مطالعه وقوع نوترتیبی و حضور ژنوتیپ‌های G گاوی در روتاویروس‌های گروه A انسانی در تهران

نوع مقاله: میکروبشناسی و ایمنی شناسی

نویسندگان

1 گروه میکروبیولوژی و ایمونولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، تهران، ایران

2 گروه میکروبیولوژی و بیوتکنولوژی میکروبی، دانشکده علوم زیستی و بیوتکنولوژی دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

3 دانشکده دامپزشکی دانشگاه تخصصی فناوری‎های نوین آمل، آمل، ایران

چکیده

زمینۀ مطالعه: روتاویروس‌های گروه A یکی از مهمترین عوامل مسبب گاستروانتریت و عامل 30 تا 50 درصد موارد اسهال نوزاد انسان و سایر حیوانات می‌باشند. ژنوتیپ G این ویروس‌ها بر اساس توالی ژن رمز کننده پروتئین سطحی این ویروس‌ها (VP7) تعیین شده که یکی از مهمترین عوامل القاء کننده ایمنی علیه ویروس است و نسبت به هر ژنوتیپ اختصاصی عمل می‌کند.
هدف: در مطالعه حاضر احتمال وقوع ژنوتیپ‌های رایج روتاویروس A گاوی در جمعیت روتاویروس انسانی مورد بررسی قرار گرفته است.
روش‌کار: تعداد 100 نمونه از مدفوع کودکان زیر 2 سال مبتلا به اسهال از شهر تهران و ورامین جمع آوری و به منظور ردیابی حضور روتاویروس A با استفاده از روش ELISA مورد بررسی قرار گرفت. نمونه‌های مثبت بر روی خط سلولی MA-104 با چند پاساژ جداسازی و کشت شدند. سپس کلیه نمونه‌های مثبت (49 نمونه) با استفاده از روش semi-nested RT-PCR و پرایمرهای اختصاصی تعیین کننده ژنوتیپ‌های رایج گاوی مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج: از 100 نمونه، 49 مورد در الایزا مثبت تشخیص داده شدند. 8 نمونه در مرحله اول semi-nested RT-PCR باند مربوط به قطعه مورد نظر را نشان دادند و در دور دوم، در دو نمونه اخذ شده از شهر ورامین، نتایج مثبت بود و وجود قطعه VP7 گاوی در یکی G6 و در دیگری دو قطعه G6 و G8 تشخیص داده شد که نشان از عفونت همزمان حداقل با دو جدایه روتاویروس انسانی نوترتیب دارد. هر 6 نمونه‌ منتخب الایزا مثبت که به روی خط سلولی MA104 برده شده بودند، پس از 5-4 بار پاساژ متوالی آثار تخریب سلولی (CPE) را نشان دادند و زنده بودن روتاویروس‌های نمونه‌های منتخب این مطالعه تایید گردید.
نتیجه‌گیری نهایی: نتایج این مطالعه بیانگر وجود نوترتیبی روتاویروس‌های انسانی با روتاویروس گاوی است و نشان می‌دهد که در صورت ظهور تیپ‌های جدید انسانی، به دلیل تفاوت سویه نوترتیب جدید در پروتئین ایمنوژن، امکان غالب شدن آن و در نهایت، همه گیری و تلفات چه بسا قابل ملاحظه‌ای امکان خواهد داشت که به مطالعات بیشتر و پایش مداوم نیاز دارد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Study on the Reassortment and the Presence of G genotypes of Bovine Group A Rotaviruses in the Human Rotaviruses in Tehran

نویسندگان [English]

  • Omid Madadgar 1
  • Seyed Masoud Hosseini 2
  • Ahmad Nazaktabar 3
  • Abbas Barin 1
  • Faeze Jahangiri 2
  • Ahmad Vahedi 1
1 Department of Microbiology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran
2 Department of Microbiology and Microbial Biotechnology, Faculty of Life Sciences and Biotechnology, Shahid BeheshtiUniversity, Tehran, Iran
3 Faculty of Veterinary Medicine, Amol University of Special Modern Technology, Amol, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Rotavirus Group A is one of the most important causes of gastroenteritis as it is isolated from 30 to 50% of infant diarrhea from humans and other animals. G genotype of the virus is determined by gene sequence of a surface protein of the virus (VP7), one of the most important factors in inducing immunity against the virus which acts very specific to each genotype.
OBJECTIVES: In the present study the presence of common bovine rotavirus genotypes A was examined in human rotavirus population.
METHODS: A total of 100 stool samples from children under 2 years of age in Tehran and Varamin were collected and to track the presence of rotavirus A, were evaluated using ELISA method. Positive samples were isolated and cultured on the MA-104 cell line after several passages. The positive samples (49 samples) were determined to be the G type using semi-nested RT-PCR and primers specific for bovine common genotype.
RESULTS: From 100 samples, 49 were positive in ELISA. Eight samples in the first semi nested RT-PCR showed the desired rotavirus bands and in the second round, the results were positive for the presence of bovine VP7 in two samples taken from Varamin, in one sample, G6, and in another sample, two genotypes of VP7, G6 and G8 were detected, indicating infection with at least two strains of human rotavirus reassortant. Six of the ELISA selected positive samples that were taken to the cell line MA104, showed effects of cell damage (CPE) after 4-5 consecutive passages, demonstrating proliferation of the rotaviruses of this study and so, their viability was confirmed.
CONCLUSIONS: The results of this study indicate reassortment between bovine and human rotaviruses and show that in case of occurrence of bovine and human rotavirus infection and the emergence of new human type, due to reassortment strain differences in protein immunogen it is possible to overcome due to lack of maternal immunity in the human population and low efficiency of current vaccines and, ultimately, epidemic and considerable losses may occur. Hence, more research is warranted.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Group A rotavirus
  • Gastroenteritis
  • Reassortment
  • VP7
  • G genotyping

