسبت معکوسی با فعالیت آنتی رادیکالی اسانس دارد. بدیهی است که هرچه عدد 50 ICکوچکترباشد قدرت آنتی اکسیدانی یا مهار رادیکال‌های آزاد بیشتر می‌باشد. همان‌گونه که مشاهده می‌شود، اسانس با (µg/ml) 50 IC (2/0±21) در مقایسه با BHT (8/1±5/4) به‌عنوان کنترل مثبت، در مهار رادیکال‌های آزاد توسط ضعیف‌تر عمل کرده است (05/0>P)، به نظر می‌رسد در واکنش اکسایش- احیا با اکسیدانت، اسانس زنیان قدرت الکترون‌دهی کمتری نسبت به BHT دارد. همان‌گونه که مشخص شد با افزایش غلظت در محدوده غلظتی بکار رفته شده، فعالیت گیرندگی رادیکال ◦DPPH افزایش و سرعت بی‌رنگ شدن ◦DPPH در حضور آن کاهش می‌یابد.

آزمون بتاکارتن- لینولئیک اسید: در این آزمون فعالیت آنتی اکسیدانی اسانس بر اساس توانایی آن در جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدها و کاهش اکسیداسیون در سیستم امولسیون بتاکارتن / لینولئیک اسید ارزیابی شد. با توجه به تصویر 3، اسانس زنیان در مقایسه با BHT، 41/1 ±3/81 درصد بازدارندگی را نشان داد. بیشترین اثر آنتی اکسیدانی در سامانه بی‌رنگ شدن بتاکاروتن مربوط به BHT در غلظت mg/ml 2 بود، هیچ اثری در گروه کنترل دیده نشد. علت کاهش فعالیت آنتی اکسیدانی اسانس در مقایسه با BHT می‌تواند ناخالصی‌های موجود در اسانس و عوامل دیگر نظیر کمتر بودن ترکیبات فنولی و اکسیژن‌دار باشد.

بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی اسانس درروغن کانولا: جهت سنجش این فعالیت، تیمارها به شیشه‌های روغن کانولا بدون آنتی اکسیدان افزوده شد واعداد پراکسید و تیوباربیتوریک اسید در روزهای 0، 14، 7، 21، 28، 35، 42و 49 اندازه‌گیری گردید.

اثرآنتی اکسیدانی اسانس بر عدد پراکسید (pv): در طول مدت نگهداری، پارامتر pv در تمام غلظت‌های اسانس افزایش یافت ولی این افزایش در مورد گروه کنترل بیشتر از بقیه گروه‌ها بود واز روز 7 به بعد بین تمام گروه‌های تیمار شده با اسانس و کنترل از لحاظ آماری، این افزایش معنی‌دار می‌باشد (05/0>P) و روغن‌های حاوی اسانس نسبت به کنترل، pvکمتری نشان دادند. با افزایش غلظت اسانس اثر آنتی اکسیدانی بهتری مشاهده شد و قوی‌ترین اثر آنتی اکسیدانی مربوط به غلظت ppm 600 اسانس بود که شکل گیری هیدرو پراکسیدها را به طور معنی‌دار به تعویق انداخت (05/0>P) و با افزودن آن به روغن کانولا، عدد نهایی پراکسید بعد از 35 روز کاهش یافت. ولی BHT در هر دو سطح غلظتی (100 و200ppm) از روز 7 تا 21 به طور معنی‌دار عدد پراکسید کمتری نسبت به سایر غلظت-های اسانس نشان داد ولی از روز 21 تا آخردوره آزمایش اثر آنتی اکسیدانی اسانس در غلظت ppm 600 قابل قیاس با BHT در هر دو سطح غلظتی بود و اختلاف معنی‌داری بین اعداد پراکسید مشاهده نگردید) (05/0>P). اBHT در هر دو سطح غلظتی100 و200 ppm، به‌صورت معنی‌دار در طی دوره آزمایش تا پایان دوره از تمامی تیمارها قدرت آنتی اکسیدانی بیشتری را نشان داد (05/0>P) و بعد از آن غلظت 400 و600 ppm اسانس قرار گرفت. فعالیت آنتی اکسیدانی با عدد پراکسید نسبت عکس دارد، هر چه فعالیت آنتی اکسیدانی بیشتر باشد، عدد پراکسید روغن پایین‌تر است. همان‌گونه که ملاحظه می‌کنید، عدد پراکسید روغن وابسته به غلظت تیمارها است و با افزایش غلظت تیمارها (تا اندازه‌ای که اثرات پرواکسیدانی نداشته باشد)، عدد پراکسیدکاهش و در نتیجه اثرات آنتی اکسیدانی افزایش می‌یابد (05/0>P) و یک رابطه خطی بین غلظت اسانس‌ها و عدد پراکسید وجود دارد. به طوریکه در مورد اسانس میان سطوح غلظتی اختلاف معنی‌دار مشاهده شد (05/0>P) و با افزایش غلظت اسانس بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی آن اضافه شد. بامقایسه ی عدد پراکسید حاصل شده از اثرات اسانس در سه سطح غلظتی با BHT، می‌توان اینگونه استدلال کرد که اسانس زنیان درسطوح غلظتی ppm 400 و600 به ترتیب معادل با BHT درسطوح غلظتی ppm 100 و200 عمل نموده است. ولی اختلاف عدد پراکسید حاصل شده از اثرات آنتی اکسیدانی سایر تیمارها در سطح غلظتی ppm 200 در مقایسه با BHT در دو سطح، معنی‌دار بوده و نشان دهنده این امر می‌باشد که درطی 49 روز اثرات آنتی اکسیدانی BHT بالاتر از سایر تیمارها در سطح غلظتی ppm  200 بوده وقوی‌ترازآن عملکرده است. باتوجه به آزمون انجام گرفته می‌توان دریافت که اثرات آنتی اکسیدانی BHTدر سطح غلظتی ppm 200 و اسانس زنیان به ترتیب در سطح غلظتی ppm 400 و 600 درجلوگیری از تشکیل پراکسید بیشتر از سایر تیمارها بود و از نظرآماری تفاوت معنی‌داری نداشتند. بنابراین با کنترل روند تشکیل پراکسید می‌توان اینگونه استنباط کرد که سرعت اکسیداسیون در نمونه‌ی کنترل بالاترین مقدار را دارد، بنابراین تمامی نمونه‌های حاوی آنتی اکسیدان در برابر اکسیداسیون پایدارتر ازنمونه‌ی کنترل می‌باشند (تصویر 4).

