نوع مقاله : انگل شناسی و بیماری های انگلی
نویسندگان
1 دانش‌آموخته دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
2 گروه انگل‌شناسی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
BACKGROUND: Blood filaria is an important arthropod-borne parasite concerning public health and causing disease in the host. Until now, no study has been conducted on the infection of dogs with blood filariasis in Ilam Province, Iran. This province has three different climates and is home to Culex species, which are the most prevalent vectors of the parasites reported in this province.
OBJECTIVES: The present study investigated the infection of dogs with Dirofilaria immitis and Acanthocheilonema reconditum (Dipetalonema reconditum) in Ilam Province, Iran.
METHODS: In this study, blood samples were collected from 139 dogs from Ilam Province. Blood samples were examined using the modified Knott method, and the polymerase chain reaction (PCR) was performed using two pairs of specific primers of the internal transcribed spacer 1 (ITS1) gene.
RESULTS: In a blood specimen from Sirvan City, microfilaria of Dirofilaria immitis (34 microfilariae in 1 mL of blood) was observed by the modified Knott test. The mean length and width of the microfilaria were 240 ± 8.72 and 5.4 ± 0.33 µ, with the straight end of the tail. A blood sample from Dehloran City and two samples of Sirvan were positive, and PCR results revealed a specific band at 155 bp in length. Two samples of Ilam City and one sample of Sarablah City were positive for Acanthocheilonema reconditum, and an amplicon with a length of 155 bp was observed.
CONCLUSIONS: The frequencies of infection with Dirofilaria immitis and Acanthocheilonema reconditum in Ilam Province were 2.6% and 3%, respectively. In the present study, infected dogs were reported from the cities of Sirvan, Sarablah, and Ilam, whose regions experience moderate winters without serious cold temperatures.
کلیدواژه‌ها [English]
فیلرها انگل‌هایی می‌باشند که ازنظر دامپزشکی و بهد‌‌اشتی اهمیت فراوان دارند. کرم‌های بالغ در خون، رگ‌های لنفاوی، بافت‌های همبند، محوطه صفاقی و غیره زندگی می‌کنند که اغلب در میزبان، ایجاد بیماری‌های بدخیم می‌کنند (1). سگ بهعنوان میزبان اختصاصی و مخزن دیروفیلاریا ایمیتیس، دیروفیلاریا ریپنس و آکانتوکیلونما رکوندیتوم مطرح است. در ایران، آلودگی سگ به دیروفیلاریا ایمیتیس و آکانتوکیلونما رکوندیتوم با فراوانی‌های متفاوت در مناطق متعدد گزارش شده است (2). تاکنون آلودگی سگ به انگلهای فیلریایی و با تأکید بر آلودگی به دیروفیلاریا ایمیتیس بهعنوان یک بیماری مشترک در مناطق مختلف کشور مطالعه شده است. این مطالعات نشان می‌دهد که آلودگی به کرم قلب در مقایسه با آلودگی به دیروفیلاریا ریپنس و آکانتوکیلونما رکوندیتوم از شیوع بیشتری برخوردار است. شیوع آلودگی سگ به فیلر و الگوی انتقال آلودگی در مناطق کشور متفاوت است. اطلاعات بهدستآمده از وضعیت آلودگی در مناطق مختلف کشور نشان می‌دهد آلودگی در هر منطقه به شرایط اقلیمی وابسته است. بررسی آلودگی سگها در کشور نشان داد بالاترین شیوع آلودگی به دیروفیلاریا ایمیتیس به میزان 6/78 و 50 درصد بهترتیب از استان‌های