بررسی تأثیر فلوفنامیک اسید به‌عنوان مهارکننده کانکسین بر روی ترمیم زخم‌های دیابتی

نوع مقاله : علوم پایه (بیوشیمی، آناتومی، جنین، بافت شناسی و فیزیولوژی)

نویسندگان

1 دانش آموخته دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران

2 گروه علوم پایه، دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران

3 گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران

4 گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران

چکیده

زمینۀ مطالعه: فلوفنامیک اسید از خانواده فنامات­ها بوده و به‌عنوان داروی ضد­التهاب غیراستروئیدی و ضد­­ درد مورداستفاده قرارگرفته است. با توجه به قابلیت دارو جهت مهار کانال‌های و ممانعت از خروج محتویات سلول ازجمله ATP، احتمال تأثیر مثبت آن بر روند التیام زخم­های دیابتی وجود دارد.
هدف: بررسی اثرات موضعی فلوفنامیک اسید به‌عنوان بلوک کننده کانال کانکسین بر التیام زخم رت­های دیابتی شده توسط آلوکسان.
روش‌کار: در این مطالعه از 40 سر رت نر نژاد ویستار استفاده شد. همه­ی رت­ها توسط 150 میلی گرم در کیلو گرم آلوکسان دیابتی و به‌صورت تصادفی به چهار گروه تقسیم شدند. پس از بیهوشی برشی به ابعاد 2×2 سانتی­متر در ناحیه پشت ایجاد و پوست به‌طور کامل جدا گردید. گروه­­ها به‌صورت جداگانه تحت درمان با پمادهای 2، 5 و 10 درصد فلوفنامیک اسید قرار گرفتند و یک گروه نیز­ به‌عنوان کنترل فقط پماد وازلین و اوسرین دریافت کرد. پماد و پانسمان روزانه تجدید شد. از روز صفر تا 21 در روزهای فرد مساحت زخم موردبررسی قرار گرفت. در هر گروه، نیمی از رت­ها در روز پنج و بقیه در روز 21 یوتانایز و از محل برش، نمونه پاتولوژیک تهیه گردید.
نتایج: فرآیند ترمیم، تراکم فیبروبلاست‌ها، روند اپیتلیالیزاسیون، آنژیوژنز، تشکیل رشته­های کلاژن و بسته شدن زخم در گروه 2 درصد بهتر از سایر گروه­ها بود و به ترتیب در گروه­های کنترل، 5 و 10 درصد از سیر نزولی برخوردار و دارای اختلاف معنی­دار بود، بطوریکه در دو گروه آخر، فرآیند ترمیم مختل گردید.
نتیجه‌گیری نهایی: غلظت 2 درصد دارو نه‌تنها اثرات ضدالتهابی قوی را بروز نداد، بلکه با تأثیر بر روی کانال­های کانکسین 43 و ممانعت از خروج ATP، فرآیند ترمیم را بهبود بخشیده و تسریع نمود، درحالی‌که در غلظت 5 و 10 درصد، اثرات ضدالتهابی دارو غالب بوده و منجر به تأخیر در فرآیند ترمیم گردید.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Effect of Flufenamic Acid as Connexin Inhibitor on Diabetic Wound Healing

نویسندگان [English]

  • Aysan Fotowat 1
  • Seyed Javad Ahmadpanahi 2
  • Ebrahim Shahroozian 2
  • Farzad Hayati 3
  • Sahar Ghaffari Khaligh 4
1 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine, Semnan University, Semnan, Iran
2 Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Semnan University, Semnan, Iran
3 Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
4 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Semnan University, Semnan, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Flufenamic acid is a member of the fenamates and is used as an analgesic and NSAID drug. According to the ability of this drug on blocking connexin and preventing leakage of substances such as ATP from cells, it seems to be beneficial in healing diabetic wounds.
OBJECTIVES: Evaluation of the effects of topical flufenamic acid as a connexin-channel blocker on skin wound healing in alloxan-induced diabetic rats.
METHODS: In this study diabetics was induced in 40 male rats by IP injection of 150mg/kg of alloxan and they were divided to 4 groups. After anesthesia, 2×2 cm incision was made on the back of the rats and the skin was separated completely. Three groups were treated by 2, 5 and 10 percent concentration of flufenamic acid ointment separately, and one group was treated by Vaseline and ucerine ointment as control. Bandage and ointment were changed daily and the procedure was carried out for 21 days. The wound surface was measured on odd days. Half of the rats of each group on day five and half of them on day 21 were euthanized to get pathologic slides.
RESULTS: Process of healing, fibroblast concentration, epithelialization, angiogenesis, collagen formation and wound closure in 2 percent group were better than other groups and in control, 5 and 10 percent groups had a decreasing trend respectively and had a significant difference. In the last two groups, the healing process was disrupted.
CONCLUSIONS: The 2 percent concentration of drug not only did not show potent anti-inflammatory effects, but also improved the process of healing by blocking the connexin 43 and inhibition of ATP release, while in the concentration of 5 and 10 percent, anti-inflammatory effects of the drug predominated and delayed the healing process.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Connexin
  • Flufenamic acid
  • Wound healing
  • diabetes
  • rat

مقدمه

 

