نوع مقاله : پژوهشی کوتاه
نویسندگان
1 دانش آموخته دانشکده دامپزشکی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران
2 گروه بیماریهای درونی و کلینیکال پاتولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران
3 گروه میکروبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
BACKGROUND: The bacterium Capnocytophaga canimorsus is a relatively newly recognized gram-negative, facultative, slow-growing bacillus that forms part of the normal oral flora of dogs and cats. Considering the pathogenicity of this bacterium in humans, determining its prevalence is very important for public health as well as the health of dog owners.
OBJECTIVES: This study aims to investigate the prevalence of Capnocytophaga canimorsus in the normal oral flora of healthy dogs.
METHODS: After taking samples from the saliva of 32 healthy dogs without oral, dental or digestive diseases at different ages, breeds, and sexes, they were placed in a test tube containing 10 mL of sterile peptone water with sterile plastic brushes, and immediately sent to the bacteriology laboratory under sterile conditions. The samples were cultured on a chocolate agar medium containing 5 % defibrinated sheep blood. Then, all the samples were kept in a greenhouse for 48 hours at a temperature of 37 °C and under anaerobic conditions. Using a loop, the grown pink colonies were isolated and to confirm the identification of the isolates, polymerase chain reaction (PCR) test was used in three main steps: Gene extraction, PCR reaction, and electrophoresis.
RESULTS: Out of 32 saliva samples, four positive cases of Capnocytophaga canimorsus bacteria were identified by PCR diagnostic method.
CONCLUSIONS: Given that Capnocytophaga canimorsus bacterium is present in the oral flora of healthy dogs, dog owners should have sufficient and favorable knowledge about this bacterium and related diseases. The PCR method can be used to detect this bacterium.
کلیدواژهها [English]
زندگی کردن با حیوانات خانگی یک پدیده جهانی است، اما این رابطه عاری از خطر نیست و امکان انتقال برخی از بیماریها به انسان وجود دارد (1). باکتری کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس که یک باسیل گرم منفی، بیهوازی اختیاری و آهستهرویش میباشد، در سال 1976 میلادی شناخته شده است و بخشی از فلور دهانی طبیعی سگها و گربهها را تشکیل میدهد. این باکتری ازجمله پاتوژنهایی است که میتواند باعث ایجاد بیماریهایی مثل تب، سردرد، تهوع و در موارد شدیدتر التهاب پردههای مغز، التهاب لایه داخلی قلب، التهاب پوست، عفونت و برخی دیگر از بیماریها در انسان شود. عفونت، بعد از گزش و یا حتی لیس زدن زخم و جراحات پوستی ایجاد میشود و علائم اولیه پس از 14 روز بروز مییابد (2). بنابراین حفظ سلامت سرپرستان حیوانات خانگی، بهویژه افراد دارای بیماری مزمن و بیمارانی که تحت عمل جراحی برداشت طحال قرار گرفتهاند، بسیار مهم است، زیرا آسیبپذیری آنها در برابر عفونت افزایش مییابد (1). البته عفونت در 40 درصد از افراد کاملاً سالم نیز اتفاق افتاده است (2). بیماریزایی این باکتری تا حد زیادی ناشناخته است. درمان با آنتیبیوتیکها در بیشتر موارد مؤثر است، اما با وجود حساسیت زیاد باکتریها به آنتیبیوتیکها، میزان مرگومیر آن 30 درصد است. مهمترین و درعینحال اساسیترین ابزار تشخیصی در دسترس پزشکان، آگاهی از مواجهه اخیر با سگها یا گربهسانان است (3). باتوجهبه تماس سرپرستان با بزاق و محتویات حفره دهانی سگ، بررسی آزمایشگاهی میکروبیوتای حفره دهان سگ، اطلاعات اساسی درباره مراقبتهای مربوط به بهداشت دهان و دندان سگ ارائه میدهد (4). بررسیها نشان داده است که تنها 4/16 درصد از گونههای دهانی بین سگها و انسانها شباهت 5/98 درصدی توالی16S rRNAداشتند (5). مطالعه حاضر با انگیزه تعیین فراوانی باکتری کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس در فلور طبیعی دهان سگهای سالم انجام شده است و باتوجهبه بررسیها و مطالعات مختلف درخصوص بیماریزایی آن در انسان، هدف از انجام مطالعه حاضر آگاهیبخشی و افزایش سطح سلامت سرپرستان است.
