ارزیابی اثرات پلاسمای غنی از پلاکت بر تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان به سلول‌های تاندونی (تنوسیت) در خرگوش

نوع مقاله : جراحی، هوشبری و بیماری های اندام حرکتی

نویسندگان

1 گروه آموزشی جراحی و رادیولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، تهران، ایران

2 پژوهشکده معتمد، جهاد دانشگاهی، تهران، ایران

3 گروه آموزشی پاتولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، تهران، ایران

4 پژوهشکده تحقیقات زیست پزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

چکیده

زمینۀ مطالعه:ترمیم تاندونمی­تواند نیازمند مجموعه­ای از مداخله­های درمانی نظیر ایجاد شرایط خاص فیزیکی، استفاده از روش­های مهندسی بافت، استفاده از فاکتورهای رشد و نیز تحریک­های مکانیکی باشد. بررسی­های گذشته نشان ­داده که استفاده از پلاسمای غنی از پلاکت در ترمیم تاندون مؤثر بوده­است.
هدف:هدف از انجام این مطالعه بررسی اثر تمایزدهندگی ترشحات لخته PRP بر سلول­های بنیادی مزانشیمال اخذ­ شده از مغز استخوان خرگوش می­باشد.
روشکار:سلول­های بنیادی مزانشیمی از مغز ­استخوان 10 سر خرگوش سفید نژاد نیوزیلندی اخذ­ شده و مورد بررسی­های فلوسایتومتری و مورفولوژیک قرار گرفتند. سپس این سلول­ها با استفاده از PRCR تحت درمان قرارگرفته و از نظر ظاهری و نیز مارکرهای معرف تنوسیت­ها با استفاده از روش Real-Time PCR بررسی شدند.
نتایج: بررسی اختلاف بیان ژن­های Scx، Tnmd، کلاژن تیپ I و تناسین C در سلول­های تمایز یافتهدر مقایسه با سلول­های بنیادی نشان داد که میزان بیان همه­ی آن­ها به صورت معنی­داری پس از درمان سلول­ها با PRCR افزایش یافته است.
نتیجه‌گیری نهایی:تحت درمان قرار دادن سلول­های بنیادی با PRCR باعث بیان شدن ژن­های مربوط به تاندون و تمایز سلول­های بنیادی به تنوسیت­ها می­شود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Evaluation of the Effects of PRCR on Differentiation of Autologous Mesenchymal Stem Cells into Tenocytes in Rabbit

نویسندگان [English]

  • MersedehSadat Hossein Boroujerdi 1
  • Mohammad Mehdi Dehghan 1
  • Fereydoun Saberi Afshar 1
  • Keyvan Majidzadeh-A 2
  • Seyed Hossein Mardjanmehr 3
  • Artimes Yahyaei 1
  • Masoumeh Jabarifakhr 4
1 Department of Surgery and Radiology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran
2 Motamed Institute, Jahade Daneshgahi, Tehran, Iran
3 Department of Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran
4 Institute of Biomedical Research, University of Tehran, Tehran, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Tendon repair requires a sequence of medical procedures such as physical modalities, tissue engineering, growth factors, and mechanical stimulation. Previous studies have shown that using of PRP is effective in tendon healing.
OBJECTIVES: The purpose of this study was to investigate the differentiation effect of PRCR on mesenchymal stem cells extracted from rabbits’ bone marrow.
METHODS: Mesenchymal stem cells were extracted from bone marrow (BM-MSCs) of 10 New Zealand white rabbits. The cells were then examined both flow cytometrically and morphologically. Afterwards, the cells received treatment using PRCR. Finally, the markers indicating tenocytes were analyzed through the method of Real-Time PCR.
RESULTS: Investigating the differences between differentiated cells and undifferentiated stem cells (BM-MSCs) regarding the expression of four genes including Scx, Tnmd, Col I, and Tenascin C revealed that the level of expression in all the four genes was significantly enhanced after receiving PRCR- mediated treatment.
CONCLUSIONS: BM-MSCs treated with PRCR express high levels of tendon-related genes and undergo differentiation into tenocyte-like cells.

کلیدواژه‌ها [English]

  • BM-MSCs
  • PRCR
  • differentiation
  • Real-Time PCR
  • Rabbit

مقدمه


جراحات تاندونی ناشی از فشار زیاد، یکی از عواقب بسیار رایج فعالیت­های ورزشی در اسب­ها و نیز انسان می­باشد که اغلب امکان بازگشت بیمار به فعالیت در سطوح قبلی را با خطر روبرو می­کند. به عنوان مثال جراحات وارده به تاندون سطحی خم‌کننده­ی انگشتی (SDFT) در اسب­های ورزشی و مسابقه­ای بسیار رایج است و بازسازی ضعیف تاندون در بسیاری از موارد منجر به ایجاد مجدد جراحت در ناحیه، پس از بازگشت آن­ها به ورزش می­شود. بهترین مدیریت درمان در جراحات ناشی از استفاده­ی بیش از حد تاندون در اسب­های ورزشی باید بتواند مانع تشکیل بافت اسکار زیاد شده، ماتریکس تاندونی نرمال تولید نموده و احتمال جراحات مجدد را در ناحیه کاهش دهد (16،26).

تحت شرایط فیزیولوژیکی طبیعی، یک تاندون کاملاً رشد ‌یافته و بالغ، بافتی است کم­عروق با دانسیته­ی سلولی کم که فعالیت میتوزی بسیار کمی را بروز می­دهد. این موضوع می­تواند توجیه مناسبی برای ترمیم کُند تاندون باشد و اینکه چرا حاصل همین ترمیم نیز در اغلب موارد ماتریکس خارج سلولی می­باشد که از نظر مکانیکی کارایی کافی را ندارد. لیگامنت­ها و تاندون­ها در برابر نیروهای کششی فوق­العاده مقاوم هستند. این­ها بافت­های ویسکوالاستیکی هستند و در فشارهای کمتر از حدود 4 درصد کاملاً الاستیک عمل می­کنند، این بدان معناست که با برطرف شدن فشار به طول اولیه خود بازمی­گردند. فشارهای بیشتر از 4 درصد درجاتی از مشکلات میکروسکوپیک یا ماکروسکوپیک را ایجاد خواهد کرد (12،13).  

