تهیه داربست سلول‌زدایی‌‌شده از اعصاب محیطی گوسفند و ارزیابی ویژگی‌های بافت‌شناسی و خواص مکانیکی آن جهت کاربرد در ترمیم اعصاب محیطی

نوع مقاله : علوم پایه (بیوشیمی، آناتومی، جنین، بافت شناسی و فیزیولوژی)

نویسندگان

1 دانش آموخته دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

2 گروه علوم پایه، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

3 گروه بیماری‌های داخلی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

4 گروه جراحی و رادیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

5 پژوهشکده تحقیقات زیست پزشکی دانشگاه تهران، تهران، ایران

چکیده

زمینه مطالعه: آسیب‌های عصب محیطی اغلب نیاز به مداخله جراحی برای بازگرداندن تداوم و عملکرد عصب دارند. پیوند عصب اتولوگ به‌عنوان یک راهکار استاندارد برای ترمیم نقایص عصب محیطی در نظر گرفته می‌شود. با‌این‌حال پیوند عصب اتولوگ دارای معایبی مانند دسترسی محدود است. از‌این‌‌رو ایجاد راهکار‌های جایگزین جهت رفع نقایص عصبی ایجاد‌شده امری ضروری به نظر می‌رسد.
هدف: مطالعه حاضر باهدف توسعه و تهیه داربست‌های عصبی سلول‌‌زدایی‌‌شده از اعصاب محیطی گوسفند و ارزیابی ویژگی‌‌های بافت‌‌شناسی و خواص مکانیکی آن‌ها به‌منظور استفاده در ترمیم اعصاب محیطی انجام شده است.
روش‎کار: اعصاب شبکه بازویی از لاشه گوسفندان نر تحت شرایط آسپتیک جدا و با استفاده از مواد شوینده طبق پروتکل سلول‌زدایی شد. فرایند سلول‌‌زدایی با استفاده از رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین‌ائوزین، تری‌کروم‌ ماسون و همچنین میکروسکوپ الکترونی ارزیابی شد. مقاومت ساختار ماتریکس خارج سلولی و خواص مکانیکی نیز توسط تست کششی بررسی گردید. همچنین میزان محتوای DNA اعصاب سلول‌زدایی‌شده و اعصاب کامل با استفاده از روش کیت و نانودراپ اندازه‌گیری شد.
نتایج: ارزیابی‌های انجام‌شده نشان داد سلول‌ها از داربست‌های عصب به‌طور کامل حذف شدند و ماتریکس خارج سلولی به‌خوبی در داربست عصبی حفظ شده ‌است. تست کشش نشان داد داربست‌های عصبی سلول‌زدایی‌شده خواص مکانیکی خود را به‌طور نسبی در مقایسه با اعصاب کنترل حفظ کردند. بررسی محتوای DNA داربست‌ها و اعصاب دست‌نخورده هم نشان داد محتوایDNA  اعصاب، پس از فرایند سلول‌زدایی به‌طور قابل‌‌توجهی کاهش یافته بود.
نتیجه­گیری نهایی: پیوند عصب محیطی سلول‌زدایی‌شده را می‌توان با حفظ اجزای ماتریکس خارج سلولی تهیه کرد. این داربست‌های عصبی به‌طور بالقوه می‌توانند به‌عنوان جایگزینی برای کاندوئیت‌‌های هدایت عصب مصنوعی و اتوگرافت‌ها برای ترمیم اعصاب محیطی استفاده شوند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Preparing Decellularized Scaffolds from Ovine Peripheral Nerves and Evaluating their Histological Features and Mechanical Properties for Use in Peripheral Nerve Repair

نویسندگان [English]

  • Somayeh Mahmoudi Yeganeh 1
  • Javad Sadeghinezhad 2
  • Sirous Sadeghian Chaleshtori 3
  • Mir Sepehr Pedram 4
  • Ali Bayat Khomejini 1
  • Neda Sabetzadeh 5
1 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran
2 Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran
3 Department of Internal Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran
4 Department of Surgery & Radiology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran
5 Institute of Biomedical Research, University of Tehran, Tehran, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Peripheral nerve injuries often require surgical intervention to repair nerves. Autologous nerve grafting is a standard method for the repair of peripheral nerves. However, autologous nerve grafts have limitations such as restricted availability. Thus, the development of alternative strategies to address nerve defects is essential.
OBJECTIVES: This study aims to develop and prepare decellularized nerve scaffolds from ovine peripheral nerves and evaluate their histological features and mechanical properties for use in peripheral nerve repair.
METHODS: Brachial plexus nerves were isolated from male sheep cadavers under aseptic conditions and decellularized using detergent agents according to a decellularization protocol. The decellularization process was assessed using hematoxylin-eosin staining (H&E), Masson's trichrome staining method, and electron microscopy. The resistance and mechanical properties of the extracellular matrix structure were examined by tensile testing. The DNA content of decellularized nerves and intact nerves was also measured using a kit and NanoDrop.
RESULTS: The evaluations showed that cells were completely removed from the nerve scaffolds, and the extracellular matrix was well preserved in the nerve scaffold. Tensile testing revealed that decellularized nerve scaffolds relatively maintained their mechanical properties compared to control nerves. Examining the DNA content of scaffolds and intact nerves also showed that the DNA content of nerves was significantly reduced after the decellularization process.
CONCLUSIONS: The prepared decellularized peripheral nerve grafts can preserve extracellular matrix components. The decellularized nerve scaffolds have the potential to be alternatives to artificial nerve conduits and autografts for peripheral nerve repair.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Decellularization
  • Extracellular matrix
  • Nerve graft
  • Peripheral nerve
  • Tissue engineering

اصل مقاله

مقدمه

آسیب‌های عصب محیطی (Peripheral nerve injuries) سالانه تقریباً 1 میلیون نفر را در سراسر جهان تحت تأثیر قرار می‌دهد (1، 2). آسیب‌های عصب محیطی بار اقتصادی قابل‌توجهی را بر جامعه تحمیل می‌کند و به از دست دادن عملکرد اندام منجر می‌شود که به‌شدت کیفیت زندگی بیماران را مختل می‌کند (3، 4).

