نوع مقاله : علوم پایه (بیوشیمی، آناتومی، جنین، بافت شناسی و فیزیولوژی)
نویسندگان
1 دانش آموخته دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران
2 گروه علوم پایه، دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران
3 گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران
4 گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
BACKGROUND: Flufenamic acid is a member of the fenamates and is used as an analgesic and NSAID drug. According to the ability of this drug on blocking connexin and preventing leakage of substances such as ATP from cells, it seems to be beneficial in healing diabetic wounds.
OBJECTIVES: Evaluation of the effects of topical flufenamic acid as a connexin-channel blocker on skin wound healing in alloxan-induced diabetic rats.
METHODS: In this study diabetics was induced in 40 male rats by IP injection of 150mg/kg of alloxan and they were divided to 4 groups. After anesthesia, 2×2 cm incision was made on the back of the rats and the skin was separated completely. Three groups were treated by 2, 5 and 10 percent concentration of flufenamic acid ointment separately, and one group was treated by Vaseline and ucerine ointment as control. Bandage and ointment were changed daily and the procedure was carried out for 21 days. The wound surface was measured on odd days. Half of the rats of each group on day five and half of them on day 21 were euthanized to get pathologic slides.
RESULTS: Process of healing, fibroblast concentration, epithelialization, angiogenesis, collagen formation and wound closure in 2 percent group were better than other groups and in control, 5 and 10 percent groups had a decreasing trend respectively and had a significant difference. In the last two groups, the healing process was disrupted.
CONCLUSIONS: The 2 percent concentration of drug not only did not show potent anti-inflammatory effects, but also improved the process of healing by blocking the connexin 43 and inhibition of ATP release, while in the concentration of 5 and 10 percent, anti-inflammatory effects of the drug predominated and delayed the healing process.
کلیدواژه‌ها [English]
اتصالات روزنهدار کانالهایی هستند که امکان انتقال ترکیبات سیتوپلاسمی کوچک را بین سلولها فراهم میکنند. پروتئینهایی که این اتصالات را میسازند تحت عنوان کانکسین شناخته میشوند (33،36). کانکسینها در گروههای 6 تایی، کانکسونها را میسازند و دو کانکسون (نیم کانال) در کنار هم یک کانال را شکل میدهند. گپجانکشنها امکان انتقال مستقیم یونها، مولکولهای کوچک و پیام رسانها نظیر Ca2+، ATP، cAMP، NAD+، IP3، گلوتامات و پروستاگلندینها را در بین سلولها فراهم میسازند (35). کانکسینهای 31، 26 و 43 امکان عبور cAMP ,ATP و IP3 و کانکسین 46 امکان نفوذ cAMP را فراهم میسازند. کانکسینها از نظر اندازه حفره با یکدیگر تفاوت دارند به طوری که کانکسین 46 کوچکترین و کانکسین 43 بزرگترین آن‌ها میباشد (19). ده نوع از 21 نوع کانکسین شناخته‌شده در انسان، در لایههای مختلف پوست قرار دارد. کانکسین 43 رایج‌ترین کانکسین پوست در ارتباط با لایه بازال، کراتینوسیت و فیبروبلاست است که در روند پرولیفراسیون سلول نقش دارد (27).
آنالیز ایمنوفلورسنت در پوست سالم رت نشان میدهد که پروتئین کانکسین 43 در لایههای زایگر و خاردار بیان میشوند. بین روزهای یک و دو بعد از ایجاد زخم میزان کانکسین 43 به‌صورت واضح در لبهها و اطراف زخم، یعنی همان‌جایی که پرولیفراسیون روی میدهد، کاهش مییابد. این کاهش سبب بسته شدن نارس اپیدرم بعد از ایجاد زخم شده و کاهش تعداد کانکسین 43 قبل از مهاجرت کراتینوسیتها میتواند روند بسته شدن زخم را سرعت بخشد (24). در روند التیام زخم، کانکسین 43 در کراتینوسیتهای لبهی زخم کاهش مییابد و امکان مهاجرت سلولها و بسته شدن زخم را فراهم میسازد. کاهش کانکسین 43 برای پرولیفراسیون و مهاجرت کراتینوسیتها در التیام زخم ضروری است اما در زخمهای مزمن مانند زخمهای دیابتی تعداد این کانکسینها بالا میرود، درنتیجه روند التیام طبیعی زخم با مشکل مواجه میشود (11،27). تا زمانی که تعداد این کانکسینها کاهش نیابد مهاجرت کراتینوسیتها آغاز نمیشود و به نظر میرسد که با کاهش تعداد کانکسینهای 43 در رتهای دیابتی شده، اپیتلیالیزاسیون مجدد سرعت مییابد (2). در آسیبهای بافتی و در طی روند التیام کانکسین 43 نقش حیاتی در تنظیم التهاب دارد (14،16). یکی از متابولیتهای داخل سلولی مهم ATP است که در غلظت میلی مولار در سیتوزول حضور دارد و میتواند به‌راحتی از برخی نیمکانالها نظیر کانکسینهای 26، 32 و 43 عبور کند. (23)