اتصالات روزنه­دار کانال­هایی هستند که امکان انتقال ترکیبات سیتوپلاسمی کوچک را بین سلول­ها فراهم می­کنند. پروتئین­هایی که این اتصالات را می­سازند تحت عنوان کانکسین شناخته می­شوند (33،36). کانکسین­ها در گروه­های 6 تایی، کانکسون­ها را می­سازند و دو کانکسون (نیم کانال) در کنار هم یک کانال را شکل می­دهند. گپ­جانکشن­ها امکان انتقال مستقیم یون­ها، مولکول­های کوچک و پیام رسان­ها نظیر Ca2+، ATP، cAMP، NAD+، IP3، گلوتامات و پروستاگلندین­ها را در بین سلول­ها فراهم می­سازند (35). کانکسین­های 31، 26 و 43 امکان عبور cAMP ,ATP و IP3 و کانکسین 46 امکان نفوذ cAMP را فراهم می­سازند. کانکسین­ها از نظر اندازه حفره با یکدیگر تفاوت دارند به طوری که کانکسین 46 کوچک­ترین و کانکسین 43 بزرگ­ترین آن‌ها می­باشد (19). ده نوع از 21 نوع کانکسین شناخته‌شده در انسان، در لایه­های مختلف پوست قرار دارد. کانکسین 43 رایج‌ترین کانکسین پوست در ارتباط با لایه بازال، کراتینوسیت و فیبروبلاست است که در روند پرولیفراسیون سلول نقش دارد (27).

آنالیز ایمنوفلورسنت در پوست سالم رت نشان می­دهد که پروتئین کانکسین 43 در لایه­های زایگر و خاردار بیان می­شوند. بین روزهای یک و دو بعد از ایجاد زخم میزان کانکسین 43 به‌صورت واضح در لبه­ها و اطراف زخم، یعنی همان‌جایی که پرولیفراسیون روی می‌دهد، کاهش می­یابد. این کاهش سبب بسته شدن نارس اپیدرم بعد از ایجاد زخم شده و کاهش تعداد کانکسین 43 قبل از مهاجرت کراتینوسیت­ها می­تواند روند بسته شدن زخم را سرعت بخشد (24). در روند التیام زخم، کانکسین 43 در کراتینوسیت‌های لبه­ی زخم کاهش می­یابد و امکان مهاجرت سلول­ها و بسته شدن زخم را فراهم می­سازد. کاهش کانکسین 43 برای پرولیفراسیون و مهاجرت کراتینوسیت­ها در التیام زخم ضروری است اما در زخم­های مزمن مانند زخم­های دیابتی تعداد این کانکسین­ها بالا می­رود، درنتیجه روند التیام طبیعی زخم با مشکل مواجه می­شود (11،27). تا زمانی که تعداد این کانکسین‌ها کاهش نیابد مهاجرت کراتینوسیت­ها آغاز نمی‌شود و به نظر می­رسد که با کاهش تعداد کانکسین­های 43 در رت­های دیابتی شده، اپیتلیالیزاسیون مجدد سرعت می­یابد (2). در آسیب­های بافتی و در طی روند التیام کانکسین 43 نقش حیاتی در تنظیم التهاب دارد (14،16). یکی از متابولیت­های داخل سلولی مهم ATP است که در غلظت میلی مولار در سیتوزول حضور دارد و می­تواند به‌راحتی از برخی نیم­کانال­ها نظیر کانکسین‌های 26، 32 و 43 عبور کند. (23)

فلوفنامیک اسید، یک آمینواسید آروماتیک است که در خانواده ضدالتهاب‌های غیراستروئیدی (NSAIDs) قرار دارد و فعالیت ضدالتهابی آن در اثر مهار سیکلواکسیژناز و درنتیجه ممانعت از سنتز پروستاگلاندین­ها از آراشیدونیک اسید رخ می‌دهد. فلوفنامیک اسید کانال­های 43 را مهار می­کند (35) و بازدارنده‌ی گپ جانکشن­ها است ولی همچنان مکانیسم دقیق عمل این دارو در مهار کردن کانال‌های بین سلولی نامشخص است. (17). تحقیقات نشان می­دهند که اثرگذاری فنامات­ها به دلیل اتصال به محل تنظیم فرکانس­هایی است که موجب بسته شدن کانال­ها می‌شود، به همین دلیل، تأثیر فنامات­ها و مشتقاتش محدود به گپ‌جانکشن­های خاصی است (36). Leybaert و همکاران در سال 2003 با استفاده از پپتید­های وابسته به کانکسین در سلول­های اندوتلیال نشان دادند که فلوفنامیک اسید قادر به مهار کانال کانکسین بوده و مانع از آزاد شدن ATP به خارج سلول می­شود (26). Becker و همکاران در سال 2012 بیان کردند که پپتیدهای وابسته به کانکسین با ممانعت از خروج ATP از سلول، درترمیم زخم­های دیابتی نقش دارند (2). Wang و همکاران در سال 2007 طی مطالعات خود نشان دادند که بیان غیر­طبیعی کانال­های کانکسین در پوست دیابتی، التیام زخم را به تعویق می­اندازد (35). یک مشکل طولانی در زمینه اتصالات روزنه­دار، فقدان عوامل یا مهار‌کننده‌های کانکسین با توانایی بالا است. بازدارنده­های اختصاصی کانال­های کانکسین ممکن است اثرات درمانی داشته باشند، زیرا این کانال­ها به‌عنوان یک هدف فارماکولوژیک قابل‌اعتماد در درمان صرع، آریتمی قلبی، سرطان و تومورها موردتوجه قرارگرفته­اند (32،36).

با توجه به اینکه کانکسین 43 عمده­ترین کانکسین پوست در ارتباط با کراتینوسیت­ها و لایه زایگر بوده و در روند التیام زخم تعداد آن‌ها در کراتینوسیت­های لبه زخم کاهش می­یابد؛ از طرفی فلوفنامیک اسید، یک داروی ضدالتهاب غیراستروئیدی است که قادر به مهار کانکسین 43 می­باشد، به نظر می­رسد که این دارو با مهار کانال­های کانکسین بتواند روند التیام زخم را بهبود بخشد. به همین علت مطالعه حاضر با هدف بررسی تأثیر این دارو بر روند التیام زخم‌های دیابتی صورت گرفت.