سیستم عصبی محیطی، احساس، حرکت و هماهنگی حرکات بدن را کنترل می‌کند. اعصاب محیطی می‌توانند به‌راحتی در اثر ضربه یا بیماری­های تخریب‌کننده عصب آسیب ببینند. شایع‌ترین این آسیب‌ها در کشش، ایسکمی، پارگی، فشار و سوختگی رخ می‌دهد. به‌طورکلی سیستم اعصاب محیطی دارای ظرفیت احیای بالاتری نسبت به سیستم اعصاب مرکزی است و باعث بهبود طبیعی بافت عصبی می‌شود. به ‌‌دنبال آسیب عصب محیطی، در بخش انتهایی آکسون، دژنراسیون والرین رخ می‌دهد که باعث عصب‌زدایی ارگان‌های اطراف می‌شود (5). در ابتدا بدن از‌طریق سلول­های شوان با تشکیل غلاف میلین، تکثیر سلولی، فاگوسیتوز و آزادسازی سیتوکین‌ها به آسیب ایجاد‌شده پاسخ می­دهد. در ترمیم اعصاب محیطی، رشد آکسون‌ها در جهت درست برای ایجاد آناستوموز و موفقیت ترمیم حائز اهمیت است (6). در صدمات شدید عصب محیطی، آکسون‌ها با اینکه قادر به بازسازی خود می‌باشند، اما رشد آن‌ها در جهت نادرست و عدم تشکیل آناستوموز به ناموفق بودن فرایند ترمیم منجر می‌شود (7). در موارد شدید پاسخ بدن قادر به ترمیم و بهبودی آسیب نمی‌باشد و فرد ناگزیر به استفاده از روش­های درمانی خواهد بود.

درمان­های رایج شامل جراحی نورورافی، پیوند عصب اتولوگ، داروهای ضد‌التهاب، فیزیوتراپی و تکنیک­های توان­بخشی برای بازسازی عصب، متعاقب آسیب موفقیت محدودی دارند. علت این مسئله آناتومی پیچیده بافت عصبی و موانع مهاری موجود در موضع آسیب است. از سوی دیگر محدودیت در دسترس بودن بافت عصبی به‌منظور پیوند عصب، عدم تطابق اندازه بافت عصبی دهنده و گیرنده، وجود تعداد ناکافی از اعصاب اتولوگ برای عصب اصلی معیوب (8) و تشکیل نورومای احتمالی از موارد مهم محدود‌کننده پیوند عصب اتولوگ به‌عنوان یک روش درمانی است (9-14).

به‌دلیل این چالش‌ها که استفاده از پیوندهای عصبی اتولوگ را محدود می‌کنند، دانشمندان استفاده از مجرای پیوند عصبی (Nerve graft conduit) را برای ترمیم عصب بررسی کرده‌اند (15). همچنین برخی کاندوئیت‌ها نیز تأییدیه سازمان غذا و دارو (Food and Drug Administration (FDA)) را دریافت کرده‌اند و در دستیابی به ترمیم عملکردی نوید‌بخش بوده‌اند (16، 17). از طرفی مجرا‌های پیوند عصبی موجود عمدتاً لوله‌های توخالی می‌باشند که ساختار سه‌بعدی یا ترکیب ماتریکس خارج سلولی (Extra Cellular Matrix) اعصاب طبیعی را تقلید نمی‌کنند (18، 19). برای غلبه بر این چالش‌ها، محققین از ساخت مجرا‌های پیوند عصبی پیشرفته که ساختار داخلی اعصاب اتولوگ را شبیه‌سازی می‌کنند، استفاده کرده‌اند. این شامل طرح‌هایی، مانند مجرا‌های پیوند عصبی متخلخل، شیاردار، چند‌کاناله و پر‌شده است (20-22). اگرچه مجرا‌های پیوند عصبی متخلخل، شیاردار، چند‌کاناله و توپر نتایج ترمیم بهتری نسبت به کاتترهای توخالی داشته‌اند، اما ساختار آن‌ها هنوز به‌طور قابل‌توجهی با معماری پیچیده سه‌بعدی اعصاب طبیعی متفاوت است (23-25).

در بین پل‌های عصبی مختلف، پیوند عصب سلول‌زدایی‌شده (Acellular Nerve Graft) با دقت بیشتری از اعصاب طبیعی در ساختار و ترکیب تقلید می‌کنند. به‌این‌ترتیب، عصب سلول‌زدایی‌شده جایگزین بسیار امیدوارکننده‌ای برای پیوندهای عصبی اتولوگ برای ترمیم نقایص عصبی می‌باشند (26). استفاده از اعصاب زنوژن، منابع پیوند را به‌طور گسترده افزایش می‌دهد، بنابراین دارای یک چشم‌انداز دلگرم‌کننده برای درمان‌های بالینی است. استفاده از زنوگرفت‌های سلول‌زدایی‌شده نیاز به سرکوب سیستم ایمنی ندارد و برای ترمیم آسیب‌های اعصاب محیطی ایمن و مؤثر است (27). ایجاد یک داربست با از بین بردن مواد تشکیل‌دهنده ایمنی‌زای بافت و باقی‌ ماندن عناصر ماتریکس خارج سلولی و ساختار سه‌بعدی آن صورت می‌گیرد. همچنین عناصر ماتریکس خارج سلولی به‌طور گسترده در میان گونه‌های مختلف مشابه‌ می‌باشند (6).

