اثرات تجویز فلورفنیکل خوراکی روی برخی شاخصهای خونشناختی قزلآلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) تحت چالش با عوامل استرپتوکوکوزیس/ لاکتوکوکوزیس

نوع مقاله : بهداشت و بیماری های آبزیان

نویسندگان

1 گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز، شیراز، ایران

2 گروه علوم پایه، دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز، شیراز، ایران

چکیده

زمینۀ مطالعه: آنتی بیوتیک‌ها می‌توانند وضعیت فیزیولوژیک و سیستم ایمنی میزبان را دستخوش تغییر نمایند و بکارگیری شاخص‌های خونی نشانگر مناسبی برای پایش آن‌هاست.
هدف: مطالعه تغییرات شاخص‌های خون‌شناختی ماهی قزل‌آلای رنگین کمان تحت چالش با عوامل استرپتوکوکوزیس/ لاکتوکوکوزیس در پی مصرف فلورفنیکل خوراکی.
روش‌کار: بدین منظور، تعدادی ماهی (5/7 ± 55 گرم) در یک بلوک کاملاً تصادفی در 6 تیمار و 3 تکرار شامل گروه‌های بدون/ با چالش عفونی هر پاتوژن به طور جداگانه و بدون/ با دارودرمانی در دوزاژ 15 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن برای 10 روز متوالی، مورد آزمایش قرار گرفتند. دوزهای باکتری‌هایStreptococcus iniae (107×87/2) و Lactococcus garvieae (105×8/6) واحد تشکیل پرگنه بر میلی‌لیتر) به مقدار 30 درصد LD50 در آزمایش اصلی بکار گرفته شدند. در پایان دوره آزمایشی، از سیاهرگ ساقه دمی ماهی‌ها خونگیری انجام شد. اندازه‌گیری هماتوکریت و هموگلوبین با استفاده از روش‌های استاندارد و شمارش یاخته‌های خونی پس از تهیه گسترش و با بکارگیری هماتوسایتومتر صورت گرفت.
نتایج: یافته‌ها نشان داد که درصد هماتوکریت، میزان هموگلوبین و تعداد گویچه‌های سرخ خون ماهیان در گروه‌های دریافت کننده دارو نسبت به گروه شاهد به طور معنی‌داری کاهش یافته است (05/0p <). مصرف روزانه فلورفنیکل به مدت 10 روز متوالی در دوز اشاره شده، توانسته سبب کاهش معنی‌دار تعداد لنفوسیت‌های خون شود (05/0p <). از سوی دیگر به نظر می‌رسد که تعداد مونوسیت‌ها، نوتروفیل‌ها و سایر یاخته‌های خونی در پی دریافت دوزاژ دارویی به طور معنی‌داری افزایش یافتند (05/0p <).
نتیجه‌گیری نهایی: به نظر می‌رسد که مصرف خوراکی فلورفنیکل توانسته است سبب بهبود ایمنی ذاتی از طریق افزایش یاخته‌های خونی شود. گرچه با توجه به کاهش فراوانی لنفوسیت‌های خون و اینکه مسئله ایجاد آنمی در ماهی به دنبال مصرف فلورفنیکل کماکان وجود دارد، توصیه می‌شود در صورت کاهش تلفات و بهبود علائم درمانگاهی از سطوح پائین‌تر دامنه مجاز مصرفی آنتی بیوتیک از نظر FDA برای درمان استفاده شود.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

 

فلورفنیکل یکی از ترکیبات ضد باکتری کاربردی در زمینه دامپزشکی است که دارای طیف اثر گسترده بوده و در درمان بیماری‎ تنفسی گاوی، خوکی و همچنین عفونت­های مزمن تنفسی و گوارشی در طیور کاربرد دارد (28). برای نخستین بار در آبزی­پروری، برای درمان و جلوگیری از گسترش عوارض بیماری­های ناشی از Vibrio anguillarum، Edwardsiella tarda وPhotobacterium damselae piscicidaاستفاده شد و مشخص گردید که کارایی بهتری نسبت به کلرامفنیکل دارد (10). همچنین در درمان فرونکولوزیس در آزاد ماهی اقیانوس اطلس به صورت خوراکی بکار گرفته شده و تجویز مقدار 10 میلی­گرم بر کیلوگرم در روز و درمان به مدت 10 روز سبب کاهش تلفات و بهبود علائم درمانگاهی گردید (14). این دارو سبب کنترل تلفات ناشی از سندرم بچه­ماهی نورس قزل­آلای رنگین کمان (RTFS) و بیماری باکتریایی آب­های سرد شده است (6،23). حتی برخی پاتوژن­های درون سلولی نظیر Piscirickettsia salmonis که قادر به ایجاد بیماری و عفونت در آزاد ماهیان هستند نیز، در آزمایشگاه و در مزرعه به فلورفنیکل پاسخ می­دهند (39). هم اکنون، فلورفنیکل خوراکی با برند تجاری Aquaflor® و در دامنه دوزاژ مصرفی تشریح شده در دستورالعمل سازمان غذا و داروی آمریکا (FDA) برای درمان بیماری‌های باکتریایی در ماهیان گرمابی نظیر سپتی سمی ادواردزیلایی و کولومناریس و همچنین کنترل مرگ و میر ناشی از فرونکولوزیس و بیماری باکتریایی کلیه در ماهیان سردابی پرورشی مورد تأیید این سازمان است (8،28).