فلوفنامیک اسید، یک آمینواسید آروماتیک است که در خانواده ضدالتهاب‌های غیراستروئیدی (NSAIDs) قرار دارد و فعالیت ضدالتهابی آن در اثر مهار سیکلواکسیژناز و درنتیجه ممانعت از سنتز پروستاگلاندینها از آراشیدونیک اسید رخ میدهد. فلوفنامیک اسید کانالهای 43 را مهار میکند (35) و بازدارنده‌ی گپ جانکشنها است ولی همچنان مکانیسم دقیق عمل این دارو در مهار کردن کانالهای بین سلولی نامشخص است. (17). تحقیقات نشان میدهند که اثرگذاری فناماتها به دلیل اتصال به محل تنظیم فرکانسهایی است که موجب بسته شدن کانالها میشود، به همین دلیل، تأثیر فناماتها و مشتقاتش محدود به گپ‌جانکشنهای خاصی است (36). Leybaert و همکاران در سال 2003 با استفاده از پپتیدهای وابسته به کانکسین در سلولهای اندوتلیال نشان دادند که فلوفنامیک اسید قادر به مهار کانال کانکسین بوده و مانع از آزاد شدن ATP به خارج سلول میشود (26). Becker و همکاران در سال 2012 بیان کردند که پپتیدهای وابسته به کانکسین با ممانعت از خروج ATP از سلول، درترمیم زخمهای دیابتی نقش دارند (2). Wang و همکاران در سال 2007 طی مطالعات خود نشان دادند که بیان غیرطبیعی کانالهای کانکسین در پوست دیابتی، التیام زخم را به تعویق میاندازد (35). یک مشکل طولانی در زمینه اتصالات روزنهدار، فقدان عوامل یا مهار‌کننده‌های کانکسین با توانایی بالا است. بازدارندههای اختصاصی کانالهای کانکسین ممکن است اثرات درمانی داشته باشند، زیرا این کانالها به‌عنوان یک هدف فارماکولوژیک قابل‌اعتماد در درمان صرع، آریتمی قلبی، سرطان و تومورها موردتوجه قرارگرفتهاند (32،36).
با توجه به اینکه کانکسین 43 عمدهترین کانکسین پوست در ارتباط با کراتینوسیتها و لایه زایگر بوده و در روند التیام زخم تعداد آن‌ها در کراتینوسیتهای لبه زخم کاهش مییابد؛ از طرفی فلوفنامیک اسید، یک داروی ضدالتهاب غیراستروئیدی است که قادر به مهار کانکسین 43 میباشد، به نظر میرسد که این دارو با مهار کانالهای کانکسین بتواند روند التیام زخم را بهبود بخشد. به همین علت مطالعه حاضر با هدف بررسی تأثیر این دارو بر روند التیام زخمهای دیابتی صورت گرفت.
حیوان: در این مطالعه از 40 سر رت نژاد ویستار با وزن 10 ±200 گرم استفاده شد. رتها در قفسهای پنجتایی در محیط با درجه حرارت 22-20 درجه سانتیگراد و رطوبت 10±50 درصد و سیکل روشنایی-تاریکی 12 ساعته نگهداری شده، غذا به‌صورت پلیت مخصوص و آب بدون محدودیت در اختیار آن‌ها قرار گرفت.
روش ایجاد دیابت تجربی: دیابت تجربی در رتها با تزریق داخل صفاقی 150 میلیگرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن آلوکسان (Sigma Aldrich Corporation – Germany) انجام شد. برای نتیجه بهتر، 24 ساعت قبل از تزریق به رتها غذا داده نشد. حیوانهایی که میزان قند خون آن‌ها در هر دسیلیتر بیش از 200 میلیگرم بود و علائمی نظیر پرنوشی و پرادراری داشتند، دیابتی در نظر گرفته شدند (4).
ایجاد زخم: پس از حصول اطمینان از دیابتی بودن حیوان، به‌منظور ایجاد زخم ابتدا رتها توسط کتامین و زایلازین بیهوش شده و موهای پشت حیوان تراشیده شد. سپس برشی به ابعاد 2×2 سانتیمتر در ناحیه پشت ایجاد و پوست بهطور کامل یا تمام ضخامت، در شرایط آسپتیک برداشته شد.
روش درمان: پس از ایجاد زخم، رتها به‌صورت تصادفی به چهار گروه ده‌تایی تقسیم شدند:
گروه اول (2 درصد): زخم ایجادشده در رتهای این گروه توسط پماد 2 درصد اسید فلوفنامیک (2/0 گرم اسید فلوفنامیک، 5/6 گرم وازلین و 3/3 گرم اوسرین) پوشانده شد و پس از قرار دادن گاز استریل بر روی آن، بانداژ گردید.
گروه دوم (5 درصد): زخم ایجادشده در رتهای این گروه توسط پماد 5 درصد اسید فلوفنامیک (5/0 گرم اسید فلوفنامیک، 3/6 گرم وازلین و 2/3 گرم اوسرین) پوشانده و مانند گروه اول بانداژ گردید.
گروه سوم (10 درصد): زخم ایجادشده در رتهای این گروه توسط پماد 10 درصد اسید فلوفنامیک (1 گرم اسید فلوفنامیک، 6 گرم وازلین و 3 گرم اوسرین) پوشانده و مانند گروه اول بانداژ گردید.
گروه کنترل: زخم ایجادشده در رتهای این گروه توسط پماد کنترل (6/6 گرم وازلین و 4/3 گرم اوسرین) پوشانده و مانند گروه اول بانداژ گردید.
از روز صفر تا 21، در تمام گروهها به‌صورت روزانه پانسمان رتها تعویض و پماد زخمها تجدید گردید.