چندین رویکرد برای سلول‌زدایی جهت تولید داربست‌های عصبی سلول‌زدایی‌شده از عصب اهدا‌کننده ثبت شده‌ است (28). هدف از هر فرایند سلول‌زدایی، حذف کارآمد کلیه مواد سلولی و هسته‌ای است، در‌حالی‌که می‌بایست هرگونه اثر سوء آن بر ترکیب، فعالیت بیولوژیکی و یکپارچگی مکانیکی ماتریکس خارج سلولی باقیمانده به حداقل برسد. باوجوداین هر فرایندی که به حذف سلول‌ها نیاز داشته باشد، احتمالاً ساختار سه‌بعدی ماتریکس خارج سلولی را تغییر خواهد‌ داد. روش‌های زیادی برای تهیه داربست‌های سلولی وجود دارد. با وجود تفاوت‌های موجود، تمام روش‌های پردازش با هدف کاهش ایمنی‌زایی بافت و افزایش ظرفیت بازسازی از‌طریق حفظ ماتریکس خارج سلولی به کار برده می‌شوند. رویکردهای سلول‌زدایی شیمیایی روش سودمندتر می‌باشند (29، 30).

Sondell و همکاران در سال 1998 توانستند با استفاده از شوینده‌های تریتون و سدیم‌ داکسی‌کولات همراه با مجموعه‌ای از محلول‌های شست‌وشو داربست‌های عصبی سلول‌زدایی‌‌شده‌ای طراحی کنند که علی‌رغم فقدان خواص ایمونوژنیسیته، به‌طور چشمگیری از رشد آکسون‌ها و مهاجرت سلول‌های شوان برای ترمیم آسیب‌های عصبی پشتیبانی می‌کردند (31). همچنین در مطالعه دیگر،Hudson  و همکاران در سال 2004، با استفاده از شوینده‌های زویتریونی سولفوبتائین همراه با شوینده آنیونی تریتون یک داربست عصبی سلول‌زدایی‌شده ایجاد کردند که ساختارهای غشای پایه و ماتریکس خارج سلولی را به نحو مناسبی حفظ کرد (32).

اگرچه مواد شیمیایی و مراحل خاص بین روش‌‌های مطرح‌شده متفاوت است، اما هدف همه آن‌ها حذف سلول‌‌ها از بافت عصبی و درعین‌حال حفظ ماتریکس خارج سلولی است. روش‌ها در انواع شوینده‌های مورد‌استفاده و همچنین مراحل اضافی، مانند انجماد یا ذوب یا استخراج دی‌اکسید کربن فوق بحرانی، متفاوت می‌باشند. به‌طور‌کلی روش‌های متعددی وجود دارد که می‌تواند برای ایجاد پیوندهای عصبی سلول‌زدایی‌شده برای کاربردهای مهندسی بافت عصبی استفاده شود.

هدف از مطالعه حاضر توسعه عصب‌های سلول‌زدایی‌شده زیست‌‌سازگار و غیر ایمنی‌زا با منبع زنوژنیک و با استفاده از محلول‌های شست‌و‌شوی کم‌خطر و پربازده است. این روش یک گزینه جدید و جایگزین برای تولید عصب‌های سلول‌زدایی‌شده است که به‌عنوان یکی از روش‌های درمان آسیب‌‌های عصبی محیطی معرفی می‌شود.

مواد و روش کار

تهیه عصب سلول‌زدایی‌شده: اعصاب شبکه بازویی، به طول حدودی 30 میلی‌متر و به تعداد 30 عدد که برای اهداف درون‌تنی (In vivo) بعدی، از‌نظر قطر با عصب سیاتیک رت مطابقت داشتند، از لاشه گوسفندان نر تحت شرایط آسپتیک بلافاصله پس از کشتار جدا شدند. روش تهیه بافت عصبی سلول‌زدایی‌شده بر‌اساس روشی بود که توسط Hudson و همکاران در سال 2004 توسعه داده شده بود و مطالعات مختلفی در این زمینه صورت گرفته است (32، 33). ابتدا چربی خارجی، بافت همبند و خون از اعصاب جمع‌آوری‌شده پاک‌سازی شد و نمونه‌های عصبی توسط بافر نمکی فسفاته حاوی 1 درصد پنی‌سیلین و استرپتومایسین به‌مدت 1 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و با سرعت 60 دور در دقیقه شست‌و‌شو داده شدند. سپس در محلول بافر نمکی فسفاته در دمای 4 درجه تا 24 ساعت نگهداری شدند. اعصاب جدا‌شده به بخش­های 10 میلی‌متری برش داده شدند و جهت انجام روند سلول‌زدایی با مواد شوینده تحت تیمار قرار گرفتند. ابتدا از بافر نمکی فسفات (PBS) به‌مدت 12 ساعت و سپس از محلول هیپرتونیک کلرید سدیم 6 درصد به‌مدت 18 ساعت به‌عنوان تیمار اولیه برای از بین بردن سلول‌ها استفاده شد. در مرحله بعد عصب‌های جدا‌شده ابتدا توسط محلول چپس (CHAPS) -3 (3-cholamidopropyl dimethylammonio -1-propanesulfonate hydrate) (Sigma chemical, USA) با غلظت 6 درصد در بافر نمکی فسفات و سپس توسط تریتون (Triton X-100)، (Merck, Germany) با غلظت 2 درصد محلول در بافر نمکی فسفات هر‌یک به‌مدت 24 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند. در مرحله نهایی ساختار‌های عصبی تهیه‌شده در محلولDNAse  (SinaClon, Iran) وRNAse  SinaClon, Iran)) در بافر نمکی فسفات، شامل 1 واحد بر میلی‌لیتر RNAse و 50 واحد بر میلی‌لیتر DNAse به‌مدت 6 ساعت قرار گرفتند. بین هر‌کدام از مراحل 3 بار شست‌‌و‌‌شو با آب‌مقطر و هر بار به‌مدت 15 دقیقه صورت گرفت. پس از هر بار شست‌‌و‌‌شو محلول‌های مورد‌استفاده تعویض شدند. تمام مراحل تحت شیکر با سرعت 120 دور در دقیقه و در دمای محیط انجام شد و PH تمام محلول‌های مورد‌استفاده 5/7 بود. ساختار‌های تهیه‌شده برای انجام آزمون‌های درون‌تنی پس از فرایند شست‌و‌شو به‌مدت 3 ساعت در محلول پراستیک‌اسید (PAA) (Merck, Germany) با غلظت 1/0 درصد در دمای اتاق استریل شدند و برای ادامه مطالعات در محلول بافر نمکی فسفاته حاوی 1 درصد پنی‌سیلین و استرپتومایسین در دمای 4 درجه نگهداری شدند.