اثرآنتی اکسیدانی اسانس زنیان بر عدد تیوباربیتوریک اسید(TBARS):  نتایج TBARS بسیار مشابه عدد پراکسید بود، تا روز7 بین کنترل و غلظت‌های اسانس اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد (05/0<P) واز روز 7 به بعد عدد تیوباربیتوریک اسید در کنترل به طور معنی‌دار (05/0>P) از تمام غلظت‌های اسانس بالاتر بود. BHT در غلظت  ppm200 مانند شاخصپراکسید به طور معنی‌دار در طی دوره آزمایش از غلظت‌های 200 و 400 ppm اسانس قدرت آنتی اکسیدانی بیشتری را نشان داد (05/0>P). نکته جالبتوجه این بود که از روز 21 تا روز پایانی آزمایش، اختلاف معنی‌داری بین سطوح غلظتی200BHT  و ppm 600 اسانس و همچنین 100 BHT و ppm 400 اسانس دیده نشد(05/0<P).اسانس زنیان از اواسط دوره تقریباًً معادل آنتی اکسیدان سنتزی BHT عمل کرده بود. اسانس ppm 200 از روز 14، بعد از کنترل بیشترین مقدار  TBARSرا به خود اختصاص داد وکمترین اثر بازدارندگی را از خود نشان داد، که این نتایج، مانند عدد پراکسید به ارتباط غلظت واثر آنتی اکسیدانی اشاره می‌کند. در مورد کنترل، از روز 14 با ارزیابی میزان عدد TBARS تفاوت معنی‌داریبا بقیه گروه‌ها داشت و قدرت آنتی اکسیدانی آن ضعیف‌تر از بقیه تیمارها بود(05/0>P). تمام تیمارها به طور معنی‌دار نسبت به کنترل، عدد تیوباربیتوریک اسید کمتری را نشان دادند. دراسانس زنیان، میان سطوح غلظتی اختلاف معنی‌دار مشاهده شد (05/0>P). با مقایسه عدد TBARS به دست آمده از اثرات اسانس زنیان با BHT، می‌توان اینگونه استدلال کرد که اسانس زنیان درسطح غلظتی ppm 400 معادل با BHT درسطح غلظتی ppm 100 عمل نموده است و اثرات آنتی اکسیدانی اسانس زنیان، درسطح غلظتی ppm 600 درمقایسه با BHT در دو سطح، معنی‌داربوده و قوی‌ترازآن عملکرده است. باتوجه به نتایج به دست آمده از این آزمون می‌توان گفت که در بین همه تیمارهای مورد بررسی در این آزمون، بیشترین میزان فعالیت آنتی اکسیدانی و بیشترین میزان جلوگیری از تولید محصولات ثانویه اکسیداسیون مربوط به غلظتppm  600 اسانس زنیان بوده که معادل با BHT در ppm 200 است (تصویر 5). باتوجه به روند تشکیل TBARS می‌توان اینگونه استنباط کرد که سرعت اکسیداسیون درنمونه‌ی کنترل بالاترین مقدار را دارد، در نتیجه تمامی نمونه‌های حاوی آنتی اکسیدان در برابر اکسیداسیون پایدارتر از نمونه‌ی کنترل می‌باشند وکنترل بیشترین عدد اسید تیوباربیتوریک را دارا می‌باشد.