مقدمه


گاستروانتریت یکی از مهمترین بیماری‌های نوزادان و کودکان است که فارغ از عامل مسبب آن، یکی از 6 عامل مسبب 6/10 میلیون موارد مرگ و میر کودکان در کشورهای در حال توسعه محسوب می‌شود. در میان عوامل مسبب اسهال کودکان روتاویروس‌های گروه A از اهمیت ویژه ای برخوردارند چرا که این ویروس‌ها از 50-30 درصد موارد این بیماری در کودکان و نوزادان جدا می‌شوند. علاوه بر نوزاد انسان، این ویروس‌ها در نوزاد سایر حیوانات از جمله گاو نیز موجب گاستروانتریت و اسهال می‌گردند.

روتاویروس‌های گروه A در جنس روتاویروس و خانواده رئوویریده طبقه بندی می‌شوند. RNA ژنومی این ویروس‌ها دو رشته‌ای بوده از 11 قطعه تشکیل شده است که درون یک پارتیکل سه لایه و فاقد پوشش چربی قرار گرفته‌اند. اعضای جنس روتاویروس بر اساس ویژگی‌های آنتی ژنی پروتئین VP6 در قالب 7 گروه سرمی که از A تا G نامگذاری شده‌اند، تقسیم بندی می‌شوند که روتاویروس‌های گروه A از نظر بیماریزایی اهمیت بالاتری نسبت به سایر گروه ها دارند. روتاویروس‌های گروه A بر‌اساس توالی ژنتیکی ژن‌های رمز کننده پروتئین‌های سطحی خود که VP7 و VP4 نامیده می‌شوند، به ترتیب به ژنوتیپ‌های G و P تقسیم‌بندی می‌شوند. این دو پروتئین نقش به سزایی در القای تولید آنتی بادی‌های خنثی کننده دارند که در این میان پروتئین VP7 نقش مهمتری دارد (4،6،9). تا کنون 27 ژنوتیپ G و 37 ژنوتیپ P شناسایی شده است (23). ایمنی ناشی از ژنوتیپ‌ها اختصاصی است و قادر به ایجاد محافظت در برابر سایر ژنوتیپ‌ها نمی‌باشد، بنابراین برای ساخت واکسن علیه بیماری آگاهی از رایج‌ترین ژنوتیپ‌های یک منطقه بسیار مهم است. به همین دلیل مطالعات بسیاری در سراسر جهان برای تعیین شایع‌ترین ژنوتیپ موجود در هر منطقه همواره انجام می‌شود (5،6،9،26). مطالعات نشان می‌دهد که ژنوتیپ‌های G1، G2، G3، G4 و G9 در کنار ژنوتیپ‌های G5 و G8 در جمعیت انسانی از بیشترین شیوع برخوردارند. در حالیکه G6، G10 و G8 رایج ترین ژنوتیپ‌های G گاوی شناخته می‌باشند (3،6). با توجه به قطعه قطعه بودن ژنوم روتاویروس‌ها، وقوع نوترتیبی یکی از مهمترین عوامل مؤثر در تکامل این ویروس‌ها شناخته می‌شود و مشاهدات بسیاری از محققان در جهان وقوع نوترتیبی در میان قطعات ژنی رمز کننده پروتئین VP7 در بین روتاویروس‌های A انسانی و گاوی و تعویض ژنوتیپ ناشی از آن را گزارش کرده‌اند. این مسئله می‌تواند منجر به ورود ژنوتیپ‌های جدید و بدون سابقه ایمنی در جمعیت انسانی بشود (9،10). مطالعات متعددی جهت تعیین ژنوتیپ‌های G روتاویروس‌های A گردش کننده در جمعیت انسانی و همچنین گوساله‌های نوزاد انجام شده است (7،16،18،21). ولی تا کنون مطالعه‌ای در مورد امکان حضور ژنوتیپ‌های G رایج گاوی در جمعیت انسانی در ایران انجام نشده است.

این مطالعه با هدف یافتن امکان نوترتیبی و حضور ژنوتیپ G گاوی در نمونه‌های بالینی اخذ شده از بیمارستان‌های شهر تهران و مراکز درمانی شهرستان ورامین، صورت گرفت.

مواد و روش کار

تعداد 100 نمونه از کودکان زیر دوسال مبتلا به اسهال در استان تهران در طول فصل بهار تا پاییز 1393 از بیمارستان‌ها و مراکز درمانی شهر تهران و شهرستان ورامین (از هر کدام 50 نمونه) جمع‌آوری شدند. نمونه‌ها پس از اخذ در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند و با حفظ زنجیره سرد به آزمایشگاه دانشکده دامپزشکی منتقل و تا زمان آزمایش در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

آنتی ژن الایزا: کلیه نمونه‌ها به منظور حضور آنتی ژن روتاویروس A با استفاده از کیت تجاری الایزا ساخت شرکت POURQUIER (Pourquier ELISA Trikit, Institut Pourquier, France)  فرانسه مطابق دستورالعمل شرکت سازنده، مورد آزمایش قرار گرفتند.