بررسی بافت‌شناسی و ارزیابی اجزای ماتریکس خارج سلولی: بافت‌های عصبی سلول‌زدایی‌شده برای ثبوت بافتی در فرمالین 10 درصد غوطه‌ور شد. پس از آن آبگیری با اتانول، شفاف‌‌سازی با گزیلول و غوطه‌ور‌سازی در پارافین مذاب انجام شد. نهایتاً قالب‌های پارافینی و برش‌هایی با ضخامت ۵ میکرومتر با استفاده از میکروتوم تهیه شد. رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین‌ائوزین برای ارزیابی حذف اجزای سلولی، تری‌کروم ماسون برای بررسی خصوصیات ریخت‌شناسی الیاف کلاژن و آلسین‌بلو برای سنجش گلیکوزآمینوگلیکان‌های سولفاته استفاده شد (34).

ارزیابی میکروسکوپ الکترونی نگاره: برای بررسی دقیق‌تر تغییرات ساختاری در داربست‌های سلول‌زدایی‌شده و نمونه‌های بافتی عصب سالم، از میکروسکوپ الکترونی نگاره استفاده شد. نمونه‌ها در گلوتارآلدئید 5/2 درصد به‌مدت 2 ساعت تثبیت شدند و مقاطع طولی آن‌ها با طلا پوشانده شد و ریزساختار نمونه‌ها و تخلخل آن‌ها توسط میکروسکوپ الکترونی نگاره (مدلAIS2300C ، ساخت کره جنوبی) با استفاده از 22 هزار ولت تصویر‌برداری شد.

بررسی استحکام کششی نمونه‌‌ها: به‌منظور بررسی میزان استحکام کششی داربست‌‌های سلول‌زدایی‌شده، همراه با نمونه‌‌های کنترل عصب، از دستگاه آزمون کششی ایکس استفاده شد. بدین منظور ابتدا قطر نمونه‌‌ها به کمک کولیس دیجیتال اندازه‌گیری شد و سپس قطعات نمونه‌‌ها به طول 1 سانتی‌‌متر به بازو‌های دستگاه متصل شدند. برای محکم کردن نمونه‌‌ها روی بازو‌های دستگاه از چسب مایع قوی استفاده شد. در ادامه نمونه‌‌ها با سرعت ثابت 1/0 میلی‌‌متر در ثانیه تحت کشش قرار گرفتند. در طول اندازه‌گیری، نمونه‌‌ها با استفاده از نرمال سالین مرطوب نگه ‌داشته شدند. هر نمونه به‌طور کامل تا حداکثر نیروی کششی و تا زمان قطع شدن کشیده شد (35).

تعیین محتوای DNA داربست‌ها: با ارجاع به مطالعه منتشر‌شده (36)، یک کیت سنجش (High yield DNA Purification‌Kit) DNPTM، (SinaClon Iran) برای تعیین محتوای DNA 3 نمونه بافت عصب پس از سلول‌زدایی استفاده شد. به‌طور خلاصه، 3 نمونه عصب سلول‌زدایی‌شده و 3 نمونه عصب دست‌نخورده گوسفند به یک میکروتیوب 5/1 میلی‌لیتری حاوی 500 میکرولیتر بافر لیز سلولی اضافه شد، 1 ساعت تحت انکوباسیون قرار گرفت و 10 دقیقه در 1000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد و سپس مراحل استخراج DNA انجام‌ شد. مقدار DNA باقیمانده با استفاده از طیف‌سنج نانودراپ (BOECO Germany) اندازه‌گیری شد. اندازه‌گیری‌ها 3 بار تکرار شد و پس از قرائت، تمام داده­ها به یک واحد اندازه‌گیری تبدیل شدند.

تجزیه‌وتحلیل آماری: ابتدا برای نرمال بودن داده‌ها از تست کولموگروف اسمیرنف (Kolmogorov-Smirnov) و سپس برای تحلیل داده‌ها، از آزمون T مستقل (Independent samples T-test) استفاده شد. مقادیر 05/0P< به‌عنوان حداقل سطح معنی‌‌داری در نظر گرفته ‌شد و تمام تحلیل‌‌های آماری توسط نرم‌‌افزار SPSS نسخه 24 انجام شد.

نتایج

بررسی‌های میکروسکوپ نوری داربست‌های عصب سلول‌زدایی‌شده نشان داد سلول‌زدایی مناسب منجر به حذف کامل سلول‌ها و همچنین حفظ ماتریکس خارج سلولی شده و محیط مناسبی برای کشت و مطالعه رفتار سلولی فراهم آمده است. در مقاطع بافت‌شناسی با رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین‌ائوزین، هسته سلولی قابل‌مشاهده در داربست‌های سلول‌زدایی‌شده وجود نداشت، در‌حالی‌که هسته سلولی به رنگ بنفش در مقاطع عصب دست‌نخورده قابل‌مشاهده بود که این نشان‌دهنده حذف کامل سلول‌ها از‌طریق فرایند سلول‌زدایی بود (تصویر 1).

آلسین‌بلو یک رنگ فتالوسیانین حاوی مس است که به پلی‌آنیون‌ها یا ماکرومولکول‌های با بار منفی متصل می‌شود. این رنگ‌آمیزی امکان شناسایی و طبقه‌بندی پلی‌آنیون‌ها در بافت عصبی را بر‌اساس ترکیب شیمیایی آن‌ها و فعل‌و‌انفعالات آنیونی فراهم می‌کند که یک راه برای مطالعه محیط ماکرومولکولی سازه‌هایی، مانند گره رانویه (Ranvier) را به وجود می‌آورد (37). این رنگ نشانگر مناسبی جهت نشان دادن گره‌های رانویه و آکسون‌ها می‌باشد که نتایج حاصل از این رنگ‌آمیزی نیز نشان داد در داربست‌های تهیه‌شده از عصب‌های سلول‌زدایی‌شده هیچ سلولی دیده نمی‌شود و سلول‌زدایی به‌طور کامل انجام شده است (تصویر 2).