گیلان و مازندران و کمترین آلودگی به میزان 9/0 و 9/6 درصد بهترتیب از استان‌های اصفهان و لرستان گزارش شده است. این اختلاف آلودگی می‌تواند ناشی از شرایط آبوهوایی، افزایش دما، بارندگی و حضور میزبان‌های واسط باشد (1، 2). فیلرهای خونی بهعنوان انگلهای منتقله توسط بندپایان، ازنظر بهد‌‌اشتی و دامپزشکی حائز اهمیت می‌باشند. انتشار این آلودگی‌ها توسط ناقلین بندپا انجام می‌شود و به دنبال افزایش دمای سطح زمین، بیماری‌های منتقله توسط بندپایان در دنیا رو به افزایش است (3). گونههای دیروفیلاریا بهعنوان انگلهای مشترک انسان و حیوان از نقاط مختلف ایران گزارش شده‌‌‌‌‌‌‌اند، اما تاکنون مطالعه‌ای درمورد آلودگی گوشتخواران در استان ایلام به انگلهای خانواده فیلاری‌ایده انجام نشده است. این استان ازنظر بارندگی بهعنوان ششمین استان پربارش کشور مطرح است (4) و به‌‌‌‌‌دلیل داشتن تنوع زیست‌محیطی، جغرافیایی و آبوهوایی، امکان تکثیر و فعالیت ناقلین انگلهای فیلریایی در این استان فراهم است (5). در این استان حضور 12 گونه کولکس گزارش شده است که گونههای کولکس تیلری، کولکس پایپینس، کولکس تریتانورینکوس بهعنوان مهم‌ترین ناقلین انگل در بین گونههای گزارششده، وجود دارد (5). بنابراین ناقلین بهعنوان رکن اصلی انتقال آلودگی در منطقه حضور دارند. باتوجهبه اهمیت دامپروری و حضور سگهای گله، سگ‌هایی با کاربری‌های متفاوت و همچنین سگهای ولگرد در این استان، مطالعه حاضر باهدف بررسی آلودگی سگها به میکروفیلرهای خونی در استان ایلام برای اولین‌بار انجام شد.
کلیه مراحل کار با حیوانات در مطالعه حاضر در کمیته تحقیقات اخلاقی دانشگاه تهران (کد: 21/6/7502001 VETMEDUT) تأیید شد. در مطالعه حاضر 139 قلاده سگ شامل 103 قلاده سگ بی‌صاحب، 16 قلاده سگ گله و 20 قلاده سگ نگهبان با سن بالاتر از 1 سال براساس امکان دسترسی به سگها، از شهرهای دهلران (23n=)، دره‌شهر (26n=)، ایوان (18n=)، بدره (6n=)، سیروان (15n=)، ایلام (32n=)، سرابله (16n=) و چوار (3n=) جمع‌آوری شدند. نمونه‌گیری از تابستان 1401 شروع و تا پایان بها‌‌ر 1402 ادامه داشت. نمونه‌های خون (تقریباً 4 میلی‌لیتر) در 2 قسمت همراه با ماده ضدانعقاد سیترات سدیم و همچنین فرمالین 2 درصد، جمع‌آوری شدند و در آزمایشگاه انگل‌شناسی با روشهای نات اصلاحشده و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) با تکثیر قطعات اختصاصی از لکوس ژن ITS1 با استفاده از 2 جفت پرایمر اختصاصی، بررسی شدند.
روش نات اصلاحشده: به‌‌منظور انجام این آزمایش، ۱ میلی‌لیتر خون حاوی ماده ضدانعقاد سیترات سدیم به لوله‌‌‌های حاوی ۹ میلی‌لیتر فرمالین 2 درصد اضافه شد. در این روش براساس ویژگی‌های ریختی میکروفیلرها، شامل طول، عرض و انتهای خلفی (صاف یا خمیده بودن)، تشخیص تفریقی انجام شد.
روش PCR: استخراج دنا از خون‌های جمع‌آوری‌‌شده دارای ضدانعقاد و الکل 70 درصد، با استفاده از کیت اختصاصی برای استخراج دنای نماتودها دقیقاً مطابق دستورالعمل کیت انجام شد (MBST, Iran). در مطالعه حاضر برای تشخیص دیروفیلاریا ایمیتیس و آکانتوکیلونما رکوندیتوم قطعه‌ای از لکوس ژنی ITS1 تکثیر شد. توالی پرایمرهای مورد‌استفاده در مطالعه حاضر در جدول 1 ارائه شده است. علاوهبراین، قطعه‌ای به طول300 جفتباز از ژن بتا‌اکتین سگ با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، بهعنوان کنترل داخلی تکثیر شد. محصول PCR بر روی ژل آگاروز 5/1 درصد با رنگ اتیدیوم بروماید رنگ‌آمیزی و با دستگاه ژل‌داک، ساخت آمریکا ((Gel Doc XR، تحت تابش فرابنفش بررسی شد.