این آنتی بیوتیک دارای خاصیت باکتریواستات وابسته به دوز بوده و با پیوستن به زیرواحد S50 ریبوزوم­های باکتری­های حساس موجب مهار آنزیم پپتیدیل ترانسفراز گشته، در نتیجه باعث توقف انتقال اسید آمینه­ به زنجیره­های پپتیدی در حال شکل­گیری می­گردد. بنابراین جزء گروه آنتی بیوتیک­های مهارکننده سنتز پروتئین به شمار می­رود (31). با توجه به اینکه، اثرات دارو به طور مستقیم به غلظت آن در محل ایجاد عفونت بستگی دارد و با توجه به نفوذ قابل قبول این آنتی بیوتیک به بافت­های هدف و در نتیجه رسیدن به دوز اثر گذار این دارو در محل آسیب به‌وسیله گردش خون، عملکرد بسیار مناسبی دارد (38). ماهیت شیمیایی دارو به صورت محلول در چربی و دارای pH اسیدی است. زیست فراهمی آن نظیر کلرامفنیکل بسیار بالا و معادل 5/96 درصد تعیین شده است. بنابراین برای رسیدن به اهداف بالینی، انتشار دارو رضایت بخش بوده و با توجه به حجم انتشار قابل توجه، مقدار بافتی آن با مقدار پلاسمایی­اش برابر است. نیمه عمر حذفی برابر با 2/12 ساعت حاکی از این است که نیاز به تجویز روزانه دارد (7،36). با توجه به اینکه فلورفنیکل و تیامفنیکل در مقایسه با آنالوگ بنیادین خود به نام کلرامفنیکل، در ساختمان ملکولی به جای نیترو (NO2) دارای متیل سولفانات (SO2-CH3) هستند، این برتری را دارند که خطراتی مانند نارسایی مغز استخوان (Myelosuppresion) و آنمی آپلاستیک در انسان ناشی از باقیمانده دارویی را ایجاد نکنند. مورد اخیر به عنوان جدی­ترین عارضه مصرف کلرامفنیکل مطرح بوده و ضمن نادر بودن رخداد آن، با توقف مصرف دارو کاملاً برگشت پذیر است (7،18). گفته شده که این آنتی بیوتیک دارای اثر ضد میکروبی نیرومندی بوده و فاقد مهارکنندگی تولید یاخته­های خونی برخلاف همتایان خود است (38).

با اینکه دلایل زیادی برای مصرف کلینیکی فلورفنیکل وجود دارد، تاکنون اثرات سرکوب­گر/ القایی آن بر یاخته­های سلولی در خون پستانداران (12،21)، طیور (13،15) و ماهیان (22،26) گزارش شده است. برای نمونه درصد تیموسیت­های CD4- و CD8- و تعداد مطلق CD4+و CD8+ خون موش در پی مصرف فلورفنیکل طی 7 روز مصرف خوراکی این آنتی بیوتیک افزایش و همچنین درصد لنفوسیت‌های B کاهش یافتند (21). به نظر می­رسد سطح سرکوب شدگی فراسنجه­های ایمنی سلولی در موش­های آزمایشگاهی وابسته به دوز مصرفی این آنتی بیوتیک باشد (12). علی رغم اینکه فلورفنیکل اثرات مثبتی بر پاسخ­های سلولی ایمنی طیور از خود نشان داده است (15). در خصوص مدیریت بهداشتی بیماری­های عفونی در آبزی پروری، آنتی بیوتیک­های مصرفی می­توانند سبب نوتروپنی و حذف آلبومین در خون ماهیان شوند (22). در تیلاپیای تحت درمان با فلورفنیکل نسبت به گروه کنترل، کاهش معنی­دار مقدار هموگلوبین، درصد هماتوکریت، تعداد گلبول­های قرمز و همچنین لوکوسیتوز (نوتروفیلی) به وجود آمده است (4). سطوح کاهش یافته فعالیت فاگوسیتوزی در این گونه ماهی تحت درمان با همین آنتی بیوتیک مشاهده شد، که البته معنی­دار نبوده است (26). با توجه به اطلاعات ناقص و ناسازگار تحقیقات پیشین، بر آن شدیم تا اطلاعات کامل­تری را در مورد درصد هماتوکریت، هموگلوبین، فراوانی یاخته­های خونی به همراه شمارش افتراقی گویچه­های سفید ماهیان قزل­آلای رنگین کمان تحت چالش عفونی با باکتری­های Streptococcus iniae وLactococcus garvieae تحت دوره درمانی 10 روزه با دوز 15 میلی­گرم فلورفنیکل خوراکی بر کیلوگرم (وزن بدن) ارائه دهیم.