جدول 1- ترکیبات تشکیل دهنده اسانس زنیان (تعیین شده باGC/MS )

Table 1.The composition of C. copticum EOs identified by GC/MS

بحث

اکسیداسیون چربی یکی از علل عمده از بین رفتن کیفیت مواد غذایی در طول نگهداری روغن، و دیگر مواد غذایی حاوی چربی است. علاوه بر این، محصولات حاصل از اکسیداسیون لیپیدها سمی و ممکن است عوارض جانبی نظیر سرطان زایی، جهش زایی و پیری را داشته باشد. در سال‌های اخیر تولیدکنندگان مواد غذایی توجه زیادی به استفاده از نگه‌دارنده‌های طبیعی با منشا گیاهی به‌جای نگه‌دارنده‌های شیمیایی در محصولات خود نموده‌اند‌. این امر به‌دلیل تمایل زیاد مصرف‌کنندگان به استفاده از مواد غذایی فرآوری شده با نگه‌دارنده‌های طبیعی می‌باشد.در تحقیقی Zarshenas و همکاران در سال 2014 نشان دادند که، تیمول،گاماترپینن وپاراسیمن بیشترین میزان  ترکیبات اسانس زنیان را تشکیل دادند(35). Hashemi و همکاران در سال2011 عمده  ترکیبات تشکیل دهنده اسانس زنیان را تیمول،گاما ترپینن و پارا سیمن گزارش کردند که بیشترین درصد تشکیل دهنده تیمولبود(12).  مشاهده می‌گردد که نتایج آنالیز اسانس در هر دو مطالعه قرابت بسیاری با هم دارند، وکار آن‌ها تطابق زیادی با مطالعه ما داشته است. Reichert و همکاران در سال 1998، گزارش کردند که ترکیبات اسانس حاصل از قسمت‌های مختلف گیاه متفاوت است و در مراحل مختلف رسیدن گیاه به‌طور قابل ملاحظه تغییر می‌کند(22). با توجه به تحقیق حاضر در زمینه خواص آنتی اکسیدانی اسانس و مطالعات سایر محققین، نشان داده شد که ترکیبات عمده اسانس گونه‌های جنس زنیان، از مونوترپن‌های فنلی مثل تیمول و مونوترپن‌های هیدروکربنی مثل گاما ترپینن می‌باشند که اغلب به همراه پاراسیمن و لینالول وجود دارند و این گروه ازترکیبات، دارای خواص آنتی اکسیدانی و آنتی میکروبی می‌باشند(26). در کل، نتایج آنالیز اسانس زنیان در تحقیق ما از دیدگاه ترکیبات، منطبق با نتایج سایر محققین بود. البته نوع ترکیبات عمده و درصد آن‌ها در اسانس مورد مطالعه، در مقایسه با سایر بررسی‌های انجام گرفته متفاوت است که می‌تواند به شرایطی نظیر شرایط محیطی وفصلی (شرایط خاک، آب و هوا)، نوع کشت، زمان برداشت، منطقه جغرافیایی رویش، رقم، سن گیاه (5) و در نهایت تفاوت ژنتیکی گیاه، وابسته باشد(8). Espin و همکاران (2000) ظرفیت حذف کنندگی رادیکال57 اسانس از 14 منبع مختلف را با استفاده از رادیکال ◦DPPH تعیین نمودند، در گزارش آن‌ها آمده ظرفیت در صورت بالا رفتن غلظت به صورت خطی و با ضریب همبستگی بالا، افزایش می‌یابد(7). Shahsavari و همکاران در سال 2008نیز نتایج مشابه‌ی در مورد اسانس زیره کوهی در آزمون رادیکال◦DPPH به‌دست آوردند(27). Kordali و همکاران در سال 2005، فعالیت آنتی رادیکالی اسانس ترخون (.Artemisia dracunculusL) را در 4 سطح غلظتی 100،200، 400 و 1000 ppm بررسی نمودند و طبق پژوهش آن‌ها