مقایسه ضریب توافق نتایج 2 روش نات اصلاحشده و مولکولی (PCR) در تشخیص آلودگی فیلرهای خونی با ضریب کاپا تعیین شد ((SPSS, version 20.
نتایج بررسی مولکولی: در بررسی مولکولی، 3 نمونه خون آلوده به دیروفیلاریا ایمیتیس از شهرستان‌های دهلران (1 مورد مثبت) و سیروان (2 مورد مثبت) و همچنین 3 مورد مثبت از آکانتوکیلونما رکوندیتوم در شهرستان‌های ایلام (2 مورد مثبت) و سرابله (1 مورد مثبت) مشاهده گردید. در ادامه نتایج مطالعه حاضر در بخش مولکولی شامل نتایج PCR ژن‌‌‌های بتا‌اکتین (تصویر 1) و ITS1 ارائه شده است (تصویر 2،3،4).
تاکنون مطالعه‌ای درمورد آلودگی سگها به فیلرهای خونی در استان ایلام انجام نشده بود. تعیین وضعیت مناطق در معرض خطر ازنظر آلودگی و آگاهی از انتشار ناقل و بیماری در کانون‌های جدید بسیار مهم است. آلودگی به فیلرها وابسته به انتشار ناقلین است. در این استان حضور 12 گونه کولکس گزارش شده است که گونههای کولکس‌تیلری، کولکس‌پایپینس و کولکس‌تری‌تانورینکوس بهعنوان مهم‌ترین ناقلین انگل در بین گونههای گزارششده وجود دارد. بنابراین ناقلین بهعنوان رکن اصلی انتقال آلودگی در منطقه حضور دارند (5). در مطالعه حاضر ضریب کاپا برای تعیین ضریب توافق دو روش انگل‌شناسی و مولکولی در تشخیص دیروفیلاریا ایمیتیس در خون 495/0 k= و آکانتوکیلونما رکوندیتوم 393/0 k=به دست آمد. در مطالعه‌ای که Hoseini و همکاران در سال 2020 انجام دادند نیز ضریب کاپا برای مقایسه دو روش در تشخیص دیروفیلاریا ایمیتیس در خون 35/0 k= و برای آکانتوکیلونما رکوندیتوم 57/0k= تعیین شد. اعداد بهدستآمده نشان می‌دهد این دو روش از توافق کمی برخوردار می‌باشند. اگرچه روش نات ارزان‌تر و ویژگی قابل‌قبولی در تشخیص میکروفیلرها دارد، اما روش مولکولی از حساسیت بالاتری برخوردار است. استفاده از روشهای مولکولی در تشخیص میکروفیلر دیروفیلاریا در سال‌های اخیر بیشتر مورد توجه قرار گرفته است. این روش‌ها حساسیت و دقت مناسبی برای تشخیص گونههای کرم‌های فیلریایی دارند که بیشتر در مواردی که آلودگی مخفی وجود دارد، یا میکروفیلرها از‌‌‌‌‌لحاظ ریخت‌شناسی قابل‌تفریق نمی‌باشند، یا اینکه مقدار نمونه بسیار کم است و مواردی که آلودگی با بیش از 1 گونه فیلر اتفاق می‌افتد و تشخیص تفریقی نمونه‌ها دشوار باشد، استفاده می‌شود (6). در تست الایزا هم به‌‌‌‌‌دلیل واکنش‌های متقاطعی که با سایر نماتودها نظیر آکانتوکیلونما رکوندیتوم دارد، نتایج مثبت کاذب نیز گزارش شده است (7).