مواد و روش­ کار

 ماهیان و شرایط سازگاری: تعداد 300 قطعه قزل­آلای رنگین کمان با میانگین وزن 5/7 ± 55 گرم از مزارع پرورشی در استان فارس (شهرستان سپیدان) خریداری شده و در تانک­های ونیرو 500 لیتری موجود در بخش بهداشت و بیماری­های آبزیان دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز برای 2 هفته دوره سازگاری نگهداری شدند. تعویض آب روزانه در طی این دوره به مقدار 20 درصد حجم هر تانک صورت می‌گرفت و هوا دهی از طریق یک هواده مرکزی انجام می­شد. خوراک‌دهی با پلت­های تجاری شرکتی بایومار (دانمارک) دو بار در روز و به مقدار 2 درصد وزن بدن آن‌ها بوده است. منبع آب یک حلقه چاه با دبی 3-1 لیتر در ثانیه بوده که سختی کل آن معادل 55/344 میلی‌گرم کربنات کلیسم در لیتر سنجیده شد. به علاوه، دمای آب و اکسیژن محلول در طول دوره آزمایش به ترتیب بر روی مقادیر (5/0±)5/16 درجه سانتی­گراد و 57/5 میلی­گرم بر لیتر تنظیم شدند.

طرح آزمایشی: آزمایش در یک بلوک کاملاً تصادفی طراحی شده و دارای 6 تیمار (با 3 تکرار) به شرح: 1) بدون چالش عفونی/ بدون دارودرمانی (C-/T-)، 2) بدون چالش عفونی/ تحت دارودرمانی (C-/T+)، 3) چالش داده شده با L. garvieae/ بدون دارودرمانی (L. g C+/T-)، 4) چالش داده شده با S. iniae/ بدون دارودرمانی (S. i C+/T-)، 5) چالش داده شده با L. garvieae/ تحت دارودرمانی     (L. g C+/T+)، 6) چالش داده شده با S. iniae/ تحت دارودرمانی (S. i C+/T+) بودند. چالش عفونی از طریق تزریق صفاقی (IP) نسبتی از دوز­های LD50 پاتوژن­ها به صورت جداگانه که پیش­تر توسط یک پایلوت مشخص شده بود، صورت گرفت. دوره درمانی در گروه­های چالش داده شده، با استفاده از خوراک آغشته به فلورفنیکل (به مقدار 5/2 درصد وزن بدن و یک بار در روز) با نام تجاری آکوافلور (Aquaflor® 50%, Rooyan Darou, Iran) صورت گرفت. دوز مصرفی 15 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن برای 10 روز متوالی تعیین شد که در دامنه مجاز FDA قرار دارد (9).

پاتوژن­ها و تعیین LD50: دوزهای مورد استفاده در چالش عفونی از طریق تعیین میانه دوز کشنده (LD50) باکتری­ها بدست آمدند. بدین منظور، از منبع باکتری­های S. iniae و L. garvieae که پیش­تر از ماهیان پرورشی بیمار ارسال شده به بخش بهداشت و بیماری­های آبزیان دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز جداسازی و شناسایی شده بودند (2،29) برداشت شده و در محیط BHA به مدت 48 ساعت در دمای 25 درجه سانتی­گراد کشت داده شدند و سپس باکتری­های رقیق شده در محلول PBS استریل، از طریق لام نئوبار (هموسایتومتر) زیر میکروسکوپ نوری (40×) شمرده شدند و رقت­های متوالی از 102الی 109 واحد تشکیل پرگنه بر میلی­لیتر تهیه گردید (2). تلقیح ماهیان از طریق تزریق صفاقی به حجم 200 میکرولیتر از رقت‌های مختلف باکتری­ها و 200 میکرولیتر PBS استریل (گروه شاهد) و بعد از اعمال بیهوشی به روش غوطه وری، با استفاده از غلظت 30 قسمت در میلیون تریکائین متان سولفونات (MS-222) انجام شد. در طی دوره آزمایش پایلوت میزان تلفات ماهیان در 4 روز متوالی ثبت شدند و محاسبه LD50 هر یک از پاتوژن­ها از طریق رگرسیون پروبیت انجام شد. بر اساس نتایج این پایلوت، دوزهای تزریقی مناسب پاتوژن­ها در آزمایش اصلی برای گروه­های چالش داده شده با باکتری­های لاکتوکوکوس گارویه (L. g C+) و استرپتوکوکوس اینیایی (S. i C+) معادل 30 درصد میزان LD50 96 ساعته به ترتیب 105×8/6 و 107×87/2 واحد تشکیل پرگنه بر میلی­لیتر در نظر گرفته شدند. همچنین زمان آغاز دوره درمانی، در پی مشاهده علائم بالینی و همچنین تشخیص باکتری از کلیه ماهیان چالش داده شده، در پایان روز سوم برای تیمارهای C+/T+ مقرر گردید.

نمونه­برداری: پس از پایان دوره آزمایش، ماهیان با استفاده از دوز 100 قسمت در میلیون از ماده MS-222 بیهوش شده و خون‌گیری با استفاده از سرنگ­های 2 میلی­لیتر از سیاهرگ ساقه دمی آن‌ها انجام شد. بخشی از نمونه خونی توسط لوله­های مویینه برداشت شده که با استفاده از خمیر هماتوکریت (Labteron) ته لوله­ها بسته شد و بلافاصله برای اندازه گیری هماتوکریت بکار رفتند. بخش عمده نمونه خونی در تیوب­های محتوی EDTA ریخته شده و برای اندازه‌گیری سایر شاخص­های خونی مورد استفاده قرار گرفت.