استفاده از زیست­مواد و فناوری مهندسی بافت افق­های نوینی را در درمان جراحات بافتی گشوده است. هدف روند رو به رشد مهندسی بافت، رژنراسیون بافت­های آسیب دیده است که این کار را با ترکیب سلول­ها با چهارچوب‌هایی از مواد زیستی (اسکافولد) انجام می­دهند که در نهایت منجر به تشکیل و رشد بافت جدید می­شود. با وجود این، در مورد نوع سلول مورد استفاده و زیست مواد به‌کار رفته به طوری که بتواند موجب بازیابی عملکرد طبیعی و ترمیم بافت آسیب­دیده به نحوی مطلوب و مؤثر شود، پرسش­های بی‌شماری وجود دارد که پاسخ به آن­ها نیازمند انجام مطالعات تجربی بیشتری است (4،6،11).

طی سال­های گذشته در دامپزشکی علاقه­ی فزاینده­ای برای فهم بیولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی (MSCs) به­وجود آمده ­است. این علاقه ناشی از توانایی کاربرد این سلول­ها خصوصاً در ترمیم زخم، مهندسی بافت و سایر زمینه­های درمانی شامل جراحی ترمیمی می­باشد. MSCs را می­توان مستقیماً از آسپیره­های مغزاستخوان، بافت چربی، بند ناف و بعضی بافت­های دیگر استخراج نمود. با آنکه اخذ سلول­های بنیادی از مغزاستخوان پیچیدگی­های خاص خود را دارد و میزان محدودی سلول می­توان از آن اخذ نمود ولی به عنوان بهترین منبع سلولی در این زمینه برگزیده شده است. این سلول­ها در شرایط کشت مناسب و یا در بدن توانایی تمایز به بافت­های متعددی از جمله استخوان، غضروف، عضله، بافت چربی و نیز تولید فاکتورهای رشد و سیتوکین­های مشوق گسترش و تمایز سلولی را دارند (4،11،12،13).

سلول­های بنیادی مزانشیمی اتولوگ به عنوان یک منبع سلولی مناسب شناخته­ شده­اند. کاشت سلول­های بنیادی در ناحیه­ی جراحت منجر به تولید ماتریکسی شده است که بیشتر مشابه ماتریکس تاندون است تا بافت اسکار و بنابراین ظرفیت بازگشت به عملکرد اولیه را افزایش می­دهد. همچنین کاربرد این سلول­ها منجر به مشاهده­ی تعداد بیشتری سلول­های دوکی شکل که در یک راستا قرار گرفته­اند در بررسی­های هیستوپاتولوژیک شده است (6،8،23). اما کاربرد این سلول­ها برخی محدودیت­های عملی را به همراه دارد. مهم‌ترین آن­ها احتمال مشاهده­ی سلول­های غیر تاندونی نظیر سلول­های استخوان و غضروف در ناحیه­ی کاشت این سلول­ها علاوه بر سلول­های تنوسیتی می­باشد. حضور سلول­های استخوان و غضروف منجر به کاهش خاصیت الاستیکی و کاهش استحکام بافت تاندونی تازه تشکیل، خواهد شد (21).

رهیافت­های مهندسی بافت برای ترمیم تاندون به سمت ترمیم جراحات و پارگی­های آن از طریق پیوند تنوسیت­هایی که در شرایط آزمایشگاهی رشد یافته­اند در حرکت است. تحریک MSCs با روش‌های مناسب می­تواند تولید آزمایشگاهی سلول­های خاص مورد نیاز را فراهم کند. نشان ­داده ­شده ­است که با روش‌های مختلفی می‌توان MSCs را به تنوسیت تمایز داد (26، 25، 24، 23، 21، 16، 12، 1).

پروسه­ی ترمیم تاندون شامل چندین مرحله و پیچیده است. تاندون بعد از طی این مراحل وارد مرحله­ی بازسازیمی­شود که در این مرحله توان مکانیکی خود را تا حدودی باز می­یابد. در پروسه­ی ترمیم تاندون بسیاری از فاکتورهای رشد دارای نقش مؤثر هستند. فاکتور رشد پلاکتی (PDGF)، فاکتور رشد اپیدرمی، TGF-β1،فاکتور رشد مشابه انسولینی (IGF-I) و گیرنده‌های خاصی (مثل گیرنده‌ی TGF-β1) به تناسب ایجاد می‌شوند (5،7،20). با توجه به مطالعات گذشته، محققان بر این باورند که اثر تحریک‌کننده‌ی پلاسمای غنی از پلاکت (PRP) در ترمیم و درمان جراحات، مربوط به فاکتورهای رشد موجود در گرانول‌های α پلاکت‌ها می‌باشد که پس از فعال‌شدن پلاکت از آن ترشح می‌شود (3). بنابراین پلاکت­ها می­توانند به عنوان یک منبع ذخیره­ای طبیعی برای آزاد کردن فاکتورهای رشد مورد نیاز ترمیم تاندون و یا تمایز سلول­های بنیادی به تنوسیت­ها به­کار روند (10،15،22).

در این مطالعه، این فرضیه که کاربرد PRCR (که ترکیبی از فاکتورهای رشد مترشحه از لخته‌ی PRP است) می‌تواند تمایز سلول‌های بنیادی به تنوسیت را تحریک کند و نیز باعث تولید مقادیر بالای کلاژن شود.

مواد و روش کار

در این مطالعه تعداد 10 سر خرگوش نر سفید نیوزلندی با وزن میانگین 3 کیلوگرم انتخاب شد. حیوانات به مدت یک هفته قبل از شروع مطالعه در مرکز نگهداری حیوانات آزمایشگاهی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران نگهداری شدند تا استرس حمل و نقل از بین رفته و به محیط جدید عادت کنند. در طی این مدت و در طول کل زمان مطالعه، حیوانات در قفس‌های انفرادی نگهداری و با غذای پلت شده‌ی مخصوص خرگوش تغذیه شدند و دسترسی آزادانه به آب آشامیدنی داشتند. قبل از شروع مطالعه حیوانات تحت معاینه بالینی قرار گرفته و سلامت آن­ها تأیید شد.