روش تعیین درصد بهبودی زخم: در روزهای صفر، 3، 5، 7، 9، 11، 13، 15، 17، 19 و 21 از سطح زخم توسط دوربین دیجیتال عکس‌برداری شد. به‌منظور بررسی روند بهبود ماکروسکوپی، با استفاده از نرم‌افزار Scion Image مساحت زخم محاسبه گردید. ایجاد زخم و اندازهگیری سطح آن توسط یک نفر انجام شد. میزان بهبودی بر اساس فرمول زیر به دست آمد (8):
100* (A1-Ax)= درصد بهبودی
A1/
Ai= سطح زخم در روز i ام
انجام مطالعات هیستوپاتولوژیک: با توجه به ویژگی ضدالتهابی دارو و امکان تعارض آن با روند التهاب و ترمیم، نیمی از رتهای هر گروه در روز 5 و بقیه آن‌ها در روز 21 پس از ایجاد زخم، توسط اتر یوتانایز شدند. به‌منظور نمونهبرداری از پوست، از ثلث میانی زخم، نواری به طول 3 – 5/2 سانتیمتر و عرض 1 – 5/0 سانتیمتر به‌صورت تمام ضخامت برداشته شد. بدین ترتیب این نوار هم شامل بخشهای حاشیهای و مرکزی زخم و هم شامل نواحی سالم مجاور لبه زخم بود. نمونهها 72 ساعت در محلول بافر فرمالین 10 درصد و پس از ثبوت، جهت عمل‌آوری در دستگاه هیستوکینت قرار گرفتند. پس از قالب‌گیری توسط پارافین، برش‌هایی به ضخامت 6 میکرون از آن‌ها تهیه و متعاقب رنگ‌آمیزی‌های هماتوکسیلین و ائوزین و ماسون تری کروم توسط میکروسکوپ نوری موردمطالعه قرار گرفتند. از هر نمونه 5 اسلاید و در هر اسلاید 5 منطقه غیر همپوشاننده به‌صورت تصادفی انتخاب و بررسی گردیدند. درجه‌بندی زخمها براساس روش نیمه کمی و مطابق جدول 1 انجام شد (12).
تجزیه‌وتحلیل آماری با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 21 صورت پذیرفت. دادههای رتبهای در پارامترهای اپیتلیالیزاسیون، فیبروبلاست، آنژیوژنز و کلاژن توسط آزمون کروسکال والیس و آزمون من ویتنی در سطح معنیداری 05/0P< با هم مقایسه گردید. همچنین دادههای مربوط به سطح زخم نیز با استفاده از آزمون One-Way-ANOVA و تست تکمیلی Tukey در سطح معنیداری05/0P< با هم مقایسه گردید.
سلولهای التهابی- (-): عدم حضور سلولهای التهابی
(خفیف): حضور سلول التهابی در دو میدان میکروسکوپی
(متوسط): حضور سلول التهابی در سه تا پنج میدان میکروسکوپی
(زیاد): حضور سلول التهابی در بیش از پنج میدان میکروسکوپی
آنژیوژنز- (-): عدم حضور عروق خونی
(خفیف): حضور صفر تا دو عروق خونی
(متوسط): حضور سه تا چهار عروق خونی
(زیاد): حضور بیش از چهار عروق خونی.
فیبروپلازی- (-): حضور تعداد کمی فیبر کلاژن نازک همراه با تعداد زیاد فیبروبلاست
(خفیف): حضور فیبرهای نازک کلاژن همراه با تعداد زیاد فیبروبلاست
(متوسط): حضور فیبرهای ضخیم کلاژن همراه با تعداد زیاد فیبروبلاست
(زیاد): حضور فراوان فیبرهای ضخیم کلاژن همراه با تعداد کمی فیبروبلاست.
مساحت زخم:در روزهای صفر، 3، 5، 7، 9، 11، 13، 15، 17، 19 و 21 مساحت زخم در گروههای موردمطالعه اندازهگیری و نتایج زیر حاصل شد:
در روزهای صفر، سه و پنج اختلاف معنیداری بین گروههای موردمطالعه دیده نشد، اما از روز هفتم در دو گروه کنترل و 2 درصد مساحت زخم کمتر شده و با گروههای 5 درصد و 10 درصد دارای تفاوت معنیدار شد (05/0P<) و این اختلاف را تا پایان دوره (روز 21) حفظ کرد. سطح زخم در گروههای 5 درصد و 10 درصد بیشتر از گروههای کنترل و 2 درصد بود. بین دو گروه کنترل و 2 درصد تفاوت معنیداری مشاهده نشد (تصویر 1).
میزان بهبود زخم نیز تا روز پنجم اختلاف معنیداری را در بین گروهها نشان نداد، اما از روز هفتم به بعد میزان بهبود زخم در گروههای کنترل و 2 درصد در مقایسه با گروههای 5 درصد و 10 درصد از اختلاف معنیدار برخوردار بود. بااین‌وجود میزان بهبود زخم در گروه 5 درصد نسبت به 10 درصد و همچنین در گروه کنترل نسبت به گروه 2 درصد واجد اختلاف معنیدار نبود. درمجموع بسته شدن و جمع شدن لبههای زخم و درنتیجه میزان بهبودی زخم، در طول دوره (مدت 21 روز)، در گروه 2 درصد اندکی بهتر از گروه کنترل بود اما این اختلاف معنیدار نبود. بااین‌حال سرعت بسته شدن زخم و میزان بهبودی آن در گروه 2 درصد بیشتر بوده و در مقایسه با سایر گروهها، حتی گروه کنترل از روند بهتر و سریعتری برخوردار بود (نمودار 1).