سنجش شاخص­های خونی: به‌منظور اندازه­گیری میزان هماتوکریت (PVC) ﻟﻮﻟﻪﻫـﺎی ﻣﻮﻳﻴﻨـﻪ ﻣﺤﺘـﻮی خون به مدت 10 دقیقه در 4000 گرم (30) با ﻣﻴﻜﺮوﻫﻤﺎﺗﻮﻛﺮیت ﺳﺎﻧﺘﺮﻳﻔﻴﻮژ ﺷﺪﻧﺪ، سپس این شاخص ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از صفحه مدرج اﻧـﺪازه ﮔﻴـﺮی گردیده و به صورت درصد بیان گردید (19). اندازه گیری هموگلوبین به روش Cyanmethemoglobin (5) و با استفاده از یک کیت تجاری (پارس آزمون، ایران) انجام شد. به طور خلاصه، مقدار 20 میکرولیتر خون دارای ضد انعقاد با 50 میلی­لیتر محلول درابکین مخلوط شده و به مدت 10 دقیقه در شرایطی که از برخورد نور محافظت می­شد، قرار داده شد. در نهایت مقادیر تراکم نوری (OD) در طول موج 540 نانومتر با استفاده از یک دستگاه اسپکتروفتومتر UV/VIS (مدل 704، شرکت Hitachi، ساخت ژاپن) خوانده شد. شمارش یاخته­های خونی پس از تهیه گسترش خونی با بکارگیری روش هماتوسایتومتر نئوبار بر مبنای روش استاندارد آسیب شناسی درمانگاهی (34) انجام شد. سایر شاخص­های گویچه­های سرخ نظیر هموگلوبین متوسط آن‌ها (MCH)، حجم متوسط گلبولی (MCV) و غلظت متوسط هموگلوبین (MCHC) نیز بر اساس معادلات ارائه شده توسط Grant در سال 2015 بدست آمدند (11):

(معادله 1) MCH (pg) = [Hb/RBC (per million)] × 10

(معادله 2)  MCV (fl) = [PVC/ RBC (per million)] × 10

(معادله 3)  MCHC (%) = (MCH/MCV) × 100

آنالیز آماری داده­ها: جهت آنالیز آماری نتایج بدست آمده از سنجش پارامترهای هماتولوژیک ماهی قزل آلای رنگین کمان در پی عفونت تجربی و دارودرمانی، از نرم افزار SPSS (نسخه 20) بهره گرفته شد. برای پی بردن به وجود اختلاف آماری بین گروه­های آزمایشی از تجزیه واریانس استفاده شده و برای یافتن تفاوت­های موجود بین میانگین­های هر یک از پارامترهای خونی در تیمار­ها، تست تعقیبی دانکن بکار گرفته شد.

نتایج

نتایج بدست آمده از این مطالعه نشان داد که درصد هماتوکریت و میزان هموگلوبین خون ماهیان در گروه­های دریافت کننده دارو نسبت به گروه شاهد به طور معنی­داری کاهش یافته است (05/0P<). از سوی دیگر، هیچ تفاوت آماری بین گروه­های چالش­داده شده با پاتوژن­های مختلف وجود نداشت (05/0P>). از نظر تعداد گویچه­های سرخ مشاهده شده، مصرف خوراکی فلورفنیکل سبب شده تا میزان این شاخص نسبت به کنترل به طور معنی­داری کمتر باشد. عفونت ناشی از عوامل استرپتوکوکوسی و لاکتوکوکوسی نیز سبب کاهش معنی­دار تعداد این گویچه­ها شده و یک اثر هم افزایی نیز در اثر مصرف دارو در ماهیان تحت چالش عفونی دیده شد (05/0P<). این در حالی است که نتایج مربوط به نسبت­های مبتنی بر گویچه­های سرخ حاکی از این بودند که شاخص­های MCH و MCV در گروه­های مصرف‌کننده آنتی بیوتیک به طور معنی­داری نسبت به سایر گروه­ها افزایش یافته است (05/0P<). در مورد شاخص MCHC هیچ تفاوت آماری بین گروه­های مختلف آزمایشی مشاهده نگردید (05/0P>) (جدول 1).

یافته­های مربوط به شمارش کلی و افتراقی گویچه­های سفید نشانگر این بود که تعداد کل این گویچه­ها به ازای یک میلی­لیتر خون جانوران آزمایشی تحت چالش عفونی افزایش یافته است (05/0P<). اثر سرکوبی آنتی بیوتیک در تولید یاخته­های ایمنی در مقایسه آماری گروه­های بیمار شده تجربی که دارودرمانی شدند با آن‌هایی که فلورفنیکل دریافت نکردند، قابل مشاهده است (05/0P<)، ولی در تیمارهای ماهیان سالم تفاوتی بین دریافت‌کنندگان دارو با شاهد وجود نداشت (05/0P>). از منظر شمارش افتراقی این یاخته­ها، این نکته قابل دریافت است که مصرف روزانه فلورفنیکل به مدت 10 روز متوالی در دوز اشاره شده، توانسته سبب کاهش معنی­دار تعداد لنفوسیت­های خون شود (05/0P<). بررسی یاخته­های نارس آن‌ها (لنفوبلاست­ها) سبب تائید این فرضیه شده است. از سوی دیگر به نظر می­رسد که تعداد مونوسیت‌ها، نوتروفیل­ها و سایر یاخته­های مربوط به ایمنی ذاتی در پی دریافت دوزاژ دارویی به طور معنی­داری افزایش یافتند (05/0P<) (جدول 2).