استخراجوکشتسلول‌هایبنیادی: تحت بیهوشی عمومی با (30 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن کتامین (Alfasan، هلند) و 8 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن زایلازین (Interchemie، هلند)، به صورت داخل عضلانی حدود 5 میلی­لیتر از مغز استخوان هر خرگوش با استفاده از سوزن جمشیدی از کرست ایلیوم تحت شرایط آسپتیک، در سرنگ حاوی ۷۰۰ واحد برمیلی لیتر هپارین (البرز دارو، ایران) مغز استخوان گرفته شد. نمونه اخذ شده در سرنگ، وارد فالکون ۱۵ میلی لیتری استریل شد و هم حجم آن (نسبت یک به یک) محیط کشت  DMEMدارای گلوکز بالا (5/4 گرم بر لیتر) (Gibco، انگلستان) اضافه شد. این محتویات به آرامی و در مجاورت دیواره فالکون، به نحوی که دو فاز مجزا (بالایی مغزاستخوان و پایینی فایکول) ایجاد شود، وارد 3 میلی­لیتر محلول فایکول شد، سپس به مدت ۳۰ دقیقه در دور g۴۰۰ سانتریفیوژ شد. سلول­های تک‌هسته‎ای جدا شده و در دو مرحله بوسیله DMEM شستشو داده شدند. سپس رسوب حاصله همراه 5 میلی­لیتر محیط کشت که حاوی ۸۰ درصد محیط کشت DMEM، ۲۰ درصد سرم جنین گاو  (FBS) (Gibco، انگلستان) و ۱ درصد آنتی بیوتیک (پنی سیلین 100 واحد بر میلی لیتر و 100 میکروگرم بر میلی لیتر استرپتومایسین) بود، وارد فلاسک ۲۵ سانتی‌متر مربعی فیلتر‌دار  شد و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد با رطوبت ۹۸ درصد همراه ۵ درصد دی­اکسیدکربن در انکوباتور نگهداری ‌شد. فلاسک‌های حاوی سلول و محیط کشت پس از انتقال به داخل انکوباتور روزانه زیر میکروسکوپ نوری معکوس بررسی ‌شدند و محیط کشت هر 3 روز یکبار تعویض شد. پس از گذشت یک هفته 10 درصد به محیط کشت DMEM افزوده شد و به تبع آن 10 درصد از مقدار FBS کم شد و بعد از ۵ تا ۷ روز، سلول‌ها تشکیل کلونی دادند. زمانی که سلول‌ها 90-۸۰ درصد کف فلاسک را پوشاندند، پاساژ اول سلول‌ها انجام شد و سپس پاساژ سلول‌ها به صورت سریالی ادامه یافت. از سلول­های پاساژ سوم پس از شمارش سلول­ها توسط لام نئوبار و اطمینان از زنده بودن سلول‌ها با رنگ آمیزی تریپان بلو، تعداد پنج میلیون سلول، مورد استفاده قرار گرفت.

روش تهیه PRP- Clot Releasate (PRCR): برای تهیه PRCR تحت بیهوشی عمومی (30 میلی­گرم بر کیلوگرم کتامین و 8 میلی­گرم بر کیلوگرم زایلازین، داخل عضلانی) و با استفاده از سرنگ10 میلی لیتری حاوی 1 میلی­لیتر سیترات سدیم (1/0 مول) حدود 9-7 میلی­لیتر خون از شریان گوشی هر خرگوش اخذ گردید. سپس خون به مدت 15 دقیقه با دورg ۴۰۰ سانتریفیوژ شده و لایه‌ی بالایی که PRP  نامیده می‌شود، جدا شد. برای فعال‌سازی پلاکت‌ها، 100 میکرولیتر از محلول 2/2 مول کلرید کلسیم به هر میلی‌لیتر از PRP حاصل اضافه‌ شده و به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه گردید. ژل حاصل به مدت 10 دقیقه درg 2000 سانتریفوژ شده و  محلول حاصل (PRCR) که حاوی فاکتورهای رشد مترشحه از پلاکت‌ها می‌باشد به روش آسپیراسیون جدا گردید. PRCR به مدت یک هفته در دمای 4 درجه سانتی گراد و 6 ماه در دمای 20- درجه سانتی گراد قابل نگهداری است (26).   

کشت BM-MSCs به همراه PRCR: سلول­های پاساژ سوم BM-MSCs به مدت 24 ساعت در محیط کشت DMEM حاوی 20 درصد FBS قرار گرفتند، سپس این محیط با محیطی حاوی 10 درصد FBS به اضافه­ی 10 درصد PRCR تعویض شده و کشت به مدت 10 روز ادامه یافت (محیط کشت هر 3 روز یکبار تعویض شد) (26).

تأیید بنیادی بودن سلول‌های BM-MSCs استخراج و کشت‌شده: روش فلوسایتومتری به‌عنوان یک روش مکمل و در عین حال مطمئن برای تأیید و شناسایی شاخص‌های سطحی سلولی مختص سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغزاستخوان خرگوش انجام شد. برای این منظور از سلول‌های پاساژ سوم  جهت آنالیز فلوسایتومتری استفاده شد. مراحل آماده‌سازی سلول‌ها به شرح زیر انجام شد:

  1. شست‌وشو و جداسازی سلول‌های BM-MSCs از کف فلاسک با استفاده از آنزیم تریپسین
  2. شمارش سلول‌ها (۱۰۶ سلول در حجم ۱ میلی لیتر)
  3. سانتریفیوژ در دور g۴۰۰  به مدت ۵ دقیقه
  4. حذف مایع فوقانی و افزودن 100 میکرولیتر محلول 1درصد سرم آلبومین گاوی به مدت 1-5/0 ساعت برای خنثی کردن گیرنده‌های غیراختصاصی
  5. حذف محلول فوقانی (سرم آلبومین گاوی)
  6. افزودن 100 میکرولیتر محیط کشت و آنتی‌بادی کنژوگه و انکوبه کردن سلول‌ها برای یک ساعت در دمای اتاق به دور از نور
  7. سه بار شستشو با PBS (سانتریفیوژ با دور g400  به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه‌ سانتی‌گراد)
  8. حذف مایع PBS فوقانی و افزودن 100 میکرولیتر PBS تازه

تمام مراحل برای پانل آنتی بادی‌های ایزوتیپ کنترل با همان غلظت آنتی بادی‌های اصلی انجام شد.