نمونهگیری: در مطالعه حاضر پس از کسب اطمینان از عدم وجود هرگونه بیماری مربوط به محوطه دهانی و همچنین عدم ابتلا حیوان به بیماری معدیرودهای و اخذ رضایت از سرپرست حیوان، نمونهبرداری از محوطه دهانی با استفاده از برسهای کوچک پلاستیکی و استریل ارتودنسی انجام شد (تصویر 1). بدین منظور با برس زدن ناحیه بوکال محوطه دهانی سگهای بهظاهر سالم نمونهبرداری انجام شد (6). سوآپها داخل لوله آزمایش حاوی 10 میلیلیتر محیط آبگوشت آب پپتونه استریل قرار گرفتند. پس از اخذ نمونه از محتویات دهانی 32 قلاده سگ با سنین، نژاد و جنسهای مختلف، برسهای پلاستیکی داخل لوله آزمایش استریل قرار گرفتند و در کنار یخ در اسرع وقت به آزمایشگاه باکتریشناسی منتقل شدند.
کشت و جداسازی: پس از انتقال نمونهها به آزمایشگاه باکتریشناسی بلافاصله کشت نمونهها بر روی محیط آگار شکلاتی حاوی 5 درصد خون دفیبرینه گوسفند صورت گرفت. نمونهها به روش خطی کشت شدند (تصویر 2) و در ظرف بیهوازی گذاشته شدند. پس از روشن کردن شمع از بسته بودن درِ ظرف اطمینان حاصل شد و گرمخانهگذاری در دمای 37 درجه سلسیوس بهمدت 48 ساعت صورت گرفت. سپس پرگنههای صورتی برای شناسایی انتخاب شدند. این باکتری میلهایشکل و گرم منفی است، اما بر روی محیط مک کانکی رشد نمیکند. ازنظر آزمونهای بیوشیمیایی این باکتری کاتالاز مثبت، متحرک، اکسیداز مثبت، سیترات منفی، اوره آز منفی، احیای نیترات مثبت، اندول منفی، ژلاتین منفی و قادر به تخمیر گالاکتوز، گلوکز، مانوز و نشاسته است.
روش تأیید تشخیص به کمک واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR): انجام این فرایند شامل 3 گام اصلی استخراج ژن، واکنش PCR و الکتروفورز است. ابتدا DNA ژنومی جدایه با استفاده از کیت شرکت فاورژن (یکتا تجهیز، تهران، ایران) استخراج و کمیت و کیفیت DNA استخراجی با نانودراپ سنجیده شد. سپس واکنش PCR با استفاده از مخلوط واکنش انجام شد که شامل مسترمیکس به مقدار 5/12 میکرولیتر، 5/0 میکرولیتر از هر پرایمر رقیقشده (رفتوبرگشت)، 3 میکرولیتر DNA الگو و 1 میکرولیتر آنزیم DNA پلیمراز و 1 میکرولیتر MgCl2 و 5/6 میکرولیتر آبمقطر در حجم 25 میکرولیتر بود. مقادیر گفتهشده به کمک سمپلر داخل میکروتیوپ ریخته شدند (تصویر 3). میکروتیوبها قبل از قرار گرفتن در PCRبرای مدتی کوتاه (10 ثانیه) مخلوط شدند. در این واکنش یک جفت پرایمر اختصاصی ژن RopB (Repressor of primer) با توالی رفتوبرگشت مشخص استفاده شد (جدول 1) (7).
واکنش زنجیرهای پلیمراز، شامل 35 چرخه با دناتوراسیون اولیه بهمدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه سلسیوس (یک چرخه)، به دنبال آن 35 چرخه، شامل دناتوراسیون در دمای 95 درجه سلسیوس بهمدت 30 ثانیه، اتصال 8/57 درجه سلسیوس بهمدت 30 ثانیه، گسترش با دمای 72 درجه سلسیوس بهمدت 30 ثانیه و سرانجام گسترش نهایی با دمای 72 درجه سلسیوس بهمدت 5 دقیقه (یک چرخه) بود.
در مرحله نهایی محصولات واکنش زنجیرهای پلیمراز با استفاده از الکتروفورز بررسی شدند. بدین منظور از ژل آگارز 5/2 درصد استفاده شد.
جهت ساخت این ژل لازم است 1 گرم پودر آگارز در 40 سیسی بافر TBE (Tris-Borate-EDTA) حل شود. مقدار 8/0 میکرولیتر رنگ مخصوص ژل آگارز به ترکیب افزوده شد و بهآرامی، پس از قرار دادن شانه چاهک داخل کاست ریخته شد. 20 دقیقه بعد ژل آماده استفاده بود که در دستگاه الکتروفورز قرار داده شد. به چاهک اول 8 میکرو لیتر مارکر ملکولی 50 جفت بازی و به سایر چاهکها به حجم 8 میکرولیتر از نمونههای حاصل از واکنش زنجیره پلیمراز منتقل شدند. سپس جریان آند و کاتد روشن شد و ولتاژ دستگاه روی عدد 70 ولت تنظیم شد. جداسازی براساس اندازه، بار و جرم مولکولی انجام شد. پس از 1 ساعت و 20 دقیقه دستگاه خاموش شد و ژل با استفاده از نور ماورای بنفش مانیتور مشاهده شد (تصویر 4).