مواد و روش‌کار

حیوان: در این مطالعه از 40 سر رت نژاد ویستار با وزن 10 ±200 گرم استفاده شد. رت­ها در قفس­های پنج­تایی در محیط با درجه حرارت 22-20 درجه سانتی­گراد و رطوبت 10±50 درصد و سیکل روشنایی-تاریکی 12 ساعته نگهداری شده، غذا به‌صورت پلیت مخصوص و آب بدون محدودیت در اختیار آن‌ها قرار گرفت.

روش ایجاد دیابت تجربی: دیابت تجربی در رت­ها با تزریق داخل صفاقی 150 میلی­گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن آلوکسان (Sigma Aldrich Corporation – Germany) انجام شد. برای نتیجه بهتر، 24 ساعت قبل از تزریق به رت­ها غذا داده نشد. حیوان­هایی که میزان قند خون آن‌ها در هر دسی­لیتر بیش از 200 میلی­گرم بود و علائمی نظیر پرنوشی و پرادراری داشتند، دیابتی در نظر گرفته شدند (4).

ایجاد زخم: پس از حصول اطمینان از دیابتی بودن حیوان، به‌منظور ایجاد زخم ابتدا رت­ها توسط کتامین و زایلازین بیهوش شده و موهای پشت حیوان تراشیده شد. سپس برشی به ابعاد 2×2 سانتی‌متر در ناحیه پشت ایجاد و پوست به‌طور کامل یا تمام ضخامت، در شرایط آسپتیک برداشته شد.

روش درمان: پس از ایجاد زخم، رت­ها به‌صورت تصادفی به چهار گروه ده‌تایی تقسیم شدند:

گروه اول (2 درصد): زخم ایجادشده در رت­های این گروه توسط پماد 2 درصد اسید فلوفنامیک (2/0 گرم اسید فلوفنامیک، 5/6 گرم وازلین و 3/3 گرم اوسرین) پوشانده شد و پس از قرار دادن گاز استریل بر روی آن، بانداژ گردید.

گروه دوم (5 درصد): زخم ایجادشده در رت­های این گروه توسط پماد 5 درصد اسید فلوفنامیک (5/0 گرم اسید فلوفنامیک، 3/6 گرم وازلین و 2/3 گرم اوسرین) پوشانده و مانند گروه اول بانداژ گردید.

گروه سوم (10 درصد): زخم ایجادشده در رت­های این گروه توسط پماد 10 درصد اسید فلوفنامیک (1 گرم اسید فلوفنامیک، 6 گرم وازلین و 3 گرم اوسرین) پوشانده و مانند گروه اول بانداژ گردید.

گروه کنترل: زخم ایجادشده در رت­های این گروه توسط پماد کنترل (6/6 گرم وازلین و 4/3 گرم اوسرین) پوشانده و مانند گروه اول بانداژ گردید.

از روز صفر تا 21، در تمام گروه­ها به‌صورت روزانه پانسمان رت­ها تعویض و پماد زخم­ها تجدید گردید.

روش تعیین درصد بهبودی زخم: در روزهای صفر، 3، 5، 7، 9، 11، 13، 15، 17، 19 و 21 از سطح زخم توسط دوربین دیجیتال عکس‌برداری شد. به‌منظور بررسی روند بهبود ماکروسکوپی، با استفاده از نرم‌افزار Scion Image مساحت زخم محاسبه گردید. ایجاد زخم و اندازه­گیری سطح آن توسط یک نفر انجام شد. میزان بهبودی بر اساس فرمول زیر به دست آمد (8):

100* (A1-Ax)=  درصد بهبودی

A1/

Ai=  سطح زخم در روز i ام

انجام مطالعات هیستوپاتولوژیک: با توجه به ویژگی ضدالتهابی دارو و امکان تعارض آن با روند التهاب و ترمیم، نیمی از رت­های هر گروه در روز 5 و بقیه آن‌ها در روز 21 پس از ایجاد زخم، توسط اتر یوتانایز شدند. به‌منظور نمونه­برداری از پوست، از ثلث میانی زخم، نواری به طول 3 – 5/2 سانتی­متر و عرض 1 – 5/0 سانتی­متر به‌صورت تمام ضخامت برداشته شد. بدین ترتیب این نوار هم شامل بخش­های حاشیه­ای و مرکزی زخم و هم شامل نواحی سالم مجاور لبه زخم بود. نمونه­ها 72 ساعت در محلول بافر فرمالین 10 درصد و پس از ثبوت، جهت عمل‌آوری در دستگاه هیستوکینت قرار گرفتند. پس از قالب‌گیری توسط پارافین، برش‌هایی به ضخامت 6 میکرون از آن‌ها تهیه و متعاقب رنگ‌آمیزی‌های هماتوکسیلین و ائوزین و ماسون تری کروم توسط میکروسکوپ نوری موردمطالعه قرار گرفتند. از هر نمونه 5 اسلاید و در هر اسلاید 5 منطقه غیر هم­پوشاننده به‌صورت تصادفی انتخاب و بررسی گردیدند. درجه‌بندی زخم­ها براساس روش نیمه کمی و مطابق جدول 1 انجام شد (12).

تجزیه‌وتحلیل آماری با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 21 صورت پذیرفت. داده­های رتبه­ای در پارامترهای اپیتلیالیزاسیون، فیبروبلاست، آنژیوژنز و کلاژن توسط آزمون کروسکال والیس و آزمون من ویتنی در سطح معنی‌داری 05/0P< با هم مقایسه گردید. همچنین داده­های مربوط به سطح زخم نیز با استفاده از آزمون One-Way-ANOVA و تست تکمیلی Tukey در سطح معنی‌داری05/0P< با هم مقایسه گردید.