پس از انجام مراحل فوق، نمونه‌ها در لوله‌های مخصوص فلوسایتومتری ریخته شد و سپس توسط دستگاه فلوسایتومتری FACSCanto II (BD Bioscience, USA) قرائت و توسط نرم‌افزار flowjo نسخه 1.6.7 آنالیز شد.

تأیید تمایز سلول­های تمایز یافته: سلول­های تمایز یافته از نظر ظاهری بوسیله­ی میکروسکوپ نوری مورد ارزیابی قرار گرفتند و نیز با روش real-time PCR از نظر بیان ژن­های Scx، Tnmd، Col I و تناسین C بررسی شدند.

ارزیابی با روش Quantitative real-time PCR (استخراج RNA): به همه­ی سلول­های مورد آزمایش 1 میلی‌لیتر،RNX plus  (سیناژن، ایران) اضافه شده و کاملاً مخلوط شد. مخلوط حاصل به مدت پنج دقیقه در دمای محیط قرار گرفت. سپس 200 میکرولیتر کلروفرم به نمونه­ها اضافه شده و به مدت پنج دقیقه در دمای 20- درجه سانتی گراد قرار گرفت.

در مرحله بعد نمونه­ها در شرایط g12000/15 دقیقه/4 درجه سانتریفیوژ شدند. بعد از اتمام سانتریفیوژ در هر میکروتیوب سه فاز تشکیل شد؛ فاز رویی که حاوی RNA، فاز وسط که حاوی DNA و فاز زیرین که حاوی پروتئین و لیپید بود.

سپس فاز رویی هر نمونه به آرامی به میکروتیوب دیگری انتقال داده شد و هم­حجم آن کلروفرم به آن اضافه شد. این مخلوط مجدداً با شرایط قبلی سانتریفیوژ شد. پس از اتمام سانتریفیوژ دو فاز تشکیل شد که فاز بالایی جدا شده و هم­حجم آن ایزوپروپانول (20- درجه سانتی گراد) اضافه شد. سپس نمونه‌ها به مدت 24 ساعت در فریزر 20- درجه سانتی گراد قرار داده شدند. بعد از گذشت 24 ساعت نمونه­ها از فریزر خارج‌ شدند و در شرایط g12000/15 دقیقه/4 درجه سانتریفیوژ شدند. در انتها رسوب سفید رنگ حاوی RNA ایجاد شد. ایزوپروپانول از داخل میکروتیوب‌ها خارج شد تا فقط رسوب بماند.

در مرحله­ی بعد (مرحله شستشوی اتانول) اتانول 70 درصد به رسوب اضافه شده و به مدت 8 دقیقه درg 7500 و 4 درجه سانتریفیوژ شد. اتانول از داخل میکروتیوب­ها خارج شده و این مرحله یک بار دیگر تکرار شد. پس از حذف اتانول از روی رسوب، میکروتیوب­ها زیر هود قرار داده شدند تا رسوب کاملاً خشک شود.

سپس 35 میکرولیتر آب DEPC به رسوب­ها اضافه شد و به مدت سه دقیقه در بن­ماری 55 درجه سانتی گراد قرارگرفت تا رسوب به طور کامل حل شود. 2 میکرولیتر از محلول حاصل جهت کنترل کمی RNA برای نانودراپ فرستاده شد و مابقی مورد استفاده قرار گرفت.

در مرحله­ی بعد 15 میکرولیتر از محلول حاصل با 1 میکرولیتر آب، 2 میکرولیتر بافر و 2 میکرولیتر DNase مخلوط ­شده و به مدت 30 دقیقه با دمای 37 درجه سانتی گراد در دستگاه ترموسایکلر PCR قرارگرفت. سپس به این محلول 2 میکرولیتر EDTA اضافه ­شده و مجدداً به مدت 10 دقیقه با دمای 65 درجه در دستگاه ترموسایکلر قرارگرفت. محلول حاصل تا زمان ساخت cDNA در فریزر 20- درجه سانتی گراد نگهداری شد.

غلظت RNA استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ قرائت شد و نسبت­های 280/260 و 230/260 در محدوده نرمال قرار داشت.

مراحل ساخت cDNA: ابتدا 5 میکرولیتر از RNA هرنمونه به داخل میکروتیوب­های مخصوصPCR  ریخته شده و 1 میکرولیتر از Random Hexamer Primer (سیناژن، ایران) به هر نمونه اضافه شد. سپس میکروتیوب­ها داخل دستگاه PCR قرار داده شده و در دو مرحله تحت گرمایش قرارگرفتند: مرحله اول به مدت 5 دقیقه و با دمای 65 درجه سانتی گراد و مرحله دوم به مدت 1 دقیقه و با دمای 5 درجه سانتی گراد.

در گام بعدی ترکیب جدول 2 به میزان 14 میکرولیتر برای هر نمونه ساخته شد و به هر کدام از نمونه­ها اضافه شد به طوری که حجم نمونه­ها به 20 میکرولیتر رسید.

سپس نمونه­ها با برنامه­ی زیر داخل دستگاه PCR قرار داده ‌شدند:

مرحله اول 5 دقیقه با دمای 25 درجه سانتی گراد، مرحله دوم 60 دقیقه با دمای 42 درجه سانتی گراد، مرحله سوم 5 دقیقه با دمای 95 درجه سانتی گراد، مرحله چهارم 1 دقیقه با دمای 5 درجه سانتی گراد در انتها نمونه­ها از دستگاه خارج شدند و در فریزر 20- درجه سانتی گراد قرار داده شدند.