زایش بافت اپیتیال:روند زایش بافت اپیتیال در گروههای 2 درصد، کنترل، 5 درصد و 10 درصد به ترتیب از بهترین تا بدترین وضعیت مشاهده شد. زایش بافت اپیتیال در روز 21 در گروههای 2 درصد و کنترل بهوقوع پیوسته و بهخوبی پیشرفت کرده بود، اما در گروههای 5 درصد و 10 درصد صورت نگرفته و بقایای لخته فیبرینی هنوز در زخم مشهود بود (تصویر 2). در گروه 2 درصد نسبت به سایر گروهها و حتی گروه کنترل، روند زایش بافت اپیتیال کاملتر صورت گرفته و این اختلاف معنیدار بود (05/0P<). در گروه کنترل نیز زایش بافت اپیتیال نسبت به گروههای 5 درصد و 10 درصد کاملتر انجام‌شده و این اختلاف معنیدار بود (05/0P<). در گروه 5 درصد اگرچه رشد و تکثیر کراتینوسیتها بهتر از گروه 10 درصد صورت گرفته بود اما روند زایش بافت اپیتیال در هر 2 گروه پیشرفت خوبی نداشت و بین آن‌ها اختلاف معنیداری مشاهده نگردید.
فیبروبلاستها: از نظر تراکم فیبروبلاست در روز پنجم بین گروههای موردمطالعه اختلاف معنیداری مشاهده نگردید و تقریباً در تمام گروهها تراکم نسبتاً کم تا متوسطی را در جوانه گوشتی تشکیل دادند. در روز 21 تراکم فیبروبلاستها در دو گروه کنترل و 2 درصد اندک بود، درحالی‌که در گروههای 5 درصد و 10 درصد تراکم متوسط و زیاد فیبروبلاستها در جوانه گوشتی به چشم خورد. تراکم فیبروبلاستها در روز 21 بین گروه کنترل و سایر گروهها از اختلاف معنیداری برخوردار بود (05/0P<)، همچنین این تراکم در گروه 2 درصد نیز با سایر گروهها واجد اختلاف معنیدار بود (05/0P<) اما هیچ اختلاف معنیداری بین تراکم فیبروبلاست در گروههای 5 درصد و 10 درصد مشاهده نشد.
آنژیوژنز:در روز پنجم در هر دو گروه کنترل و 2 درصد عروق جدید نسبتاً زیادی در جوانه گوشتی شکل گرفت اما عروق تشکیل‌شده در گروه 2 درصد از وسعت بیشتری نسبت به گروه کنترل برخوردار بود به‌گونه‌ای که این تفاوت واجد اختلاف معنیدار بود. میزان تشکیل عروق جدید در جوانه گوشتی در گروه 2 درصد در حد متوسط و در گروه کنترل اندکی کمتر از آن مشاهده شد. این میزان در گروههای 5 درصد و 10 درصد بسیار کمتر از گروههای کنترل و 2 درصد بود. اختلاف موجود بین گروههای 5 درصد و 10 درصد با هر دو گروه کنترل و 2 درصد از نظر تشکیل عروق جدید معنیدار بود (05/0P<)، بااین‌حال عروق جدید در جوانه گوشتی گروه 5 درصد اگرچه بیشتر از گروه 10 درصد تشکیل شد اما این اختلاف معنیدار نبود.
در روز 21 در هر دو گروه کنترل و 2 درصد بهطور قابل‌ملاحظه‌ای از عروق موجود درجوانه گوشتی کاسته شد. میزان عروق موجود در گروه 2 درصد کمتر از گروه کنترل بوده و اختلاف موجود بین این دو گروه کاملاً معنیدار بود (05/0P<). در دو گروه 5 درصد و 10 درصد حتی در روز 21 عروق فراوانی در جوانه گوشتی حضور داشت و این تعداد در گروه 10 درصد بیشتر از گروه 5 درصد بود (تصویر 3). اختلاف موجود در گروههای 5 درصد و 10 درصد با گروههای کنترل و 2 درصد از نظر تعداد عروق موجود در جوانه گوشتی کاملاً معنیدار بود (05/0P<)؛ اما بین دو گروه 5 درصد و 10 درصد تفاوت معنیداری از این نظر مشاهده نشد.