کشت: به منظور بررسی زنده بودن روتاویروس‌های انسانی این مطالعه، 6 نمونه‌ای که در آزمون آنتی ژن الایزا مثبت تشخیص داده شده بودند و جذب نوری بالایی داشتند، به منظور جداسازی در کشت سلول انتخاب شدند. کشت روتاویروس فقط به منظور بررسی زنده بودن و تایید صحت آزمایشات انجام گرفت و کشت نمونه‌های الایزا منفی انجام نگردید. پس از عمل آوری سلول‌های دودمان MA104 (Monkey African Green Kidney cell line) در فلاسک‌های کشت سلول، با نمونه‌های آماده شده تلقیح انجام شد. آماده سازی نمونه‌های مدفوع جهت تلقیح به کشت سلول به صورت زیر انجام شد. پس از تهیه سوسپانسیون 10درصد مدفوع در محیط کشت DMEM و ورتکس شدید، سوسپانسیون‌ها به مدت 20 دقیقه با قدرت 25000-20000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند و مایع رویی پس از جمع آوری در میکروتیوپ‌های 5/1میلی لیتری با افزودن 5 میکرولیتر آنتی بیوتیک پنی سیلین ( 1000000واحد بین المللی) – استرپتومایسین (1 گرم) ضدعفونی شدند.

جهت فعال سازی ویروس‌ها به سوسپانسیون تهیه شده به نسبت برابر محلول حاوی تریپسین 20 میکروگرم/میلی لیتر اضافه شد و به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری گردیده و در مرحله بعد، پس از سه مرتبه شستشوی کشت سلول تک لایه MA104 با محیط DMEM فاقد سرم (جنین گوساله)، به فلاسک حاوی کشت سلول MA104 تلقیح شد. فلاسک‌های تلقیح شده به مدت یک ساعت در گرمخانه در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری شد. سپس محتویات فلاسک تخلیه و یکبار شستشو شده و در نهایت به آن 10 میلی لیتر محیط کشت DMEM حاوی تریپسین با غلظت 20 میکروگرم/میلی لیتر و فاقد سرم (جنین گوساله) افزوده شد و به مدت یازده روز در گرمخانه در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری می‌گردیدند. نمونه‌ها روزانه به منظور مشاهده CPE بررسی می‌شدند و از آنجایی که معمولاً مشاهده این آثار در کشت روتاویروس‌های گروه A نیاز به عادت دادن ویروس به کشت سلول دارد تا زمان مشاهده CPE، در صورت لزوم سه بار عمل پاساژ کشت سلول به صورت کور تکرار می‌شد. در صورت مشاهده آثار CPE از محیط کشت عکس برداری می‌شد.

Semi-nested RT-PCR: به منظور بررسی احتمال وقوع نوترتیبی، با استفاده از روش Semi-nested RT-PCR کلیه نمونه‌های مثبت با استفاده از پرایمرهای تعیین کننده ژنوتیپ‌های مهم گاوی G6، G10 و G8 که پیش از این توسط سایر محققان ارائه شده بود، با اندکی تغییرات به شرح زیر بررسی شدند (12،14) (جدول 1). به طور خلاصه dsRNA ژنوم ویروس با استفاده از کیت تجاری  VETEK viral DNA/RNA Extraction Kit (iNtRON, South Korea)  استخراج شد. مرحله اول آزمون RT-PCR با استفاده از کیت One-Step RT-PCR (Bioneer, South Korea) و با استفاده پرایمرهای VP7F وVP7R  با شرایط زیر انجام شد. 5 میکرولیتر RNA استخراج شده به همراه 1 میکرولیتر از هر پرایمر و به 13 میکرولیتر مستر میکس آماده لیوفلیزه RT-PCR در داخل میکروتیوب‌های مخصوص افزوده شد و در دستگاه ترمال سایکلر با برنامه دمایی و زمانی 60 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه جهت انجام واکنش رونویسی معکوس و سپس 95 درجه به مدت 5 دقیقه جهت غیرفعال کردن آنزیم رونویسی معکوس و واسرشتی اولیه اعمال شد، در ادامه 35 چرخه حرارتی شامل 95 درجه سانتیگراد (یک دقیقه)، 52 درجه سانتیگراد (یک دقیقه) و 72 درجه سانتیگراد (یک دقیقه) اعمال شد و جهت طویل سازی نهایی 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه در نظر گرفته شد.