طراحی و آماده­سازی پرایمرها: تمامی پرایمرها توسط سایت NCBI-BLAST بررسی و سفارش­دهی و خریداری شدند.

توالی­های پرایمرها برای هر ژن در جدول 3 بیان شده است. تمامی پرایمرها در غلظت 10 پیکومول در میکرولیتر برای واکنشPCR آماده سازی شدند.

روش تست cDNA و انجام Real-Time PCR: برای بررسی کیفیت cDNA از ژن GAPDH که یک ژن House Keeping (کنترل داخلی) است، استفاده شد.

ابتدا cDNA‌های ساخته ­شده از فریزر خارج شدند و بعد از ذوب شدن در دمای محیط به نسبت 1 به 1 با آب مقطر استریل رقیق شدند. سپس واکنش Real-Time PCR مطابق جدول 4 برای هر نمونه به دور از نور و در محیط تاریک تهیه شد و به داخل استریپ­های مخصوص دستگاه Real-Time PCR ریخته­ شد به‌طوری‌که حجم نهایی برای هر نمونه به 10 میکرولیتر رسید.

سپس استریپ­ها داخل دستگاه Rotor-Gene Q قرار داده­ شدند و بر‌اساس برنامه­ای که به دستگاه داده ­شد آنالیز شدند.

پس از تأیید میزان CT نمونه­ها توسط ژن GAPDH، میزان بیان ژن­های Scx، Tnmd، TnC و Col I، تمامی نمونه­ها ارزیابی شد.

برای این کار همانند تست cDNA ابتدا واکنش Real-Time PCR مطابق جدول 4 برای هر نمونه به طور جداگانه داخل استریپ‌های مخصوص به دور از نور و در محیط تاریک تهیه شد به طوری‌که حجم نهایی برای هر نمونه 10 میکرولیتر بود. سپس استریپ­ها داخل دستگاه Rotor-Gene Q قرار داده ­شده و براساس برنامه­ی داده­ شده اجازه­ی آنالیز داده­ها داده­ شد.

آنالیز گراف­های رسم­شده توسط دستگاه Real-Time PCR: بعد از قرار دادن نمونه­ها در دستگاه و آنالیز آن­ها، دستگاه گراف­هایی را ارائه داد که این گراف­ها به روش زیر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند:

  • تعیین مقدار نسبی بیان ژن با استفاده از روش CT(Threshold cycle) مقایسه­ای
  • اعداد بدست­آمده توسط نرم­افزار Excel آنالیز شدند و از ژن GAPDH برای نرمال­کردن داده­ها استفاده شد: بدین‎صورت که ابتدا میزان CT ژن مورد نظر در نمونه­های مختلف از میزان CT ژن GAPDH کاسته­شد. عدد حاصله تحت عنوان Δ CT نام­داشت.                

             ΔCT= CT(Target Gene) – CT(GAPDH)

سپس ΔCT نمونه کنترل از ΔCT تمامی نمونه­ها (نمونه‌های تیمارشده) کاسته شد، عدد حاصله تحت عنوان  Δ ΔCT نام گرفت.

ΔΔCT= ΔCT(Control Sample) - ΔCT(Treated Sample)

در مرحله بعد تغییرات میزان بیان ژن موردنظر در نمونه‌های مختلف به شکل زیر محاسبه شد:

Relative Fold Change in Gene Expression=

روش­ تحلیل آماری داده­ها: داده­های بدست­آمده از محاسبه­ی بیان ژن­ها در نرم­افزار spss نسخه 23 بوسیله­ی آزمون t زوجی مورد بررسی قرارگرفت و نمودار میزان بیان ژن­ها در گروه‌های مختلف در نرم­افزار Excel ترسیم شد.

 

نتایج

نتایج سیتومورفولوژیک: سلول­هایی که از مغز استخوان جدا می­شوند ابتدا کروی شکل و همراه با سلول­ها و اجزای دیگر مغز استخوان هستند (مانند سلول­های هماتوپویتیک، گلبول­های قرمز، سلول­های چربی و غیره). BM-MSCs به دلیل دارا بودن خاصیت چسبندگی به کف فلاسک چسبیده و با تعویض محیط کشت و پاساژ دادن سلول­ها درصد خلوص آن­ها بالا رفته و سایر سلول­ها حذف شدند.

در مورفولوژی سلول­ها با گذشت زمان تغییرات محسوسی مشاهده شد. سلول­ها ابتدا زائده­دار و پراکنده بودند و به تدریج تعداد بیشتری از آن­ها ظاهری شبه فیبروبلاستی و دوکی­شکل داشتند، به‌طوری‌که پس از سه پاساژ متوالی سلول­ها بیشتر به صورت دوکی‌شکل و تعدادی نیز با ظاهر مثلثی دیده ­می­شدند که زوائدی را در سطح سلول دارا بودند. این سلول­ها با الگوی گردابی و در جهات مختلف کنار هم قرار گرفته ­بودند. هسته­ها بزرگ و بیضوی­ شکل و حاوی 4-2 هستک بودند. سلول­های تحت درمان قرارگرفته با PRCR از نظر ظاهری با BM-MSCs پاساژ سوم تفاوت داشتند. آن­ها کشیده­تر و باریک­تر شده و زوائد بسیار کمتری داشتند، در یک راستا جهت­گیری کرده و ساختار متراکمی را نشان می­دادند. هسته­ها کاملاً کشیده و حاوی هستک بودند.

نتایج فلوسایتومتری BM-MSCs: اطلاعات بدست آمده از فلوسایتومتری توسط نرم افزارFlowjo  تجزیه و تحلیل شد و به صورت هیستوگرام نمایش داده شدند. در هیستوگرام محور Y نشان‌دهنده تعداد سلول‌های شمارش شده و محور X شدت بیان شاخص سلولی را به صورت لگاریتمی نشان می‌دهد. نتایج فلوسایتومتری سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان نشان داد که این سلول‌ها شاخص‌های سطحی سلولی CD29 (92 درصد) و CD90 (89 درصد) را بیان کردند. CD45 (نشانگر سلول‌های هماتوپویتیک) و CD34 (نشانگر سلول‌های اندوتلیال) 100 درصد منفی بودند (19).

