نوع مقاله : انگل شناسی و بیماری های انگلی
نویسندگان
1 دانش آموخته دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی زنجان، زنجان، ایران
2 گروه انگل‌شناسی و قارچ‌شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی زنجان، زنجان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
BACKGROUND: Toxocara canis is a zoonotic disease that commonly infects canids. Mammals and birds are sometimes infected with this disease as paratenic hosts. It can also cause accidental infection in humans. The increase in the number of stray dogs, the expansion of urban gardens, and the proximity of dogs to humans increase the risk of human infection with Toxocara canis.
OBJECTIVES: This study aims to determine the prevalence of Toxocara canis infection in dogs and foxes in Zanjan province, Iran.
METHODS: A total of 484 fecal samples of stray dogs (n=355), rescue dogs (n=49), guard dogs (n=50), and foxes (n=30) in Zanjan were randomly collected from June 2021 to February 2022. The microscopic examination was done following formalin-ethyl acetate sedimentation procedures. Finally, the PCR method was used to confirm the presence of Toxocara canis in positive samples.
RESULTS: Microscopic study revealed that, out of 484 samples, 21 (4.3%) were positive for Toxocara/ Toxascaris eggs. Between these positive samples of dogs and foxes, only 6 samples from dog feces were confirmed as a Toxocara canis infection by the PCR method.
CONCLUSIONS: There is an increase in the prevalence of Toxocara canis infection in stray dogs in Zanjan, Iran. Given the presence of dogs in parks and residential areas, there is a risk of human infection with Toxocara canis, emphasizing the importance of adhering to treatment and prevention protocols in dealing with stray dogs.
کلیدواژه‌ها [English]
توکسوکارا کنیس از‌جمله انگل‌های زئونوز با شیوع بالاست که در روده سگ‌سانان مستقر می‌شود. وجود میزبان‌های حیوانی مناسب، شرایط اقلیمی مطلوب و تماس نزدیک میان انسان‌ها و حیوانات از‌جمله دلایل ایجاد آلودگی در انسان می‌باشد. شیوع کلی توکسوکاریازیس در ایران، 6/21 درصد گزارش شده است که در‌این‌بین آلودگی سگ‌ها و گربه‌ها به کرم بالغ 8/26 درصد و موارد سرولوژی مثبت در جامعه انسانی 8/15 درصد برآورد شده است (1). در سال‌های اخیر، با افزایش جمعیت سگ‌ها، گسترش باغ‌شهرها و نزدیک‌تر شدن این حیوانات به محیط زندگی انسان، احتمال آلودگی محیط به تخم انگل‌ها افزایش داشته است (2). با رشد و توسعه زندگی شهرنشینی، گوشتخواران کوچک همچون روباه نیز توانسته‌اند در کنار بافت شهرها ساکن شوند و با دسترسی به منابع غذایی به بقا و تولیدمثل بپردازند و حتی سرپناهی برای ماندن در شهرها بیابند (3) که خود اهمیت مطالعه بیماری‌های زئونوز را دوچندان می‌کند. بررسی‌های گذشته از سال 1955 تا 2016 بر روی جمعیت‌های مختلف سگ‌سانان در ایران نشان می‌دهند که بیشترین مورد آلودگی به گونه‌های توکسوکارا در سال 1955 در تهران 76 درصد و کمترین مورد آلودگی در استان فارس در سال 2002، 9/3 درصد ثبت شده است.
امروزه شیوع این انگل در سگ‌ها با‌توجه‌به روش و مکان جغرافیایی مطالعه بین 3/4 تا 5/43 درصد متغیر است (4). مطالعات مختلفی مثل بررسی شیوع سرمی، بررسی آلودگی خاک در پارک‌ها، بررسی آلودگی در گربه و سگ‌ها و بررسی لارو در میزبان پاراتنیک در استان زنجان انجام شده است (5-9) که نشان‌دهنده حضور و اهمیت انگل‌های توکسوکارا در این منطقه می‌باشد.