محصول این واکنش جهت تعیین تیپ با پرایمرهای تعیین ژنوتیپ‌های G6(DT6)، G8(HT8) و G10(ET10) که در جدول 1 آمده است به همراه پرایمر VP7F به عنوان پرایمر مشترک، در واکنش PCR با استفاده از کیت PCR ساخت شرکت سیناکلون ایران، به شرح زیر مورد بررسی قرار گرفتند. جهت انجام این واکنش 2 میکرولیتر از محصول RT-PCR دور اول با 5/2 میکرولیتر بافر، 75/0 میکرولیتر MgCl2، 75/0 میکرولیتر  dNTPs، 75/0 میکرولیتر از هرکدام از پرایمرهای ذکر شده، 5/0 میکرولیتر آنزیم Taq DNA polymerase و 5/14 میکرولیتر آب عاری از نوکلئاز مخلوط شد و با استفاده از دستگاه ترمال سایکلر تحت برنامه دمایی 94 درجه سانتیگراد (5 دقیقه) برای واسرشتی اولیه و سپس 30 چرخه حرارتی شامل 94 درجه سانتیگراد(1دقیقه)، 42 درجه سانتیگراد (2 دقیقه) و 72 درجه سانتیگراد (5/1 دقیقه) و در آخر 72 درجه سانتیگراد به مدت 7 دقیقه قرار گرفته شد.

پس از انجام واکنش PCR محصول آن‌ها در ژل آگاروز 1 درصد الکتروفورز شد و پس از رنگ آمیزی با رنگ اتیدیوم بروماید از نظر حضور باند‌های مورد انتظار بررسی شدند.

نتایج

الایزا: از مجموع 100 نمونه مدفوع اسهالی که با آزمون آنتی‌ژن الایزا مورد آزمایش قرار گرفتند، 49 نمونه از نظر حضور آنتی‌ژن روتاویروس گروه A مثبت شناخته شدند. میزان شیوع کلی 49 درصد بود که در تهران و ورامین به ترتیب، 44 درصد و 54 درصد محاسبه شد.

کشت: هر 6 نمونه‌ منتخب مثبت شده از نظر حضور آنتی‌ژن روتاویروس A در روش الایزا که به روی کشت سلولی MA104 برده شده بودند، پس از 5-4 بار پاساژ متوالی در محیط کشت سلولی MA104 و در حضور تریپسین عادت کرده تکثیر داده شدند و آثار تخریب سلولی ناشی از تکثیر ویروس زنده در سلول‌ها (CPE) را نشان دادند. بنابراین زنده بودن روتاویروس‌های نمونه‌های منتخب این مطالعه تایید گردید.

 

Semi-nested RT-PCR: در این مطالعه ابتدا به منظور تکثیر ژنوم رمزکننده پروتئین VP7 از پرایمرهای عمومی VP7-R و VP7-F استفاده شد که این پرایمرها قطعه‌ای با طول 871 باز نوکلئوتیدی از کل ژنوم رمزکننده پروتئین VP7 را تکثیر می‌دهند و از نمونه‌های مثبت که PCR گذاشته شد، 8 نمونه باند واضح مربوط به قطعه مورد نظر را نشان دادند و تعدادی هیچ باندی در دور اول ایجاد نکردند ولی در دور دوم باند مورد نظر ایجاد گردید. هدف از این مطالعه به دست آوردن شیوع با روش مولکولی نبود. از مجموع 49 نمونه‌ای که برای تعیین ژنوتیپ با روش Semi-nested RT-PCR با پرایمرهای اختصاصی نوع گاوی مورد آزمایش قرار گرفتند، در 1 نمونه باند واضح مربوط به قطعه با طول 222 باز نوکلئوتیدی (ژنوتیپ G8) دیده شد و در یک نمونه دیگر  باند واضح مربوط به قطعات 448 باز نوکلئوتیدی (ژنوتیپ G6) و 222 باز نوکلئوتیدی (ژنوتیپ G8) را نشان دادند. که هر دو باند مشاهده شده در نمونه دوم، نشان‌دهنده وجود عفونت همزمان نوزاد با هر دو ژنوتیپ است. سایر نمونه‌ها علی‌رغم اینکه در واکنش دور اول PCR باندهای واضح در طول 881 باز نوکلئوتیدی ایجاد کرده بودند در واکنش دور دوم PCR (واکنش تعیین ژنوتیپ G گاوی) هیچ باندی که معرف وجود ژنوتیپ G گاوی با توجه به پرایمرهای اختصاصی مورد استفاده باشد، ایجاد نکردند. نتایج کلی صورت گرفته در آزمایش دور دوم Semi-nested RT-PCR نشان می‌دهد که Reassortment یا بازآرایی (نوترتیبی) روتاویروس‌های گاوی و انسانی صورت گرفته است به طوری که در سه مورد وجود قطعات VP7 گاوی در روتاویروس‌های انسانی تایید شد.

بحث

در مطالعه حاضر تعداد 100 نمونه مدفوع از کودکان زیر دوسال مبتلا به اسهال از دو شهر واقع در استان تهران در طول فصل بهار تا پاییز 1393 جمع آوری شد. به این منظور از بیمارستان‌ها و مراکز درمانی شهرهای تهران و شهرستان ورامین از هر کدام 50 نمونه جمع آوری گردید. شهرستان ورامین به این علت برای جمع آوری 50 درصد نمونه‌ها انتخاب شد که علاوه بر بالا بودن تراکم و جمعیت شهری، در مناطق روستایی اطراف آن گاوداری‌های صنعتی بسیاری وجود دارد و احتمال برخورد دو جمعیت انسانی و دامی و تبادل ویروس میان این دو جمعیت بالا است و از طرفی به علت پایین بودن ارائه خدمات پزشکی در روستاها و همچنین فاصله ناچیز میان روستاها با مرکز شهرستان ورامین (شهر ورامین) میزان مراجعه روستائیان به مراکز درمانی این شهر بالا است و از این رو انتظار می‌رود احتمال آلودگی با روتاویروس‌های جمعیت گاوی در جمعیت انسانی در این شهرستان بالا باشد.