رشتههای کلاژن:در روز پنجم رشتههای کلاژن در تمام گروههای موردمطالعه یا هنوز تشکیل نشده یا در کمترین مقدار خود بود؛ اما در روز 21 با پیشرفت ترمیم، تراکم رشتههای کلاژن بیشتر شده و حجم رشتههای ضخیم کلاژن نیز افزایش یافت. در گروههای کنترل و 2 درصد حجم قابل‌توجهی از کلاژن ضخیم در جوانه گوشتی دیده شد. اگرچه اختلاف معنیداری بین این دو گروه از نظر حجم رشتههای کلاژن وجود نداشت، اما نظم رشتهها و تشکیل دستجات ضخیم کلاژن در گروه 2 درصد بهتر از گروه کنترل قابل رویت بود. تراکم رشتههای کلاژن موجود در جوانه گوشتی در گروه 5 درصد کمتر از کنترل و در گروه 10 درصد کمتر از گروه 5 درصد بوده و علاوه بر آن ضخامت رشتهها نیز با روند مشابهی در گروه 5 درصد کمتر از کنترل و در گروه 10 درصد کمتر از گروه 5 درصد بود (تصویر 4). این اختلاف اگرچه بین دو گروه 5 درصد و 10 درصد معنیدار نبود، اما بین گروههای کنترل و 2 درصد با گروههای 5 درصد و 10 درصد دارای اختلاف معنیدار بود (05/0P<). از منظر کیفی نیز رشتههای کلاژن موجود در جوانه گوشتی در گروههای 5 درصد و 10 درصد بسیار نامنظم بوده و درجات متفاوتی از رشتههای نازک تا نسبتاً ضخیم را شامل می‌گردید که با پراکندگی ضعیف تا متوسط در جوانه گوشتی قابل‌رؤیت بود.
مساحت زخم در هر دو گروه کنترل و 2 درصد به نحو چشمگیری نسبت به دو گروه دیگر کمتر بود که از روز هفتم تسریع شد و تا پایان دوره ادامه داشت. به‌منظور بسته شدن سطح زخم، بافت اسکار کوچکی از لبههای زخم به سمت مرکز گسترش مییابد و با حرکتی جاذب به مرکز، سطح زخم را مسدود میکند (10). فاز پرولیفراسیون در روند ترمیم شامل آنژیوژنز، رسوب کلاژن، شکل‌گیری بافت گرانوله، رشد سلولی و انقباض زخم است. در فیبروپلازی و تشکیل بافت گرانوله فیبروبلاستها تکثیر مییابند و با تولید کلاژن و فیبرونکتین، یک ماتریکس خارج سلولی موقت پدید میآورند (1،18). با تکمیل زایش بافت اپیتیال، سلولهای اپیدرمی تمایز مجدد پیداکرده و فنوتیپ اپیتلیالی خود را به دست میآورند و کلاژن نیز بستری را برای مهاجرت سلولها پدید میآورد (36). میوفیبروبلاستها بیشترین سلولهای موجود در بافت گرانولاسیون بالغ بوده و بااتصال به لبههای زخم مسئول انقباض زخم هستند (1،10). Wang و همکاران در سال 2010، بامطالعه بر روی زخمهایی با شرایط ایسکمیک نشان دادند که استفاده از لیپوزومهای حاوی ATP سبب افزایش زایش بافت اپیتیال میگردد (35). Ghatnekar و همکاران در سال 2009 و 2014 نشان دادند که ACT1 میتواند منجر به کاهش عملکرد کانکسین 43، افزایش پرولیفراسیون فیبروبلاستها، افزایش کشش پوستی و تسریع روند التیام گردد (14،15). در مقابل گزارشات Dvivedi و همکاران در سال 1997 و Krischak و همکاران در سال 2007 حاکی از آن است که NSAID ها سبب کاهش کشش زخم و کاهش میزان فیبروبلاستها در بافت همبند شده و اثر ضدپرولیفراتیو دارند (9،25).
در گروه 2 درصد به علت انسداد کانالهای کانکسین و افزایش فیبروبلاستها، فرایند انقباض زخم و جمع شدن لبههای زخم بهتر از سایر گروهها به وقوع پیوست، درحالی‌که در دو گروه 5 و 10 درصد به علت اختلال در فاز التهابی ترمیم و متعاقب آن ممانعت از تکثیر و مهاجرت فیبروبلاستها، مکانیسمهای مشروحه مختل شده و انقباض زخم، روند بسیار آهسته را طی کرد.
همانگونه که در قسمت نتایج بیان شد، در دو گروه کنترل و 2 درصد روند زایش بافت اپیتلیال نسبت به سایر گروهها از پیشرفت بهتری برخوردار بوده به طوری که بافت پوششی از لبه زخم به هم رسیده و اپیدرم را در سطح زخم گسترش داده بود. Cogliati و همکاران در سال 2015 با مطالعه بر روی موشهایی که به‌صورت ژنتیکی دچار نقص کانکسین 43 بودند گزارش کردند که زایش بافت اپیتلیال مجدد و بسته شدن زخم در این موشها بهتر صورت میگیرد (7). فلوفنامیک اسید دارویی است که کانکسین 43 را مهار میکند (27،35) بنابراین انتظار میرود گروههای تحت درمان با این دارو از روند زایش بافت اپیتیال بهتری برخوردار باشند زیرا به نظر میرسد که کاهش کانکسین 43 در لبه زخم مهاجرت سلولی را تحریک کرده و برای پرولیفراسیون و مهاجرت کراتینوسیتها در التیام زخم ضروری است (27) به‌علاوه مشخص‌شده که در رتهای دیابتی تا زمانی که تعداد این کانکسین کاهش نیابد روند زایش بافت اپیتیال و مهاجرت کراتینوسیتها آغاز نمیشود (2).