سلول­های التهابی- (-): عدم حضور سلول­های التهابی

(خفیف): حضور سلول التهابی در دو میدان میکروسکوپی

(متوسط): حضور سلول التهابی در سه تا پنج میدان میکروسکوپی

(زیاد): حضور سلول التهابی در بیش از پنج میدان میکروسکوپی

آنژیوژنز- (-): عدم حضور عروق خونی

(خفیف): حضور صفر تا دو عروق خونی

(متوسط): حضور سه تا چهار عروق خونی

(زیاد): حضور بیش از چهار عروق خونی.

فیبروپلازی- (-): حضور تعداد کمی فیبر کلاژن نازک همراه با تعداد زیاد فیبروبلاست

(خفیف): حضور فیبرهای نازک کلاژن همراه با تعداد زیاد فیبروبلاست

(متوسط): حضور فیبرهای ضخیم کلاژن همراه با تعداد زیاد فیبروبلاست

(زیاد): حضور فراوان فیبرهای ضخیم کلاژن همراه با تعداد کمی فیبروبلاست.

نتایج

 

مساحت زخم:در روزهای صفر، 3، 5، 7، 9، 11، 13، 15، 17، 19 و 21 مساحت زخم در گروه­های موردمطالعه اندازه­گیری و نتایج زیر حاصل شد:

در روزهای صفر، سه و پنج اختلاف معنی­داری بین گروه­های موردمطالعه دیده نشد، اما از روز هفتم در دو گروه کنترل و 2 درصد مساحت زخم کم­تر شده و با گروه­های 5 درصد و 10 درصد دارای تفاوت معنی­دار شد (05/0P<) و این اختلاف را تا پایان دوره (روز 21) حفظ کرد. سطح زخم در گروه­های 5 درصد و 10 درصد بیشتر از گروه­های کنترل و 2 درصد بود. بین دو گروه کنترل و 2 درصد تفاوت معنی­داری مشاهده نشد (تصویر 1).

میزان بهبود زخم نیز تا روز پنجم اختلاف معنی­داری را در بین گروه­ها نشان نداد، اما از روز هفتم به بعد میزان بهبود زخم در گروه­های کنترل و 2 درصد در مقایسه با گروه­های 5 درصد و 10 درصد از اختلاف معنی­دار برخوردار بود. بااین‌وجود میزان بهبود زخم در گروه 5 درصد نسبت به 10 درصد و همچنین در گروه کنترل نسبت به گروه 2 درصد واجد اختلاف معنی­دار نبود. درمجموع بسته شدن و جمع شدن لبه­های زخم و درنتیجه میزان بهبودی زخم، در طول دوره (مدت 21 روز)، در گروه 2 درصد اندکی بهتر از گروه کنترل بود اما این اختلاف معنی­دار نبود. بااین‌حال سرعت بسته شدن زخم و میزان بهبودی آن در گروه 2 درصد بیشتر بوده و در مقایسه با سایر گروه­ها، حتی گروه کنترل از روند بهتر و سریع­تری برخوردار بود (نمودار 1).

زایش بافت اپیتیال:روند زایش بافت اپیتیال در گروه‌های 2 درصد، کنترل، 5 درصد و 10 درصد به ترتیب از بهترین تا بدترین وضعیت مشاهده شد. زایش بافت اپیتیال در روز 21 در گروه­های 2 درصد و کنترل به­وقوع پیوسته و به­خوبی پیشرفت کرده بود، اما در گروه­های 5 درصد و 10 درصد صورت نگرفته و بقایای لخته فیبرینی هنوز در زخم مشهود بود (تصویر 2). در گروه 2 درصد نسبت به سایر گروه­­ها و حتی گروه کنترل، روند زایش بافت اپیتیال کامل­تر صورت گرفته و این اختلاف معنی­دار بود (05/0P<). در گروه کنترل نیز زایش بافت اپیتیال نسبت به گروه‌های 5 درصد و 10 درصد کامل­تر انجام‌شده و این اختلاف معنی­دار بود (05/0P<). در گروه 5 درصد اگرچه رشد و تکثیر کراتینوسیت­ها بهتر از گروه 10 درصد صورت گرفته بود اما روند زایش بافت اپیتیال در هر 2 گروه پیشرفت خوبی نداشت و بین آن‌ها اختلاف معنی­داری مشاهده نگردید.

فیبروبلاست­ها: از نظر تراکم فیبروبلاست در روز پنجم بین گروه­های موردمطالعه اختلاف معنی­داری مشاهده نگردید و تقریباً در تمام گروه­ها تراکم نسبتاً کم تا متوسطی را در جوانه گوشتی تشکیل دادند. در روز 21 تراکم فیبروبلاست­ها در دو گروه کنترل و 2 درصد اندک بود، درحالی‌که در گروه­های 5 درصد و 10 درصد تراکم متوسط و زیاد فیبروبلاست­ها در جوانه گوشتی به چشم خورد. تراکم فیبروبلاست­ها  در روز 21 بین گروه کنترل و سایر گروه­ها از اختلاف معنی­داری برخوردار بود (05/0P<)، همچنین این تراکم در گروه 2 درصد نیز با سایر گروه­ها واجد اختلاف معنی­دار بود (05/0P<) اما هیچ اختلاف معنی­داری بین تراکم فیبروبلاست در گروه­های 5 درصد و 10 درصد مشاهده نشد.