نتایج Quantitative real-time PCR: نتایج حاصل از منحنی‌های بدست آمده از ارزیابی Real-Time PCR همانطور که قبلاً توضیح داده شد مورد بررسی قرار گرفته و مقادیر بدست آمده مورد آنالیز آماری قرار گرفتند. بررسی اختلاف بیان ژن­های Scx، Tnmd، کلاژن تیپ I و تناسین C در سلول­های تمایز یافتهدر مقایسه با سلول­های بنیادی نشان داد که میزان بیان همه­ی آن­ها به صورت معنی­داری پس از درمان سلول­ها با PRCR افزایش یافته است. جدول 5 ΔCt ژن­های مورد بررسی را نسبت به ژن داخلی GAPDH در سلول­های هر دو گروه مورد مقایسه قرار می‌دهد. در نمودار 1 نیز نسبن بیان ژن نهایی بدست آمده مورد مقایسه قرار گرفته ­است.

بحث

پروسه‌ی ترمیم و بازسازی جراحات لیگامنت‌ها و تاندون‌ها در بدن بسیار ضعیف بوده و به کندی انجام می‌شود. این بدان معناست که تاندون- عضو تعیین کننده سیستم اسکلتی عضلانی‌ در صورت آسیب‌ دیدن از نظر بیولوژیک و بیومکانیکی به حالت اولیه‌ی خود باز نمی­گردد. بنابراین استفاده از یک راهکار درمانی که بتواند باعث تسریع ترمیم، افزایش بازگشت به فعالیت­های نرمال و کاهش ایجاد مجدد جراحت در ناحیه شود بسیار مفید خواهد بود.

Fackelman در سال 1973، بطور کامل شرایط تورم تاندون و التیام آن را شرح داده و عنوان نمود که در شرایط تجربی و بدون مصرف دارو، حداقل شش ماه زمان برای التیام تاندون آسیب دیده مورد نیاز می‌باشد (9).

یک نکته مهم در التیام و بازسازی بافت، وجود سلول‌های مناسب در محل جراحت می‌باشد. هنگامی که جراحتی در یک اندام یا ارگان رخ می‌دهد سیگنال‌هایی از سلول‌های آسیب دیده به خون رها شده که باعث جذب سلول‌های بنیادی به آن محل جهت التیام آن می‌شود. حضور این سلول‌ها بخاطر پتانسیل تکثیر آن­ها، سیگنال‌های سلول به سلول، تولید بیومولکول‌ها و ایجاد ماتریکس خارج سلولی، مهم می‌باشد. سلول‌های بنیادی پس از رسیدن به موضع به سلول‌های آن بافت تبدیل شده و التیام آغاز می‌شود. بنابراین به‌نظر می‌رسد که حضور سلول‌ها در محل التیام برای ایجاد بافت طبیعی لازم باشد. این نظریه را می‌توان به التیام تاندون‌ها نیز نسبت داد (17).

تعداد زیادی از اسکافولدها و سلول­ها از انواع مختلف در مهندسی بافت برای ترمیم تاندون­های آسیب دیده استفاده شده­اند. فیبروبلاست­ها و سلول­های بنیادی مزانشیمی بیشترین کاربرد را در این زمینه داشته­اند.

در مطالعات گذشته رعایت فاصله که استفاده از PRP باعث بهبود پروسه ترمیم بافتی از جمله لیگامنت­ها و تاندون­ها می­شود (14). علاوه بر این مطالعه و بررسی کشت­های سلولی نشان داده ‌است که تحت درمان قراردادن سلول­ها با PRCR باعث تمایز به تنوسیت و تزاید آن­ها و تولید کلاژن می­شود (2،8).

در مطالعه­ی حاضر استفاده از PRCR باعث تمایز سلول­های بنیادی به تنوسیت­ها شد و این موضوع با توجه به تغییرات ایجاد شده در سایز و شکل سلول­ها به سمت فنوتیپ­های تنوسیتی و بیان ژن­های مرتبط با تنوسیت­ها اثبات شد.

در مطالعات بسیاری از روش­های مختلف برای تمایز سلول‌های بنیادی به تنوسیت­ها استفاده­ شده ­است. Wang و همکاران در مطالعه­ای در سال 2005 ژن BMP-12 را از طریق الکتروپوراسیون به BM-MSCs رزوس منتقل نموده و سپس فنوتیپ سلول­های حاصل را با مشاهده­ی مورفولوژیک و آزمایشات بیولوژیکی مولکولی مورد مطالعه قرار دادند. پس از انتقال ژن، سلول­ها کشیده­تر شده و به صورت شبکه­ای قرار گرفتند و تعداد ارگانل­های داخل سلولی در آن­ها نسبت به MSCs مادری بیشتر بود. همچنین RT-PCR سلول­های تمایز یافته نشان داد که ژن‌های BMP12 و Col I در این سلول­ها بیان شده است. نقطه­ی مشترک این مطالعه و مطالعه حاضر افزایش مقدار Col I در سلول‌های تمایز یافته و نیز تغییرات ظاهری سلول­ها بعد از تمایز به سمت تنوسیتی شدن بوده است (23). در بعضی از مطالعات نیز از روش‌های فیزیکی برای تمایز سلول­های بنیادی به تنوسیت­ها استفاده شده است. این روش­ها شامل کشت سلولی در محیط­های سه­بعدی و دینامیک و یا تحریک سلول­ها به صورت سیکلیک و یا کشش­های مکانیکی بوده است (1،12،24،25).