برخلاف انتظار در گروههای 5 و 10 درصد نه‌تنها روند زایش بافت اپیتیال پیشرفت نکرده بود بلکه در همان مراحل اولیه باقی‌مانده بود اما این روند در گروه 2 درصد بهخوبی و بسیار کاملتر از سایر گروهها انجام‌شده بود. فلوفنامیک اسید یک داروی ضدالتهاب غیراستروئیدی است که با مهار متابولیسم سیکلواکسیژناز، تولید پروستاگلاندین را در بافت ملتهب، کند یا متوقف میسازد (18). به‌علاوه با مهار کانال کانکسین مانع از آزاد شدن ATP به خارج سلول میشود (31). از طرفی التهاب یکی از مراحل ضروری در فرآیند ترمیم زخم میباشد که طی آن نفوذ نوتروفیلها، نفوذ مونوسیتها و تبدیل‌شدن به ماکروفاژ و نهایتاً نفوذ لنفوسیتها به زخم و بافتهای مجاور صورت میگیرد (18). با افزایش ماکروفاژها تشکیل بافت گرانوله نیز آغاز میگردد. بر اساس گزارشهای موجود استفاده از داروهای ضدالتهاب، ترمیم را در جراحات پوستی مختل میکند. ترمیم جراحات اگرچه در غیاب نوتروفیلها میتواند صورت بگیرد اما در فقدان ماکروفاژها کاملاً مختل میشود (28).
به نظر میرسد استفاده از غلظتهای 5 و 10 درصد باعث گردیده تأثیرات ضدالتهابی دارو تشدید و روند زایش بافت اپیتلیال مختل گردد. احتمالاً اثرات ضدالتهابی دارو در همان مراحل اولیه ترمیم زخم، نفوذ نوتروفیلها، لنفوسیتها و مونوسیتها را به زخم کاهش داده و متعاقب آن کاهش ماکروفاژها را نیز در پی داشته است. اگرچه Chang و همکاران در سال 2003 نشان دادند که NSAIDها بر روی عملکرد و فعالیت TGF-β تأثیر قابل ملاحظه‌ای ندارد (5) اما به نظر میرسد اثر ضدالتهابی این دارو با کاهش ماکروفاژها میزان تولید TGF-β را کاهش داده و به‌این‌ترتیب مهاجرت کراتینوسیتها و روند زایش بافت اپیتلیال را مختل مینماید. در غلظت پایین فلوفنامیک اسید (2 درصد)، اثرات ضدالتهابی دارو ناچیز بوده و نفوذ سلولهای آماسی را به محل زخم تحت تأثیر قرار نمیدهد اما همین غلظت اندک دارو برای مهار کانکسین 43 و جلوگیری از اتلاف ATP کافی است به همین علت روند زایش بافت اپیتلیال در گروهی که غلظت 2 درصد دارو را دریافت نموده بود نسبت به سایر گروهها بهتر صورت گرفته و از اختلاف معنیداری برخوردار بود.
در روز پنجم در تمام گروههای موردمطالعه، عروق جدیدی در جوانه گوشتی شکل گرفت. در روز 21 تراکم عروق جدید در هر دو گروه کنترل و 2 درصد بهطور قابل‌ملاحظه‌ای کاهش پیدا کرد اما در گروههای 5 و 10 درصد هنوز عروق فراوانی در جوانه گوشتی حضور داشت. آنژیوژنز بخش ضروری ترمیم است که با ایجاد جریان خون در محل آسیب، نکروز ایسکمیک را محدود کرده، ذخیره اکسیژن بافت، تغذیه و رشد سلول را تأمین نموده و با افزایش میزان متابولیسم، سنتز، تقسیم و مهاجرت سلولی را افزایش میدهد. بعلاوه افزایش خون‌رسانی و تغذیه کافی میزان سنتز پروتئین را در فیبروبلاستها که مسئول تولید کلاژن هستند گسترش میدهد و منجر به افزایش سرعت‌ترمیم میگردد (20). Chiang و همکاران در سال 2007، Wang و همکاران در سال 2010 و Howard و همکاران نیز در سال 2014 نشان دادند که ATP با افزایش آنژیوژنز، سرعت تولید بافت گرانوله را افزایش داده و ترمیم زخم را تسریع میکند (6،21،35).
مطالعات موجود در زمینه NSAID ها و نقش آن‌ها در آنژیوژنز، نتایج متفاوتی را ارائه نموده است. برخی نظیر Ge و همکاران در سال 2013 نشان دادند که فلوفنامیک اسید قادر به تحریک آنژیوژنز میباشد (13). از طرفی مطالعات انجام‌شده توسط Jones و همکاران در سال 1999، Tarnawski و همکاران در سال 2003 و Pai و همکاران در سال 2000 نیز حاکی از ممانعت NSAID ها از آنژیوزنز میباشند. (22،30،34)؛ اما آنچه اخیراً به اثبات رسیده، این است که مکانیسم اثر NSAID های مختلف بر آنژیوژنز و ترمیم زخم متفاوت است. اغلب NSAID ها در محدوده دوز طبیعی خود، تأثیر ناچیزی بر آنژیوژنز دارند، درحالی‌که در مقادیر زیاد میتوانند مهاجرت و تکثیر سلولها را مهار کرده و حتی منجر به مرگ سلول شوند (29).
با توجه به مطالب ذکرشده و نتایج حاصل از این مطالعه میتوان اظهار داشت که داروی فلوفنامیک اسید در غلظتهای کم (2 درصد) با مهار کانکسینها و حفظ ATP سلولی، فرآیند ترمیم زخم، ازجمله آنژیوژنز را سرعت بخشیده و حتی در مقایسه با گروه کنترل نتایج بهتری را نشان داد. به نظر میرسد حتی غلظتهای 5 درصد و 10 درصد دارو نیز فرآیند آنژیوژنز را مختل نکرده بلکه فرآیند ترمیم را طولانی کرده و پس از 21 روز، زخمها هنوز در مرحله بافت گرانوله باقی ماندند.
در روز 21 در دو گروه کنترل و 2 درصد تراکم فیبروبلاست اندک بوده و حجم قابل‌توجهی از رشتههای ضخیم کلاژن در بافت گرانوله حضور داشت اما در دو گروه 5 و 10 درصد، تراکم متوسط و زیاد فیبروبلاستها به چشم خورد و حجم رشتههای کلاژن در بافت گرانوله اگرچه نسبتاً زیاد بود اما رشتهها در مقایسه با دو گروه دیگر نازکتر، پراکندهتر و نامنظمتر بودند و تراکم رشتههای ضخیم کلاژن در آن‌ها بسیار کم بود.
کلاژن اصلیترین پروتئین ماتریکس خارج سلولی است که در پستانداران 70 تا 80 درصد پروتئینهای پوست را شامل میشود و کلاژنهای نوع I، II و III اصلیترین انواع آن به شمار میروند که در ترمیم زخم شرکت دارند (3). فیبروبلاستها اصلیترین سلول مستقر در بافت همبند هستند که سنتز و ترشح ترکیبات بافت همبند و مولکولهای پیشساز انواع مختلف کلاژن و فیبرهای الاستیک را بر عهده دارند (3،28). فیبروبلاستها متعاقب پرولیفراسیون و مهاجرت، به ماتریکس موقت فیبرین واردشده و آن را توسط ماتریکس خارج سلولی (ECM) جایگزین میکنند. TGF-β حاصل از ماکروفاژها تکثیر فیبروبلاستها را تحریک میکند (28). Cogliati و همکاران در سال 2015 نشان دادند که کانکسینهای مهارشده میتوانند تکثیر و فعالیت فیبروبلاستها را در زخم افزایش دهند (7). Chiang و همکاران در سال 2007 نیز نشان دادند که استفاده از لیپوزومهای حاوی ATP میتواند اثر مشابهی را در ترمیم زخم بروز دهد (6). از طرفی مطالعاتی نظیر بررسیهای Krischak و همکاران در سال 2007 و Guo و DiPietro در سال 2010 بیانگر آن است که NSAID ها میزان فیبروبلاستها را در بافت همبند کاهش میدهند و روند التیام زخم را با اختلال مواجه میسازند (18،25).
با عنایت به نتایج حاصل از این مطالعه به نظر میرسد غلظت 2 درصد فلوفنامیک اسید با انسداد کانالهای کانکسین و حفظ ATP سلول نقش مثبتی در تکثیر و مهاجرت فیبروبلاستها داشته و متعاقباً رسوب بیشتر و بهتر کلاژن را به دنبال داشته است. غلظتهای 5 درصد و 10 درصد دارو با اختلال در فاز التهابی و کاهش سلولهای التهابی، فرآیند ترمیم را به تعویق انداخته، تکثیر و مهاجرت فیبروبلاستها را تقلیل داده و با تأخیر مواجه ساخته و درنتیجه رسوب کلاژن نیز مطلوب نبوده است.
درمجموع میتوان گفت که فلوفنامیک اسید دارویی است که ازیک‌طرف دارای اثرات ضدالتهابی است و از طرفی قادر به مهار کردن کانالهای کانکسین و حفظ ATP است. این دو خصوصیت در ترمیم زخم خصوصاً زخمهای دیابتی که میزان کانالهای کانکسین 43 درم افزایش‌یافته و درنتیجه با نشت زیاد ATP مواجه هستیم، اثرات متفاوت و متضادی را بروز میدهند. مهار کردن کانالهای کانکسین میتواند منجر به تسریع در فرآیند ترمیم زخم شود در حالیکه اثرات ضدالتهابی دارو با اختلال در فاز التهابی مانع از هجوم سلولهای التهابی به زخم شده و متعاقباً فاکتورهای رشد لازم برای ادامه روند ترمیم به مقدار کافی تولید نشده و فرآیند ترمیم مختل شده و یا به تعویق میافتد.
نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که داروی فلوفنامیک اسید در غلظتهای کم، با مهار کانالهای کانکسین و حفظ ATP، روند ترمیم زخمهای دیابتی را تسریع مینماید و اثرات ضدالتهابی آن مانع از بهبود ترمیم نمیشود؛ اما غلظتهای زیاد دارو نه‌تنها روند ترمیم را در زخمهای دیابتی بهبود نمیبخشد، بلکه با تداخل در مرحله التهابی، منجر به تأخیر در فرآیند ترمیم میگردد.
بدینوسیله از مسئولین دانشگاه سمنان جهت فراهم آوردن امکانات لازم برای انجام این پژوهش و از آقای مرتضی صابری و حسن تقیزاده جهت همکاری در امور آزمایشگاهی این پژوهش صمیمانه تقدیر و تشکر میگردد.