در این مطالعه از 100 نمونه، 49 مورد در الایزا مثبت تشخیص داده شدند. سپس به منظور تکثیر ژنوم رمزکننده پروتئین VP7 از پرایمرهای عمومی VP7-R و VP7-F استفاده شد که این پرایمرها قطعه‌ای با طول 881 باز نوکلئوتیدی از کل ژنوم رمزکننده پروتئین VP7 را تکثیر می‌دهند و از نمونه‌های مثبت که PCR گذاشته شد، 8 نمونه باند واضح مربوط به قطعه مورد نظر را نشان دادند ولی در دور دوم، فقط در دو نمونه ورامین نتایج مثبت بود و وجود قطعه VP7 گاوی در روتاویروس انسانی تایید گردید. اختلاف نتیجه بین الایزا و  PCR می‌تواند به حضور عوامل مهارکننده PCR در نمونه مدفوع، عدم استفاده از سایر پرایمرها، پاسخ مثبت کاذب الایزا، و نیز روش استخراج RNA مربوط باشد (22،24)، یکی دیگر از دلایل منفی بودن واکنش PCR، عدم اتصال مناسب پرایمرها با توالی نوکلئوتیدی الگو است. این موضوع به ویژه در RNA ویروس‌ها که میزان جهش در آن‌ها به مراتب بالاتر از سایر موجودات زنده است بیشتر به چشم می‌خورد (8).

در این مطالعه تعداد 6 نمونه منتخب که بر روی خط سلولی MA104 پاساژ داده شدند، در پاساژ چهارم یا پنجم آثار CPE را بر روی کشت سلولی تک لایه نشان دادند و ویروس‌های عادت داده شده به کشت سلولی MA104، در تلقیح به کشت سلولی پس از 48 تا 72 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد CO2 آثار مرگ سلولی را نشان می‌دادند. نتایج حاصل از روشی که در این مطالعه برای کشت و جداسازی روتاویروس در نظر گرفته شد با روش پیشنهاد شده توسط Kutsuzawa و همکارانش در سال 1982 همخوانی دارد؛ آنان در پاساژ سوم تا ششم آثار CPE را مشاهده نمودند (17). نتایج نشان می‌دهد که روتاویروس‌های نوترتیب این مطالعه فعال بوده و تکثیر پیدا می‌کنند.