بحث

یافته­های تحقیق مبین کاهش معنی­دار درصد هماتوکریت و میزان هموگلوبین و همچنین تعداد گویچه­های سرخ خون ماهیان در گروه­های دریافت کننده دارو نسبت به گروه شاهد بودند. این نتایج مطابقت زیادی با یافته­های تحقیق Badr در سال 2012 دارد، به طوری که شاخص­های وابسته به گویچه­های سرخ تیلاپیای نیل در پی مصرف فلورفنیکل کاهش یافتند (4). اثبات شده است که مصرف کلرامفنیکل  می­تواند سبب بروز نارسایی مغز استخوان در انسان و مدل­های جانوری گردد و خود منجر به سرکوب تولید همه یاخته­های خونی از جمله گویچه­های سرخ می­شود (36). همانطور که گفته شد تغییر در ساختار شیمیایی کلرامفنیکل، از این عارضه جلوگیری کرده و باعث شد مصرف فلورفنیکل در مدل­های جانوری خطر کمتری برای آن‌ها و همچنین مصرف کننده به دنبال داشته باشد (18). از سوی دیگر، با توجه به اینکه در ماهیان استخوانی جایگاه تولید یاخته­های خونی همانند نوادگان فرگشتی خود همچون پستانداران، در مغز استخوان نبوده و عمدتاً در راس کلیه و طحال است (33)، بر اساس نتایج تحقیق پیش رو، احتمالاً فلورفنیکل از طریق مکانیسم جداگانه‌ای نسبت به کلرامفنیکل سبب سرکوب تولید گویچه­های سرخ و در نتیجه کاهش تعداد آن‌ها در خون شده است. متیل سولفانات اثر منفی بر روی رشد اریتروبلاست­های هسته‌دار در پستانداران داشته و روند تکوینی آن‌ها را به تأخیر می­اندازد (32). اما واجد هسته بودن گویچه­های سرخ بالغ ماهیان در خون محیطی سبب می­شود تا تکوین اریتروبلاست ماهیان به نحوی دیگری باشد (37). بنابراین ممکن است جایگزینی نیترو در ساختار شیمیایی این رده از آنتی بیوتیک­ها (فنیکل­ها) تغییری در اثرپذیری اریتروبلاست­ها ایجاد نکند. همچنین به نظر می­رسد که افزایش شاخص­های MCH و MCV حاکی از یک مکانیسم جبرانی در جهت حفظ بقا در ماهیانی که دچار کم خونی ناشی از مصرف این آنتی بیوتیک شده­اند، باشد.

کاهش معنی­دار در میزان هماتوکریت و تعداد گویچه­های سرخ خون در هنگام آلودگی با پاتوژن­ها به ویژه در مورد لاکتوکوکوس گارویه مشاهده شد که در مطابقت با تحقیقTavakoli  و  Akhlaghiدر سال 2009 است، که پیش­تر اثرات عفونت تجربی باکتری گرم منفی Aeromonas hydrophila روی شاخص­های خونی ماهی قزل­آلای رنگین کمان را بررسی کرده بود (35). کاهش این شاخص­ها در اثر عفونت می­تواند ناشی از دلایل مختلفی از جمله افزایش نفوذپذیری مویرگی و افزایش نرخ فاگوسیتوز لوکوسیت­ها روی گویچه­های سرخ باشد. به علاوه، القای عفونت پاتوژن­های مورد بررسی (S. iniae و L. garvieae) به ماهیان آزمایشی سبب شد تا گویچه­های سفید نیز به شکل کلی و نیز افتراقی افزایش معنی­داری داشته باشند، که تحقیقات زیادی می­توانند این یافته­ها را پشتیبانی کنند. به طوری که بازتولید گرانولوسیت­ها در خون به افزایش نرخ فاگوسیتوزی و کموتاکسی در استرپتوکوکوزیس/ لاکتوکوکوزیس شده است (1،20،25).