مطالعه مقطعی حاضر با گذشت 5 سال از مطالعه قبل در این استان، به‌منظور بررسی روند آلودگی توکسوکارا کنیس در سگ‌ها و همچنین به‌دلیل نداشتن آگاهی از وضعیت آلودگی این انگل در روباه‌های منطقه با روش میکروسکوپی و با استفاده از PCR انجام شد.
منطقه مورد‌مطالعه: مطالعه حاضر در تابستان، پاییز و زمستان سال 1400 در استان زنجان، در شمال غربی ایران با آب‌و‌هوای غالب سرد و خشک با زمستان‌های سرد انجام شد. میانگین دمای کمینه و بیشینه این استان در 10 سال اخیر حدود 5/19- تا 5/37 درجه سانتی‌گراد بود. این استان بهطور متوسط 1500 متر از سطح دریا ارتفاع دارد و شامل 8 شهرستان است.
جمع‌آوری نمونه: جمع‌آوری نمونه مدفوع در 4 گروه سگ‌های بدون سرپرست، سگ‌های نگهبان باغ، سگ‌های پناهگاه و روباهها انجام شد. نمونه مدفوع سگ‌های بدون سرپرست (355 نمونه) از 8 شهرستان (ابهر، ایجرود، خدابنده، خرمدره، زنجان، سلطانیه، طارم و ماهنشان) به‌صورت تصادفی، نمونه مدفوع سگ‌های نگهبان (50 نمونه) از باغات اطراف زنجان و مدفوع سگ‌های پناهگاه (49 نمونه) از پناهگاه دستان مهر زنجان گرفته شد. جهت اطمینان از تکراری نبودن نمونه‌ها، از هر منطقه فقط 1 بار و در 1 روز جمع‌آوری نمونه انجام شد و از بین نمونه‌هایی که شکل و رنگ مشابهی داشتند و در مکانی نزدیک به یکدیگر قرار گرفته بودند، تنها 1 مورد برای مطالعه استفاده شد. جمع‌آوری نمونه مدفوع روباه توسط محیط‌بانان اداره محیط‌زیست از مناطق محافظت‌شده استان، پس از تشخیص لانه روباه و شناسایی مدفوع از‌نظر شکل ظاهری، اندازه، رنگ و محتویات انجام شد. نمونه‌ها بهطور کامل در کیسه‌های پلاستیک زیپ‌دار جمع‌آوری شدند و درون یخدان به آزمایشگاه انگل‌شناسی دانشگاه علوم‌پزشکی زنجان منتقل شدند (7).
بررسی میکروسکوپی: بررسی میکروسکوپی به دنبال انجام روش تغلیظ فرمالین اتیل استات بر روی تمام نمونه‌ها انجام شد. بدین صورت که هر نمونه مدفوع در 10 میلی‌لیتر فرمالین (Neutroclean®, Iran) 10 درصد قرار گرفت و بعد از عبور از گاز 2 لایه و انجام روش تغلیظ، 4 لام گسترش مدفوع از هر رسوب توسط میکروسکوپ با بزرگ‌نمایی 100× و 400× بررسی شد (10). تشخیص آلودگی به تخم گونه‌های توکسوکارا و توکساسکاریس لئونینا با مقایسه اشکال مورفولوژیک رؤیت‌شده در بررسی میکروسکوپی و اطلس‌های معمول انگل‌شناسی انجام شد (11). نمونه‌های مثبت و نمونه‌های مشکوک به‌منظور بررسی مولکولی PCR پس از شست‌وشو در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد ذخیره‌سازی شدند.
استخراج DNA و انجام PCR: جهت استخراج DNA از تخم انگل در مدفوع و با‌توجه‌به ضخیم بودن دیواره تخم‌ها، ابتدا با روش ذوب و انجماد (نیتروژن مایع و آب در دمای 90 درجه سانتی‌گراد) دیواره تخم‌ها شکسته شد (12). سپس نمونه‌ها توسط کیت استخراج DNA از مدفوع شرکت Molecular Biological System Transfer (MBST, Iran) و طبق دستورالعمل کیت استخراج شدند. نمونه‌ها پس از استخراج در دمای 20- درجه سانتی‌گراد تا زمان انجام PCR ذخیره شدند.