آنژیوژنز:در روز پنجم در هر دو گروه کنترل و 2 درصد عروق جدید نسبتاً زیادی در جوانه گوشتی شکل گرفت اما عروق تشکیل‌شده در گروه 2 درصد از وسعت بیشتری نسبت به گروه کنترل برخوردار بود به‌گونه‌ای که این تفاوت واجد اختلاف معنی­دار بود. میزان تشکیل عروق جدید در جوانه گوشتی در گروه 2 درصد در حد متوسط و در گروه کنترل اندکی کمتر از آن مشاهده شد. این میزان در گروه­های 5 درصد و 10 درصد بسیار کمتر از گروه­های کنترل و 2 درصد بود. اختلاف موجود بین گروه­های 5 درصد و 10 درصد با هر دو گروه کنترل و 2 درصد از نظر تشکیل عروق جدید معنی­دار بود (05/0P<)، بااین‌حال عروق جدید در جوانه گوشتی گروه 5 درصد اگرچه بیشتر از گروه 10 درصد تشکیل شد اما این اختلاف معنی­دار نبود.

در روز 21 در هر دو گروه کنترل و 2 درصد به‌طور قابل‌ملاحظه‌ای از عروق موجود درجوانه گوشتی کاسته شد. میزان عروق موجود در گروه 2 درصد کم­تر از گروه کنترل بوده و اختلاف موجود بین این دو گروه کاملاً معنی­دار بود (05/0P<). در دو گروه 5 درصد و 10 درصد حتی در روز 21 عروق فراوانی در جوانه گوشتی حضور داشت و این تعداد در گروه 10 درصد بیشتر از گروه 5 درصد بود (تصویر 3). اختلاف موجود در گروه‌های 5 درصد و 10 درصد با گروه­های کنترل و 2 درصد از نظر تعداد عروق موجود در جوانه گوشتی کاملاً معنی­دار بود (05/0P<)؛ اما بین دو گروه 5 درصد و 10 درصد تفاوت معنی‌داری از این نظر مشاهده نشد.

رشته­های کلاژن:در روز پنجم رشته­های کلاژن در تمام گروه­های موردمطالعه یا هنوز تشکیل نشده یا در کمترین مقدار خود بود؛ اما در روز 21 با پیشرفت ترمیم، تراکم رشته­های کلاژن بیشتر شده و حجم رشته­های ضخیم کلاژن نیز افزایش یافت. در گروه­های کنترل و 2 درصد حجم قابل‌توجهی از کلاژن ضخیم در جوانه گوشتی دیده شد. اگرچه اختلاف معنی­داری بین این دو گروه از نظر حجم رشته­های کلاژن وجود نداشت، اما نظم رشته­ها و تشکیل دستجات ضخیم کلاژن در گروه 2 درصد بهتر از گروه کنترل قابل رویت بود. تراکم رشته­های کلاژن موجود در جوانه گوشتی در گروه 5 درصد کمتر از کنترل و در گروه 10 درصد کمتر از گروه 5 درصد بوده و علاوه بر آن ضخامت رشته­ها نیز با روند مشابهی در گروه 5 درصد کمتر از کنترل و در گروه 10 درصد کمتر از گروه 5 درصد بود (تصویر 4). این اختلاف اگرچه بین دو گروه 5 درصد و 10 درصد معنی­دار نبود، اما بین گروه­های  کنترل و 2 درصد با گروه­های 5 درصد و 10 درصد دارای اختلاف معنی­دار بود (05/0P<). از منظر کیفی نیز رشته­های کلاژن موجود در جوانه گوشتی در گروه­های 5 درصد و 10 درصد بسیار نامنظم بوده و درجات متفاوتی از رشته­های نازک تا نسبتاً ضخیم را شامل می‌گردید که با پراکندگی ضعیف تا متوسط در جوانه گوشتی قابل‌رؤیت بود.

بحث

مساحت زخم در هر دو گروه کنترل و 2 درصد به نحو چشمگیری نسبت به دو گروه دیگر کم­تر بود که از روز هفتم تسریع شد و تا پایان دوره ادامه داشت. به‌منظور بسته شدن سطح زخم، بافت اسکار کوچکی از لبه­های زخم به سمت مرکز گسترش می­یابد و با حرکتی جاذب به مرکز، سطح زخم را مسدود می­کند (10). فاز پرولیفراسیون در روند ترمیم شامل آنژیوژنز، رسوب کلاژن، شکلگیری بافت گرانوله، رشد سلولی و انقباض زخم است. در فیبروپلازی و تشکیل بافت گرانوله فیبروبلاست­ها تکثیر می­یابند و با تولید کلاژن و فیبرونکتین، یک ماتریکس خارج سلولی موقت پدید می­آورند (1،18). با تکمیل زایش بافت اپیتیال، سلول­های اپیدرمی تمایز مجدد پیداکرده و فنوتیپ اپیتلیالی خود را به ­دست می­آورند و کلاژن نیز بستری را برای مهاجرت سلول­ها پدید می­آورد (36). میوفیبروبلاست­ها بیشترین سلول­های موجود در بافت گرانولاسیون بالغ بوده و بااتصال به لبه­های زخم مسئول انقباض زخم هستند (1،10). Wang و همکاران در سال 2010، بامطالعه بر روی زخم­هایی با شرایط ایسکمیک نشان دادند که استفاده از لیپوزوم­های حاوی ATP سبب افزایش زایش بافت اپیتیال می‌گردد (35). Ghatnekar و همکاران در سال 2009 و 2014 نشان دادند که ACT1 می­تواند منجر به کاهش عملکرد کانکسین 43، افزایش پرولیفراسیون فیبروبلاست­ها، افزایش کشش پوستی و تسریع روند التیام گردد (14،15). در مقابل گزارشات Dvivedi و همکاران در سال 1997 و Krischak و همکاران در سال 2007 حاکی از آن است که NSAID ها سبب کاهش کشش زخم و کاهش میزان فیبروبلاست­ها در بافت همبند شده و اثر ضدپرولیفراتیو دارند (9،25).