از میان 32 نمونه بزاق اخذشده با استفاده از سوآپ، از دهان سگهای فاقد بیماری دهان و دندان و بیماری گوارشی به کمک روش تشخیصی واکنش زنجیرهای پلیمراز و الکتروفورز، در 4 مورد باند مربوط به ژن موردنظر روی عدد 79 جفتباز (Base pair) تشکیل شد (تصویر 5 و 6) که نشانگر شباهت ژنی باکتری موجود در نمونه اخذشده از بزاق حیوان و باکتری هدف (کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس) بود. بنابراین 4 مورد (5/12 درصد) مثبت از باکتری کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس شناسایی شد (تصویر 7).
سگها فراوانترین حیوانات خانگی در ایالات متحده آمریکا میباشند. پیشبینی شده است که 50 درصد از مردم ایالات متحده آمریکا در طول زندگیشان توسط یک حیوان گزیده میشوند و سالانه بیش از ۱ میلیون گازگرفتگی توسط سگ اتفاق میافتد (8). این آمار نمایانگر اهمیت مطالعه بر روی پاتوژنهای قابلانتقال به انسان است. باکتری کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس در فلور طبیعی محوطه دهانی سگ و گربه مشترک است و آنها را بیمار نمیکند، اما با انتقال ازطریق گاز گرفتن، لیسیدن یا حتی نزدیکی به حیوانات میتواند باعث بیماریزایی در انسان شود (3). باتوجهبه دادههای موجود، این باکتری در بین سگها شایعتر است (9).
کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس متعلق به خانواده Flavobacteriaceae است (10). این باکتریها میلهای نازک، گرم منفی، کاپنوفیل و تخمیرکننده گلوکز میباشند. تاژک ندارند، اما متحرکاند. هاگ تشکیل نمیدهند، طولی بین 5/2 تا 7/5 میکرومتر دارند و پلئومورفیکاند (11). شرایط بهینه برای رشد باکتری در محیط حاوی 5 تا 10 درصد CO2 و دمای 37 درجه سانتیگراد ایجاد میشود. شرایط رشد در محیطهای حاوی 5 درصد خون گوسفند و شکلات آگار بهبود مییابد. لازم است باکتری کشتیافته حداقل 5 روز گرمخانهگذاری شود (9). این باکتریها کاتالاز و اکسیداز منفی و رایجترین پاتوژنهای مرتبط با بیماری پریودنتال میباشند (12).
Westwell و همکاران در سال 1989، نتایج مطالعهای را که در آن نمونهها با استفاده سوآپ از حفره دهان 180 سگ و 249 گربه گرفته شد، منتشر کردند. کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس در فلور دهان 24 درصد از سگها و 17 درصد از گربهها شناسایی شد (13). Suzuki و همکاران در سال 2010، نمونههای اخذشده از حفره دهان 325 قلاده سگ و 115 گربه را با استفاده از روش PCR بررسی کردند که کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس در 240 (74 درصد) سگ و 66 گربه (57 درصد) یافت شد (14). تاکنون بیش از 480 مورد عفونت ناشی از کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس در انسان گزارش شده است (9). میزان بروز عفونت در بین مردان نسبت به زنان بیشتر است (15). مرگومیر ناشی از عفونت شدید تقریباً 30 درصد گزارش شده است (16). عفونت اغلب با گاز گرفتن سگ یا گربه (54 درصد)، خراشها (5/8 درصد) یا تماس نزدیک، بهعنوان مثال لیسیدن زخمهای قبلی (27 درصد) مرتبط است. منبع عفونت، در حدود 10 درصد از موارد ناشناخته است (9).
Pers و همکاران در سال 1996، 39 مورد سپتی سمی ناشی از کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس را بررسی کردند. انعقاد داخل عروقی منتشر در 14 بیمار، مننژیت در 5 بیمار و اندوکاردیت در 1 بیمار ایجاد شد (17). Cadre و همکاران در سال 2018 دریافتند که کاهش شنوایی حسیعصبی پس از مننژیت به دنبال عفونت کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس دارای ویژگیهای متمایزی نسبت به موارد ناشی از مننژیت باکتریایی است و جنبههای تشخیصی، درمانی و پیشگیرانه آن مورد بحث قرار گرفت (2). همچنین در مطالعه Thommen و همکاران در سال 2020 گزارش موردی از اندوفتالمیت باکتریایی حاد ناشی از کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس بعد از عمل جراحی آبمروارید، با احتمال آلودگی ازطریق قطرات بزاق سگ انجام شد (18). این مطالعه بروز عارضهای نادر (اندوفتالمیت باکتریایی حاد) در انسان را گزارش کرده است.