PCR برای افتراق آلودگی به توکسوکارا کنیس، با استفاده از پرایمرهای مربوط به قطعه ژنی ITS2 انجام شد (13). مشخصات پرایمرهای استفاده‌شده در جدول 1 ارائه شده است (14).
حجم کلی واکنش PCR، 25 میکرولیتر، شامل 5/12 میکرولیتر مسترمیکس (Ampliqon, Denmark)، 1 میکرولیتر از هر پرایمر (Metabion international AG) با غلظت 10 میکرومولار، 2 میکرولیتر نمونه استخراج‌شده و 5/8 میکرولیتر آب‌مقطر بود. میکروتیوب‌های حاوی مواد واکنش به دستگاه ترمال سایکلر (SimpliAmpTM Thermal Cycler, Thermo Fisher Scientific, Singapore) انتقال داده شدند و تکثیر براساس برنامه زمانی به کار گرفته‌شده در مطالعه Khademvatan و همکاران در سال 2013 با کمی تغییرات (تصویر 1)، انجام شد (14). بهطور خلاصه یک مرحله 5 دقیقه‌ای واسرشت شدن در دمای 94 درجه سانتی‌گراد، 35 تکرار 40 ثانیه واسرشت شدن در دمای 94 درجه سانتی‌گراد، 30 ثانیه اتصال در دمای 55 درجه سانتی‌گراد، 60 ثانیه طویل شدن در دمای 72 درجه سانتی‌گراد و یک تکرار نهایی طویل شدن به‌مدت 10 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‌گراد بر روی نمونه‌ها انجام شد.
پس از اتمام واکنش، 5 میکرولیتر از هر محصول PCR و مارکر 100 جفت‌بازی بر روی ژل آگارز 2 درصد حاوی رنگ نشانگر safe stain (SinaClon, Iran) الکتروفورز (Jencons, HU13, United Kingdom) شد. از آب به‌عنوان کنترل منفی و یک نمونه DNA که در مطالعات قبلی به‌عنوان توکسوکارا کنیس (15) تأیید شده بود، به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شد. ژل حاوی نمونه‌های الکتروفورز‌شده در دستگاه ژل داک (UVIdoc, England) با نور فرابنفش بررسی شد.
بررسی نمونه‌ها به روش میکروسکوپی: از 484 نمونه بررسی‌شده، 21 مورد (3/4 درصد) آلودگی به توکسوکارا (8 نمونه)، توکساسکاریس (9 نمونه) و 4 مورد به‌دلیل شکل نا‌واضح غشا، مشکوک تشخیص داده شدند. آلودگی بر‌حسب گروه‌های مورد‌مطالعه در جدول 2 نشان داده شده است. بیشترین میزان آلودگی در سگ‌های بدون سرپرست به دست آمد. در نمونه‌های جمع‌آوری‌شده از سگ‌های نگهبان باغ، آلودگی یافت نشد و در سگ‌های پناهگاه، آلودگی تنها در گروهی از سگ‌ها که به‌تازگی به پناهگاه وارد شده بودند و قرص ضد‌انگل دریافت نکرده بودند، دیده شد و در روباهها 3 مورد آلودگی مشاهده شد.
بررسی نمونه‌ها با روش PCR معمولی: برای اطمینان از تشخیص صحیح تخم توکسوکارا و مشخص کردن موارد آلودگی به توکسوکارا کنیس، تمام 21 نمونه که در بررسی میکروسکوپی تخم انگل گونه‌های توکسوکارا یا توکساسکاریس در آن‌ها مشخص یا مشکوک بود با پرایمر اختصاصی گونه توکسوکارا کنیس بررسی شدند. از 21 نمونه بررسی‌شده، 6 مورد در این مرحله باند اختصاصی ایجاد کرد که تمام آن‌ها متعلق به سگ‌های بدون سرپرست بودند. درکل (454 نمونه) شیوع آلودگی به توکسوکارا کنیس در سگ‌های مطالعه‌شده در این منطقه 3/1 درصد برآورد شد. از سه نمونه روباه که در روش میکروسکوپی مشکوک تشخیص داده شده بودند، به روش مولکولی هیچ کدام توکسوکارا کنیس تایید نشدند.