در گروه 2 درصد به علت انسداد کانال­های کانکسین و افزایش فیبروبلاست­ها، فرایند انقباض زخم و جمع شدن لبه­های زخم بهتر از سایر گروه­ها به­ وقوع پیوست، درحالی‌که در دو گروه 5 و 10 درصد به علت اختلال در فاز التهابی ترمیم و متعاقب آن ممانعت از تکثیر و مهاجرت فیبروبلاست­ها، مکانیسم­های مشروحه مختل شده و انقباض زخم، روند بسیار آهسته را طی کرد.

همان­گونه که در قسمت نتایج بیان شد، در دو گروه کنترل و 2 درصد روند زایش بافت اپیتلیال نسبت به سایر گروه­ها از پیشرفت بهتری برخوردار بوده به طوری که بافت پوششی از لبه زخم به هم رسیده و اپیدرم را در سطح زخم گسترش داده ­بود. Cogliati و همکاران در سال 2015 با مطالعه بر روی موش­هایی که به‌صورت ژنتیکی دچار نقص کانکسین 43 بودند گزارش کردند که زایش بافت اپیتلیال مجدد و بسته شدن زخم در این موش­ها بهتر صورت می­گیرد (7). فلوفنامیک اسید دارویی است که کانکسین 43 را مهار می­کند (27،35) بنابراین انتظار می­رود گروه­های تحت درمان با این دارو از روند زایش بافت اپیتیال بهتری برخوردار باشند زیرا به نظر می‌رسد که کاهش کانکسین 43 در لبه زخم مهاجرت سلولی را تحریک کرده و برای پرولیفراسیون و مهاجرت کراتینوسیت­ها در التیام زخم ضروری است (27) به‌علاوه مشخص‌شده که در رت­های دیابتی تا زمانی که تعداد این کانکسین کاهش نیابد روند زایش بافت اپیتیال و مهاجرت کراتینوسیت­ها آغاز نمی­شود (2).

برخلاف انتظار در گروه­های 5 و 10 درصد نه‌تنها روند زایش بافت اپیتیال پیشرفت نکرده بود بلکه در همان مراحل اولیه باقی‌مانده بود اما این روند در گروه 2 درصد به‌خوبی و بسیار کامل­تر از سایر گروه­ها انجام‌شده بود. فلوفنامیک اسید یک داروی ضدالتهاب غیراستروئیدی است که با مهار متابولیسم سیکلواکسیژناز، تولید پروستاگلاندین را در بافت ملتهب، کند یا متوقف می­سازد (18). به‌علاوه با مهار کانال کانکسین مانع از آزاد شدن ATP به خارج سلول می­شود (31). از طرفی التهاب یکی از مراحل ضروری در فرآیند ترمیم زخم می­باشد که طی آن نفوذ نوتروفیل­ها، نفوذ مونوسیت­ها و تبدیل‌شدن به ماکروفاژ و نهایتاً نفوذ لنفوسیت­ها به زخم و بافت­های مجاور صورت می­گیرد (18). با افزایش ماکروفاژها تشکیل بافت گرانوله نیز آغاز می­گردد. بر اساس گزارش­های موجود استفاده از داروهای ضدالتهاب، ترمیم را در جراحات پوستی مختل می­کند. ترمیم جراحات اگرچه در غیاب نوتروفیل­ها می­تواند صورت بگیرد اما در فقدان ماکروفاژها کاملاً مختل می­شود (28).

به نظر می­رسد استفاده از غلظت­های 5 و 10 درصد باعث گردیده تأثیرات ضدالتهابی دارو تشدید و روند زایش بافت اپیتلیال مختل گردد. احتمالاً اثرات ضدالتهابی دارو در همان مراحل اولیه‌ ترمیم زخم، نفوذ نوتروفیل­ها، لنفوسیت­ها و مونوسیت­ها را به زخم کاهش داده و متعاقب آن کاهش ماکروفاژها را نیز در پی داشته است. اگرچه Chang و همکاران در سال 2003 نشان دادند که NSAIDها بر روی عملکرد و فعالیت TGF-β تأثیر قابل‌ ملاحظه‌ای ندارد (5) اما به نظر می­رسد اثر ضدالتهابی این دارو با کاهش ماکروفاژها میزان تولید TGF-β را کاهش داده و به‌این‌ترتیب مهاجرت کراتینوسیت­ها و روند زایش بافت اپیتلیال را مختل می­نماید. در غلظت پایین فلوفنامیک اسید (2 درصد)، اثرات ضدالتهابی دارو ناچیز بوده و نفوذ سلول­های آماسی را به محل زخم تحت تأثیر قرار نمی­دهد اما همین غلظت اندک دارو برای مهار کانکسین 43 و جلوگیری از اتلاف ATP کافی است به همین علت روند زایش بافت اپیتلیال در گروهی که غلظت 2 درصد دارو را دریافت نموده بود نسبت به سایر گروه­ها بهتر صورت گرفته و از اختلاف معنی­داری برخوردار بود.

در روز پنجم در تمام گروه­های موردمطالعه، عروق جدیدی در جوانه گوشتی شکل گرفت. در روز 21 تراکم عروق جدید در هر دو گروه کنترل و 2 درصد به­طور قابل‌ملاحظه‌ای کاهش پیدا کرد اما در گروه­های 5 و 10 درصد هنوز عروق فراوانی در جوانه گوشتی حضور داشت. آنژیوژنز بخش ضروری ترمیم است که با ایجاد جریان خون در محل آسیب، نکروز ایسکمیک را محدود کرده، ذخیره اکسیژن بافت، تغذیه و رشد سلول را تأمین نموده و با افزایش میزان متابولیسم، سنتز، تقسیم و مهاجرت سلولی را افزایش می­دهد. بعلاوه افزایش خون‌رسانی و تغذیه کافی میزان سنتز پروتئین را در فیبروبلاست­ها که مسئول تولید کلاژن هستند گسترش می­دهد و منجر به افزایش سرعت‌ترمیم می‌گردد (20). Chiang و همکاران در سال 2007، Wang و همکاران در سال 2010 و Howard و همکاران نیز در سال 2014 نشان دادند که ATP با افزایش آنژیوژنز، سرعت تولید بافت گرانوله را افزایش داده و ترمیم زخم را تسریع می­کند (6،21،35).