در تست الایزا موارد منفی کاذب وجوددارد. اگر کرم بالغ در بدن میزبان از بین برود، میکروفیلرها در حدود 1 تا 3 سال در گردش خون باقی خواهند ماند و در این مدت علی‌رغم مثبت بودن آلودگی در روش نات، نتیجه تست الایزا منفی می‌شود. بنابراین علی‌رغم حساسیت بالای این تست‌ها، موارد منفی کاذب در دوره پیش‌آشکاری و یا مواردی که در آلودگی، تنها کرم نر حضور دارد، گزارش شده است. روش الایزا بهعنوان یک روش کمی، براساس میزان غلظت پادگن و شدت واکنش می‌تواند تعداد کرم‌ها را پیش‌بینی کند. این کاربرد روش الایزا از اهمیت زیادی برخوردار است (8). میزان آلودگی به دیروفیلاریا ایمیتیس در استان لرستان، همجوار شرقی این استان، 7 درصد گزارش شده است، همچنین آلودگی در استان کرمانشاه، همسایه شمالی 18 درصد و در استان خوزستان در جنوب این استان 16 درصد گزارش شده است (9، 10).
نتایج بررسی فیلاریوزیس سگهای ولگرد شهرستان گرمسار نشان داد از 122 قلاده سگ که با روش نات اصلاحشده آزمایش شده بودند، در 18 نمونه حضور میکروفیلرهای خونی مشاهده شد (75/14 درصد). در 15 نمونه، میکروفیلر دیروفیلاریا ایمیتیس (29/12 درصد)، 2 نمونه آکانتوکیلونما رکوندیتوم (64/1 درصد) و در 1 نمونه آلودگی مختلط (82/0 درصد) تشخیص داده شد (11) و در بررسی میزان شیوع فیلرهای خونی استان گلستان با روش نات اصلاحشده نتایج نشان داد 45/15 درصد سگهای مورد‌مطالعه به دیروفیلاریا ایمیتیس و 55/4 درصد به آکانتوکیلونما رکوندیتوم آلوده بودند (12). بررسی اپیدمیولوژی فیلرهای خونی سگهای روستایی و شهری تبریز با روشهای نات اصلاحشده و همچنین با کیت‌‌‌های سریع تشخیص آنتی‌ژن نشان داد 13/44 درصد از سگها به یکی از 2 میکروفیلر دیروفیلاریا ایمیتیس و آکانتوکیلونما رکوندیتوم و یا هر دو میکروفیلر آلوده بودند. یافته‌‌‌های این مطالعه، تبریز را بهعنوان کانون بومی آلودگی به دیروفیلاریا ایمیتیس معرفی کرد (13).
نتایج مثبت و منفی کاذب در تستهای مبتنی بر جست‌وجوی آنتی‌ژن، یک عامل محدودکننده در برآورد خطر واقعی فیلاریازیس است. مثبت کاذب موجب تخمین بیش‌از‌حد شیوع آلودگی می‌شود و منفی کاذب شیوع کمتر آلودگی واقعی را گزارش می‌دهد. پروتئین‌‌‌های نوترکیب بیان‌شده در سیستم‌‌‌های آزمایشگاهی و با روشهای تخلیص مناسب می‌توانند نتایج مثبت کاذب را در تستهای تشخیصی کاهش دهند (14، 15).