در مطالعه حاضر به روش میکروسکوپی 8 مورد آلوده به گونه‌های توکسوکارا و 4 مورد مشکوک تشخیص داده شدند که با روش مولکولی تنها 6 مورد از آن‌ها مربوط به توکسوکارا کنیس تشخیص داده شدند. علی‌رغم اینکه شکل تخم‌های توکسوکارا کنیس و توکسوکارا کتی را تا حدودی با‌توجه‌به اندازه (تخم توکسوکارا کنیس کمی بزرگتر از توکسکارا کتی است) و شکل چالههای روی پوسته خارجی (چالههای روی پوسته تخم توکسوکارا کنیس خشن‌تر است) می‌توان افتراق داد، تعدادی از نمونه‌ها در هنگام جمع‌آوری خشک شده بودند و شکل ظاهری تخم‌های موجود در این نمونه‌ها دچار تغییر شکل شده بود که تشخیص قطعی آن‌ها با روش میکروسکوپی دشوار بود.
با‌توجه‌به نتایج مطالعه Fahrion و همکاران در سال 2011 که نشان دادند در نمونه مدفوع سگ‌ها علاوه‌بر تخم توکسوکارا کنیس که میزبان اصلی آن سگ است، برخی نمونه‌ها ممکن است حاوی تخم توکسوکارا کتی باشند (16) و از‌آنجاکه احتمال بلع تخم توکسوکارا کتی همراه با کوپروفاژی و شکار محتمل است، ممکن است تعدادی از نمونه‌های مطالعه حاضر که در بررسی میکروسکوپی توکسوکارا کنیس تشخیص داده شده بودند، توکسوکارا کتی باشند. همچنین از‌جمله دلایل اختلاف در نتایج بررسی میکروسکوپی با روش PCR می‌توان به محدودیت‌هایی که در روش مولکولی وجود دارد، از‌جمله دشواری در استخراج DNA انگل و تخریب نمونه استخراج‌شده در حین انجام مطالعه اشاره کرد.
Eslami در سال 2002 در ایران مطالعه‌ای بر روی آلودگی‌های نماتودی در روباه قرمز انجام داد. از نقاط مختلف ایران 24 قلاده روباه صید شد و با بازرسی لوله گوارش و سایر ارگان‌ها، برای اولین‌بار آلودگی انگلی از روباه قرمز در ایران گزارش شد. موارد آلودگی به توکساسکاریس لئونینا 12 درصد به دست آمد (17). در مطالعه Akhtardanesh و همکاران در سال 2023 در جنوب شرقی ایران، آلودگی به توکسوکارا کنیس 40 درصد به دست آمد که در این مطالعه انگل‌های دستگاه گوارش روباه‌های آسیب‌دیده در تصادفات جاده‌ای، به روش نکروپسی و پس از مرگ آسان بررسی شده بودند (18). در مطالعات بررسی انگلی با صید حیوان و نکروپسی ارگان‌ها و دیدن کرم بالغ، تشخیص انگل با قطعیت بیشتری انجام می‌شود، اما امروزه به‌دلیل مسائل اخلاقی و در خطر انقراض قرار گرفتن موجودات حیات وحش، این نوع مطالعات به‌ندرت انجام می‌شوند و مطالعات غیر‌تهاجمی، مثل بررسی نمونه مدفوع جانوران که در مطالعه حاضر نیز از این روش استفاده شد، جایگزین مطالعات قبلی شده است. متأسفانه در این نوع مطالعات، شانس مشاهده و تشخیص تخم تحت تأثیر عوامل متعددی است و ممکن است موارد آلودگی کمتر از حد واقعی به دست آید.