مطالعات موجود در زمینه NSAID ها و نقش آن‌ها در آنژیوژنز، نتایج متفاوتی را ارائه نموده است. برخی نظیر Ge و همکاران در سال 2013 نشان دادند که فلوفنامیک اسید قادر به تحریک آنژیوژنز می­باشد (13). از طرفی مطالعات انجام‌شده توسط Jones و همکاران در سال 1999، Tarnawski و همکاران در سال 2003 و Pai و همکاران در سال 2000 نیز حاکی از ممانعت NSAID ها از آنژیوزنز می­باشند. (22،30،34)؛ اما آنچه اخیراً به اثبات رسیده، این است که مکانیسم اثر NSAID های مختلف بر آنژیوژنز و ترمیم زخم متفاوت است. اغلب NSAID ها در محدوده دوز طبیعی خود، تأثیر ناچیزی بر آنژیوژنز دارند، درحالی‌که در مقادیر زیاد می­توانند مهاجرت و تکثیر سلول­ها را مهار کرده و حتی منجر به مرگ سلول شوند (29).

با توجه به مطالب ذکرشده و نتایج حاصل از این مطالعه می‌توان اظهار داشت که داروی فلوفنامیک اسید در غلظت­های کم (2 درصد) با مهار کانکسین­ها و حفظ ATP سلولی، فرآیند ترمیم زخم، ازجمله آنژیوژنز را سرعت بخشیده و حتی در مقایسه با گروه کنترل نتایج بهتری را نشان داد. به نظر می­رسد حتی غلظت­های 5 درصد و 10 درصد دارو نیز فرآیند آنژیوژنز را مختل نکرده بلکه فرآیند ترمیم را طولانی کرده و پس از 21 روز، زخم­ها هنوز در مرحله بافت گرانوله باقی ماندند.

در روز 21 در دو گروه کنترل و 2 درصد تراکم فیبروبلاست اندک بوده و حجم قابل‌توجهی از رشته­های ضخیم کلاژن در بافت گرانوله حضور داشت اما در دو گروه 5 و 10 درصد، تراکم متوسط و زیاد فیبروبلاست­ها به چشم خورد و حجم رشته­های کلاژن در بافت گرانوله اگرچه نسبتاً زیاد بود اما رشته­ها در مقایسه با دو گروه دیگر نازک­تر، پراکنده­تر و نامنظم­تر بودند و تراکم رشته­های ضخیم کلاژن در آن‌ها بسیار کم بود.

کلاژن اصلی­ترین پروتئین ماتریکس خارج سلولی است که در پستانداران 70 تا 80 درصد پروتئین­های پوست را شامل می­شود و کلاژن­های نوع I، II و III اصلی­ترین انواع آن به شمار می­روند که در ترمیم زخم شرکت دارند (3). فیبروبلاست­ها اصلی­ترین سلول مستقر در بافت همبند هستند که سنتز و ترشح ترکیبات بافت همبند و مولکول­های پیش­ساز انواع مختلف کلاژن و فیبرهای الاستیک را بر عهده دارند (3،28). فیبروبلاست­ها متعاقب پرولیفراسیون و مهاجرت، به ماتریکس موقت فیبرین واردشده و آن را توسط ماتریکس خارج سلولی (ECM) جایگزین می­کنند. TGF-β حاصل از ماکروفاژها تکثیر فیبروبلاست­ها را تحریک می‌کند (28). Cogliati و همکاران در سال 2015 نشان دادند که کانکسین­های مهارشده می­توانند تکثیر و فعالیت فیبروبلاست­ها را در زخم افزایش دهند (7). Chiang و همکاران در سال 2007 نیز نشان دادند که استفاده از لیپوزوم­های حاوی ATP می­تواند اثر مشابهی را در ترمیم زخم بروز دهد (6). از طرفی مطالعاتی نظیر بررسی­های Krischak و همکاران در سال 2007 و Guo و DiPietro در سال 2010 بیان­گر آن است که NSAID ها میزان فیبروبلاست­ها را در بافت همبند کاهش می­دهند و روند التیام زخم را با اختلال مواجه می­سازند (18،25).

با عنایت به نتایج حاصل از این مطالعه به نظر می­رسد غلظت 2 درصد فلوفنامیک اسید با انسداد کانال­های کانکسین و حفظ ATP سلول نقش مثبتی در تکثیر و مهاجرت فیبروبلاست­ها داشته و متعاقباً رسوب بیشتر و بهتر کلاژن را به دنبال داشته است. غلظت‌های 5 درصد و 10 درصد دارو با اختلال در فاز التهابی و کاهش سلول­های التهابی، فرآیند ترمیم را به تعویق انداخته، تکثیر و مهاجرت فیبروبلاست­ها را تقلیل داده و با تأخیر مواجه ساخته و درنتیجه رسوب کلاژن نیز مطلوب نبوده است.