Lee و همکاران در سال 2011 اثر مجاورت BMP-12 را بر سلول­های بنیادی رت بررسی نمودند. آن­ها Scx و Tnmd را به عنوان ژن­هایی که عمدتاً در سلول­های تاندونی بیان شده و قابل­ اعتمادترین مارکرهای فنوتیپی در بررسی رده­های سلولی تاندونی می­باشند، ذکر نمودند. در حالی‌که Scx یک تنظیم­کننده­ی رونویسی است و اول در سلول­های پیش­ساز تاندون بیان می­شود، Tnmd یک پروتئین غشایی است که در تنوسیت­های بالغ­تر بیان می­شود و در تکثیر آن­ها و ساختار ماتریکس نقش تنظیم­کنندگی دارد. بنابراین می­توان از این مارکرها جهت تست روش­های تمایز دادن سلول­های بنیادی به تنوسیت­ها استفاده کرد. در مطالعه­ی آن­ها سلول­های تمایز یافته بوسیله­ی q Real time-PCR از نظر بیان ژن­های Scx، Tnmd و Col I مورد ارزیابی قرارگرفتند و بیان آن­ها به صورت معنی­داری از سلول­های تمایز نیافته بیشتر بود. در این بررسی اسکافولدهای حاوی این سلول­ها سپس در یک نقیصه‌ی کالکانئال در رت مورد استفاده قرار گرفت و پس از سه هفته بافت ترمیم ­یافته نیز در گروه حاوی سلول­های تمایز یافته مقادیر بالاتری از ژن­های مذکور را بیان ­داشت (13). نتایج مطالعه­ی حاضر با این بررسی همسو بوده و مقادیر اندازه­گیری شده برای Scx، Tnmd و Col I در سلول­های تمایز یافته افزایش پیدا کرد.

در مطالعه­ای که توسط de Mos و همکاران در سال 2008 انجام شد استفاده از PRCR باعث تحریک تزاید سلول­های تنوسیت انسان و افزایش تولید کلاژن توسط سلول­ها شد (8). Zhang و Wang در سال 2010 به استفاده از PRP در درمان تاندون­های آسیب ­دیده اشاره­کردند و توضیح دادند که PRCR باعث تمایز سلول­ها به تنوسیت می­شود. آن­ها دریافتند که ژن­های مربوط به تنوسیت­ها (کلاژن تیپ I و III و تناسین C) در مقادیر بالایی در سلول­های تمایز یافته بیان­ شده­اند در حالی که ژن­های مرتبط با سلول­های غیرتنوسیتی( PPARɣ، SOX-9 و Runx2) یا اصلاً بیان نشده و یا مقادیر بسیار ناچیزی داشتند (26). در مطالعه­ی حاضر نیز از اثر PRCR برای تمایز سلول­های بنیادی مشتق‌ شده از مغزاستخوان به تنوسیت­ها استفاده شده و افزایش بیان ژن‌های Scx، Tnmd، Col I و تناسین C و همچنین تغییرات مشهود ظاهری سلول­ها نشانگر تمایز سلول­های بنیادی به سمت تنوسیتی شدن بود.

 اثر تحریک­کننده­ی PRP در ترمیم و درمان جراحات، مربوط به فاکتورهای رشد موجود در گرانول‌های α پلاکت‌ها می‌باشد که پس از فعال ‌شدن پلاکت از آن ترشح می‌شود. کاربرد PRCR (که ترکیبی از فاکتورهای رشد مترشحه از لخته‌ی PRP است) تمایز سلول‌های بنیادی به تنوسیت را تحریک کرده و باعث افزایش تکثیر تنوسیت­ها و تولید مقادیر بالای کلاژن می‌شود. این موضوع قابل توجه است که سلول­ها در مجاورت PRCR به سلول‌های غیر تنوسیتی (شامل استئوسیت، ادیپوسیت و کندروسیت) تبدیل نمی­شوند. تبدیل شدن به سلول­های غیرتنوسیتی مذکور منجر به تولید بافت­های چربی، استخوانی کلسیفیه و غضروفی در اغلب ضایعات مزمن تاندونی می­شود که در جهت ترمیم ساختار و عملکرد تاندون بسیار مضر خواهد بود. در مطالعه حاضر نیز از PRCR برای القای تمایز تنوسیتی استفاده شد تا از همه مزایای آن نظیر در دسترس بودن و هزینه کمتر بهره برده­ شود. استفاده از این روش می­تواند پیچیدگی­هایی که در سایر روش­های تمایز وجود دارد نظیر استفاده از مقادیر زیاد فاکتورهای رشد با هزینه­های بالا، استفاده از وکتورهای حاوی ژن یا محیط­های کشت فیزیکی پیچیده و چند بعدی را برطرف کند.

در مجموع با توجه به یافته­های مطالعه­ی حاضر می­توان این‌گونه نتیجه گرفت که تحت درمان قرار دادن سلول­های بنیادی با PRCR باعث بیان شدن ژن­های مربوط به تاندون و تمایز سلول‌های بنیادی به تنوسیت­ها می­شود.

سپاسگزاری

این مقاله حاصل بخشی از نتایج پایان­نامه دکترای تخصصی می­باشد و نویسندگان بر خود لازم می­دانند که از معاونت محترم پژوهشی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران به خاطر تأمین بخشی از هزینه­های مالی پایان­نامه تشکر و قدردانی بعمل آورند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

  1. References

     