محتوای ماتریکس خارج سلولی، از‌جمله ساختار و تراکم رشته‌های کلاژن با رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون ارزیابی شد. این رنگ‌آمیزی امکان تمایز فیبرهای کلاژن ماتریکس خارج سلولی را از سایر انواع ساختارها فراهم می‌کند (38، 39). این رنگ‌آمیزی نشان داد در طی روند سلول‌زدایی رشته‌های کلاژن در ماتریکس خارج سلولی به‌طور نسبی حفظ شده‌اند (تصویر 3). مقایسه داربست سلول‌زدایی‌شده با عصب دست‌نخورده در سطح میکروسکوپ الکترونی نگاره نشان داد در عصب سلول‌زدایی‌شده همه سلول‌ها از بین رفته‌اند و ساختار ماتریکس خارج سلولی عصب به‌طور نسبی حفظ شده است (تصویر 4). آزمون کششی نشان داد میانگین نیروی بیشینه مورد‌نیاز برای پاره شدن عصب دست‌نخورده 6/2 نیوتن و برای عصب سلول‌زدایی‌شده 4/1 نیوتن بود که تفاوت معنی‌داری را ازلحاظ آماری نشان می‌داد (05/0P<) (تصویر 5). همچنین افزایش طول تا نقطه پارگی عصب در 2 گروه متفاوت بود.

بررسی محتوای DNA داربست‌ها و اعصاب دست‌نخورده هم نشان داد محتوای DNA اعصاب دست‌نخورده بالا بود. در اعصاب طبیعی در هر میلی‌گرم نمونه 1/364‌±‌2/4362 نانوگرم، DNA وجود داشت که محتوای آن پس از فرایند سلول‌زدایی به‌طور قابل‌‌توجهی کاهش یافته بود، به‌طوری‌که در داربست‌ها در هر میلی‌گرم نمونه 3/4‌±‌8/68 نانوگرمDNA  وجود داشت. بررسی آماری نیز اختلاف معنی‌داری را میان عصب‌های سلول‌زدایی‌شده و دست‌نخورده نشان داد (05/0P<) (تصویر 6).

بحث

رویکرد­های متعددی برای کاهش چالش­های درمان ضایعات بافت عصبی پیشنهاد و به‌عنوان جایگزین استفاده از پیوندهای عصبی مشتق از بیمار ارائه شده است. با‌این‌حال تاکنون هیچ روشی که به اندازه‌ پیوند اتوگرفت کارآمد باشد توسعه نیافته است (40). محصولاتی با منشأ انواع بافت‌های زنوژنیک از استراتژی‌های درمانی جدید است که برای بهبود و به‌ویژه تسریع بازسازی عصب از اهمیت زیادی برخوردار است (27). استفاده از بافت زنوژنیک می‌تواند یک روش جایگزین مناسب برای عصب آسیب‌دیده در انسان باشد. برخی از اعضای حیوانات از‌نظر ساختاری مشابه اندام‌های انسانی می‌باشند و می‌توان از آن‌ها به‌عنوان یک گزینه درمانی برای پیوند استفاده کرد (41).

امروزه استفاده از داربست‌های مختلفی جهت استفاده در ترمیم جراحات اعصاب محیطی گزارش شده است (42، 43). در مقایسه با کاندوئیت‌های هدایت عصب مصنوعی که با استفاده از پلیمرهای طبیعی یا پلیمرهای مصنوعی تهیه می‌شوند، پیوندهای عصبی سلول‌زدایی‌شده مشتق‌شده از اعصاب طبیعی دارای مزایای بیونیک در ترکیب و ساختار می‌باشند که مواد پلیمری آن را ندارند. از‌جمله این مزایا می‌توان به زیست‌‌سازگاری مطلوب، خواص بیومکانیکی بهتر و عملکرد زیستی بالا و همچنین موفقیت بیشتر آن‌ها در ترمیم جراحات عصبی اشاره کرد (44).

از طرفی چندین رویکرد برای سلول‌زدایی جهت تولید پیوند‌های عصبی سلول‌زدایی‌شده از عصب اهدا‌کننده ثبت شده است؛ از‌جمله این موارد پروتکل توسعه‌یافته توسط Sondell و همکاران در سال 1998 است که در این روش استخراج شیمیایی سلول‌ها از اعصاب با استفاده از غوطه‌وری هیپوتونیک و به ‌دنبال آن تیمارهای شوینده متناوب با تریتون و سدیم ‌دی‌اکسی‌کولات انجام می‌شود. همچنین در روشی دیگر که بر‌اساس پروتکل Hudson و همکاران در سال 2004 است، از تیمارهای شیمیایی با سولفوبتائین‌ها، تریتون و سدیم ‌دی‌اکسی‌کولات و به ‌دنبال آن شست‌‌و‌‌شو و استریل کردن استفاده می‌شود. مشابه این روش برای ایجاد داربست‌های عصبی سلول‌زدایی‌شده دمیلینه شده حیوانی و داربست‌های عصبی سلول‌زدایی‌شده انسان هم استفاده شده است. همچنین روش‌های جدید‌تر دیگر شامل انجماد و ذوب، تیمار با سدیم‌ دودسیل‌سولفونات (SDS)، اولتراسوند، محلول‌های DNase/RNase و استخراج دی‌اکسید‌ کربن فوق‌بحرانی برای سلول­زدایی کردن بافت استفاده می­شوند (45).

هدف از هر فرایند سلول‌زدایی، حذف کارآمد کلیه مواد سلولی و هسته‌ای است؛ در‌حالی‌که می‌بایست هرگونه اثر سوء آن بر ترکیب، فعالیت بیولوژیکی و یکپارچگی مکانیکی ماتریکس خارج سلولی باقیمانده به حداقل برسد. تمام روش‌های سلول‌زدایی با هدف کاهش ایمنی‌زایی بافت و افزایش ظرفیت بازسازی از‌طریق حفظ ماتریکس خارج سلولی به کار برده می‌شوند (46).