درمجموع می­توان گفت که فلوفنامیک اسید دارویی است که ازیک‌طرف دارای اثرات ضدالتهابی است و از طرفی قادر به مهار کردن کانال­های کانکسین و حفظ ATP است. این دو خصوصیت در ترمیم زخم خصوصاً زخم­های دیابتی که میزان کانال­های کانکسین 43 درم افزایش‌یافته و درنتیجه با نشت زیاد ATP مواجه هستیم، اثرات متفاوت و متضادی را بروز می­دهند. مهار کردن کانال­های کانکسین می­تواند منجر به تسریع در فرآیند ترمیم زخم شود در حالی­که اثرات ضدالتهابی دارو با اختلال در فاز التهابی مانع از هجوم سلول­های التهابی به زخم شده و متعاقباً فاکتورهای رشد لازم برای ادامه روند ترمیم به مقدار کافی تولید نشده و فرآیند ترمیم مختل شده و یا به تعویق می­افتد.

نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که داروی فلوفنامیک اسید در غلظت­های کم، با مهار کانال­های کانکسین و حفظ ATP، روند ترمیم زخم­های دیابتی را تسریع می­نماید و اثرات ضدالتهابی آن مانع از بهبود ترمیم نمی­شود؛ اما غلظت­های زیاد دارو نه‌تنها روند ترمیم را در زخم­های دیابتی بهبود نمی­بخشد، بلکه با تداخل در مرحله التهابی، منجر به تأخیر در فرآیند ترمیم می­گردد.

سپاسگزاری

بدینوسیله از مسئولین دانشگاه سمنان جهت فراهم آوردن امکانات لازم برای انجام این پژوهش و از آقای مرتضی صابری و حسن تقی­زاده جهت همکاری در امور آزمایشگاهی این پژوهش صمیمانه تقدیر و تشکر می­گردد.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

 

جدول 1. معیار درجه بندی زخم­ها با روش نیمه کمی.

 

کلاژن

آنژیوژنز

فیبروبلاست

سلول التهابی

اپیتلیالیزاسیون

درجه

-

-

-

-

ضخیم شدن لبه­های برش

0

حداقل در جوانه گوشتی

خفیف در بافت­های زیرجلدی

خفیف در بافت­های مجاور

خفیف در بافت­های مجاور

مهاجرت سلول­ها

(50> درصد)

1

خفیف در جوانه گوشتی

خفیف در جوانه گوشتی

خفیف در جوانه گوشتی

خفیف در جوانه گوشتی

مهاجرت سلول­ها

(50≤ درصد)

2

متوسط در جوانه گوشتی

متوسط در جوانه گوشتی

متوسط در جوانه گوشتی

متوسط در جوانه گوشتی

به هم رسیدن لبه­های برش

3

زیاد در جوانه گوشتی

زیاد در جوانه گوشتی

زیاد در جوانه گوشتی

زیاد در جوانه گوشتی

کراتینه شدن

4

 

 

 

 

 

جدول 2. درجه بندی زخم‌ها از منظر فاکتورهای اپیتلیالیزاسیون، سلول‌های التهابی، حضور فیبروبلاست‌ها، آنژیوژنز و کلاژن.

 

کلاژن

    آنژیوژنز

  فیبروبلاست

  سلول التهابی

 اپیتلیالیزاسیون

 

روز 21

روز 5

روز 21

روز 5

روز 21

روز 5

روز 21

 روز 5

روز 21

 روز 5

4

1

2

3

2

3

0

0

2

0

1

گروه کنترل

4

1

2

3

2

3

0

0

2

0

2

4

1

2

3

2

3

0

0

2

0

3

4

1

2

2

1

3

0

0

2

0

4

4

1

2

2

2

3

0

0

2

0

5

4

1

1

3

2

3

0

0

3

0

1

گروه 2 درصد

4

1

1

3

1

3

0

0

3

0

2

4

1

1

3

1

3

0

0

3

0

3

4

1

2

3

1

3

0

0

3

0

4

4

1

1

2

2

3

0

0

3

0

5

3

1

3

2

3

3

0

0

1

0

1

گروه 5 درصد

3

1

3

2

3

3

0

0

1

0

2

3

0

4

1

4

2

0

0

1

0

3

3

0

4

1

4

2

0

0

1

0

4

3

1

3

2

3

3

0

0

1

0

5

2

0

4

2

4

3

0

0

0

0

1

گروه 10 درصد

2

0

4

2

4

3

0

0

0

0

2

2

0

4

1

4

3

0

0

0

0

3

2

0

4

2

4

2

0

0

0

0

4

2

0

4

1

4

3

0

0

0

0

5

 

 

 

نمودار ۱. میزان بهبودی زخم در گروه های موردمطالعه.

تصویر 1. سطح زخم در روز 21 ترمیم. بسته شدن زخم در گروه 2 درصد از بهترین و در گروه 10 درصد از بدترین وضعیت برخوردار است. کنترل=A، 2=B درصد، 5=C درصد، 10=D درصد.

تصویر 2. وضعیت زایش بافت اپیتیال در روز 21 ترمیم. در دو گروه کنترل  و 2 درصد زایش بافت اپیتیال به‌خوبی گسترش‌یافته و سلول‌های بافت سنگفرشی مطبق به‌خوبی شکل‌گرفته‌اند. در دو گروه 5 درصد و 10 درصد زایش بافت اپیتیال صورت نگرفته و سطح زخم هنوز واجد لخته فیبرینی است. (H&E; ×=400) کنترل=A، 2=B درصد، 5=C درصد، 10=D درصد، پیکان= اپیتلیوم سنگفرشی مطبق.

تصویر 3. وضعیت عروق جدید در روز 21 ترمیم. تعداد عروق از کمترین در گروه 2 درصد تا بیشترین در گروه 10 درصد متغیر است. (H&E; ×=400) کنترل=A، 2=B درصد، 5=C درصد، 10=D درصد، نوک پیکان= رگ خونی.