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
جدول 1. معیار درجه بندی زخمها با روش نیمه کمی.
|
کلاژن |
آنژیوژنز |
فیبروبلاست |
سلول التهابی |
اپیتلیالیزاسیون |
درجه |
|
- |
- |
- |
- |
ضخیم شدن لبههای برش |
0 |
|
حداقل در جوانه گوشتی |
خفیف در بافتهای زیرجلدی |
خفیف در بافتهای مجاور |
خفیف در بافتهای مجاور |
مهاجرت سلولها (50> درصد) |
1 |
|
خفیف در جوانه گوشتی |
خفیف در جوانه گوشتی |
خفیف در جوانه گوشتی |
خفیف در جوانه گوشتی |
مهاجرت سلولها (50≤ درصد) |
2 |
|
متوسط در جوانه گوشتی |
متوسط در جوانه گوشتی |
متوسط در جوانه گوشتی |
متوسط در جوانه گوشتی |
به هم رسیدن لبههای برش |
3 |
|
زیاد در جوانه گوشتی |
زیاد در جوانه گوشتی |
زیاد در جوانه گوشتی |
زیاد در جوانه گوشتی |
کراتینه شدن |
4 |
جدول 2. درجه بندی زخمها از منظر فاکتورهای اپیتلیالیزاسیون، سلولهای التهابی، حضور فیبروبلاستها، آنژیوژنز و کلاژن.
|
کلاژن |
آنژیوژنز |
فیبروبلاست |
سلول التهابی |
اپیتلیالیزاسیون |
|
||||||
|
روز 21 |
روز 5 |
روز 21 |
روز 5 |
روز 21 |
روز 5 |
روز 21 |
روز 5 |
روز 21 |
روز 5 |
||
|
4 |
1 |
2 |
3 |
2 |
3 |
0 |
0 |
2 |
0 |
1 |
گروه کنترل |
|
4 |
1 |
2 |
3 |
2 |
3 |
0 |
0 |
2 |
0 |
2 |
|
|
4 |
1 |
2 |
3 |
2 |
3 |
0 |
0 |
2 |
0 |
3 |
|
|
4 |
1 |
2 |
2 |
1 |
3 |
0 |
0 |
2 |
0 |
4 |
|
|
4 |
1 |
2 |
2 |
2 |
3 |
0 |
0 |
2 |
0 |
5 |
|
|
4 |
1 |
1 |
3 |
2 |
3 |
0 |
0 |
3 |
0 |
1 |
گروه 2 درصد |
|
4 |
1 |
1 |
3 |
1 |
3 |
0 |
0 |
3 |
0 |
2 |
|
|
4 |
1 |
1 |
3 |
1 |
3 |
0 |
0 |
3 |
0 |
3 |
|
|
4 |
1 |
2 |
3 |
1 |
3 |
0 |
0 |
3 |
0 |
4 |
|
|
4 |
1 |
1 |
2 |
2 |
3 |
0 |
0 |
3 |
0 |
5 |
|
|
3 |
1 |
3 |
2 |
3 |
3 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
گروه 5 درصد |
|
3 |
1 |
3 |
2 |
3 |
3 |
0 |
0 |
1 |
0 |
2 |
|
|
3 |
0 |
4 |
1 |
4 |
2 |
0 |
0 |
1 |
0 |
3 |
|
|
3 |
0 |
4 |
1 |
4 |
2 |
0 |
0 |
1 |
0 |
4 |
|
|
3 |
1 |
3 |
2 |
3 |
3 |
0 |
0 |
1 |
0 |
5 |
|
|
2 |
0 |
4 |
2 |
4 |
3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
گروه 10 درصد |
|
2 |
0 |
4 |
2 |
4 |
3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
2 |
|
|
2 |
0 |
4 |
1 |
4 |
3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
3 |
|
|
2 |
0 |
4 |
2 |
4 |
2 |
0 |
0 |
0 |
0 |
4 |
|
|
2 |
0 |
4 |
1 |
4 |
3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
5 |
|
نمودار ۱. میزان بهبودی زخم در گروه های موردمطالعه.
تصویر 1. سطح زخم در روز 21 ترمیم. بسته شدن زخم در گروه 2 درصد از بهترین و در گروه 10 درصد از بدترین وضعیت برخوردار است. کنترل=A، 2=B درصد، 5=C درصد، 10=D درصد.
تصویر 2. وضعیت زایش بافت اپیتیال در روز 21 ترمیم. در دو گروه کنترل و 2 درصد زایش بافت اپیتیال بهخوبی گسترش‌یافته و سلولهای بافت سنگفرشی مطبق بهخوبی شکل‌گرفته‌اند. در دو گروه 5 درصد و 10 درصد زایش بافت اپیتیال صورت نگرفته و سطح زخم هنوز واجد لخته فیبرینی است. (H&E; ×=400) کنترل=A، 2=B درصد، 5=C درصد، 10=D درصد، پیکان= اپیتلیوم سنگفرشی مطبق.
تصویر 3. وضعیت عروق جدید در روز 21 ترمیم. تعداد عروق از کمترین در گروه 2 درصد تا بیشترین در گروه 10 درصد متغیر است. (H&E; ×=400) کنترل=A، 2=B درصد، 5=C درصد، 10=D درصد، نوک پیکان= رگ خونی.
تصویر 4. فیبروپلاژی در روز 21 ترمیم. رشتههای کلاژن در گروه 2 درصد از بیشترین تراکم، ضخامت و نظم برخوردار است. این وضعیت در گروه کنترل اندکی ضعیفتر میشود ولی در گروههای 5 و 10 درصد رشتههای کلاژن ظریف بوده و از تراکم اندکی برخوردارند. (Masson Trichrome; ×=400). کنترل=A، 2=B درصد، 5=C درصد، 10=D درصد.
', './data/jvr/coversheet/cover_fa.jpg'))