بسیاری از آنتی بیوتیک­ها بر فراوانی و عملکرد لوکوسیت­ها اثرگذار هستند و برخی از این داروها مستقیما سبب رفع التهاب تجربی در جانوران می­شوند. تاکنون بیشترین تحقیقات بر روی ماکرولیدها، کینولون­ها و سایکلین­ها انجام شده است (24). یافته‌های تحقیق حاضر نشان داد که مصرف روزانه فلورفنیکل (15 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن) به مدت 10 روز متوالی، منجر به کاهش لوکوسیت­های خون (شمارش کلی)، لنفوسیت­ها و لنفوبلاست­های ماهی قزل­آلای رنگین کمان می­شود. تحقیقات نشان داده است که رفتار لنفوسیت­ها بسته به منشأ آن‌ها می­تواند در مواجهه با آنتی بیوتیک فلورفنیکل اثرپذیری متفاوتی داشته باشد. به‌طوری‌که لنفوسیت­های T در خون موش­ها دریافت­کننده دارو افزایش یافته ولی لنفوسیت­های تکوین یافته از سلول­های بنیادین مغز استخوان روند کاهشی را با افزوده شدن به دوز مصرفی آنتی بیوتیک تجربه کردند (12،21). به نظر می­رسد که نویا یاخته­های (Progenitor cell) لنفوسیت­ها در مغز استخوان پستانداران و یا راس کلیه (و طحال) ماهیان استخوانی به طور غیرمستقیم تحت تاثیر بتالاکتام­ها، کلرامفنیکل و داپسون قرار می­گیرند و تولید لنفوبلاست­ها را محدود می­کنند، که کاهش تولید یاخته­های بالغ را در پی دارد (27).

نتایج تحقیق حاضر نشان از افزایش فراوانی مونوسیت­ها، نوتروفیل­ها و سایر گرانولوسیت­ها به دنبال مصرف فلورفنیکل با دوزاژ اشاره شده داشت. در مورد نوتروفیل­ها، کاهش تعداد این سلول­ها در پی مصرف 10 روزه دوز بالاتر (20 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن) این آنتی بیوتیک را در قزل­آلا (22) و تیلاپیا (4) گزارش شده است که با نتایج تحقیق ما مغایرت دارد که شاید به دلیل تفاوت در دوزاژ مصرفی باشد. در واقع مطالعات اشاره شده تلویحا اثرات ضد التهابی فلورفنیکل را نشان می­دهند به طوریکه نوتروفیل‌ها در دفاع از بدن به ویژه علیه باکتری­ها یک عنصر حیاتی هستند و انتشار آن‌ها همراه با دیگر میانجی­های التهاب سبب می‌شود تا تولید اکسیدانت­ها نظیر هیدروژن پروکساید نیز افزایش یابد (16). این در حالی است که تحقیقات نشان داده بتالاکتام­ها و تتراسیایکلین­ها می­توانند عوامل ایجادکننده انفجار تنفسی را در گرانولوسیت­های چندهسته­ای مهار کنند ولی فنیکل­ها اینگونه نیستند. کلرامفنیکل و تیامفنیکل با افزایش فراوانی این یاخته­های فاگوسیت کننده و تولید HOCl در آن‌ها به ارتقاء دفاع ذاتی کمک می­کنند (17). این بهبود عملکرد می­تواند از طریق اوپسونیزاسیون بواسطه کمپلمان و یا ایمونوگلوبولین و سپس فاگوسیت شدن باکتری­های اوپسونیزه شده منجر به تحریک انفجار تنفسی ناشی از تولید اکسیدانت­ها شود (17،24). این در حالی است که سایر رده­های عوامل ضد باکتریایی نظیر ماکرولیدها و کینولون­ها با استفاده از کاهش تولید گرانولوسیت­ها رفع التهاب طولانی مدت را تسهیل می‌نمایند (24،27).

به‌عنوان نتیجه‌گیری، با توجه به افزایش فراوانی یاخته­هایی نظیر نوتروفیل و مونوسیت، مصرف خوراکی فلورفنیکل توانسته است سبب بهبود ایمنی ذاتی به ویژه از طریق افزایش فاگوسیتوز شود. گرچه ظاهرا ایمنی اختصاصی (حاصل از لنفوسیت­های B) قزل­آلا به دنبال تجویز این دوزاژ از آنتی بیوتیک سرکوب می­شود. بنابراین، یافتن و پیشنهاد یک دوزاژ بالینی که بتواند تمامی شاخص­های ایمنی را در وضعیت بهینه نگهدارد، می­تواند مفید و کاربردی باشد. به نظر می­رسد که مسئله ایجاد آنمی در ماهی به دنبال مصرف فلورفنیکل کماکان وجود دارد. بنابراین توصیه می­شود، مصرف این آنتی بیوتیک از نظر دوزاژ با دقت بیشتری انجام شده و در صورت کاهش تلفات و بهبود علائم درمانگاهی از سطوح پایین­تر دامنه مجاز مصرفی از نظر FDA برای درمان استفاده شود. همچنین برای پیشگیری از تلفات ناشی از هیپوکسی و خفگی احتمالی تا پایان دوره درمان (10 روزه)، هوادهی به طور ویژه برای تانک­ها انجام شده و به جز زمان دارودرمانی از خوراک دهی به ماهیان در سایر زمان‌ها خودداری شود.