درصد فعالیت گیرندگی رادیکال به ترتیب  4، 8، 10 و18 درصد به‌دست آمد(16). Zhang و همکاران  در سال 2006 ، در مطالعه‌ای مشابه، اعلام کرد که اسانس جعفری .Petroselinum crispum L در غلظت512/0 فعالیت آنتی اکسیدانی نزدیک باBHT  در غلظت 1/0 درصد دارد(36) . بنابراین می‌توان نتیجه گرفت، با افزایش غلظت، فعالیت آنتی اکسیدانی افزایش معنی‌داری می‌یابد که این امر می‌تواند ناشی از تأثیر افزایش درصد مواد اثرگذار و نیز افزایش محتوای فنول کل آن‌ها باشد. فعالیت گیرندگی رادیکال آزاد اسانس نیز، به‌صورت شاخص50IC بیان شد. در مطالعات انجام شده،Tepe و همکاران در سال 2005، مقدار 50 IC اسانس Lا Cyclotrichium origanifolium، µg/ml17100 برآورد کردند که نشانگر فعالیت آنتی رادیکالی نسبتاًً کم این اسانس می‌باشد(31). در مطالعه‌ای دیگر Kamkar و همکاران  در سال 2010، 50IC اسانس پونه را µg/ml 5±1765 وغلظت مهاری50 درصد اسانس شوید راµg/ml 41000 گزارش کردند(15). با توجه به نتایج به دست آمده از آزمون ◦DPPH در مقایسه با اسانس و استانداردهای کار شده درمطالعات دیگران، مشخص شد که اسانس زنیان دارای فعالیت آنتی اکسیدانی متوسطی نسبت به BHTاست و به‌دلیل کمتر بودن مقدار50IC، فعالیت آنتی رادیکالی نسبتاًً خوبی را نسبت به سایر گیاهان دارویی نشان داد و در مهار رادیکال‌ها تقریباًً در سطح بالایی عمل کرده است.نتایج تحقیق حاضر نشان داد که اسانس زنیان فعالیت آنتی اکسیدانی قابل توجهی دارد. با توجه به کار سایر محققین، می‌توان با افزایش غلظت، اثر سایر عوامل راکم‌رنگ‌ترکرد. تیمول،کارواکرول،گاماترپینن وپاراسیمن عمده‌ترین ترکیبات موجود در اسانس مورد مطالعه بوده‌اند،  نقش کلیدی آن‌ها بخصوص ترکیب‌های فنلی به عنوان حذف کننده‌های رادیکال‌های آزاد در چندین مطالعه گزارش شده است(32). Oke و همکاران  در سال 2009، ویژگی‌های آنتی اکسیدانی اسانس Satureja cuneifolia Ten را مورد بررسی قرار دادند و درصد بازدارندگی اسانس و BHT را به ترتیب 3/0 ± 5/84 درصد و 100گزارش کردند. نتایج نشان داد که علت بالا بودن فعالیت آنتی اکسیدانی اسانس، به علت حضور ترکیب فنولی کارواکرول، پاراسیمن، تیمول و گاما ترپینن است(20)، که این ترکیبات در اسانس مورد استفاده در این تحقیق هم وجود داشت. براساس نتایج بدست آمده ازGC/MS، یکی ازترکیب‌های عمده تشکیل دهنده اسانس زنیان، منوترپن هیدروکربنه گاماترپینن است. Ruberto و Baratta در سال 2000 گزارش کردند، دلیل فعالیت آنتی اکسیدانی بالای گاماترپینن، وجود گروه‌های متیلن فعال در ساختار آن است، این گروه‌ها با گروه‌های متیلن  C- 11اسید لینولئیک رقابت می‌کنند و مانع از اکسیداسیون اسید لینولئیک می‌شوند(23). با مطالعه و بررسی نتایج دیگران و مقایسه آن‌ها با نتایج این پژوهش می‌توان دریافت که بین نتایج بدست آمده از دو روش مورد استفاده، ارتباط مستقیم و مثبتی وجود دارد.