Dalimi و همکاران در سال 2006، کرم‌های روده‌ای را در 3 جمعیت سگ‌های بدون سرپرست، روباه و شغال در غرب ایران مطالعه کردند (19). تعداد موارد آلوده به توکسوکارا کنیس و توکساسکاریس لئونینا به‌ترتیب در سگ‌های بدون سرپرست 02/6 و 53/32 درصد، در روباه قرمز 54/4 و 82/31 درصد و در شغال طلایی 10 و 30 درصد بود. در هر 3 گروه مقدار آلودگی به توکساسکاریس لئونینا نسبت به توکسوکارا کنیس بیشتر بوده است. در مطالعه کنونی نیز این نسبت تا حدودی مشابه است.
اگرچه در مطالعه‌ای که در بلژیک در سال 2005 بر روی روباه قرمز انجام شد، هیچ ارتباطی بین فاکتورهای وابسته به میزبان نظیر سن، جنس، اندازه بدن و تغییرات دما بر تعداد و نوع انگل یافت نشد (20)، اما در مطالعه منتشر‌شده که توسط Meshgi و همکاران در سال 2009 بر روی آلودگی انگلی در جمعیت شغال‌ها و روباهها در 3 ناحیه متفاوت آبوهوایی ایران انجام شد، ارتباطی بین شیوع انگل در 3 ناحیه متفاوت آبوهوایی دیده شد. استان‌های گیلان، مازندران و گلستان به‌عنوان ناحیه 1 با میانگین دمایی 8 تا 26 درجه سانتی‌گراد، آذربایجان‌شرقی و آذربایجان‌غربی، اردبیل، مرکزی، اصفهان و خراسان به‌عنوان ناحیه 2 با میانگین دمایی 5 تا 29 درجه سانتی‌گراد و استان‌های خوزستان و هرمزگان به‌عنوان ناحیه 3 با میانگین دمایی 13 تا 36 درجه سانتی‌گراد طبقه‌بندی شدند. موارد مثبت توکسوکارا کنیس در روباهها بین 8/10 تا 4/32 درصد بود و بیشترین مورد آلودگی در ناحیه 3 گزارش شد (21). زنجان از‌لحاظ آبوهوایی شرایطی مشابه با ناحیه 2 این مطالعه داشت که کمترین درصد شیوع آلودگی به توکسوکارا مربوط به این ناحیه بوده است.
Beiromvand و همکاران در سال 2013، با بررسی شیوع انگل‌های روده‌ای در سگ‌های بدون سرپرست در مناطق روستایی خراسان‌رضوی نشان دادند در مقایسه با مطالعات قبلی در این ناحیه شیوع توکسوکاریازیس روندی رو به افزایش دارد (22).
طراحی مطالعه حاضر با استناد به روش مطالعه Kohansal و همکاران در سال 2017 در همین منطقه صورت گرفته است. تقریباً حجم نمونه مشابهی از 8 شهرستان جمع‌آوری و به روش میکروسکوپی و سپس انجام تغلیظ نمونه‌ها با تکنیک رسوبی، بررسی انجام شده است. در‌مجموع 1/19 درصد از نمونه‌ها حداقل به یک انگل آلوده بودند. میزان آلودگی به انگل‌های توکسوکارا 8/1 و توکساسکاریس لئونینا 9/0 درصد گزارش شد (7). با مقایسه مطالعه حاضر و مطالعه Kohansal و همکاران در سال 2017 می‌توان بیان کرد که با گذشت 5 سال، میزان شیوع آلودگی به گونه‌های توکسوکارا و توکساسکاریس در سگ‌های بدون سرپرست با روش میکروسکوپی نسبت به گذشته افزایش نشان داده است (از 6/2 به 5/4 درصد). به‌دلیل نزدیکی و رفت‌و‌آمد سگ‌ها به پارک‌ها و مناطق مسکونی، همچنان خطر آلودگی انسان به توکسوکاریازیس وجود دارد و این اهمیت رعایت پروتکل‌های درمانی و پیشگیری در سگ‌های بدون سرپرست را نشان می‌دهد.