ارزیابی‌های هیستولوژیک با رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین‌‌ائوزین نشان داد سلول‌ها به‌طور کامل در داربست‌ها حذف شده‌اند. همچنین با ارزیابی محتوای ماتریکس خارج سلولی، از‌جمله ساختار و تراکم رشته‌های کلاژن با استفاده از رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون مشخص شد ساختار ماتریکس خارج سلولی در داربست‌ها به‌طور مناسبی حفظ شده است. بررسی‌های دقیق‌تر توسط میکروسکوپ الکترونی نیز نشان‌دهنده این بود که حذف سلول‌ها به‌خوبی انجام شده و ساختار کلی بافت محصول نیز حفظ شده است. همچنین مقاومت مکانیکی و ساختاری داربست‌های تهیه‌شده توسط تست استحکام کششی تأیید شد. بخشی از سیمان بافتی در فرایند سلول‌زدایی از بین می‌رود. به همین دلیل بافت حاصل مقداری از قابلیت مقاومت در برابر پارگی و شکنندگی خود را از دست می‌دهد. از طرفی الیاف کلاژن و الاستیک باقیمانده نسبت به کشش ایجاد‌شده مقاومت نشان می‌دهند که این مقاومت به‌صورت دو پیک خود را نشان می‌دهد که پیک اول مربوط به رشته‌های کلاژن و پیک دوم مربوط به رشته‌های الاستیک است. جای خالی سیمان بافتی و سلول‌های حذف‌شده باعث متخلخل شدن داربست محصول می‌شود که این سبب فراهم شدن زمینه نفوذ و چسبندگی سلول‌ها درون داربست و همچنین افزایش قابلیت کشسانی آن جهت آماده‌سازی داربست‌های سلول‌زدایی‌شده مناسب می‌شود (47، 48).

مطالعات نشان داده‌اند ایمنی‌زایی اجزای ماتریکس خارج سلولی اعصاب، مانند پروتئین لامینین و فیبرونکتین ضعیف و حتی تقریباً ناچیز است. بنابراین ایمنی‌زایی احتمالی داربست‌های عصبی عمدتاً در‌نتیجه‌ سلول‌های باقیمانده در بافت آن‌ها پس از فرایند سلول‌زدایی است (49، 50). نتایج مطالعات انجام‌شده نشان‌دهنده این است که استفاده از شوینده‌ها در فرایند سلول‌زدایی و از بین بردن بقایای سلولی در بافت‌های عصبی به‌طور موفقیت‌آمیزی مؤثر واقع شده است (49، 51).

نتیجه‌گیری نهایی: بررسی‌های انجام‌شده در مطالعه حاضر در‌مجموع بیانگر این بود که داربست‌های تهیه‌شده از بافت‌های طبیعی عصبی زنوژن از طریق فرایند سلول‌زدایی با شوینده‌ها، ویژگی‌های ساختاری مناسبی جهت ایجاد بستر رشد سلولی فراهم می‌کنند.

سپاسگزاری

از پژوهشکده تحقیقات زیست­پزشکی دانشگاه تهران تشکر و قدردانی می­شود.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