در این مطالعه با توجه به مزایای یاد شده از روش Semi-nested RT-PCR جهت تعیین ژنوتیپ‌های G گاوی در موارد انسانی به وسیله پرایمرهای اختصاصی DT6 و HT8 و ET10 مرتبط با قطعات شایع روتاویروس‌ گاوی G6، G8 و G10 استفاده شد (22)، تا بررسی قطعات اختصاصی G تایپ گاوی در موارد اسهال انسانی و وجود نوترتیبی ژنتیکی مشخص شود. از میان نمونه‌هایی که در دور دوم با روش Semi-nested RT-PCR مورد بررسی قرار گرفتند دو نمونه از شهر ورامین علاوه بر ایجاد باند در دور اول، باند واضحی مربوط به دو سروتیپ‌های G6 و G8 ایجاد کردند که در یکی از این دو نمونه هر دو باند G6 و G8 ایجاد شد که نشان‌دهنده عفونت همزمان با هر دو ژنوتیپ است. این نتیجه با در نظر گرفتن این واقعیت که ژنوم روتاویروس‌ها قطعه‌قطعه است بسیار حائز اهمیت می‌باشد، چرا که همواره احتمال وقوع نوترتیبی ژنتیکی در آلودگی همزمان یک سلول با دو روتاویروس و در نتیجه پیدایش سویه نوترتیب جدید وجود دارد (8). پدیده نوترتیبی ژنتیکی، یکی از راهکارهای مهم روتاویروس‌ها در تکامل و همچنین فرار از سیستم ایمنی میزبان است (20). از آنجا که شیوع سروتیپ‌های غیرمعمول در یک نقطه خاص ممکن است در نتیجه وقوع نوترتیبی بین روتاویروس‌های انسانی و حیوانی ایجاد شود (که خود ناشی از انتقال بین گونه روتاویروس‌های حیوان و انسان است) و یا سروتیپ غالب در حیوانات به جمعیت انسانی مجاور زیستگاه حیوانات سرایت و در آن‌ها ایجاد بیماری کند. Gombold و همکاران در تحقیق جالبی درسال 1986 دو جدایه وحشی روتاویروس میمون (SA11) و رزوس (RRA) را به موش‌های نژاد CD-1 نوزاد مادران سرم منفی بطور همزمان خورانده ودر مقاطع زمانی مختلف از نمونه‌های مدفوع، ویروس جدا نموده و روی ژل پلی آکریلامید وجود نوترتیبی قطعات را بررسی نمودند. نتایج نشانگر میزان نوترتیبی 38 درصد (252 از 662 جدایه) بوده که 25 درصد در 12 ساعت ابتدایی و در ادامه در طی 72 و 96 ساعت، بترتیب، 80-100 درصد جدایه ها نوترتیبی حداقل در یک قطعه را نشان دادند. نیز رفته رفته یک جدایه نوترتیب غالب می‌شده که علت آن فشارهای انتخابی ذکر شده است (11). نیز Graham و همکاران در سال 1987 هنگامی‌که جدایه‌های روتاویروس انسانی و گاوی را به خط سلولی کلیه میمون MA104 و نیز BSC-1 همزمان تلقیح نمودند، 511 پلاک متفاوت جدا نموده که از نظر ژنتیک در ژل پلی آکریلامید دارای قطعات متفاوت بودند. نتایج نشان داد که نوترتیبی پدیده اتفاقی نیست، مربوط به قطعات خاصی است و نوع سلول، گونه میزبان و فشارهای انتخابی در فراوانی و قطعه نوترتیب، تأثیر بسزایی دارد (13). همینطور Maunula و همکاران در سال 2002 با بررسی 17 جدایه شاخص اپیدمی‌های سال‌های 1997-1980 فنلاند و بررسی ژنوتیپ آن‌ها، فراوانی بالای تغییرات مشاهده شده را بدلیل نوترتیبی قطعات دانسته و عنوان کردند که این تغییرات فقط در VP7 و VP4 نبوده و دیگر قطعات را نیز شامل می‌شود (19). Iturriza-Gomara و همکاران در سال 2001 پس از بررسی 3601 جدایه روتاویروسی انسانی کشور انگلستان بین سال‌های 99-1995، میزان نوترتیبی جدایه‌ها را 2 درصد گزارش نموده و اظهار داشتند که این پدیده نادر نبوده و جمعیت آن در کل جمعیت روتاویروس جهانی، معنی‌دار است (15). نیز Unicomb و همکاران در سال 1999 روی 1534 جدایه انسانی بنگلادش بین سال‌های 7-1992 مطالعه نموده و تفاوت زیادی در ژنوتیپ G9 از نظر تیپ متفاوت P و همینطور در جدایه‌های G2 و G4 مشاهده نمودند و آن را ناشی از نوترتیبی جدایه‌های G آن‌ها با VP4 (P) متفاوت دانستند. این پژوهشگران نیز تواتر نوترتیبی را در جدایه‌های روتاویروس بنگلادش بسیار بالا برآورد نمودند (28). Trojnar و همکاران در سال 2013 نشان دادند که قطعه VP4(P) از یک جدایه روتاویروس طیورمشابه قطعه جدایه‌های سگ و خوک بوده و نوترتیبی بین روتاویروس‌های طیوری و پستانداری را نشان دادند (27). هم چنین Schumann و همکاران در سال 2009 با بررسی چهار ژن VP4, VP6, VP7, NSP5 در هشت جدایه روتاویروسی ماکیان و بوقلمون، امکان انتقال بین گونه‌ای و نوترتیبی ژن‌های روتاویروس طیور را نشان دادند (25). Bányai و همکاران در سال 2008 در نیکاراگوئه وقوع نوترتیبی و بیماریزایی یک روتاویروس A نوترتیب انسانی – گاوی در کودکان را نشان دادند (2). در نهایت Gentsch و همکاران در سال 2005 با مرور و بررسی ژنوتیپ‌های انسانی و تغییرات بالای آن‌ها اینطور نتیجه گرفتند که تنوع بالای تغییرات روتاویروس انسانی و امکان تبادل بالای آن با قطعات جدایه‌های دیگر انسانی و نیز دامی، لزوم پوشش همه سروتیپ‌ها را در واکسن‌های نوترتیب انسانی یادآور می‌کند (9). 

به عبارت دیگر در صورت عدم رعایت بهداشت، امکان نوترتیبی طبیعی ویروس بین سویه‌های مختلف انسانی و حتی بین سویه‌های انسانی با حیوانی که در این مطالعه به آن پرداخته شد، امکان ایجاد ژنوتیپ نوظهور فراهم می‌گردد. از آنجایی که تبادل قطعات بین سویه‌های انسانی و گاوی به کرات از نقاط مختف دنیا گزارش شده (6،10) و در مطالعه Ahmadi و همکاران در سال 2012 داشتند، تولید سویة بازآرایی (نوترتیب) شدة روتاویروس گاوی را در کشت سلولی با موفقیت انجام داده‌اند، در این مطالعه امکان وجود نوترتیبی در ایزوله‌های جدا شده از بیماران بیمارستان‌ها مطالعه و اثبات گردید (1).

به عبارت دیگر نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که در صورت تبادل قطعه VP7 و ظهور تیپ‌های جدید انسانی، به دلیل تفاوت سویه نوترتیب جدید در پروتئین ایمونوژن، امکان غالب شدن آن در جمعیت انسانی به علت فقدان ایمنی مادری و کارآیی پایین واکسن‌های رایج روی سویه جدید و در نهایت، همه‌گیری و تلفات چه بسا قابل ملاحظه‌ای امکان خواهد داشت که به مطالعات بیشتر و پایش مداوم نیاز دارد. بنابراین پایش سویه‌های موجود روتاویروسی انسانی غالب در مناطق آلوده با روتاویروس گاوی و هشیاری و آمادگی در برابر احتمال وقوع چنین رخدادی منطقی و لازم بنظر می‌رسد.

سپاسگزاری

به این وسیله از معاونت پژوهشی دانشکده علوم زیستی دانشگاه شهید بهشتی به جهت تـأمین هزینه‌های این طرح و نیز از کارکنان آزمایشگاه ویروس شناسی و آزمایشگاه مرکزی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران برای مساعدت و همکاری صمیمانه، تشکر و قدردانی می‌گردد.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

 

جدول 1.ویژگی و توالی هر یک از پرایمر‌های استفاده شده در این مطالعه.

 

منبع

جایگاه اتصال

مفهوم

Sequence 5’ to 3’

نام پرایمر

آزمون

15

51-71

+

ATG TAT GGT ATT GAA TAT ACC AC

VP7-F

G-typing

15

932-914

-

AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC

VP7-R

13

499-481

-

CTA GTT CCT GTG TAG AAT C

DT6 (G6)

13

273-256

-

CGG TTC CGG ATT AGA CAC

HT8 (G8)

13

714-697

-

TTC AGC CGT TGC GAC TTC

ET10 (G10)

 

تصویر 1. وجود آثار تخریب سلولی سایتوپاتیک یکی از نمونه‌های مثبت  پس از 4 پاساژ روی سلول‌های MA104.

تصویر2. آزمایش Semi-nested RT-PCR و باندهای G گاوی مربوط به دو نمونه مثبت که شماره 1، یک باند به اندازه bp222 (ژنوتیپ G8) و شماره 2، دو باند به اندازه‌های bp222 (ژنوتیپ G8) و bp448 (ژنوتیپ G6) را نشان دادند.

 

 

References
 
  1. Ahmadi, E., Soleimanjahi, H., Sadeghizadeh, M., Teimoori., A. (2012). Rearrangement bovine rotavirus production by multiplication with a high proportion Infectivity of the virus in cell culture and proliferation of other nonstructural genes by RT-PCR method. Modares J Med Sci Pathobiol, 15(3), 1-9.
  2. Bányai, K., Esona, M.D., Mijatovic, S., Kerin, T.K., Pedreira, C., Mercado, J., Balmaseda, A., Perez, M.C., Patel, M.M., Gentsch, J.R. (2009). Zoonotic bovine rotavirus strain in a diarrheic child, Nicaragua. J Clin Virol,46, 391-393. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2009.08.005 PMID:19775934
  3. Cashman, O., Lennon, G., Sleator, R.D., Power, E., Fanning, S., O'Shea, H. (2010). Changing profile of the bovine rotavirus G6 population in the south of Ireland from 2002 to 2009. Vet Microbil,146, 238-244. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2010.05.012 PMID: 20541335
  4. Desselberger, U. (2000). Rotaviruses: Methods and Protocols, Vol 34. (1st ed.) Humana Press. Inc. Cambridge, UK. p. 187-218
  5. Desselberger, U., Wolleswinkel-van den Bosch, J., Mrukowicz, J., Rodrigo, C., Giaquinto, C., Vesikari, T. (2006). Rotavirus types in Europe and their significance for vaccination. Pediatric Infect Dis J,25, S30. https://doi.org/ 10.1097/01.inf.0000197707.70835.f3 PMID: 16397427
  6. Estes, M.K., Kapikian, A.Z. (2007). Rotaviruses, In: Fields Virology. Knipe, D.M., Griffin, D.E., Lamb, R.A., Straus, S.E., Howley, P.M., Martin, M.A., Roizman, B. (eds.). (5th ed.) Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, USA. p.1917-1958.
  7. Farahtaj, F., Gallimore, C., Iturriza-Gomara, M., Taremi, M., Zali, M., Edalatkhah, H., Fayaz, A., Gray, J. (2007). Rotavirus VP7, VP4 and VP6 genotypes co-circulating in Tehran, Iran, between 2003 and 2004. Epidemiol Infect,135, 834-838. https://doi.org/10.1017/s0950268806 007485 PMID:17109772
  8. Fenner, F., Bachmann, P.A., Gibbs, E.P.J., Murphy, F.A., Studdert, M.J., White, D.O. (1987). Veterinary virology. (1st ed.) Academic Press Inc. Ltd. London, UK.p. 590-595.
  9. Gentsch, J.R., Laird, A.R., Bielfelt, B., Griffin, D.D., Bányai, K., Ramachandran, M., Jain, V., Cunliffe, N.A., Nakagomi, O., Kirkwood, C.D. (2005). Serotype diversity and reassortment between human and animal rotavirus strains: implications for rotavirus vaccine programs. J Glob Infect Dis,192, S146. https://doi.org/10.1086/431499 PMID: 1710977
10. Ghosh, S., Varghese, V., Samajdar, S., Sinha, M., Naik, T.N., Kobayashi, N. (2007). Evidence for bovine origin of VP4 and VP7 genes of human group A rotavirus G6P [14] and G10P [14] strains. J Clin Microbiol,45, 2751-2753. https://doi.org/10.1128/jcm.00230-07 PMID: 17537935
11. Gombold, J.L., Ramig, R.F. (1986). Analysis of reassortment of genome segments in mice mixedly infected with rotaviruses SA11 and RRV. J Virol, 57(1), 110-116. PMID: 3001336
12. Gouvea, V., Santos, N., Timenetsky, Mdo.C. (1994). Identification of bovine and porcine rotavirus G types by PCR. J Clin Microbiol,32, 1338-1340. PMID: 8051263
13. Graham, A., Kudesia, G., Allen, A.M., Desselberger, U. (1987). Reassortment of human rotavirus possessing genome rearrangements with bovine rotavirus: evidence for host cell selection. J Gen Virol, 68(1), 115-122. https:// doi.org/10.1099/0022-1317-68-1-115 PMID: 3027239
14. Iturriza Gómara, M., Green, J., Brown, D.W.G., Desselberger, U., Gray, J.J. (1999). Comparison of specific and random priming in the reverse transcriptase polymerase chain reaction for genotyping group A rotaviruses. J Virol Methods,78, 93-103. https://doi.org/ 10.1016/s0166-0934(98)00168-2 PMID: 10204700
15. Iturriza-Gómara, M., Isherwood, B., Desselberger, U., Gray, J.I.M. (2001). Reassortment in vivo: driving force for diversity of human rotavirus strains isolated in the United Kingdom between 1995 and 1999. J Virol, 75(8), 3696-3705. https://doi.org/10.1128/jvi.75.8.3696-3705.2001 PMID: 11264359
16. Khalili, B., Cuevas, L., Reisi, N., Dove, W., Cunliffe, N., Hart, C.A. (2004). Epidemiology of rotavirus diarrhoea in Iranian children. J Med Virol,73, 309-312. https://doi.org/10.1002/jmv.20092 PMID: 15122809
17. Kutsuzawa, T., Konno, T., Suzuki, H., Kapikian, A., Ebina, T., Ishida, N. (1982). Isolation of human rotavirus subgroups 1 and 2 in cell culture. J Clin Microbiol,16, 727-730. PMID: 6296195
18. Madadgar, O., Nazaktabar, A., Keivanfar, H., Salehi, T.Z., Zadeh, S.L. (2015). Genotyping and determining the distribution of prevalent G and P types of group A bovine rotaviruses between 2010 and 2012 in Iran. Vet Microbiol, 179(3), 190-196. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2015. 04.024 PMID: 26072368
19. Maunula, L., von Bonsdorff, C.H. (2002). Frequent reassortments may explain the genetic heterogeneity of rotaviruses: analysis of Finnish rotavirus strains. J Virol, 76(23), 11793-11800. https://doi.org/10.1128/jvi.76.23. 11793-11800.2002 PMID: 12414921
20. Midgley, S.E., Bányai, K., Buesa, J., Halaihel, N., Hjulsager, C.K., Jakab, F., Kaplon, J., Larsen, L.E., Monini, M., Poljšak-Prijatelj, M. (2012). Diversity and zoonotic potential of rotaviruses in swine and cattle across Europe. Vet Microbiol, 156(3), 238-45. https://doi.org/10. 1016/j.vetmic.2011.10.027 PMID: 22079216
21. Modarres, S., Modarres, S., Oskoii, N.N. (1995). Rotavirus infection in infants and young children with acute gastroenteritis in the Islamic Republic of Iran. La Revue de Sante de la Mediterranee Orientale, 1(2), 210-214.
22. Monini, M., Cappuccini, F., Battista, P., Falcone, E., Lavazza, A., Ruggeri, F.M. (2008). Molecular characterization of bovine rotavirus strains circulating in northern Italy, 2003-2005. Vet Microbil,129, 384-389. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2007.11.036 PMID: 18191347
23. Papp, H., Matthijnssens, J., Martella, V., Ciarlet, M., Bányai, K. (2013). Global distribution of group A rotavirus strains in horses: a systematic review. Vaccine,31, 5627-5633. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2013.08.045 PMID: 23994380
24. Reidy, N., Lennon, G., Fanning, S., Power, E., O'Shea, H. (2006). Molecular characterisation and analysis of bovine rotavirus strains circulating in Ireland 2002-2004. Vet Microbiol,117, 242-247. https://doi.org/10.1016/j.vetmic. 2006.05.004 PMID: 16844325
25. Schumann, T., Hotzel, H., Otto, P., Johne, R. (2009). Evidence of interspecies transmission and reassortment among avian group A rotaviruses. Virol, 386(2), 334-343. https://doi.org/10.1016/j.virol.2009.01.040 PMID: 19249805
26. Snodgrass, D., Ojeh, C., Campbell, I., Herring, A. (1984). Bovine rotavirus serotypes and their significance for immunization. J Clin Microbiol, 20, 342-346. PMID: 6092421
27. Trojnar, E., Sachsenröder, J., Twardziok, S., Reetz, J., Otto, P.H., Johne, R. (2013). Identification of an avian group A rotavirus containing a novel VP4 gene with a close relationship to those of mammalian rotaviruses. J Gen Virol, 94(1), 136-142. https://doi.org/10.1099/vir.0.047 381-0 PMID: 23052396
28. Unicomb, L.E., Podder, G., Gentsch, J.R., Woods, P.A., Hasan, K.Z., Faruque, A.S.G., Albert, M.J., Glass, R.I. (1999). Evidence of high-frequency genomic reassortment of group A rotavirus strains in Bangladesh: emergence of type G9 in 1995. J Clin Microbiol, 37(6), 1885-1891. PMID: 10325342