سپاسگزاری

بدین وسیله از آقای محمد سعید فریدونی به پاس همکاری و همفکری ارزنده ایشان در این تحقیق قدردانی می­شود.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

 

  1. Akbary, P., Mirvaghefi, A.R., Akhlagi, M., Fereidouni, M.S. (2015). Influence of Maternal and Larval Immunisation against Lactococcus garviae Infection in Rainbow Trout Oncorhynchus mykiss (Walaum) Lysozyme Activity and IgM Level. Open J Anim Sci, 5, 258-269. http://dx.doi.org/10. 4236/ojas.2015.53030
  2. Akhlaghi, M., Mahjor, A.A. (2004). Some histopathological aspects of streptococcusis cultured rainbow trout. B Eur Assoc Fish Path, 24, 132-136. https://doi.org/10.1111/jfd.12775
  3. Alishahi, M., Soltani, M., Zargar, A. (2009). Bacteriological study of Grass carp (Ctenopharyngodon idella) mortality in Khuzestan province. Iran Vet J, 5, 25-34. [In Persian]
  4. Badr, M.O.T., Hashem, M.A., Elmandrawi, S.A. (2012). Clinicopathological studies on some antibiotics used in Nile tilapia with Streptococcus iniae. J Am Sci, 8, 1057-1070.
  5. Blaxhall, P.C., Daisley, K.W. (1973). Routine haematological methods for use with fish blood, J Fish Biol, 5, 771–781.
  6. Branson, E.J. (1998). Rainbow trout fry syndrome: an update. Fish Vet J, 2, 63-66.
  7. De Ocenda, V.R., Almeida-Prieto, S., Luzardo-Álvarez, A., Barja, J.L., OteroEspinar, F.J., Blanco-Méndez, J. (2016). Pharmacokinetic model of florfenicol in turbot (Scophthalmus maximus): establishment of optimal dosage and administration in medicated feed. J Fish Dis, 98, 12-20. https://doi.org/10. 1111/jfd.12525 PMID: 27502011
  8. Food & Drug Administration of the United States. (2011). Judicious use of Florfenicol and Other Antibiotics. (1st ed.) Aquaculture Drug Approval Coordination Workshop, New Hampshire, U.S.A.
  9. Food & Drug Administration of the United States. (2014). FDA-Approved Drugs for Aquaculture in the USA. (5th ed.) US.FDA, Kenilworth N.J., U.S.A.
  10. Fukui, H., Fujihara, Y., Kano, T. (1986). In vitro and in vivo antibacterial activities of florfenicol, a new fluorinated analog of thiamphenicol, against fish pathogens. Fish Pathol, 22, 201-207. https://doi.org/10.3147/jsfp.22.201
  11. Grant, K. R. (2015). Fish Hematology and associated disorders. Vet Clin Exot Anim, 18, 83–103.
  12. Guan, S., Lu, J., Shen, X., Qian, W., Liu, J., Deng, X. (2011). Florfenicol impairs the immune responses to vaccination against foot-and-mouth disease in mice. Immunopharmacol Immunotoxicol, 33, 609–613. https://doi.org/10.3109/08820 139.2010.551434
  13. Hassanin, O., Abdallah, F., Awad, A. (2014). Effects of florfenicol on the immune responses and the interferon-inducible genes in broiler chickens under the impact of E.coli infection. Vet Res Commun, 38, 51-58. https://doi.org/10. 1007/s11259-013-9585-7
  14. Inglis, V., Richards, R.H., Varma, K., Sutherland, I.H., Brokken, E.S. (1991). Florfenicol in Atlantic salmon, Salmo salar L, Parr: tolerance and assessment of efficacy against furunculosis. J Fish Dis, 14, 343-351. https://doi.org/10. 1111/j.1365-2761.1991.tb00831.x
  15. Khalifeh, M.S., Amawi, M.W., Abu-Basha, E.A., Bani Yonis, I. (2009). Assessment of humoral and cellularmediated immune response in chickens treated with tilmicosin, florfenicol, or enrofloxacin at the time of Newcastle disease vaccination. Poult Sci, 88, 2118-2124. https://doi.org/10. 3382/ps.2009-00215
  16. Kobayashi, S.D., Voyich, J.M., DeLeo, F.R. (2003). Regulation of the neutrophil-mediated inflammatory response to infection. Microb Infect, 5, 1337–44. PMID: 14613777
  17. Labro, M-T. (2005). Antimicrobial agents and oxidative burst. In: Antibiotics as Anti-Inflammatory and Immunomodulatory Agents. Rubin, B.K., Tamaoki, J. (eds.). Birkhäuser Verlag. Basel, Switzerland. p. 87-106.
  18. Labro, M-T. (2012). Immunomodulatory effects of antimicrobial agents. Part I: antibacterial and antiviral agents. Expert Rev Anti Infect Ther, 10, 319–340. https://doi.org/10. 1586/eri.12.11
  19. Larsen, H.N., Snieszko, S.F. (1961). Modification of the microhematocrit technique with trout blood. Trans Am Fish Soc, 90, 139–142.
  20. Liaghat, M., Akhlaghi, M., Hosseini, A., Nematollahi, A., Hosseini, S.M. (2011). Humoral and non-specific immune responses in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) naturally exposed to and immunized with Streptococcus iniae. Int J Vet Res, 5, 218-224.
  21. Lis, M., Szczypka, M., Suszko, A., Świtała, M., Obmińska-Mrukowicz, B. (2011). The effects of florfenicol on lymphocyte subsets and humoral immune response in mice. Polish J Vet Sci, 14, 191-198. PMID: 21721401
  22. Maklakova, M.E., Kondratieva, I.A., Mikhailova, E.S., Stupin, R.V., Khapchaev, Sh., Kasumyan, A.O. (2011). Effect of antibiotics on immunophysiological status and their taste attractiveness for rainbow trout Parasalmo (=Oncorhynchus) mykiss (Salmoniformes, Salmonidae). J Ichthyol, 51, 11, 1133–1142. https://doi.org/10.1134/S0032945211110063
  23. Meinertz, J.R. (2011). Depletion of florfenicol amine from the fillet tissue of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) maintained in a recirculating aquaculture system and treated with Aquaflor® medicated feed. Online J Up Mid Environ Sci Centre, 2, 13-18.
  24. Parnham, M.J. (2005). Antibiotics, Inflammation and its resolution: An overview. In: Antibiotics as Anti-Inflammatory and Immunomodulatory Agents. Rubin, B.K., Tamaoki, J. (eds.). Birkhäuser Verlag. Basel, Switzerland. p. 27-48.
  25. Pérez-Sánchez, T., Balcázar, J.L., Merrifield, D.L., Carnevali, O., Gioacchini, G., de Blas, I., Ruiz-Zarzuela, I. (2011). Expression of immune-related genes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) induced by probiotic bacteria during Lactococcus garvieae infection. Fish Shellfish Immunol, 31, 196-201. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2011.05.005
  26. Reda, R.M., Ibrahim, R.E., Ahmed, E.N.G., El-bouhy, Z.M. (2013). Effect of oxytetracycline and florfenicol as growth promoters on the health status of cultured Oreochromis niloticus. Egypt J Aquat Res, 39, 241-248. https://doi.org/10. 1016/j.ejar.2013.12.001
  27. Rubin, B.K. Henke, M.O., Dalhoff, A. (2005). Anti-inflammatory properties of antibiotics other than macrolides. In: Antibiotics as Anti-Inflammatory and Immunomodulatory Agents. Rubin, B.K., Tamaoki, J. (eds.). Birkhäuser Verlag. Basel, Switzerland. p. 247-268. 
  28. Schering-Plough Animal Health Corp. (2005). Freedom of Information Summary, Original New Animal Drug Application, AQUAFLOR Type A Medicated Article (florfenicol), An Antibiotic, For the Control of Mortality in Catfish Due to Enteric Septicemia of Catfish Associated with Edwardsiella ictaluri. (3th ed.) NADA 141-246. p. 5-16.
  29. Sharifiyazdi, H., Akhlaghi, M., Tabatabaei, M., Mostafavi Zadeh, S.M. (2010). Isolation and Characterization of Lactococcus garvieae from diseased rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) cultured in Iran. Iran J Vet Res, 11, 342-350. https://doi.org/10.22099/ijvr.2010.105
  30. Shiry, N., Khoshnoodifar, K., Mirvaghefi, A.R. (2014). Toxicity and impacts of Malathion on some blood indices in Caspian common carp (Cyprinus carpio). J Fish Sci Technol, 3, 1-11. [In Persian]
  31. Shiry, N., Shomali, T., Soltanian, S., Akhlaghi, M. (2018). Comparative single-dose pharmacokinetics of orally administered florfenicol in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum, 1792) at health and experimental infection with Streptococcus iniae or Lactococcus garvieae. J Vet Pharmacol Ther, 41, 51-64. https://doi.org/10.1111/jvp.12736
  32. Shu, X., Gao, Y., Linet, M., Gao, R.N., Gao, U.T., Brinton, L.A., Jin, F., FraumeniJR, J.F. (1987). Chloramphenicol use and childhood leukaemia in Shanghai. Lancet, 8565, 934–937.
  33. Soltani, M. (2009). Immunology of Fish and Crustaceans (1st ed.). University of Tehran Press, Tehran, Iran. [In Persian]
  34. Stopskopf, M. (1993). Clinical Pathology. In Fish Medicine. M Stopskopf, WB. (ed.). Saunders Company, Philadelphia, USA. p. 113-131.
  35. Tavakoli, H., Akhlaghi, M. (2009). Study of lysozyme, immunoglobulin, blood celland hematocrit changes following experimental infection with apathogenic Aeromonas hydrophila in rainbow trout. J Vet Res, 64, 157-162.
  36. Treves-Brown, K.M. (2000). Applied Fish Pharmacology, Aquaculture Series (volume 3) (1st ed.). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands.
  37. Walsh, P.J., Wood, C.M., Moon, T.W. (1990). Red blood cell metabolism. In: Fish Respiration. Perry, S.F., Tufts, B. (eds.). Academic Press. San Diago, USA. p. 41-69.
  38. Wang, L., Han, Y., Jin, S., Ma, Y., Wang, G., Zhao, Q., Chen, Y. (2015). Pharmacokinetic study of florfenicol in healthy and vibriosis-infected Pseudosciaena crocea after oral administration. J Appl Biol Chem, 58, 363−368.https://doi.org/10.3839/jabc.2015.057
  39. Yanez, A.J., Valenzuela, K., Matzner, C., Olavarria, V., Figueroa, J., Avenda~no-Herrera, R., Carcamo, J.G. (2013). Broth microdilution protocol for minimum inhibitory concentration (MIC) determinations of the intracellular salmonid pathogen Piscirickettsia salmonis to florfenicol and oxytetracycline. J Fish Dis, 12, 1-5. https://doi.org/10.1111/jfd.12144