در مطالعه Oluyombo و همکاران در سال 2021 اولین مورد از اندوکاردیت عفونی بهعنوان یک بیماری غیرمعمول دیگر ناشی از کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس در یک بیمار تحت همودیالیز شرح داده شد (1). در مطالعه Schuler و همکاران در سال 2022 یک مورد مرگ ناشی از گازگرفتگی سگ در یک بیمار 61 ساله که سابقه طحالبرداری داشته، گزارش شده است. عفونت ناشی از باکتری کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس به ابتلای بیمار به سندرم کشنده واترهاوس ـ فریدریشن (WFS) و نکروز خونریزیدهنده و دوطرفه قشر غده آدرنال منجر شد (12). بیمارانی که تحت عمل برداشت طحال قرار گرفتهاند، مستعد ابتلا به عفونت میباشند (19). سرپرستان حیوانات خانگی و افرادی مثل دامپزشکان، کارگران پناهگاه حیوانات و پرورشدهندگان سگ که با حیوانات ارتباط شغلی دارند نیز در معرض خطر ابتلا به عفونت با باکتریِ موردمطالعه میباشند. عفونتهای علامتدار معمولاً در بیماران مبتلا به ضعف سیستم ایمنی رخ میدهند. خطر بروز عفونت در مبتلایان به سیروز یا در هنگام سوءمصرف الکل و استفاده از کورتیکواستروئیدها بیشتر است. سالمندان و افراد بالای 50 سال آسیبپذیرتر میباشند (10، 19).
عفونت کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس دارای طیف وسیعی از علائم بالینی است. بیمارانی که 8 تا 12 ساعت پس از گزش به پزشک مراجعه میکنند، تنها با واکنش موضعی پوستی مواجه خواهند شد. طی دوره نهفتگی بیماران ممکن است احساس خستگی، درد شکم و تنگی نفس داشته باشند (19). سلولیت ناشی از کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس با قرمزی، درد در محل گزش و ترشحات چرکی از زخم مشخص میشود. عفونت در بیماران مبتلا به نقص ایمنی ممکن است بهصورت سپسیس، مننژیت، استئومیلیت، پریتونیت، اندوکاردیت، پنومونی یا آرتریت سپتیک دیده شود (9). در بیماران مبتلا به مننژیت کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس تب مکرر کمتر رخ میدهد (32 درصد از بیماران). از دست دادن شنوایی نیز گزارش شده است (20).
شایعترین علت مرگ در بیماران درگیر با عفونت این باکتری، شوک سپتیک است و مرگومیر در این موارد تا 60 درصد افزایش مییابد. بیماران بالای 50 سال نسبت به ایجاد شوک سپتیک آسیبپذیرتر میباشند (19). پس از گزش سگ یا گربه، برای جلوگیری از عفونت در بیماران مبتلا به نقص ایمنی، درمان پیشگیرانه آنتیبیوتیک وسیعالطیف توصیه میشود. درمان پیشگیرانه هاری و کزاز نیز باید در دستور کار قرار گیرد (10). گونههای کاپنوسایتوفاگا به طیفی از آنتی بیوتیکها شامل پنیسیلینها، سفالوسپورینهای نسل سوم، کارباپنمها، کلیندامایسین، داکسی سایکلین و کلرامفنیکل حساس میباشند (19). آموکسیسیلین با اسید کلاوولانیک آنتیبیوتیکی است که طیف باکتریهای هوازی و بیهوازی جداشده از اغلب زخمهای گازگرفتگی را پوشش میدهد (21).
نتیجهگیری نهایی: در مطالعه حاضر وجود باکتری کاپنوسایتوفاگا کانی مورسوس در بزاق سگهای سالم بهعنوان فلور طبیعی دهانی نشان داده شد که این موضوع باتوجهبه امکان انتقال عامل عفونت و بیماریزایی آن در انسان و همچنین ارتباط نزدیک سگها و سرپرستانشان حائز اهمیت است و لازم است بهمنظور ارتقای سطح بهداشت عمومی جامعه به سرپرستان و افرادی که مشاغلی در ارتباط با حیوانات دارند، آموزشهای کافی داده شود.
از معاونت پژوهشی دانشکده دامپزشکی دانشگاه ارومیه قدردانی میشود.
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.