Abdalla و Roozen در سال 1999 اثر آنتی اکسیدانی عصاره مریم گلی را در روغن آفتابگردان بررسی کردند. عصاره مریم گلی در غلظت ppm 1200 بالاترین فعالیت آنتی اکسیدانی را نشان داد و فعالیت آن قابل مقایسه با آنتی اکسیدان سنتزی BHT در غلظت ppm 300 بود(1).Bera و همکاران در سال 2006 اثر آنتی اکسیدانی عصارهAjowan (ادویه مورد استفاده در هند) را در روغن بزرک بررسی و با آنتی اکسیدان‌های سنتزی مقایسه کردند این عصاره فعالیت آنتی اکسیدانی بالایی در روغن بزرک نشان داد که به دلیل حضور تیمول در آن بود. فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره نسبت به BHA و BHT بیشتر ولی نسبت به TBHQ کمتر بود. این محققان عصاره Ajowan را به عنوان آنتی اکسیدان طبیعی پیشنهاد کردند؛ زیرا علاوه بر بهبود پایداری روغن، ارزش غذایی آن را نیز افزایش می‌دهد(4). Singh و همکاران در سال 2006 اثر آنتی اکسیدانی عصاره رازیانه را در روغن بزرک بررسی کردند. نتایج نشان داد، عصاره سرعت اکسیداسیون روغن بزرک را کاهش می‌دهد. این محققان گزارش کردند فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره به دلیل اثر تشدید کنندگی بین ترکیب‌های فنولی موجود در آن بود(29). در ارتباط با بررسی خاصیت آنتی اکسیدانی اسانس‌ها، Singh و همکاران در سال 2006 فعالیت آنتی اکسیدانی اسانس Carumnigrum را با استفاده از آزمون آون در روغن خردل بررسی کردند اسانس با غلظت ppm 200 به روغن خردل اضافه شد و تغییرات عدد پراکسید و اندیس اسید تیوباربیتوریک در دمای C°60، به مدت 28 روز بررسیشد. نتایج نشان داد اسانس قادر به کاهش سرعت اکسیداسیون روغن خردل در شرایط تسریع شده بوده و قابل مقایسه با آنتی اکسیدان‌های سنتزی BHA و BHT درغلظت02/0درصد می‌باشد(28). Iqbal و Bhanger در سال 2007، در مطالعه‌ای که روی اثرات آنتی اکسیدانی عصاره‌ی سیر در پایداری روغن آفتابگردان در دمای تسریع شده (65 در جه سانتی گراد)، در طول 24 روز انجام دادند به فعالیت بالای آنتی اکسیدانی عصاره در غلظت ppm 1000 در مقایسه با BHA وBHT در غلظت ppm 200 پی بردند که سبب افزایش پایداری روغن در مرحله‌ی اولیه‌ی اکسیداسیون می‌شود(13). در این تحقیق نشان داده شد که اسانس زنیان در سطح غلظتی ppm 400 قادر به مهار اکسیداسیون اولیه و ثانویه در روغن کانولا در طول نگهداری می‌باشد ودر برخی از هفته‌های آزمایش بین این غلظت با BHT اختلاف معنی‌داری دیده نشد. در ارتباط با سایر تیمارها در مهار اکسیداسیون، از نظر آماری به طور معنی‌دار ضعیف‌تر از BHT در سطح غلظتی ppm 200 عمل نمودند ودر بیشتر روزهای آزمایش بین آن‌ها و ppm 100 BHT اختلاف معنی‌داری وجود نداشت.

نتیجه‌گیری کلی: همان‌طور که ملاحظه شد تحقیقات نسبتاًً وسیعی در ارتباط با کاربرد آنتی اکسیدان‌های طبیعی و سنتزی در روغن‌های خوراکی انجام شده و در سال‌های اخیر تحقیقات زیادی بر روی توان بالقوه منابع طبیعی به عنوان آنتی اکسیدان‌ها متمرکز شده است که در طراحی پژوهش حاضر مورد استفاده قرار گرفته‌اند. لذا در این پژوهش با بررسی تغییرات عدد پراکسید و عدد تیوباربیتوریک اسید روغن کانولا حاوی تیمارهای BHT، اسانس زنیان، و کنترل نگهداری شده در گرمخانه (C°60) و ارزیابی نتایج آماری آن‌ها در دوره 49 روزه، نشان داده شد که تیمارهای آنتی اکسیدانی BHT- 200 و اسانس زنیان-400 نسبت به سایر تیمارها، بیشترین فعالیت آنتی اکسیدانی را داشته‌اند .

تشکر و قدردانی

این طرح تحقیقاتی با استفاده از اعتبارات ویژه پژوهشی ( گرنت شماره 8/3631) دانشگاه تخصصی فناوری‌های نوین آمل انجام شده است، بدینوسیله از حمایت‌های مالی مدیر محترم پژوهشی و فناوری دانشگاه تخصصی فناوری نوین آمل صمیمانه قدردانی می‌شود.

تعارض در منافع

بین نویسندگان  هیچ گونه تعارض در منافع  گزارش نشده است.