عادت کوپروفاژی در سگ‌ها که به دلایل مختلفی از‌جمله گرسنگی، سوء‌تغذیه، تمیز کردن محیط زندگی خود یا رفتار غریزی حفاظت از توله‌ها در مقابل سایر حیوانات شکارچی انجام می‌شود، در صورت آلوده بودن مدفوع به تخم توکسوکارا کنیس خود می‌تواند به افزایش شیوع عفونت کمک کند.
در این میان از اهمیت میزبان‌های پاراتنیک نیز نباید غفلت شود، برای مثال در مطالعه Shokri و همکاران که در سال 2022 منتشر شده است، مشخص شد 5/10 درصد مرغ‌ها (میزبان پاراتنیک) آلوده به مراحل نوزادی گونه‌های توکسوکارا بوده‌اند (9). به‌دلیل نزدیکی محل رفت‌و‌آمد سگ‌ها به محل نگهداری مرغ‌ها در مناطقی که مرغ‌ها به‌صورت سنتی و آزاد در منطقه تغذیه می‌کنند، احتمال شکار شدن آن‌ها توسط سگ‌های بدون سرپرست و آلوده شدن آن‌ها وجود دارد.
در‌رابطه‌با تعدادی از سگ‌های بدون سرپرست در مطالعه حاضر، مشخص شد یک برنامه کنترل دوره‌ای با استفاده از قرص‌های ضد‌انگل توسط برخی فعالان امدادرسانی به حیوانات انجام شده است. بدین صورت که قرص‌های ضد‌انگل را در آب و غذاهایی که در مناطقی مثل گاوازنگ و باغ‌شهر علوم‌پزشکی زنجان برای حیوانات بدون سرپرست ارسال می‌شد، قرار داده‌اند و این اطلاعات توسط اداره کل دامپزشکی استان زنجان تأیید شده است. همان‌طور که در مطالعه Zibaei و Sadjjadi در سال 2017 بهترین روش برای کاهش توکسوکاریازیس در سگ‌ها، درمان پیشگیری‌کننده دارویی معرفی شده است (4)، به نظر می‌رسد کنترل آلودگی‌های انگلی می‌تواند با برنامه‌های مناسب و زیر نظر دامپزشکان تسریع شود. بهتر است مطالعات جامع‌تری برای بررسی اثربخشی این برنامه‌های کنترلی در سطح استان انجام شود.
پیشنهاد می‌شود چرخه زندگی و نحوه انتقال گونه‌های توکسوکارا به انسان خصوصاً در مناطق حاشیه شهر که احتمال رفت‌و‌آمد سگ‌ها بیشتر است و به افرادی که حیوان خانگی دارند، آموزش داده شود و مطالعاتی مجدد در‌رابطه‌با شیوع توکسوکاریازیس نزد انسان و بررسی مجدد آلودگی خاک‌های مناطق پررفت‌وآمد جهت پایش برنامه کنترلی انجام شود.
نتیجهگیری نهایی: به‌دلیل افزایش شیوع انگل گونه‌های توکسوکارا / توکساسکاریس در سگ‌های بدون سرپرست و افزایش تردد آن‌ها به مناطق مسکونی، احتمال آلودگی انسان افزایش پیدا می‌کند که این اهمیت رعایت پروتکل‌های پیشگیری و کنترل را در سگ‌های بدون سرپرست نشان می‌دهد.
مطالعه حاضر برگرفته از پایان‌نامه دانشجویی با کد IR.ZUMS.REC.1400.443 مصوب کمیته اخلاق دانشگاه علوم‌پزشکی زنجان می‌باشد. نویسندگان از آقای دکتر محمد زیبایی، استاد گروه انگل‌شناسی دانشگاه علوم‌پزشکی البرز که نمونه کنترل مثبت برای انجام PCR را در اختیار نویسندگان قرار دادند و خانم دکتر کیمیا حقیقت (دامپزشک) که در جمع‌آوری و شناسایی نمونه‌ها یاری کرده‌اند، قدردانی و تشکر می‌کنند.
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
', './data/jvr/coversheet/cover_fa.jpg'))