استان ایلام 425 کیلومتر با کشور عراق مرز مشترک دارد، اما اطلاعاتی درمورد وضعیت آلودگی این مناطق به دیروفیلاریا ایمیتیس وجود ندارد. وضعیت مشابه در سایر مناطق دنیا گزارش شده است. به‌طور مثال شیوع سرمی دیروفیلاریازیس در کرواسی پایین گزارش شده است، درحالیکه در رومانی به 14 درصد رسیده است (16). در یونان، شیوع بین 7 تا 14 درصد با روش سرم‌شناسی گزارش شده‌است، اما در ترکیه صفر تا 18 درصد گزارش شده است (16). در شمال شرقی چین، شیوع بین 2 تا 15 درصد و در ایالات شمال شرقی هند، شیوع بین 5/29 تا 7/4 درصد متغیر است (16). عوامل اصلی تأثیرگذار بر گسترش عفونت دیروفیلاریا، تغییرات آبوهوایی و آلودگی گونههای جدید پشه‌‌‌های ناقل بیان شده‌‌‌‌‌‌‌اند، از دیگر عوامل مؤثر نیز می‌توان به جابه‌جایی سگها و عدم پیشگیری صحیح از آلودگی در این حیوانات اشاره کرد (17). علاوهبراین گوشتخواران دیگری شامل گرگ، شغال و روباه نیز در همه‌گیری (اپیدمیولوژی) فیلرها نقش دارند، اما مطالعاتی درمورد آلودگی این میزبان‌ها به‌‌‌‌‌دلیل محدودیت‌های ناشی از جمع‌آوری نمونه از حیات‌وحش انجام نشده است (17). دیروفیلاریا ایمیتیس در بخش‌‌‌هایی از کانادا در ایالت انتاریو بومی است. انتاریو استانی است که بیشترین موارد عفونت‌‌‌های کرم قلب در آن رخ می‌دهد. معمولاً در جنوب انتاریو در مقایسه با سایر مناطق استان و کشور، درجه حرارت گرم‌تر است. دیروفیلاریا ایمیتیس در غرب، جنوب و شرق انتاریو با مدل رگرسیون پواسون بررسی شد، نتایج نشان داد مناطق جنوبی ازنظر شاخص‌‌‌های اقلیمی تأثیر مثبت بر عفونت کرم قلب دارند و درنتیجه شاخص‌‌‌های اقلیمی عامل تعیین‌کننده در پیش‌بینی عفونت می‌باشند (18). مطالعات اخیر نشان داده‌اند آلودگی به دیروفیلاریا ایمیتیس و دیروفیلاریا ریپنس از مناطق آندمیک به مناطقی که قبلاً بیماری گزارش نشده است و یا انتشار بیماری در آن کم بوده است، در حال افزایش است (19). درمطالعه حاضرشهرستان‌های سیروان و سرابله و دهلران ازنظر آلودگی مثبت بودند، این شهرها در مسیر سیلاب‌های شدید سال‌های 1394 و 1398 قرار داشتند. سیلاب‌ها می‌توانند یک عامل مؤثر در ایجاد زیستگاه برای پشه ناقل باشند. سیل می‌تواند باعث افزایش انتشار آلودگی در برخی مناطق شود (19). بنابراین باتوجهبه شرایط اقلیمی استان، حضور گسترده ناقلین، وضعیت آلودگی استان‌های همجوار و عدم درمان سگهای آلوده، امکان آلودگی بیشتر سگها به گونههای فیلری مورد انتظار است. حداقل دما در این استان در فصول سرد سال در برخی مناطق به 8- درجه سانتی‌گراد می‌رسد، به‌‌‌‌‌طوری‌‌‌که در فصل‌های سرد در مناطق شمالی استان، حدود 1 ماه یخبندان وجود دارد. برای پیش‌بینی وضعیت آلودگی به دیروفیلاریازیس در استان ایلام، لازم است مطالعات بیشتر و پیوسته باتوجهبه تغییرات آبوهوایی و تغییر جمعیت پشه‌‌‌های میزبان واسط انجام شود.
نتیجهگیری نهایی: هر 3 نمونه آلوده به دیروفیلاریا ایمیتیس مربوط به سگهای بی‌صاحب مناطق دهلران و سیروان بودند. این مناطق در مقایسه با سایر مناطق استان زمستان‌های معتدل دارند. 3 مورد سگ آلوده به آکانتوکیلونما رکوندیتوم نیز مربوط به شهرستان‌های ایلام و سرابله بودند. این نواحی نیز از مناطق معتدل استان محسوب می‌شوند.
مطالعه حاضر با حمایت صندوق حمایت از پژوهشگران ریاست‌جمهوری (کد طرح 4013275) و معاونت پژوهش و فناوری دانشکده دامپزشکی (کد طرح ۰۶/۶/۲۷۷۱۴) دانشگاه تهران انجام شد. مراحل آزمایشگاهی آن در آزمایشگاه مولکولی گروه انگل‌شناسی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران انجام شد و نویسندگان بدین‌وسیله مراتب قدردانی خود را از حامیان اعلام می‌کنند.
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
', './data/jvr/coversheet/cover_fa.jpg'))