مراجع

  1. Sun X, Wang Y, Guo Z, Xiao B, Sun Z, Yin H, et al. Acellular cauda equina allograft as main material combined with biodegradable chitin conduit for regeneration of long-distance sciatic nerve defect in rats. Adv Healthc Mater. 2018;7(17):e1800276. doi: 10.1002/adhm.201800276 PMID: 30044554
  2. Magaz A, Faroni A, Gough JE, Reid AJ, Li X, Blaker JJ. Bioactive silk-based nerve guidance conduits for augmenting peripheral nerve repair. Adv Healthc Mater. 2018;7(23):e1800308. doi: 10.1002/adhm.201800308 PMID: 30260575
  3. Gu X, Ding F, Williams DF. Neural tissue engineering options for peripheral nerve regeneration. Biomaterials. 2014;35(24):6143-56. doi: 10.1016/j.biomaterials.2014.04.064 PMID: 24818883
  4. Sarker MD, Naghieh S, McInnes AD, Schreyer DJ, Chen X. Regeneration of peripheral nerves by nerve guidance conduits: Influence of design, biopolymers, cells, growth factors, and physical stimuli. Prog Neurobiol. 2018. doi: 10.1016/j.pneurobio.2018.07.002 PMID: 30077776
  5. Hall S. The response to injury in the peripheral nervous system. J Bone Joint Surg Br. 2005;87(10):1309-19. doi: 10.1302/0301-620X.87B10.16700 PMID: 16189300
  6. Zilic L, Wilshaw SP, Haycock JW. Decellularisation and histological characterisation of porcine peripheral nerves. Biotechnol Bioeng. 2016;113(9):2041-53. doi: 10.1002/bit.25964 PMID: 26926914
  7. Walsh S, Midha R. Practical considerations concerning the use of stem cells for peripheral nerve repair. Neurosurg Focus. 2009;26(2):E2. doi: 10.3171/FOC.2009.26.2.E2 PMID: 19435443
  8. Siemionow M, Sonmez E. Nerve allograft transplantation: a review. J Reconstr Microsurg. 2007;23(8):511-20. doi: 10.1055/s-2007-1022694 PMID: 18189213
  9. Marchesi C, Pluderi M, Colleoni F, Belicchi M, Meregalli M, Farini A, et al. Skin-derived stem cells transplanted into resorbable guides provide functional nerve regeneration after sciatic nerve resection. Glia. 2007; 55(4):425-38. doi: 10.1002/glia.20470 PMID: 17203471
  10. Hu J, Zhu QT, Liu XL, Xu YB, Zhu JK. Repair of extended peripheral nerve lesions in rhesus monkeys using acellular allogenic nerve grafts implanted with autologous mesenchymal stem cells. Exp Neurol. 2007;204(2):658-66. doi: 10.1016/j.expneurol.2006.11.018 PMID: 17316613
  11. Kingham PJ, Kalbermatten DF, Mahay D, Armstrong SJ, Wiberg M, Terenghi G. Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro. Exp Neurol. 2007;207(2):267-74. doi: 10.1016/j.expneurol.2007.06.029 PMID: 17761164
  12. Chalfoun CT, Wirth GA, Evans GR. Tissue engineered nerve constructs: where do we stand? J Cell Mol Med. 2006;10(2):309-17. doi: 10.1111/j.1582-4934.2006.tb00401.x PMID: 16796801
  13. IJkema-Paassen J, Jansen K, Gramsbergen A, Meek MF. Transection of peripheral nerves, bridging strategies and effect evaluation. Biomaterials. 2004;25(9):1583-92. doi: 10.1016/s0142-9612(03)00504-0 PMID: 14697860
  14. Bini TB, Gao S, Xu X, Wang S, Ramakrishna S, Leong KW. Peripheral nerve regeneration by microbraided poly(L-lactide-co-glycolide) biodegradable polymer fibers. J Biomed Mater Res A. 2004;68(2):286-95. doi: 10.1002/jbm.a.20050 PMID: 14704970
  15. Singh A, Asikainen S, Teotia AK, Shiekh PA, Huotilainen E, Qayoom I, et al. Biomimetic photocurable three-dimensional printed nerve guidance channels with aligned cryomatrix lumen for peripheral nerve regeneration. ACS Appl Mater Interfaces. 2018;10(50):43327-43342. doi: 10.1021/acsami.8b11677 PMID: 30460837
  16. Kehoe S, Zhang XF, Boyd D. FDA approved guidance conduits and wraps for peripheral nerve injury: a review of materials and efficacy. Injury. 2012;43(5):553-72. doi: 10.1016/j.injury.2010.12.030 PMID: 21269624
  17. MacEwan MR, Zellmer ER, Wheeler JJ, Burton H, Moran DW. Regenerated sciatic nerve axons stimulated through a chronically implanted macro-sieve electrode. Front Neurosci. 2016;10:557. doi: 10.3389/fnins.2016.00557 PMID: 28008303
  18. Sarker M, Naghieh S, McInnes AD, Schreyer DJ, Chen X. Strategic design and fabrication of nerve guidance conduits for peripheral nerve regeneration. Biotechnol J. 2018;13(7):e1700635. doi: 10.1002/biot.201700635 PMID: 29396994
  19. Sun B, Zhou Z, Wu T, Chen W, Li D, Zheng H, et al. Development of nanofiber sponges-containing nerve guidance conduit for peripheral nerve regeneration in vivo. ACS Appl Mater Interfaces. 2017;9(32):26684-26696. doi: 10.1021/acsami.7b06707 PMID: 28718615
  20. Yao L, de Ruiter GC, Wang H, Knight AM, Spinner RJ, Yaszemski MJ, et al. Controlling dispersion of axonal regeneration using a multichannel collagen nerve conduit. Biomaterials. 2010;31(22):5789-97. doi: 10.1016/j.biomaterials.2010.03.081 PMID: 20430432
  21. Wang J, Xiong H, Zhu T, Liu Y, Pan H, Fan C, et al. Bioinspired multichannel nerve guidance conduit based on shape memory nanofibers for potential application in peripheral nerve repair. ACS Nano. 2020;14(10):12579-12595. doi: 10.1021/acsnano.0c03570 PMID: 32786254
  22. Vijayavenkataraman S. Nerve guide conduits for peripheral nerve injury repair: A review on design, materials and fabrication methods. Acta Biomater. 2020;106:54-69. doi: 10.1016/j.actbio.2020.02.003 PMID: 32044456
  23. Yang S, Wang C, Zhu J, Lu C, Li H, Chen F, et al. Self-assembling peptide hydrogels functionalized with LN- and BDNF- mimicking epitopes synergistically enhance peripheral nerve regeneration. Theranostics. 2020;10(18):8227-8249. doi: 10.7150/thno.44276 PMID: 32724468
  24. Rao F, Wang Y, Zhang D, Lu C, Cao Z, Sui J, et al. Aligned chitosan nanofiber hydrogel grafted with peptides mimicking bioactive brain-derived neurotrophic factor and vascular endothelial growth factor repair long-distance sciatic nerve defects in rats. Theranostics. 2020;10(4):1590-1603. doi: 10.7150/thno.36272 PMID: 32042324
  25. Wang J, Cheng Y, Wang H, Wang Y, Zhang K, Fan C, et al. Biomimetic and hierarchical nerve conduits from multifunctional nanofibers for guided peripheral nerve regeneration. Acta Biomater. 2020;117:180-191. doi: 10.1016/j.actbio.2020.09.037 PMID: 33007489