    1. Altman, G.H., Horan, R.L., Martin, I., Farhadi, J., Stark, P.R.H., Volloch, V., Richmond, J.C., Novakovic, G.V., Kaplan, D.L. (2002). Cell differentiation by mechanical stress. FASEB J, 16(2), 270-272. https://doi.org/10.1096/fj. 01-0656fje
    2. Anitua, E., Andía, I., Sanchez, M., Azofra, J., del Mar Zalduendo, M., de la Fuente, M., Nurden, A.T. (2005). Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J Orthop Res, 23(2), 281-286. https://doi.org/10.1016/j.orthres.2004.08.015
    3. Anitua, E., Andia, I., Ardanza, B., Nurden, P., Nurden, A.T. (2004). Autologous platelets as a source of proteins for healing and tissue regeneration. Thromb Haemost, 91(1), 4-15. https://doi.org/10.1160/th03-07-0440
    4. Awad, H.A., Butler, D.L., Boivin, G.P., Smith, F.N.L., Malaviya, P., Huibregtse, B., Caplan, A.I. (1999). Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair of tendon. Tissue Eng, 5(3), 267-277. https://doi.org/10.1089/ ten.1999.5.267
    5. Chang, J., Most, D., Stelnicki, E., Siebert, J.W., Longaker, M.T., Hui, K., Lineaweaver, W.C. (1997). Gene expression of transforming growth factor beta-1 in rabbit zone II flexor tendon wound healing: evidence for dual mechanisms of repair. Plast Reconstr Surg, 100(4), 937-944. https://doi.org/ 10.1097/00006534-199709001-00016
    6. Chong, A.K.S., Ang, A.D., Goh, J.C.H., Hui, J.H.P., Lim, A.Y.T., Lee, E.H., Lim, B.H. (2007). Bone marrow-derived mesenchymal stem cells influence early tendon-healing in a rabbit Achilles tendon model. J Bone Joint Surg Am, 89(1), 74-81. https://doi.org/10.2106/jbjs.e.01396
    7. Dahlgren, L.A., Mohammed, H.O., Nixon, A.J. (2005). Temporal expression of growth factors and matrix molecules in healing tendon lesions. J Orthop Res, 23(1), 84-92. https://doi.org/10.1016/j.orthres.2004.05.007
    8. de Mos, M., van der Windt, A.E., Jahr, H., van Schie, H.T., Weinans, H., Verhaar, J.A., van Osch, G.J. (2008). Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. Am J Sports Med, 36(6), 1171-1178. https://doi.org/ 10.1177/0363546508314430
    9. Fackelman, G. (1973). The nature of tendon damage and its repair. Equine Vet J, 5(4), 141-149. https://doi.org/10.1111/ j.2042-3306.1973.tb03214.x
    10. Hsu, C., Chang, J. (2004). Clinical implications of growth factors in flexor tendon wound healing. J Hand Surg Am, 29(4), 551-563. https://doi.org/10.1016/j.jhsa.2004.04.020
    11. Kryger, G.S., Chong, A.K.S., Costa, M., Pham, H., Bates, S.J., Chang, J. (2007). A comparison of tenocytes and mesenchymal stem cells for use in flexor tendon tissue engineering. J Hand Surg Am, 32(5), 597–605. https://doi. org/10.1016/j.jhsa.2007.02.018
    12. Kuo, C.K., Tuan, R.S. (2008). Mechanoactive tenogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A, 14(10), 1615-1627. https://doi.org/10.1089/ten.tea. 2006.0415
    13. Lee, J.Y., Zhou, Z., Taub, P.J., Ramcharan, M., Li, Y., Akinbiyi, T., Maharam, E.R., Leong, D.J., Laudier, D.M., Ruike, T., Torina, P.J., Zaidi, M., Majeska, R.J., Schaffler, M.B., Flatow, E.L., Sun, H.B. (2011). BMP-12 treatment of adult mesenchymal stem cells in vitro augments tendon-like tissue formation and defect repair in vivo. PLoS ONE, 6(3), 17-31. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017531
    14. Marx, R.E. (2004). Platelet-rich plasma: evidence to support its use. J Oral Maxillofac Surg, 62(4), 489-496. https://doi.org/10.1016/j.joms.2003.12.003
    15. Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. (2003). The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med, 33(5), 381-394. https://doi.org/10.2165/00007256-200333050-00004
    16. Murray, S.J., Santangelo, K.S., Bertone, A.L. (2010). Evaluation of early cellular influences of bone morphogenetic proteins 12 and 2 on equine superficial digital flexor tenocytes and bone marrow–derived mesenchymal stem cells in vitro. Am J Vet Res, 71, 103-14. https://doi.org/10.2460/ajvr.71.1.103
    17. Smith, R.K. (2006). Stem cell technology in equine tendon and ligament injuries. Vet Rec, 158(4), 140-140. https://doi.org/10.1136/vr.158.4.140-a
    18. Smith, R.K.W. (2008). Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disabil Rehabil, 30(20-22), 1752-1758. https://doi.org/10.1080/09638280701788241
    19. Tan, S.L., Ahmad Ts Fau – Selvaratnam, L., Selvaratnam L Fau – Kamarul, T., Kamarul, T. (2013). Isolation, characterization and the multi-lineage differentiation potential of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Anat, 222(4), 437-450. https://doi.org/10.1111/joa.12032  
    20. Tsubone, T., Moran, S.L., Amadio, P.C., Zhao, C., An, K.N. (2004). Expression of growth factors in canine flexor tendon after laceration in vivo. Ann Plast Surg, 53(4), 393-397. https://doi.org/10.1097/01.sap.0000125501.72773.01
    21. Violini, S., Ramelli, P., Pisani, L.F., Gorni, C., Mariani, P. (2009). Horse bone marrow mesenchymal stem cells express embryo stem cell markers and show the ability for tenogenic differentiation by in vitro exposure to BMP-12. BMC Cell Biol, 10, 29-44. https://doi.org/10.1186/1471-2121-10-29
    22. Wang, J.H. (2006). Mechanobiology of tendon. J Biomech, 39(9), 1563-1582. https://doi.org/10.1016/j.jbiomech.2005. 05.011
    23. Wang, Q.W., Chen, Z.L., Piao, Y.J. (2005). Mesenchymal stem cells differentiate into tenocytes by bone morphogenetic protein (BMP) 12 gene transfer. J Biosci Bioeng, 100(4), 418-422. https://doi.org/10.1263/jbb.100.418
    24. Yin, Z., Chen, X., Chen, J.L., Shen, W.L., Nguyen, T.M.H., Gao, L., Ouyang, H.W. (2010). The regulation of tendon stem cell differentiation by the alignment of nanofibers. Biomaterials, 31, 2163-2175. https://doi.org/10.1016/j. biomaterials.2009.11.083
    25. Zhang, J., Wang, J.H.C. (2010). Mechanobiological response of tendon stem cells: Implications of tendon homeostasis and pathogenesis of tendinopathy. J Orthop Res, 28(5), 639-643. https://doi.org/10.1002/jor.21046
    26. Zhang, J., Wang, J.H.C. (2010). Platelet-rich plasma releasate promotes differentiation of tendon stem cells into active tenocytes. Am J Sports Med, 38, 2477-2486. https://doi.org/10.1177/0363546510376750