  26. Cerqueira SR, Lee YS, Cornelison RC, Mertz MW, Wachs RA, Schmidt CE, et al. Decellularized peripheral nerve supports Schwann cell transplants and axon growth following spinal cord injury. Biomaterials. 2018;177:176-18. doi: 10.1016/j.biomaterials.2018.05.049 PMID: 29929081
  27. Jia H, Wang Y, Tong XJ, Liu GB, Li Q, Zhang LX, et al. Sciatic nerve repair by acellular nerve xenografts implanted with BMSCs in rats xenograft combined with BMSCs. Synapse. 2012;66(3):256-69. doi: 10.1002/syn.21508 PMID: 22127791
  28. Moore AM, MacEwan M, Santosa KB, Chenard KE, Ray WZ, Hunter DA, et al. Acellular nerve allografts in peripheral nerve regeneration: a comparative study. Muscle Nerve. 2011;44(2):221-34. doi: 10.1002/mus.22033 PMID: 21660979
  29. Fu SY, Gordon T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 1997;14(1-2):67-116. doi: 10.1007/BF02740621 PMID: 9170101
  30. Hundepool CA, Nijhuis TH, Kotsougiani D, Friedrich PF, Bishop AT, Shin AY. Optimizing decellularization techniques to create a new nerve allograft: an in vitro study using rodent nerve segments. Neurosurg Focus. 2017;42(3):E4. doi: 10.3171/2017.1.FOCUS16462 PMID: 28245670
  31. Sondell M, Lundborg G, Kanje M. Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction. Brain Res. 1998;795(1-2):44-54. doi: 10.1016/s0006-8993(98)00251-0 PMID: 9622591
  32. Hudson TW, Zawko S, Deister C, Lundy S, Hu CY, Lee K, et al. Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration. Tissue Eng. 2004;(11-12):1641-51. doi: 10.1089/ten.2004.10.1641 PMID: 15684673
  33. Bae JY, Park SY, Shin YH, Choi SW, Kim JK. Preparation of human decellularized peripheral nerve allograft using amphoteric detergent and nuclease. Neural Regeneration Research. 2021;16(9):1890-1896. doi: 10.4103/1673-5374.306091 PMID: 33510098
  34. Fischer AH, Jacobson KA, Rose J, Zeller R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008;pdb.prot4986. doi: 10.1101/pdb.prot4986 PMID: 21356829
  35. Zhao Z, Wang Y, Peng J, Ren Z, Zhang L, Guo Q, et al. Improvement in nerve regeneration through a decellularized nerve graft by supplementation with bone marrow stromal cells in fibrin. Cell Transplant. 2014;23(1):97-110. doi: 10.3727/096368912X658845 PMID: 23128095
  36. Gu Y, Zhu J, Xue C, Li Z, Ding F, Yang Y, et al. Chitosan/silk fibroin-based, Schwann cell-derived extracellular matrix-modified scaffolds for bridging rat sciatic nerve gaps. Biomaterials. 2014;35(7):2253-63. doi: 10.1016/j.biomaterials.2013.11.087 PMID: 24360577
  37. Langley OK. The interaction between peripheral nerve polyanions and Alcian blue. J Neurochem. 1970;17(11):1535-41. doi: 10.1111/j.1471-4159.1970.tb03723.x PMID: 4097507
  38. Raimondo S, Fornaro M, Di Scipio F, Ronchi G, Giacobini-Robecchi MG, Geuna S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. Int Rev Neurobiol. 2009;87:81-103. doi: 10.1016/S0074-7742(09)87005-0 PMID: 19682634
  39. Carriel V, Garzón I, Alaminos M, Cornelissen M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen Res. 2014;9(18):1657-60. doi: 10.4103/1673-5374.141798 PMID: 25374585
  40. Wakimura Y, Wang W, Itoh S, Okazaki M, Takakuda K. An experimental study to bridge a nerve gap with a decellularized allogeneic nerve. Plast Reconstr Surg. 2015;136(3):319e-327e. doi: 10.1097/PRS.0000000000001556 PMID: 26313836
  41. Zaminy A, Sayad-Fathi S, Kasmaie FM, Jahromi Z, Zendedel A. Decellularized peripheral nerve grafts by a modified protocol for repair of rat sciatic nerve injury. Neural Regen Res. 2021;16(6):1086-1092. doi: 10.4103/1673-5374.300449 PMID: 33269754
  42. Dhandayuthapani B, Yoshida Y, Maekawa T, Kumar DS. Polymeric scaffolds in tissue engineering application: a review. Int J Polym Sci. 2011 Jul 19;2011. doi: 10.1155/2011/290602
  43. Lin MY, Manzano G, Gupta R. Nerve allografts and conduits in peripheral nerve repair. Hand Clin. 2013;29(3):331-48. doi: 10.1016/j.hcl.2013.04.003 PMID: 23895714
  44. Badylak SF, Freytes DO, Gilbert TW. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. 2009;5(1):1-13. doi: 10.1016/j.actbio.2008.09.013 PMID: 18938117
  45. Wei S, Hu Q, Ma J, Dai X, Sun Y, Han G, et al. Acellular nerve xenografts based on supercritical extraction technology for repairing long-distance sciatic nerve defects in rats. Bioact Mater. 2022;18:300-320. doi: 10.1016/j.bioactmat.2022.03.014 PMID: 35387172
  46. Kawazoye S, Tian SF, Toda S, Takashima T, Sunaga T, Fujitani N, et al. The mechanism of interaction of sodium dodecyl sulfate with elastic fibers. J Biochem. 1995;117(6):1254-60. . doi: 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a124852 PMID: 7490268
  47. Wang Q, Zhang C, Zhang L, Guo W, Feng G, Zhou S, et al. The preparation and comparison of decellularized nerve scaffold of tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 2014;102(12):4301-8. doi: 10.1002/jbm.a.35103 PMID: 24497414
  48. Chenite A, Chaput C, Wang D, Combes C, Buschmann MD, Hoemann CD, et al. Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegradable gels in situ. Biomaterials. 2000;21(21):2155-61. doi: 10.1016/s0142-9612(00)00116-2 PMID: 10985488
  49. Hess JR, Brenner MJ, Fox IK, Nichols CM, Myckatyn TM, Hunter DA, et al. Use of cold-preserved allografts seeded with autologous Schwann cells in the treatment of a long-gap peripheral nerve injury. Plast Reconstr Surg. 2007;119(1):246-259. doi: 10.1097/01.prs.0000245341.71666.97 PMID: 17255680
  50. Choi J, Enis DR, Koh KP, Shiao SL, Pober JS. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 2004; 22:683-709. doi: 10.1146/annurev.immunol.22.012703.104639 PMID: 15032593
  51. Johnson PJ, Wood MD, Moore AM, Mackinnon SE. Tissue engineered constructs for peripheral nerve surgery. Eur Surg. 2013;45(3):122-135. doi: 10.1007/s10353-013-0205-0 PMID: 24385980
مجله تحقیقات دامپزشکی (Journal of Veterinary Research)
دوره 79، شماره 3
مهر 1403
صفحه 145-156

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار